CN212008238U - 测定药剂的可扩散浓度或游离浓度或自由浓度变化率的系统及确定可扩散剂的渗透性的系统 - Google Patents

Abstract

一种测定药剂的可扩散浓度或游离浓度或自由浓度变化率的系统及确定可扩散剂的渗透性的系统，本实用新型提供了一种改进的微透析系统，用于测定药剂或药物的游离浓度(定义为溶解和自由扩散，而不是非溶解或沉淀、复合、结合，包含在胶束或微乳液中的药剂浓度等。)。此外，本实用新型在微透析探针的性质可以改变的条件下提供这种系统。本实用新型进一步提供了一种用于确定扩散剂通过探针壁的渗透性的系统。本实用新型还提供了一种确定介质中药剂浓度变化率的系统。

Description

测定药剂的可扩散浓度或游离浓度或自由浓度变化率的系统 及确定可扩散剂的渗透性的系统

技术领域

本实用新型涉及一种实现和测量质量传递的改良系统。特别地，本实用新型涉及改进的微透析系统在测量两种介质(微透析探针的一个内部和一个外部)之间相对少量的溶解、混悬或以其他方式分散的材料的转移中的用途。转移的特征在于物质从其所在的介质中丢失和/ 或被另一种介质收集，并且尤其可以用于对药物浓度进行采样和/或表征各种过程发生的速率和转移程度。实例包括确定药物溶解度和过程，例如药物与蛋白质的结合，药物的螯合和络合，溶液中药物在木炭和其他吸附剂上的吸附以及药物从乳剂和微乳剂体系中的释放。另外，转移速率可用于确定药物的扩散系数和放置在探针窗口上的涂层的渗透性。(尽管这些例子涉及药物并且具有药学意义，但是本实用新型扩展到可以通过膜而在两种介质之间转移的任何化学物质，颗粒或液滴)。其他应用包括确定药物的溶解速率，以及从过饱和溶液中溶解的药物的沉淀/结晶速率。本领域技术人员将想到在本实用新型的范围和意图内的其他应用。

背景技术

以连续方式进行的微透析是从生物组织或体外系统中的介质中采样药物浓度的已知方法。但是，某些不足之处，如下面将更全面讨论的，妨碍了其最佳应用。现有技术基于透析原理，采用“半渗透性”膜，即对水和小分子具有高渗透性的膜。在这个方法中，采样溶液(透析液)通过探针连续灌注，药物或其他感兴趣的物质从周围介质被动扩散到透析液中。收集并分析透析液的药物含量，然后根据该信息估算周围介质中药物或其他目标物质的浓度。(可以执行类似的程序，其中透析液是供体，确定周围介质中的药物损失量。这通常称为逆透析或逆微透析。)

与其他采样方法相比，微透析可以提供明显的优势。例如，由于微透析探针非常小，因此可以将它们直接放置在生物组织中以进行体内测试，也可以放置在小型“接收器”中以进行体外系统测试。另外，该方法提供了清洁的水性样品而无需预先检测样品的准备，例如分离或净化步骤的优点。因此，微透析已成为药物和生化浓度体内和体外分析的标准技术。

在标准微透析方法中，透析液通过探针连续灌注，通常以恒定的流速灌注。(这将被称为连续流动微透析，或CFMD。)对于本实用新型的目的，膜将涉及为高度可渗透的，即，它可渗透水和相对小的分子、颗粒和液滴(例如，来自微乳液)，但是对于蛋白质等相对大的分子是不可渗透的。当然，必需的参数是该膜对于要测量或通过扩散抽出的材料(例如药物)是可渗透的。透析液的灌注流速的选择主要取决于分析的样品大小。对于将通过例如高压液相色谱(HPLC)方法分析的样品，典型的CFMD灌注流速为0.5-2.0μL/min。然而，在这些流速下，采样所需的时间相对较长，并且样品的时间分辨率(即，将特定浓度与特定时间或短时间间隔相关联的能力)较差。另外，存在与在短时间间隔(小于30秒，可能小于5-10秒)内产生足够的样品体积 (5-20μL)相关的问题。例如，样品浓度变得非常稀，并且可能低于所用测定的检测限。因此，CFMD不适合浓度变化相对较快的研究。此类病例经常出现在药学和生物学中，可包括体外细胞药物摄取动力学研究或结合研究，药物络合，药物吸附到木炭或其他粘合剂，从过饱和溶液中沉淀等。例如，据报道，悬浮在缓冲液中的红细胞对甲基唑胺的摄取在早期非常迅速，缓冲液浓度在最初的1-2分钟内降低了 50％。对于其他系统，例如蛋白质结合，浓度降低50％可能在不到10-15 秒内发生。对于这样的设置，CFMD无法每10-15秒采样一次是一个很大的缺点。此外，对于需要将细胞与缓冲液分离的采样方法例如加标采样，由于在样品制备过程中摄取过程持续进行，因此可能会出现大的错误。因此，可以在相对短的时间范围内提供良好时间分辨率的微透析方法将为这些系统提供显着的优点。

