CN205333649U - 猪圆环病毒抗体检测卡 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种猪圆环病毒抗体检测卡，包括装配在外壳内的检测卡本体，所述检测卡本体包括底板，在底板上依次设置样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上包被猪圆环抗原为检测线，包被羊抗鸡抗体为质控线，在外壳上对应样品垫开设加样孔，对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线开设视窗孔。本实用新型灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，可实现猪圆环病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种检测卡，特别是涉及一种用于快速定量检测猪血清中猪圆环病毒抗体的检测卡。
背景技术
猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）是20世纪90年代，世界范围内人们在病猪及一些无明显临床症状猪体内检测到了一种新型猪小环状样病毒（Allan和Ellis，2000）。该病毒与已知的由PK-15细胞培养污染而分离的PCV不同，有人建议将原来的PCV命名为圆环病毒Ⅰ型（PCV-1），将新出现的与临床疾病相关的PCV命名为圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）。PCV-2感染后会出现断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PNDS）、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍综合征等。现在把由PCV2引起的多种病症均叫“猪圆环病毒病”。PCV2中，PMWS对养猪业造成的危害最为严重，它主要引起猪渐进性消瘦、腹泻、呼吸道症状、皮肤苍白或出现黄疸、生产性能降低。另外PCV2还侵害猪的免疫系统，抑制猪的免疫功能，还能与猪蓝耳病、流感、支原体肺炎、副猪嗜血杆菌和链球菌等疫病病原相互作用，加重这些病的危害。给养猪业造成巨大的经济损失。
疫苗免疫是我国猪圆环防控的主要手段，采集免疫后猪血清，并检测血清中猪圆环2病毒抗体的效价是监控猪圆环的主要方法，也就是评价猪圆环疫苗免疫效果、免疫程序和监控猪圆环病毒的抵抗能力，也是适时注射疫苗的主要依据。
市面上有猪圆环病毒抗体胶体金快速检测卡，通过对样品的检测，即可粗略判断猪体内是猪圆环抗体含量，兽医根据检测结果判断是否需要注射猪圆环疫苗。
同样市场上也大量使用检测猪圆环病毒抗体酶标试剂盒，即ELISA酶标试剂盒，ELISA试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员，另外检测样本还需要需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。而本专利猪圆环抗体试剂盒就克服了以上两类试剂盒的各自缺点，操作简单，实现现场、快速、准确、高灵敏地定量（半定量）检测。
实用新型内容
本实用新型的目的就是提供一种猪圆环病毒抗体检测卡，能完全解决上述现有技术的不足之处。
本实用新型的目的通过下述技术方案来实现：
一种猪圆环病毒抗体检测卡，包括装配在外壳内的检测卡本体，所述检测卡本体包括底板，在底板上从左至右依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，且样品垫的右端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水纸左端搭在硝酸纤维素膜的右端上，所述标记垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，所述检测微球和质控微球均为表面带有羟基或氨基的硅胶微球或聚苯乙烯微球，所述硝酸纤维素膜上包被猪圆环抗原为检测线，包被羊抗鸡抗体为质控线，在外壳上对应样品垫开设加样孔，对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线开设视窗孔。
作为优选，所述检测微球为标记有猪圆环抗原的微球，质控微球为标记有鸡lgY或兔lgG的质控微球。
作为优选，所述硝酸纤维素膜上的检测线和标记垫上采用的猪圆环抗原均为灭活猪圆环病毒抗原、猪圆环疫苗、猪圆环病毒衣壳蛋白PCV2-Cap或猪圆环病毒2多肽；所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗体为羊抗鸡lgY的lgG或者羊抗兔lgG。
作为优选，所述标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光是指镧系元素Eu、Sm或Tb与β－二酮配基产生的荧光。其发光效率高、吸收光谱宽、发射光谱很窄、斯特克斯位移宽，使其荧光光谱分析的灵敏度很高。
作为优选，所述样品垫为检测血清或血浆的样品垫，或者为检测全血的样品垫。
作为优选，本检测卡利用猪血样品中猪圆环病毒抗体、猪圆环病毒抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被猪圆环病毒抗原通过双抗原夹心法来检测猪血样本中猪圆环病毒抗体。
作为优选，本检测卡为定量层析检测卡，它是通过检测仪检测层析后检测卡的检测线和质控线发出的荧光信号，然后根据此批检测卡的IC卡储存的标准曲线，再由检测线和质控线的荧光信号从标准曲线计算出待检物的浓度。
名词解释：
羊抗鸡lgY的lgG：羊抗鸡lgY的免疫球蛋白G；
羊抗兔lgG：羊抗兔lgG的免疫球蛋白G；
鸡lgY：鸡卵黄抗体；
兔lgG：兔免疫球蛋白G；
抗猪RBC：抗猪红细胞表面蛋白抗体。
与现有技术相比，本实用新型的有益效果在于：灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，既可检测全血样本，也可以检测血清和血浆样本，与PRRSV（猪生殖与呼吸综合征病毒）、CSFV猪瘟病毒、PPV（猪细小病毒）、PRV（猪轮状病毒）等抗体没有交叉反应。可实现猪圆环病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值。
附图说明
图1是本实用新型的结构示意图；
图2是图1中检测卡本体的结构示意图；
图3是图2的俯视图；
图4是猪圆环病毒抗体检测标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步的说明。
