CN213977736U - 一种基因测序基片的制备设备 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供一种基因测序基片的制备设备，可以消除在玻璃上的纳米压印胶的荧光性，从而使得紫外纳米压印胶制备的微坑结构可以应用于基因测序芯片。设备包括基片、平台、光源、菲涅尔透镜；其中所述的基片为基因测序芯片的组成部分；所述基片为软压印的方法制备微结构基片；所述基片的表面有紫外纳米压印胶；所述光源为LED光源；LED光源的光经过菲涅尔透镜照射到基片上面；所述基片放置在平台上面。利用紫外光源长时间的照射玻璃上的纳米压印胶的薄层，可以消除该薄层纳米压印胶的荧光。设备方法简单，并且不会对于纳米压印胶造成损伤。

Description

一种基因测序基片的制备设备

技术领域

本实用新型涉及一种基因测序基片的制备设备，属于基因测序领域。

背景技术

高通量测序仪是近几年高速发展的技术。高通量测序，相较于传统桑格测序，最大的优势是可以同时读出海量的序列信息。虽然准确度不如传统测序方法，但由于海量数据分析，便可得出超出序列本身的信息，如基因表达量、拷贝数变异。当今主流测序仪均使用SBS(sequencing by synthesis边合成边测序)方法，如solexa/illumina、454、iontorrent等。这些测序仪的结构相似，都包括流体系统，光学系统，和芯片系统。测序反应在芯片内发生。测序过程也很相似，都包括：将反应液通入芯片，发生SBS反应，采集信号，冲洗，进行下一轮。一般的测序芯片都包括微反应池，主要是石英等物质为基底。纳米压印技术是通过光刻胶辅助，将模板上的微纳结构转移到待加工材料上的技术。这种技术有望替代现有的光刻技术。纳米压印技术成本低，精度高，重复性好。本实用新型提供一种在玻璃上利用纳米压印制备有机物微坑的方法，这种微坑用于基因测序的时候，通过一定的处理，可以消除原始的荧光对于测序反应的影响。

实用新型内容

一种去除基因测序基片荧光性的设备，其特征在于，包括基片、平台、光源、菲涅尔透镜；其中所述的基片为基因测序芯片的组成部分；所述基片为软压印的方法制备微结构基片；所述基片的表面有紫外纳米压印胶；所述光源为LED光源；LED光源的光经过菲涅尔透镜照射到基片上面；所述基片放置在平台上面。

根据优选的实施方式，所述平台是旋转的。

根据优选的实施方式，所述光源的波长为300-600nm。

根据优选的实施方式，所述纳米压印胶的厚度为0.5-5微米。

本设备的原理是利用大功率的LED光源均匀照射片子表面，获得低荧光的基片。一般的纳米压印方法中，UV胶或者热压胶是主要的纳米压印胶。UV胶或者热压胶一般具备在特定波段很强烈的荧光。这对于测序反应来说是不能接受的。因此需要除掉基片表面的荧光。本实用新型方法简单，不会对于纳米压印胶造成损伤，并且可以将纳米压印胶的荧光性去除90％以上，可以满足基因测序的需求。

本实用新型中所涉及的词均为本领域的通用说法，为了进一步的表述清楚，下面对于本实用新型涉及的用词做进一步的解释。

本实用新型所述的基片为本领域的常见用法。指的是生物化学实验中，直接用于实验的玻璃片、硅片、石英片等透明或者不透明的平整基底，或者封装以后形成密封芯片的平整基底。基底上可以选择性的部分区域通过微加工或者其它手段形成图案作为功能区域。

本实用新型所述的低荧光或者无荧光属于相对的概念。但是本领域技术人员可以明显知道的是，常见的紫外胶等物质有明显的荧光性，例如US8等等，在使用紫外光源照射的时候，会发出明显的光，并且会导致部分生物化学实验不能使用。低荧光也属于相对的概念。即使是纯度十分高(99.99％以上)的石英也会被灵敏的荧光显微镜观察到，但是石英片并不会因为荧光影响某些生物化学实验的观测。除特殊说明外，本实用新型中所涉及的词均为本领域的通用说法。

