CN218793243U - 一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架。所述组织工程支架，包括由内而外依次设置的丝素蛋白膜内层、丝素蛋白海绵层和丝素蛋白膜外层；其中：所述丝素蛋白膜内层用于实现生长因子的时序释放；所述丝素蛋白海绵层用于促进细胞的粘附并起支撑作用；所述丝素蛋白膜外层起保护作用，防止组织工程支架受损。本实用新型将生物相容性好的丝素蛋白和时序性释放的促血管生长因子有机结合起来，构建一个完整的递送系统，并且在系统制备过程中充分考虑膀胱壁的生理层次，进行仿生构建。将该系统应用于膀胱修复重建，展现出良好的促血管化作用。
Description
技术领域
本实用新型属于生物工程领域，具体涉及一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架。
背景技术
膀胱组织工程是医学、生物工程学和材料学交叉诞生的产物，其初衷是为解决膀胱替代这一难题而提供新的方法。临床上最常用的是肠道代膀胱，但由于肠粘膜以及肠壁组织的固有特性，常常导致感染、结石形成、尿瘘甚至癌变等并发症。组织工程膀胱因其良好的组织相容性、坚韧的生物力学特性、富含多种细胞及生物活性成分而备受期待，一度被认为是最有潜力的器官替代方法。
现有的组织工程膀胱支架种类繁多、功能不一，但是普遍存在以下两个缺点：
其一，多数组织工程膀胱支架为单层结构，未能很好地模仿膀胱壁的生理结构，以至于在重建后无法达到预期的功能指标。原因在于单层结构的膀胱组织工程支架移植入体内后会出现结石形成、尿瘘、平滑肌发育不全、收缩功能不理想等并发症，这些都与支架结构设计不合理有关系。
其二，组织工程膀胱支架血管化不足，而且少有在支架设计之初就将促血管化成分作为支架的重要组成部分。研究表明，组织内毛细血管周围氧气和养分的扩散极限是200μm，组织工程膀胱移植物进入体内后因为血管化不足引起缺血缺氧和代谢产物堆积，最终导致移植物萎缩及坏死。因此，实现组织工程膀胱移植物快速及有效的血管化是保障其存活，乃至后续的形态结构和生理功能的重要前提。
更具体的，虽然研究人员已经认识到血管化在组织工程膀胱存活中的重要意义，但是对于血管化实现方法的研究却寥寥无几。传统的大网膜孵育促进组织工程移植物血管化的方法存在两点不足。其一，大网膜孵育需要1～2周的时间在移植物周围形成一层带毛细血管的组织膜，比较耗时；其二，大网膜孵育需要将移植物包裹在大网膜内，取出包埋于大网膜内的支架时会对研究对象或者患者造成二次创伤。而现阶段将促血管生长因子应用于组织工程移植物以实现血管化是目前最新的研究。目前的研究多数使用一种促血管生长因子，但促血管生成效果并不理想。血管生成是血管内皮细胞和细胞外基质间复杂和动态的相互作用，包括血管生成启动和血管成熟过程。有研究显示，在组织工程移植物制备过程中单用血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)只能形成不成熟的血管，这种血管非常脆弱而且容易渗漏。正常生理条件下，血管生成是在多种细胞、细胞因子以及外界环境的刺激下的复杂过程。因此组织工程器官血管化需要多种生长因子的联合应用，并且需要考虑到生长因子作用的时序性。
故基于此，提出本实用新型技术方案。
实用新型内容
为了解决现有技术存在的问题，本实用新型提供了一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架及其制备方法。本实用新型将生物相容性好的丝素蛋白和时序性释放的促血管生长因子有机结合起来，构建一个完整的递送系统。并且在系统制备过程中充分考虑膀胱壁的生理层次，进行仿生构建。将该系统应用于膀胱修复重建，展现出良好的促血管化作用。
本实用新型的方案是提供一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，包括由内而外依次设置的丝素蛋白膜内层、丝素蛋白海绵层和丝素蛋白膜外层；其中：
所述丝素蛋白膜内层用于防止尿液对深层结构造成损伤并实现生长因子的时序释放；
所述丝素蛋白海绵层用于促进细胞的粘附并起支撑作用；
所述丝素蛋白膜外层起保护作用，防止组织工程支架受损。
优选地，所述丝素蛋白膜内层包含丝素蛋白微球。
优选地，所述丝素蛋白微球内包载血管内皮细胞生长因子。
优选地，所述丝素蛋白微球内包载血小板源性生长因子。
优选地，包载血管内皮细胞生长因子的丝素蛋白微球粒径为4.429±1.096μm。
优选地，包载血小板源性生长因子的丝素蛋白微球粒径为315±87nm。
为了便于理解本实用新型，现对所述组织工程支架的结构设计思路进行阐述：