与CFMD相关的另一个问题是，在典型的灌注流速下，药物的回收和由此产生的采样效率可能很差。药物的回收是供体流体中的药物浓度与透析液的药物浓度之间的关系，回收的部分(F_R)根据透析液浓度(C_S)和供体浓度(C_D)的比例来定义。对于透析液最初没有药物，当C_D可以作为常数时，这被给出为

在体外，许多参数影响F_R，包括温度，流速，探针长度和药物，灌注液和膜的物理性质。由于灌注在CFMD中是连续的，因此透析液和供体介质之间的平衡不能达到，并且F_R通常较低。

对于反渗析，类似参数为透析液中剩余部分R_F。将输入探针之前透析液中的浓度表示为C₀，这被定义为

对于在抽取微透析样品期间外部介质浓度发生明显变化的情况，由于C_D随时间变化，因此上述F_R不适用。因此，需要一种测定在特定时间C_D的方法。如上所述，由于快速采集样品通常是困难的事实，这使情况进一步复杂化，因为在样品分析之前的分离或其他净化步骤中采样过程可能正在进行。因此，显然需要一种使用快速方法在特定时间获得特定C_D值的方法。

实用新型内容

本实用新型包括一种在微透析探针内部或外部的介质中通过扩散包含(溶解或悬浮)的至少一些可扩散材料(下文中称为试剂或药物) 来转移(提取或给予)的系统。如本文所用，“可扩散的”是指能够在或通过流体介质扩散。

更具体地，本实用新型提供了一种确定药物试剂的游离浓度的系统(定义为包含在胶束或微乳剂中的，溶解且能够自由扩散，而不是未溶解或沉淀、络合、结合的试剂的浓度，等等)。

从最广泛的意义上讲，本实用新型涉及以脉冲方式泵送透析液，并分析至少一些这样的透析液中所需物质的含量。更具体地，本实用新型涉及一种微透析系统，具有一探针，通过该探针泵送透析液，而改进包括以脉冲方式泵送透析液并分析至少一些这样的透析液中所需物质的含量。

于一方面，本实用新型提供一种测定药剂的可扩散浓度或游离浓度的系统，所述药剂在探针性质可能发生变化的介质中，所述系统包括：

一探针(11)，其窗口体积V_w和内半径α是已知的，但λ的值可以改变，包括相对于任何材料的相对高渗透性的膜的一部分，该膜被附着以支撑并定位在进入透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，用于将所述探针与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，用于以特定的流速Q将已知量的透析液，灌注到探针的相对高渗透性部分中，其中所述的透析液的扩散剂的扩散系数D是已知的；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用于以单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，用于计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的λ，f_D，F_RQ和γ1的值，受限于透析液中可扩散剂的扩散系数等于其已知值；以及

计算供体中的游离浓度为C_D,f＝f_DC_D。

于另一方面，本实用新型提供一种确定可扩散剂的渗透性的系统，可扩散剂的渗透性指的是在探针的性质可能改变的介质中可扩散剂通过探针壁的渗透性，所述系统包括：

一探针(11)，该探针(11)包括相对于任何材料的相对高渗透性的膜的一部分，其中窗口体积V_W和内半径α是已知的，但是值可以改变，膜被附着以支撑并定位在透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，将所述探针(11)与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，以规定的流速Q将已知量的透析液，灌注到探针的相对高渗透性部分中，其中所述的透析液的扩散剂的扩散系数D是已知的；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述可扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第一计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的λ，f_D，F_RQ和γ₁的值，受限于透析液中可扩散剂的扩散系数等于其已知值；以及通过探针壁药剂作为供体中的自由浓度计算其渗透系数，P＝λD/α。

于一方面，本实用新型提供一种测定药剂的可扩散浓度或自由浓度变化率的系统，所述药剂在介质中，所述系统包括：

一探针(11)，其窗口体积V_W和内半径α和参数λ是已知的，包括相对于任何材料相对高度可渗透的膜的一部分，该膜附接到所述材料以用于支撑并且定位在透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，用于将所述探针(11)与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，用于以指定的流速Q将已知量的透析液灌注到该探针(11)的相对高渗透部分；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述可扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，用于计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的f_D，F_RQ和γ₁的值；计算供体中的游离浓度为C_D,f＝f_DC_D；以及绘制C_D,f与时间的关系。

于一方面，本实用新型提供一种测定药剂的可扩散浓度或自由浓度变化率的系统，所述药剂在探针性质可能发生变化的介质中，所述系统包括：

一探针(11)，其窗口体积V_W和内半径α是已知的，但λ的值可以改变，包括相对于任何材料相对高度可渗透的膜的一部分，该膜被附着以支撑并定位在透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，将所述探针(11)与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，以规定的流速Q将已知量的透析液，其扩散剂的扩散系数D是已知的，灌注到该探针(11)的相对高渗透性部分中；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述可扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的λ，f_D，F_RQ和γ₁的值，受限于透析液中可扩散剂的扩散系数等于其已知值；计算供体中的游离浓度为 C_D,f＝f_DC_D；以及绘制C_D,f与时间的关系。