附图说明

图1.装置示意图。

具体实施方式

为了进一步说明本实用新型的核心内容，现将本实用新型用下面的例子作为说明。实施例是为了进一步解释实用新型内容部分，并不对于本实用新型造成限制。

纳米压印技术作为一种下一代光刻技术，具有高分辨率、高产率、低成本等优点。与传统光刻技术不同的是，纳米压印技术直接采用机械压印的方法来转移微纳图形而不是采用光照使光刻胶成型。根据材料和工艺不同，常用的纳米压印技术可分为热压印(HEL)和紫外压印(UV-NIL)两种。热塑型纳米压印(即热压印)具体使用热塑性材料，将热塑性材料加热至玻璃化转变温度以上时，通过压力将模板的图案转移到衬底上。紫外压印采用紫外光照射模板，使充满模板空隙的光刻胶固化，从而将模板上的图案转移到衬底上。紫外纳米压印胶的研究重点在于成型、脱离、刻蚀性等方面，而很少有人研究压印胶的本身的荧光性能。首先的，这种荧光性能并不受很多人的关注，因为其比较微弱，一般来说，只有光刻胶例如SU8的50％以下，但是在特殊应用领域，这种级别的荧光性能仍然有很大的影响。另一个方面，纳米压印胶很多的时候是作为中间媒介来使用的，例如用于刻蚀，直接的应用是受到限制的，因为其材料比较特殊。紫外压印胶很多的性能是与热压印胶不同的，例如可以做更小的图形，可以填充更好。综合来看，在紫外纳米压印胶制作的图案直接使用的领域，研究是比较少的。

本实用新型涉及一种生物化学芯片，更具体的是基因测序芯片。申请人在之前申请了一些关于测序方法或者技术的专利，例如CN201510155218.9，CN201510212788.7，CN201510212789.1，CN201510822361.9，CN201510815685.X，CN201510944878.5，CN201610899880.X等，这些专利是属于荧光切换的多碱基测序方法。必要的时候，上述专利的内容可以以引用的方式加入本专利。申请人之前申请了一系列关于测序芯片的专利，例如CN2017105741742，CN2017105741441，201910156547.3，必要的时候，上述专利的内容可以以引用的方式加入本专利。

基因测序芯片制备的过程中，基片属于测序芯片的重要组成部分。基片同其他封装材料组合可以形成完整的芯片。例如2017105741441中，图片2中序号102或者101可以对应于基片的位置。芯片的具体封装方式在前面的专利中已经有描述，此处就不再赘述。可以想到的，利用本实用新型中所述的基片，同另一个玻璃片或者不透明的金属或非金属片组成一个两层的芯片。需要说明的是，基因测序芯片由于其使用的条件需要光学信号的传导，因此，其至少一个封装面是透明的。

基因检测的时候，高通量测序一般指的是二代测序。大部分的二代测序中，需要使用到带有微坑结构的基片。申请人之前的专利中已经具体的进行过描述。一般的微坑指的是阵列排布的，高度密集的结构。一般的，微坑的直径为0.2-5微米，优选0.3-2微米。微坑的周期为0.5-10微米，优选的0.6-4微米。微坑的直径与深度比值为0.3-3，优选0.5-2。

纳米压印技术属于常规技术，其一般步骤包括提供衬底，在衬底表面形成聚合物层；使得聚合物层处于软化状态，并对聚合物层远离衬底的一侧进行压印，加热和/或紫外曝光硬化，脱模成型。纳米压印胶多种多样，主要有UV型和热敏型两种。然而常规的纳米压印胶在极端的测试条件下，均会具备一定的荧光性。在一般的应用中，这种荧光性不影响，然而在基因测序等领域中，这种微弱的荧光直接会导致背景荧光的偏高，影响测序的结果。

本实用新型涉及一种紫外纳米压印胶制备的基因测序芯片。特别指的是二代基因测序芯片。二代基因测序是高通量基因测序，需要在一个小尺寸的芯片区域内有密集的数据点。数据点一般的可以利用微坑来进行隔开。因此，纳米压印制备基因测序芯片是理想的领域。热压印的时候，会有很多的问题。基因测序芯片一般的微坑尺寸范围为0.1-5微米，优选0.2-3微米。也就是说，芯片上有密集的十分小尺寸的微坑。在这种尺寸级别下，紫外胶纳米压印技术有更好的表现，而热压印则比较困难。这样小的尺寸，并且图形密集程度十分高，热压印的时候，脱模和图形完整度都有很大的挑战。