膀胱壁在组织结构上主要包括四层：粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层。其中粘膜层是由尿路上皮细胞构成的防水层，能够形成粘膜屏障，防止尿液对深层结构造成损伤；粘膜下层包含血管和细胞外基质，对粘膜层和肌层起到支撑和营养作用；肌层富含平滑肌，是完成膀胱舒、缩功能的主要结构；浆膜层位于膀胱最外层，对膀胱起保护作用。
本实用新型使用丝素蛋白构建三层支架，最内层由一层不透水的丝素蛋白膜构成，模拟膀胱壁粘膜层，并且在其制备过程中加入包载促血管生长因子的微球，通过控制微球的粒径来实现生长因子的时序释放，此层为丝素蛋白膜内层。中间层由丝素蛋白海绵构成，模拟膀胱壁粘膜下层和肌层，其多孔结构能够促进细胞的粘附，同时为血管的再生提供预留的通道及支撑结构，此层为丝素蛋白海绵层。最外层由一层不透水的丝素蛋白膜构成，模拟膀胱壁浆膜层，此层为丝素蛋白膜外层。
而在实际应用过程中，支架的厚度是可以根据应用对象膀胱壁厚度可调节的。比如大鼠膀胱壁厚度约为1～2mm，则支架的丝素蛋白膜内层和丝素蛋白膜外层的厚度即设计为100μm，中间的丝素蛋白海绵层的厚度约为1～1.5mm。
基于相同的技术构思，本实用新型的再一方案是提供一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(I)制备丝素蛋白膜内层：
(1)将丝素蛋白溶液与血管内皮细胞生长因子混合均匀，再与聚乙烯醇共混，完成后烘干，得到干燥膜a；
(2)将所述干燥膜a与水混合后溶解，并进行离心，完成后得到包载血管内皮细胞生长因子的丝素蛋白微球溶液；
(3)将丝素蛋白溶液与血小板源性生长因子(Platelet derived growth factorBB，PDGF-BB)混合均匀，再与聚乙烯醇共混，完成后烘干，得到干燥膜b；
(4)将所述干燥膜b与水混合后溶解，并进行离心，完成后得到包载血小板源性生长因子的丝素蛋白微球溶液；
(5)将丝素蛋白溶液、包载血管内皮细胞生长因子的丝素蛋白微球溶液和包载血小板源性生长因子的丝素蛋白微球溶液进行混合，并滴入多孔板，干燥后即得到丝素蛋白膜内层；
(II)制备丝素蛋白海绵层：
(S1)将丝素蛋白溶液滴入多孔板，并加入氯化钠，完成后静置待充分凝固，得到预制丝素蛋白海绵层；
(S2)采用去离子水对所述预制丝素蛋白海绵层进行漂洗，完成后即得到丝素蛋白海绵层；
(III)制备丝素蛋白膜外层：
将丝素蛋白溶液滴入多孔板，烘干后即得丝素蛋白膜外层；
(IV)制备组织工程支架：
先根据步骤(III)制备丝素蛋白膜外层，然后按照步骤(II)在丝素蛋白膜外层的上层制备丝素蛋白海绵层，之后将丝素蛋白海绵层切平整，最后按照步骤(I)在丝素蛋白海绵层的上层制备丝素蛋白膜内层，完成后即得到所述组织工程支架。
优选地，步骤(I)中，所述离心的转速为10000～11000r/min，离心的温度为3～4℃，离心的时间为18～30min。
优选地，步骤(I)、(III)中，所述烘干的温度为55～60℃，烘干的时间为10～12h。
优选地，步骤(II)中，所述漂洗的时间为70～72h，每24h换水3～5次。
本实用新型的有益效果为：
1、本实用新型所述的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架为三层仿生支架，与目前单层或者双层复合材料构建的组织工程膀胱支架相比，既避免了复合材料生物相容性差、降解时间久的缺点，又能够模拟膀胱壁的多层结构和功能，同时材料生物相容性好、机械强高，并且材料来源广泛、制作方法简单、适合大规模生产。
2、本实用新型使用丝素蛋白微球实现VEGF和PDGF-BB两种生长因子的时序性释放，有效地促进了组织工程膀胱支架移植后早期的血管化，提高了移植物的存活率。本实用新型构建的生长因子时序释放体系将材料和生长因子有机结合起来，并且在构筑方式上最大限度模拟膀胱壁的多层结构。包载VEGF的丝素蛋白微球直径为4.429±1.096μm，体积较大，生长因子释放速度快，可快速释放7天左右。包载PDGF-BB的丝素蛋白微球直径为315±87nm，体积小，生长因子释放速度慢，可缓慢释放30天以上。VEGF在血管生成的起始阶段发挥重要作用，PDGF-BB是血管生成的成熟阶段的关键因子，两者时序性释放可以有效促进血管生成。另外，该体系无需大网膜包埋，在节省时间的同时也避免研究对象二次创伤的发生。本实用新型将结构仿生与促进组织工程膀胱移植物血管化有机结合起来，极大地提高了移植物存活率，为临床上膀胱修复重建这一难题提供了新的方法和产品。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本实用新型所述模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架的结构示意图。