本质上，本实用新型提供了一种用于精确确定介质中试剂的可扩散或游离浓度的方法，包括：

a)提供一种探头，该探头的窗口体积V_W和内半径a和参数λ已知，包括一部分相对任何支撑材料高渗透性的膜，该膜的一部分在其进口处连接至透析液源，并且在其出口处连接至接收器，并且通过该膜扩散剂被转移；

b)使所述探针与所述介质接触；

c)以规定的流速Q将已知量的透析液灌注到探针的相对高渗透性的部分中；

d)允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静止。

e)用单个脉冲冲洗所述已知量的透析液，以与上述步骤 (c)中所使用的相同的流速将已知体积Vs的透析液收集到所述容器中；

f)确定所述透析液中所述扩散剂的浓度；

g)计算表观回收率F_R ^App。

h)以相同的流速和样品体积但至少1个不同静置时间，重复步骤(c)至(g)；

i)使用从F_R ^App与暴露时间中选择的样品体积和流速确定探针的f_D、F_RQ和γ₁值；

j)计算供体中的游离浓度为：C_D,F＝f_D C_D·

通过扩展如权利要求书中进一步提供的上述详细系统，还可以确定试剂在其中微透析探针的性质可能改变的介质中的游离浓度。还可能确定这种试剂通过探针壁的渗透性。另外，可以确定试剂的游离浓度的变化率。

附图说明

为说明本实用新型，以下列附图呈现较佳具体实施例，但是是以阐述本实用新型为目的。应被理解的是，本实用新型并不局限于所示的较佳具体实施例：

图1(A)-图1(B)是可用于本实用新型的微透析探针的示意图。

附图标记说明：

100 微透析系统

11 探针

12 接触元件

13 灌注元件

14 冲洗元件

15 测定元件

16 第一计算模块

17 控制模块

18 第二计算模块。

具体实施方式

本实用新型用来解决常规微透析系统，称为连续流微透析(CFMD) 系统，有关的问题的方法，是使用一种称为脉动性微透析(PMD)的新型微透析方法。在这种方法中，将透析液泵入探头中，然后使其静置一小段不连续的时间，称为静置时间(t_R)。在合适的t_R之后(通常 3-100秒，优选3-15秒)，将透析液冲洗(即，泵出)并收集用于测定。通常优选的是，以相对高的流速(通常为50-165μL/min)以单个脉冲进行冲洗，优选地是最小化或消除进一步扩散的影响，这通常简化了对流体的数学分析数据。PMD方法可以灵活地优化实验过程。例如，可以将t_R选择为足够长以通过扩散在透析液和外部介质之间提供可接受量的转移，并且选择足够短以提供期望的时间分辨率。另外，选择冲洗的体积(即样品体积)以完全收集在探针窗口中静置的样品，同时最小化其稀释度。(为了测定外部介质中的浓度，必须选择足够长的时间以使透析液可以收集到足够的药物，其特征在于回收部分F_R由方程(1)定义。类似地，当将透析液用作供体介质时，时间必须足够长，以使透析液中的一部分药物损失到外部介质中，如方程(2)所给出的R_F)。结果，PMD方法相对于CFMD具有两个优点：首先，即使浓度快速变化，脉冲法也具有出色的时间分辨率。第二，通过增加t_R可以使PMD的F_R更高，与使用CFMD相比，可以用更短的时间间隔检测周围流体中的低浓度药物。

供体和透析液之间的药物交换的PMD过程被建模为扩散过程。因此，建模仅跟踪溶解或自由扩散的药物或其他药物，也称为游离药物。 (此处，游离是指药物或药物已溶解并能够通过探针窗口壁扩散并扩散。处于游离形式时，假定药物或其他药剂未沉淀或不溶解，不复合或以其他方式与其他分子或颗粒结合，未掺入胶束，微乳液，颗粒中的空隙空间等。)

当将药物分子添加到溶剂中并且没有结合、络合、捕获、沉淀等作用时，总药物浓度应与游离药物浓度相同。然而，对于许多系统而言并非如此。实例包括多相系统，例如胶束、微乳液、含有不溶颗粒的悬浮液、环糊精复合物等。其他实例包括药物分子与蛋白质结合，与聚合物复合的溶液等。在这些情况下，重要的是区分供体C_D中的药物或试剂的总浓度和游离浓度C_D,f。(例如，在药物输送和治疗中，只有游离药物才能在体内分布并产生药理作用。)

实验上，在不存在降解或损失的情况下，可以将C_D计算为添加到供体血管介质中的总药物或试剂除以供体体积。另外，PMD样品中存在的药物量可以通过测定来确定。由此可以确定游离浓度。

脉冲微透析：采样间隔过程中探头外部介质恒定浓度的数学模型

采样间隔

PMD和微透析通常基于以下概念：扩散形式的药物可以在探针外部的介质与探针内部的透析液之间交换。因此，扩散方程式假设药物或其他分子为可扩散形式，这在物理上要求其溶解和游离(即，不是未溶解或沉淀、络合、结合、吸附、或以胶束或微乳状液等形式存在)。处于其溶解和自由扩散形式的任何药物或其他分子也将被称为游离，并且以该形式的药物或其他分子的浓度将被称为游离浓度。当分子在探针外部的供体培养基中时，游离浓度将用C_D,f表示(游离供体浓度)。总供体浓度，以C_D表示，指供体中每体积的药物或其他分子的总量，其中包括游离、未溶解、结合、络合、吸附、胶束和微乳液等。