本实用新型还公开一种基因测序基片的制备方法，包括下面的步骤：

在基底上涂胶，然后利用软压印的方法制备微结构基片；

将制备好微结构的基片放在照射设备下面，

照射设备包括LED光源和菲涅尔透镜；

将基片用照射设备照射；

其中所述LED光源的波长为300-600nm。

根据优选的实施方式，所述微结构指的是阵列排布的微坑。

根据优选的实施方式，所述微结构的周期为1-10微米，优选的1.2-5微米。

根据优选的实施方式，所述基底上涂胶指的是旋涂紫外纳米压印胶。

根据优选的实施方式，所述基底为玻璃，石英，蓝宝石玻璃，硅片，金属板中的一种。

根据优选的实施方式，将基片放置在照射设备下面，LED光源的光透过菲涅尔透镜照射到基片上；所述基片的照射时间为为1-8小时，优选的2-6小时。

根据优选的实施方式，将基片封装形成基因测序芯片。

根据优选的实施方式，所述基片经过照射以后，涂层材料在450-650nm的发射光明显降低，优选480-600nm的发射光明显降低，所述的明显降低指的是发射光强度降低50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，更优选80％以上，更优选90％以上。

一种基因测序方法，其特征在于，

利用基因测序芯片进行测序；所述测序芯片具有流体出口、流体入口以及流体室；

所述流体室的至少一个表面上有预先用纳米压印方法制备的微坑；

所述基因测序芯片经过波长300-600nm的光照射，优选400-550nm光照射。

所述LED的功率为10-500W，优选50-100W。

前面已经描述，紫外纳米压印胶由于其本身的特点，导致了其在300-650nm的吸收/发射光范围内有很强的表现。也就是说，在基片上，直接用纳米压印胶制备的微坑图案是不容易直接使用的，会对于基因测序的信号有很大的影响。因此，除去这种信号的方法是很有意义的事情。

一般性的，石英基片(纯度达到99.9％以上)的荧光可以认为不影响测序过程。则整个系统中，纳米压印胶属于最大的额外影响。

本实用新型提供一种利用大功率UV灯去除纳米压印胶的荧光性的方法。利用均匀的紫外灯，产生准直光，直接照射基片的表面。在达到一定的照射时间的情况下，可以去除基片表面纳米压印胶的荧光背景。一般的，利用大面积、大功率的UV灯作为光源。利用菲涅尔透镜可以产生准直光，并且调整光强分布。利用UV灯同菲涅尔透镜的组合，长时间照射，就可以去除纳米压印胶的背景荧光。

一般的将纳米压印胶旋涂在基底上，然后进行压印。基底可以是透明或者不透明的。例如玻璃，石英，硅片，BF33玻璃等等。基底的厚度优选0.1-1mm。

菲涅尔透镜(Fresnel lens)，又名螺纹透镜，多是由聚烯烃材料注压而成的薄片，也有玻璃制作的，镜片表面一面为光面，另一面刻录了由小到大的同心圆，它的纹理是根据光的干涉及扰射以及相对灵敏度和接收角度要求来设计的。利用菲涅尔透镜，可以在光源的另一侧形成比较均匀的光场。

其它除去荧光性的技术可能破坏纳米压印胶的结构。实验性的，将纳米压印胶用84处理，会导致微结构的严重变形破坏，甚至脱落。其它的有机物质，例如丙酮并不能达到除去荧光性的目的。并且，丙酮等化学溶剂，也可以对于纳米压印胶造成影响，当图形例如大于100微米的时候，影响可能不太严重，更小的图形则可能造成明显的影响。其它的可能的实验也进行了尝试，包括照射太阳光，简单的结果表明，长期的处于太阳光的照射环境中，可以降低纳米压印胶的荧光性，但是随之会有很多影响，首先时间特别长，需要1-6个月，第二处理以后的基片表面结构容易产生裂纹等，并且荧光的降低并不能达到80％甚至90％的程度。

纳米压印胶分为多种类型，一般的热压印胶、紫外压印胶、复合型纳米压印胶等。一般的，紫外纳米压印胶应用更加广泛，条件温和，并且可以做更小的图形。本实用新型所述的压印指的是采用紫外纳米压印胶。紫外纳米压印胶可以分为丙烯酸型压印胶、环氧型压印胶、乙烯醚型压印胶等等。然而可以确定的是，紫外纳米压印胶在压印以后都有荧光物质残留的问题。本实用新型采用了光照射去除纳米已经制备好的图案中的荧光性的方法，简单，成本低、易于操作。

一般的生物化学实验中，例如基因测序，对于芯片荧光背景的要求都是比较高的。例如荧光染色的观察的时候，背景荧光可能严重影响观察的准确性。例如基因测序中，由于一般的信号强度都是十分微弱，背景信号的强度是十分重要的指标，会导致荧光测序测不准。而经过本实用新型所述的方法处理以后，则不会影响测序反应。