图2是实施例1中，包载VEGF的丝素蛋白微球的扫描电镜图和粒径分布图。
图3是实施例2中，包载PDGF-BB的丝素蛋白微球的扫描电镜图和粒径分布图。
图4是试验例1中，包载VEGF的5％丝素蛋白微球和包载PDGF-BB的0.5％丝素蛋白微球的累积释放曲线。
图5是试验例2中，live/dead染色实验对比结果。
图6是试验例3中，CCK8检测实验对比结果。
图中附图标记为：
1-丝素蛋白膜内层；11-包载VEGF的丝素蛋白微球；12-包载PDGF-BB的丝素蛋白微球；2-丝素蛋白海绵层；3-丝素蛋白膜外层。
具体实施方式
为使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本实用新型的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本实用新型所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(I)制备丝素蛋白膜内层1：
(1)将1mL 5％(W/V)丝素蛋白溶液与200ng VEGF混合均匀，再与5％(W/V)聚乙烯醇按体积比1:4共混，超声25％振幅作用30s，之后将其倒入培养皿中并置于60℃烘箱过夜，得到干燥膜a；
(2)将干燥膜a从培养皿内揭下，置入50ml离心管中并加入20ml去离子水，将离心管置于摇床上室温摇晃30min使其充分溶解，最后将离心管放入离心机内于11000r/min、4℃的条件下离心20min，即得到包载VEGF的丝素蛋白微球11溶液；经扫描电镜测量得微球直径为4.429±1.096μm；
(3)将1ml 0.5％(W/V)丝素蛋白溶液与200ng PDGF-BB混合均匀，再与0.5％(W/V)聚乙烯醇按体积比1:4共混，超声25％振幅作用30s，之后将其倒入培养皿中并置于60℃烘箱过夜，得到干燥膜b；
(4)采用与步骤(2)相同的操作，制备得到包载PDGF-BB的丝素蛋白微球12溶液；经扫描电镜测量得微球直径为315±87nm；
(5)将8％(W/V)丝素蛋白溶液100μL、包载VEGF的丝素蛋白微球11溶液50μL和包载PDGF-BB的丝素蛋白微球12溶液50μL充分混合后滴入24孔板，开盖放入60℃烘箱干燥过夜即可得到丝素蛋白膜内层1。
(II)制备丝素蛋白海绵层2：
将8％(W/V)丝素蛋白溶液600μL滴入24孔板，均匀撒入1.2g氯化钠，盖上盖子室温放置48小时，待其充分凝固后放入装有2L去离子水的大烧杯中漂洗72小时，每天换水3～5次，完成后即得到丝素蛋白海绵层2。
(III)制备丝素蛋白膜外层3：
将8％(W/V)丝素蛋白溶液200μL滴入24孔板，开盖放入60℃烘箱干燥过夜即可得到丝素蛋白膜外层3。
(IV)制备组织工程支架：
使用“层层叠加”的方法，先根据步骤(III)制备丝素蛋白膜外层，然后按照步骤(II)在丝素蛋白膜外层的上层制备丝素蛋白海绵层，之后将丝素蛋白海绵层切平整，最后按照步骤(I)在丝素蛋白海绵层的上层制备丝素蛋白膜内层，完成后即得到所述组织工程支架。
实施例2
在实施例1的基础上，实施例2提供一种由实施例1制备得到的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，参考图1，其包括由内而外依次设置的丝素蛋白膜内层1、丝素蛋白海绵层2和丝素蛋白膜外层3；其中：
所述丝素蛋白膜内层1用于实现生长因子的时序释放；
所述丝素蛋白海绵层2用于促进细胞的粘附并起支撑作用；
所述丝素蛋白膜外层3起保护作用，防止组织工程支架受损。
进一步地，所述丝素蛋白膜内层1包含丝素蛋白微球。
进一步地，所述丝素蛋白微球内包载血管内皮细胞生长因子。
进一步地，所述丝素蛋白微球内包载血小板源性生长因子。
进一步地，包载VEGF的丝素蛋白微球11粒径为4.429±1.096μm。
进一步地，包载PDGF-BB的丝素蛋白微球12粒径为315±87nm。
试验例1
为了验证包载VEGF的丝素蛋白微球和包载PDGF-BB的丝素蛋白微球的释放性能，使用Elisa试剂盒分别检测包载VEGF的5％丝素蛋白微球和包载PDGF-BB的0.5％丝素蛋白微球1d、3d、7d、14d、21d的累积释放量并绘制累积释放曲线。如图4所示，从曲线可看出7d内以VEGF释放为主，其释放量大约是PDGF-BB释放量的10倍以上，7天以后两种生长因子缓慢而持续释放。
试验例2