接下来，将使用表示为f_D的分数因子来关联游离和总供体浓度，其定义为

在本节中，考虑了要从供体中采样的所有或分子溶解且可自由扩散(也称为游离浓度)的情况。在此，溶解和自由扩散(或自由)将被认为是指药物或其他分子溶解在供体介质中并在分子上分散(或几乎分散)。因此，它不会沉淀(未溶解)，不会与蛋白质或其他络合剂结合，不会混入微胶粒或微乳液等。因此，分子可以自由扩散穿过组成探针窗口壁(如下定义)的透析膜，并且因此如下所述，可以在探针外部的供体介质和探针内部的透析液介质之间移动。

原型微透析装置如图1(A)-图1(B)所示，其示出了由恒定内半径为a，长度为L和体积为V_W的高渗透性管制成的探针窗口。在最一般的情况下，微透析可以在圆柱坐标系中描述为药物的传输，它是通过径向上的被动扩散和轴向上的对流加被动扩散的组合而发生的。这在数学上写成

在此，C是在给定位置和时间的探针内部的透析液浓度，D是药物在透析液中的扩散系数，V_z是轴向速度，通常是r的函数，但通常 (即对于CFMD)相对于时间保持恒定。在方程(3)的右侧，第一项代表对流的影响，而第二项和第三项分别代表轴向和径向扩散的贡献。对于PMD，方程(3)可以简化如下：

当透析液在探针中静止时，V_z＝0，对流项可以忽略。

透析液可以快速、完全地移入和移出探针窗口。因此，对于透析液样品的任何部分的暴露时间(在探针窗口内花费的时间，以及可能扩散到探针内或从探针外扩散的时间)是很明确的。

样品的暴露时间应选择足够短的时间以忽略轴向扩散。根据变量分离理论，对于半径为a的管，径向扩散均衡方法的松弛时间特性为～a²/D(Carslaw and Jaeger,Conduction of Heat in Solids,Clarendon Press,Oxford,1985)。根据随机游走理论，在时间间隔t内分子扩散所经过的平均距离为

(Reichl,A Modern Course inStatistical Physics,U. Texas Press,Austin,1980,Chapter 6)。当曝光时间与弛豫时间相当时，由于扩散而传播的平均轴向距离为-a。由于微透析探针的a<<L，轴向扩散对样品中的质量平衡影响可忽略不计。

即使在冲洗透析液时，流动样品的暴露时间也足够短，因此轴向梯度没有时间形成，并且

可以忽略不计。

结果，上述方程简化为：

(4)

方程(4)是一个偏微分方程，需要一个初始条件和两个边界条件才能完全求解。初始条件是透析液进入微透析管的探针区域时，最初没有药物(或其他要分离的物质)。边界条件是部分出于以下考虑而获得的：

在每个采样周期内，探头外部介质中的浓度是恒定的(或近似恒定)。

微透析探针中各处的药物浓度都是有限的。

透析管壁非常薄且具有高渗透性，因此可以很快建立壁中的伪稳态。因此，药物从供体进入透析液的流量与跨探针窗口壁的浓度差成比例。比例因子是探针窗口的渗透率P，假定保持不变。渗透率由方程定义

其中dM/dt是药物穿过探针窗口壁的速率，A是探针窗口的面积， C_Donor-C_Receiver是整个膜上的浓度差(即内部两种液体介质中的浓度差和膜的外表面)。

下面将考虑两种情况。第一种情况是供体是探针外部的介质，而透析液会从供体中积聚药物。第二种情况是透析液是供体，并向探针周围的介质损失药物。

供体介质在探针外面

当探针外部的介质是供体时，则C_D,f对应于探针外部的游离浓度， C_R是r＝a附近透析液中的浓度。在这种情况下，边界条件和初始条件在数学上写为

初始条件C(r,0)＝0 t＝0 (6)

边界条件C(0,t)＝finite r＝0

使用变量分离方法，可以求解方程(4)和(6)，以给出给定半径的透析液体积元素中的浓度为

在这里，t是给定体积的透析液在探测窗口中的时间长度(曝露时间)，J₀和J₁分别是第一类零阶和一阶贝塞尔函数(Carslaw and Jaeger,op. cit.；OZisik,BoundaryValue Problems of Heat Conduction,Dover Publications,New York,1989)，β_n是方程的根

(8)β_nJ₁(β_n)-λJ₀(β_n)＝0

其中，

(9)

在文献中已将各种值λ和n的β_n值制成表格((Crank,The Mathematics ofDiffusion,Clarendon Press,Oxford,1975),并且还可以使用电子表格(例如