可以了解的，本实用新型所述的实施例1中，石英的荧光背景强度是500-1000。石英的背景强度也是一个比较的结果，不同的检测条件对应于不同的背景强度，本实用新型中，涉及到荧光背景强度的数值，基本按照统一的实验条件测定。一般的芯片即使使用低荧光玻璃，或者石英制作，由于多重结构或者微加工图案的存在，也会导致荧光背景的上升。可以理解的，一般背景强度低于石英强度的2-3倍则满足绝大多数的生物化学检测条件了。一般的石英玻璃满足前面的描述,其石英纯度应该在99.99％以上。除高纯度石英之外,其它玻璃的荧光背景值并不统一，实验室检测的结果表明，普通的浮法玻璃可能的背景值相对于石英高约1.5-5倍；这个数值范围很多的情况下，满足一般测序的需求，但是其潜在一定的干扰，更低的荧光背景，综合考虑成本是工业化的优选方案。

LED光源的功率是可以选择的。选自10-500W，优选50-100W。当然这个条件是可以变化的，可以理解的，功率比较低的时候，照射更长的时间，功率比较高的时候，照射较短的时间。辐照量与处理时间并不成简单的直线比例关系，但是偏差并不明显。

LED光源由多个灯珠组成。单个灯珠的功率选自1-500W，优选1-10W.

单个基片的照射时间为1-8小时，优选的2-6小时。

单个基片的照射的时候，考虑到光源不均匀导致的光场不均匀，优选以变换基片和光源相对位置的条件进行。将基片固定在距离光源恒定距离，并且可以旋转或者其它方式消除光场不均匀的影响。

基片涂胶的一面朝向LED光源的方向。整体的，如果使用石英作为基片，那么对于很多波段的光的阻拦比较小，也可以透过基片材料处理纳米压印胶。

实施例1

选用TAYLAN实际功率50W的LED组作为光源。选用深圳市美英科技螺纹菲涅尔透镜，直径255mm，焦距1000mm。在预先搭建好的平台上，将菲涅尔透镜和光源分别固定。将纳米压印的基片放在平台上，开启光源，照射120min，记录其荧光值，然后再照射120min，记录荧光值。参见图1。101为LED光源，102为纳米压印的基片，103为平台，104为菲涅尔透镜。

利用石英基片作为对照。利用488nm的光源作为激发光,532纳米为中心值作为吸收光。在相同的条件下，石英的荧光背景值记录为500。没有经过处理的带纳米压印胶的基片的荧光背景值约为23000到30000。不同的基片荧光背景会有一定的差别。测试处理了120min的基片，发现其荧光值降低，大约为3600-6000。再经过120min的处理，其荧光值大概范围为1200-2500。分析，这个结果是50片的平均结果，虽然结果的区间值还比较大，但是其下降趋势或者说下降比例是比较明显的。比较好的结果显示，荧光背景的下降达到了95％左右，平均值也在90％以上。

相比于石英片，这种荧光值稍微高一点点，然而可以知道的，由于纳米压印片的表面具备微结构，测量的时候，会导致一定的荧光升高，可以适用于基本上所有已知的生物化学实验。另外，该荧光值的强度基本上达到了大部分设备的检测极限。本实施例中，测试了多批、多片纳米压印片，均表现出了相同的范围，纳米压印片之间的区别比较大。根据测序实验的结果，这种荧光背景可以在测序的条件下使用。可以知道的是，单纯的提出荧光背景值是没有意义的，本实用新型中所有的荧光背景值的检测条件是一致的，保证了其相对强度测量的准确性即可。

实施例2

根据实施例1所述的处理方法。在两次处理以后，再将纳米压印片放在平台上，处理240min。结果发现，纳米压印片的荧光背景降低不明显。本实用新型中所有荧光值的测量均采用了统一的条件。

实施例3

将SU8制备的纳米压印片，微结构为微坑，尺寸为直径5微米，高度5微米。利用实施例1所述的光照射的条件，发现处理以后荧光值为1500。满足常见生物化学实验要求。

实施例4

根据实施例3所述的纳米压印片，利用丙酮处理，无效。利用84处理基本无效。

本实用新型具体实施方式中的具体实施例，仅仅是对于本实用新型的进一步说明，并不够构成成本实用新型的限制因素。

以上所述，仅为本实用新型较佳的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种基因测序基片的制备设备，其特征在于，包括基片、平台、光源、菲涅尔透镜；其中所述的基片为基因测序芯片的组成部分；所述基片为软压印的方法制备微结构基片；所述基片的表面有紫外纳米压印胶；所述光源为LED光源；LED光源的光经过菲涅尔透镜照射到基片上面；所述基片放置在平台上面。

2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述平台是旋转的，使得基片受到均匀光照。

3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述纳米压印胶的厚度为0.5-5微米。

4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述光源的波长为300-600nm。

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