为了验证实施例1所得模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架的生物相容性，进行live/dead染色实验。live/dead染色是检验材料生物相容性的常用方法，通过染色，活细胞呈现绿色荧光，死细胞呈现红色荧光。实施例1所得组织工程支架(A组)和对照组(B组)分别使用支架浸提液和正常培养基培养细胞。在第1d、3d、5d分别染色，由图5可见实施例1所得组织工程支架细胞生长良好，与对照组无明显差别，说明实施例1所得组织工程支架细胞毒性小，生物相容性好。
试验例3
CCK8检测也是检验材料生物相容性的常用方法。它的原理是使用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8)对培养细胞的增值活性进行检测，细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色越浅。颜色的深浅通过酶标仪来检测吸光度。Scaffold组和Control组分别使用支架浸提液和正常培养基培养细胞。在第0d、1d、3d、5d、7d分别检测吸光度，由图6可见实施例1所得组织工程支架细胞增殖速度良好，说明实施例1所得组织工程支架细胞毒性小，适于细胞生长增殖，生物相容性好。
以上所述，仅为本实用新型的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，其特征在于，包括由内而外依次设置的丝素蛋白膜内层、丝素蛋白海绵层和丝素蛋白膜外层；其中：
所述丝素蛋白膜内层用于实现生长因子的时序释放；
所述丝素蛋白海绵层用于促进细胞的粘附并起支撑作用；
所述丝素蛋白膜外层起保护作用，防止组织工程支架受损。
2.根据权利要求1所述的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，其特征在于，所述丝素蛋白膜内层包含丝素蛋白微球。
3.根据权利要求2所述的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，其特征在于，所述丝素蛋白微球内包载血管内皮细胞生长因子。
4.根据权利要求2或3所述的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，其特征在于，所述丝素蛋白微球内包载血小板源性生长因子。
5.根据权利要求3所述的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，其特征在于，包载血管内皮细胞生长因子的丝素蛋白微球粒径为4.429±1.096μm。
6.根据权利要求4所述的模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架，其特征在于，包载血小板源性生长因子的丝素蛋白微球粒径为315±87nm。
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| CN202222505098.9U CN218793243U (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架 |
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|---|---|---|---|---|
| CN115414533A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-02 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架及其制备方法 |
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2022
- 2022-09-20 CN CN202222505098.9U patent/CN218793243U/zh active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN115414533A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-02 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架及其制备方法 |
| CN115414533B (zh) * | 2022-09-20 | 2024-02-23 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种模拟膀胱壁生理结构的组织工程支架及其制备方法 |
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