)随附的非线性求解器，根据方程(8)进行计算。对于此处使用的探针，可以假设药物未分配到探针材料中，因此仅通过孔渗透探针窗口壁。如果供体和受体介质相似，则可将孔介质与供体或透析液之间的分配系数统一。因此，分别用ε，h和τ表示探针窗口的孔隙率、厚度(外半径和内半径之差)和曲折度，窗口的渗透率由下式给出：

(10)

可以与方程(9)组合以得出

(11)

因此，对于这些探针，λ取决于探针窗口的性质，而不取决于药物或溶剂的性质。但是，这是方程(9)的一种特殊情况。如果对探针进行了涂层或修饰，则λ不仅取决于探针的几何特性，而且还取决于药物与探针之间的材料相互作用，必须使用方程(9)。

在给定的暴露时间后，通过对样品体积中的浓度进行积分，可以求出在给定的暴露时间后，透析液在探针窗口中收集的药物总量。由于质量平衡中忽略了轴向依赖性，因此在体积V的样品中曝露时间为 t的质量，可以从下面求出，

并非收集到的透析液样品的所有部分都将在相同的时间内暴露于供体，因此必须考虑两个部分。样品的一部分(称为连续部分)不停地流过探针窗口。另一部分(称为脉冲部分)被泵入窗口，使其在静置时间t_R内保持静止，然后泵出。对于连续部分，透析液暴露时间只是某种流体元素通过探针窗口所需的转移时间。脉冲部分的曝露时间 t_P是静置时间和转移时间的总和。这些分别由下式给出并非收集到的透析液样品的所有部分都将在相同的时间内暴露于供体，因此必须考虑两个部分。样品的一部分(称为连续部分)不停地流过探针窗口。另一部分(称为脉冲部分)被泵入窗口，使其在静置时间t_R内保持静止，然后泵出。对于连续部分，透析液暴露时间只是某种流体元素通过探针窗口所需的转移时间。脉冲部分的曝露时间t_P是静置时间和转移时间的总和。这些分别由下式给出，

其中Q是冲洗的流量(每时间的体积)。因此，对于体积为Vs 的样本，脉冲部分在总曝露时间t_P内具有体积V_W累积质量M_P，而连续部分在暴露时间t_Q的体积为Vs-V_W，累积质量M_Q。通过在方程(7) 中设置t＝t_P，在方程(12)中进行积分，然后乘以探测窗口的长度V_W/ πa²可以求M_P。可以通过在方程(7)中将t＝t_Q设置，在方程(12)中进行积分并乘以长度(Vs-V_W)/πa²来求M_Q。收集的样品中药物M的总质量为

M＝M_P+M_Q (14)

其中，

常数γ_n和δ_n由下式给出，

其中

(应注意，这种形式的γ_n仅适用于透析液解决方案。对于微乳液等两相系统，γ_n的形式可能会发生变化，但在随后的方程式中使用γ_n的方式应保持不变。)

当外部介质中的浓度恒定或近似为恒定时，方程式(1)中定义的样品中的部分回收率可以用样品中的质量和样品体积表示为

M₁＝V_SC_S

同样，样品的脉冲部分(F_RP)和连续部分(F_RQ)的部分回收率定义为，

样品中的总质量可以写成

M_S＝V_WC_D，fF_RP+(V_S-V_W)C_D，fF_RQ (23)

由于M与游离供体浓度C_D，f成正比，所以与C_D和Cs相关的线性校准图可以根据方程(1)构建。也可以将方程(23)重写为，

(24)

对于恒定的流量，F_RQ对应于CFMD的部分回收率，当t_P＝t_Q(等价的，t_R＝0)时，从方程(21)，(22)和(24)可以看出。这提供了根据以下条件从F_R数据获取F_RQ的过程：

实际上，这可以通过使用非线性回归对经验函数拟合F_R VS.t_R，将函数的值设为t_R＝0来完成。由于以上理论预测F_R随曝露时间呈指数变化，因此使用以下方程式：

(26)F_R＝a₁exp(-b₁t_R)+a₂exp(-b₂t_R)+a₃

(27)F_RQ＝a₁+a₂+a₃

由于F_R和F_RQ可以通过实验确定(分别参见方程(1)和示例1)，因此可以从方程(24)获得任何曝露时间t_P的F_RP。然而，这需要准确地知道窗口体积V_W。实际上，当首次使用探针时，需要对其进行校准以确定V_W，然后才能在使用该探针的任何后续实验中计算F_RP。(应注意，使用制造商的质量标准或光学测量结果简单地计算出的V_W值对于此处介绍的许多分析而言不够准确。因此，最好使用F_RP已知值的常数静置时间将F_R与1/V_S作图来测量V_W。下文对此进行了更全面的讨论。)

在上面的方程中，平衡的方法的特征是无限级数中的指数瞬态项。对于λ和n的所有值，δ_n和指数项都在0和1之间，并且随着暴露时间的增加，两者都趋于零。使用本研究中使用的透析探针的典型值 (a～100-150μ，h＝8-12μ，ε<0.05)和典型曲折度值(τ>1.5-2)，方程 (11)表明0<λ<0.5。对于此λ范围，数值计算结果表明δ₁>0.99并且δ₂/δ₁<0.005。因此，忽略n>1项引入的误差可忽略不计(小于0.1-0.5％)，因此方程(21)和(22)可以写为

(28)

(29)

(30)ln(1-F_RP)＝lnδ₁-γ₁t_P

其中

(31)

(32)

其中

(33)β₁J₁(β₁)-λJ₀(β₁)＝0

F_RP由式(24)决定。

从理论上讲，ln(1-F_RP)与t_P的关系图可用于确定γ₁和δ₁(然后可在方程(8)和(18)中使用它们找到λ)。得到γ₁的情况如此，因为较小的实验误差将对斜率的影响最小。但是，截距通常接近零，因为δ₁接近于1，因此实验错误可能会导致截距中出现明显的相对误差。由于值为δ₁的较小误差会导致相应λ的较大误差，因此可以近似得出

δ₁＝1neglectn＞1terms (34)

P_RP＝1-exp(-γ₁t_P) (35)

F_RP＝1-exp(-γ₁t_Q) (36)

由于将δ₁设为1，因此仅从方程(35)的图获得γ₁。但是，为了准确地获得F_RP并避免γ₁值可能出现实质性误差，必须准确知道窗体积V_W。(确定V_W的方法如下所示。)也可以使用另一种方法获得γ₁，该方法由下面的方程(47)给出。

探针窗口壁的渗透系数也可以使用PMD计算。根据方程(13)， (28)和(34)，样品脉冲部分的质量由下式给出

M_P＝V_WC_DF_RP＝V_WC_D[1-exp(-γ₁t_Q)exp(-γ₁t_R)]

使用方程(14)并注意，当以相同方式采集所有样品时，M_Q是恒定的，下式给出了药物进入透析液的吸收率：

使用方程(29)得出

如果t_R＝0，可以写成

与供体浓度C_D(此处对应于外部溶液中的浓度)相比，在很早的时候(t_R接近零)，接收器浓度C_R(此处对应于探针膜附近的透析液浓度)可以忽略不计，方程(5)可以简化为

此处，A是探针窗口的面积，可以从V_w和窗口L的长度(易于测量)获得。结合方程(37)和(38)可得出

可以如下进行改进。在t_P＝0极限下的dM/dt值可以通过对曲线进行最佳拟合从M与t_R的关系图上以图形方式获得并外推到t_R＝-t_Q。这将对应于F_RQ＝0和C_R＝0。因此，方程(38)将完全成立，方程(37) 将写为

(39)

结果，渗透率将给出为

(40)

根据以上，可以求出药物在透析液介质中的扩散系数D。方程(8)， (9)和(17)导出

(41)

(42)

(43)

已知P，a和γ₁允许从方程(43)计算β₁，然后允许从方程(42) 计算D，并且从方程(9)或方程(41)计算λ。

如上所述，必须准确知道探针窗口的体积才能获得F_RP的准确值。由于光学测量和使用制造商的名义规格不够准确，因此开发了此处介绍的方法来更准确地确定V_W.

如果在PMD实验中使用了较长的静置时间，则停留在探针窗口和探针外部介质中的透析液浓度将达到平衡，因此

(44)F_RP→1 long t_R

方程(24)变为

(45)

F_R vs.1/V_s的图将给出F_RQ的截距和V_W(1-F_RQ)的斜率，这将允许计算V_W。(F_RQ也可以独立于CFMD数据进行测量。)此方法的一种不需要长时间静置的方法是在一定的静置时间范围内获得F_R vs.1/V_s的矩阵，并对矩阵非线性回归。但是，使用方程式(45)的首选方法是首选，因为它避免了与非线性回归相关的潜在数值问题。

另一个避免长时间静置需求的变化如下。如果以相同方式采集所有样本，则V_s和F_RQ为常数，并且V不变。因此，将方程(24)重写为

取导数给出

将其与方程(28)结合并近似为δ₁＝1，其对微透析探针有效，可得出

该导数始终为正，取自然对数可得出

(47)

(48)

其中，k′是常数。根据方程(47)中导数的自然对数与静置时间的关系图，可以从斜率获得γ₁，从截距获得V_W。但是，应注意，这个方法可以给出好的γ₁结果，但是对于获得V_W不够好。实际上，通过绘制F_R与1/Vs的关系图(在下面的示例1中进行描述)，可以从方程(24) 最好地获得V_W。然后在通过取方程(47)的斜率获得γ₁时使用，但要满足截距k′与从方程(24)的图获得的V_W值一致的约束。这很容易在 Microsoft Excel(R)(使用规划求解功能)和其他程序中完成。

应当指出，方程(47)提供了一种从log(dF_R/dt_R)vs.t_R或t_P的斜率确定参数γ₁的替代方法(当t_Q恒定时，t_P＝t_R+t_Q导致dt_P＝d t_R)。在实践中，此方法效果很好。通常通过将F_Rvs.t_R数据拟合到经验函数 (通常是双指数加常数)，然后对导数进行解析，然后绘制导数对t_R的对数来完成。

当药物或其他分子不是完全游离时，C_D,f<C_D和f_D<1。这带来了一个问题，因为通过测定已知C_S，并且从实验设置中已知C_D(每供体体积添加的总药物)，但是游离药物浓度(因此，f_D)未知。因此，对于多相系统，只能指定表观回收率，表示为F_R ^App，定义为

F_R ^App是实验确定的数量，但它不直接表示系统的机械扩散行为，因为它基于总供体浓度，而仅表示供体中的游离药物扩散到探针中。与扩散机理有关的量是C_S与游离供体浓度之比。这称为真实的部分回收率，再次用F_R表示，并定义为

根据等式(3)和(49)，表观和真实回收率关系为

F_R ^APP＝f_DF_R (51)

由于0<f_D≦1，F_R ^App≦F_R当所有药物均为游离药物时，游离和总供体浓度相同，因此f_D＝1表观和真实回收率相同(F_R ^App＝F_R)

上面的概括导致

该方程式用于数据拟合。为此，将F_R ^App通过曝露或静置时间，以及F_R ^App＝f_DF_R的轮廓确定(以类似于关于方程式讨论的方式的轮廓，除了拟合在这里使用三个参数γ₁、F_RQ和f_D)。

重要的是要注意，f_D表示供体中游离药物浓度与总药物浓度的比率。可以从f_D计算自由质量分数。

数值程序

上面的等式的实现在下面描述并在实施例中说明。根据公式(53)，可以仅使用f_D和γ₁进行拟合，然后根据λ和V_W的校准值计算所有其他参数(γ_n，β_n，F_RQ)。(用于这种校准的方法在2009年7月21日提交的共同未决的美国专利申请序列号12/460,606中进行了讨论，其公开内容通过引用结合在本文中。)但是，使用三参数拟合并对f_D、γ₁和F_RQ进行迭代，可以获得更好的结果，这是实践中使用的方法。另外，出现两种情况：1)探针的特性(例如，探针窗壁的渗透性)不变。当游离浓度远低于药物或其他试剂的溶解度时，就会发生这种情况。2) 探针的特性(例如，探针窗口壁的渗透性)发生变化。当药物或其他药物的浓度接近或高于其溶解度时，会发生这种情况，从而导致药物或药物在药物治疗剂的孔中沉淀。这会降低渗透率并改变λ的值。

在第一种情况下，使用λ和V_W的校准值，并通过迭代f_D、γ₁和 F_RQ来完成F_R ^App与t_P的非线性回归。在第二种情况下，使用了V_W的校准值，但假设λ发生了变化。结果，通过迭代λ、f_D、γ₁和F_RQ完成F_R ^App与t_P的非线性回归。受制于药物或试剂的扩散系数D，例如根据等式(53)、(8)或(31)计算的系数或等效值等于先前确定的值。(换句话说，D在给定温度下在透析液中是恒定的，并且不依赖于λ。)

例1

测定高于CMC(临界胶束浓度)的布洛芬和Tween 40的供体的游离布洛芬浓度

可以使用CFMD数据直接测量F_RQ，或者使用PMD数据获得此参数。在此应用中，供体在探针外部，其浓度取恒定值(因此，F_RQ定义明确)。

使用PMD确定F_RQ的方法的示例如下：

a)将预先校准的探针(对于λ和V_W，如2006年10月31日提交的专利申请序列号1/591,083中给出，其公开内容通过引用并入本文) 浸入液体供体介质，探针外包含已知总浓度布洛芬(扩散剂)和吐温 40(非离子表面活性剂)。外部溶液的体积应足够大(至少～25mL)，以使药物转移至透析液中不会改变外部介质的浓度。

b)将新鲜的透析液(即不含药物)泵入探针窗口。透析液应与外部介质使用相同的液体。流速Q最好较高(至少～100μL/min)，以便F_RQ远小于1。

c)允许透析液静置探头一段已知的时间t_R。

d)用相同的流速Q冲洗并收集已知的透析液样品体积Vs。Vs必须足以收集窗口中所有静止的透析液。

e)进行适当的测定(HPLC等)以确定透析液样品中药物的浓度和量，并根据公式(49)计算F_R ^APP。

f)使用相同的样品体积和流速重复步骤b)至e)，但至少一个(最好至少4个)不同的静置时间。

g)通过方程(53)给出的函数拟合F_R ^APP与t_p，迭代f_D、γ₁和F_RQ。

h)使用公式(3)计算游离布洛芬浓度。

例2

对达到或超过供体培养基中的药物溶解度的布洛芬纳米颗粒溶解过程中布洛芬的溶解(游离)浓度测定

该参数λ表征跨探针窗口的传输以及该传输如何影响透析液中试剂的浓度。λ优选为0-10，更优选为0-3，再更优选为<0.3。

在PMD实验期间λ可能发生变化的情况下，确定参数f_D的示例方法如下：

a)在低pH值(例如，pH＝2，远低于布洛芬的pK_a值～4.5)下制备缓冲水溶液。浸入其窗口体积V_W通过校准已知的PMD探头。

b)在连续搅拌的同时，以足以接近或超过药物在缓冲溶液中的溶解度的量添加一定量的未溶解的布洛芬纳米颗粒(这可能导致药物在微透析探针的孔中沉淀，从而改变λ和P)。这将是供体溶液。

c)将新鲜的透析液(即不含药物)泵入探针窗口。透析液应与外部介质使用相同的液体。流速Q最好较高(至少～100μL/min)，以使F_RQ远小于1。

d)允许透析液静置探头一段已知的时间t_R。

e)冲洗并以相同的流量Q收集透析液的已知样品体积Vs。Vs必须足以收集窗口中所有静止的透析液。

f)进行适当的测定(HPLC等)以确定透析液样品中药物的浓度和量，然后根据公式(49)计算F_R ^APP。

g)使用相同的样品体积和流速重复步骤b)至e)，但在此示例中，至少需要三个(最好是至少四个)不同的静止时间。

h)通过公式(53)给出的函数拟合F_R ^APP与t_p的关系图，并使用公式(8)和(31)进行迭代λ、f_D、γ₁和F_RQ，其受制于从等式(9) 或(31)计算出的D的值等于先前确定的值的约束。(例如，可参考 US 11/591,083)。

i)使用方程(3)计算溶解(游离)浓度。

Claims (4)

1.一种测定药剂的可扩散浓度或游离浓度的系统，所述药剂在探针性质可能发生变化的介质中，其特征在于，所述系统包括：

一探针(11)，其窗口体积V_w和内半径α是已知的，但λ的值可以改变，包括相对于任何材料的相对高渗透性的膜的一部分，该膜被附着以支撑并定位在进入透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，用于将所述探针与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，用于以特定的流速Q将已知量的透析液，灌注到探针的相对高渗透性部分中，其中所述的透析液的扩散剂的扩散系数D是已知的；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用于以单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，用于计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的λ，f_D，F_RQ和γ1的值，受限于透析液中可扩散剂的扩散系数等于其已知值；以及

计算供体中的游离浓度为C_D,f＝f_DC_D。

2.一种确定可扩散剂的渗透性的系统，可扩散剂的渗透性指的是在探针的性质可能改变的介质中可扩散剂通过探针壁的渗透性，其特征在于，所述系统包括：

一探针(11)，该探针(11)包括相对于任何材料的相对高渗透性的膜的一部分，其中窗口体积V_W和内半径α是已知的，但是值可以改变，膜被附着以支撑并定位在透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，将所述探针(11)与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，以规定的流速Q将已知量的透析液，灌注到探针的相对高渗透性部分中，其中所述的透析液的扩散剂的扩散系数D是已知的；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述可扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的λ，f_D，F_RQ和γ₁的值，受限于透析液中可扩散剂的扩散系数等于其已知值；以及通过探针壁药剂作为供体中的自由浓度计算其渗透系数，P＝λD/α。

3.一种测定药剂的可扩散浓度或自由浓度变化率的系统，所述药剂在介质中，其特征在于，所述系统包括：

一探针(11)，其窗口体积V_W和内半径α和参数λ是已知的，包括相对于任何材料相对高度可渗透的膜的一部分，该膜附接到所述材料以用于支撑并且定位在透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，用于将所述探针(11)与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，用于以指定的流速Q将已知量的透析液灌注到该探针(11)的相对高渗透部分；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述可扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，用于计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的f_D，F_RQ和γ₁的值；计算供体中的游离浓度为C_D,f＝f_DC_D；以及绘制C_D,f与时间的关系。

4.一种测定药剂的可扩散浓度或自由浓度变化率的系统，所述药剂在探针性质可能发生变化的介质中，其特征在于，所述系统包括：

一探针(11)，其窗口体积V_W和内半径α是已知的，但λ的值可以改变，包括相对于任何材料相对高度可渗透的膜的一部分，该膜被附着以支撑并定位在透析液源的一入口和容器的一出口之间，扩散剂通过该膜转移；

一接触元件(12)，连接该探针(11)，将所述探针(11)与所述介质接触；

一灌注元件(13)，连接该探针(11)，以规定的流速Q将已知量的透析液，其扩散剂的扩散系数D是已知的，灌注到该探针(11)的相对高渗透性部分中；以及允许所述已知量的透析液在指定的静置时间t_R内保持静置；

一冲洗元件(14)，连接该探针(11)，用单脉冲冲洗掉所述已知量的透析液，以与该灌注元件(13)中使用的相同流速将已知体积V_S的透析液样品收集到所述容器中；

一测定元件(15)，连接该探针(11)，用于确定所述透析液中所述可扩散剂的浓度；

一第一计算模块(16)，计算表观回收率F_R ^App；

一控制模块(17)，以相同的流速、样品体积和至少有一个不同的静置时间重复该灌注元件(13)、该冲洗元件(14)、该测定元件(15)、和该第一计算模块(16)的作动；

一第二计算模块(18)，使用选定的样品体积和来自F_R ^App与暴露时间的流速确定该探针(11)的λ，f_D，F_RQ和γ₁的值，受限于透析液中可扩散剂的扩散系数等于其已知值；计算供体中的游离浓度为C_D,f＝f_DC_D；以及绘制C_D,f与时间的关系。

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