如图1至图4所示，一种猪圆环病毒抗体检测卡，包括装配在外壳10内的检测卡本体，所述检测卡本体包括PVC底板1，在PVC底板1上从左至右依次粘贴样品垫2、标记垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，且样品垫2的右端搭在标记垫3的左端上，标记垫3的右端搭在硝酸纤维素膜4的左端上，吸水纸5左端搭在硝酸纤维素膜4的右端上。所述硝酸纤维素膜4上包被猪圆环抗原为检测线6，包被羊抗鸡抗体为质控线7。在外壳10上对应样品垫2开设加样孔11，对应硝酸纤维素膜4上的检测线6和质控线7开设视窗孔12。
所述硝酸纤维素膜4上质控线4采用的羊抗鸡抗体为羊抗鸡lgY的lgG或者羊抗兔lgG。
所述标记垫3由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，且检测微球为标记有猪圆环抗原的微球，质控微球为标记有鸡lgY或兔lgG的质控微球。所述检测微球和质控微球均为表面带有羟基或氨基的硅胶微球或聚苯乙烯微球。并且，检测微球和质控微球的粒径均为50～500nm。
所述硝酸纤维素膜4上的检测线6和标记垫3上采用的猪圆环抗原均为灭活猪圆环病毒2抗原、猪圆环疫苗、猪圆环病毒衣壳蛋白PCV2-Cap或猪圆环2多肽。
所述样品垫2为检测血清或血浆的样品垫，或者为检测全血的样品垫。检测全血的样品垫可以为滤血膜或加入有抗猪RBC的样品垫。
所述猪血样品中猪圆环病毒抗体、猪圆环病毒抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被猪圆环病毒抗原是通过双抗原夹心法来检测猪血样本中猪圆环病毒抗体。
标记垫3上喷的镧系荧光微球，其镧系荧光是指镧系元素与β－二酮配基产生的荧光，标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光物质是指镧系元素Eu、Sm和Tb与β－二酮配基产生的荧光。采用检测仪检测镧系元素与配合物的独特荧光光谱特性。
制备存储有猪圆环病毒抗体检测标准曲线的IC卡：配置含有猪圆环病毒抗体的校准液6份，浓度分别为0、5、15、45、100、200ng/ml。将上述不同浓度的校准液分别加入装配好的检测卡的加样孔内，层析15分钟后，通过检测仪进行检测，将6次得到的检测结果线性回归得到标准曲线，最后将此曲线数据存入IC卡中。每一批检测卡需要对应配置一个IC卡。
该检测卡的使用方法：将待检样品（以血浆为例）与样品稀释液按1:40比例稀释，将稀释好的样本80ul加入加样孔11中，在吸水纸5的作用下，样本从样品垫2向吸水纸5方向移动。在避免强光照射的情况下层析15min，然后用检测仪对检测卡进行检测，检测仪获取检测线6和质控线7的荧光信号，并与此批检测卡的IC卡中储存的标准曲线进行对比，通过标准曲线计算出待检样本的浓度，参见图4的标准曲线。
上述检测卡的制备方法如下：
步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.3mg/ml的羊抗鸡lgY的lgG形成质控线和已稀释至0.5mg/ml的猪圆环病毒2重组结构蛋白形成检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
步骤二，用封闭液（该封闭液的组成为5g/L的BSA（牛血清白蛋白）、质量浓度1%的PVA（聚乙烯醇），pH7.5的10mM的磷酸盐缓冲液）封闭硝酸纤维素膜30分钟，用10mM磷酸缓冲液清洗硝酸纤维素膜30分钟，干燥2小时后备用；
步骤三，制备标记有鸡lgY的镧系荧光微球和标记有猪圆环病毒2重组抗原的镧系荧光微球，将50mg的镧系荧光微球加入到50mg的MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液（0.1M，pH7.0）中，再加入10mg碳二亚胺（EDC）和10mgN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液（pH8.2）复溶，加入2mg透析过的鸡lgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存（保存环境温度为2～8℃），即得标记有鸡lgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记猪圆环病毒2重组抗原的镧系荧光微球；
步骤四，把标记有鸡lgY和标记有猪圆环病毒2重组抗原的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
步骤五，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本猪圆环病毒抗体检测卡。
以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种猪圆环病毒抗体检测卡，包括装配在外壳内的检测卡本体，其特征在于：所述检测卡本体包括底板，在底板上从左至右依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，且样品垫的右端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水纸左端搭在硝酸纤维素膜的右端上，所述标记垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，所述检测微球和质控微球均为表面带有羟基或氨基的硅胶微球或聚苯乙烯微球，所述硝酸纤维素膜上包被猪圆环抗原为检测线，包被羊抗鸡抗体为质控线，在外壳上对应样品垫开设加样孔，对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线开设视窗孔。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒抗体检测卡，其特征在于：所述检测微球为标记有猪圆环抗原的微球，质控微球为标记有鸡lgY或兔lgG的质控微球。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒抗体检测卡，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上的检测线和标记垫上采用的猪圆环抗原均为灭活猪圆环病毒抗原、猪圆环疫苗、猪圆环病毒衣壳蛋白PCV2-Cap或猪圆环病毒2多肽；所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗体为羊抗鸡lgY的lgG或者羊抗兔lgG。
4.根据权利要求2所述的猪圆环病毒抗体检测卡，其特征在于：所述标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光是指镧系元素Eu、Sm或Tb与β－二酮配基产生的荧光。
5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒抗体检测卡，其特征在于：所述样品垫为检测血清或血浆的样品垫，或者为检测全血的样品垫。
6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒抗体检测卡，其特征在于：本检测卡利用猪血样品中猪圆环病毒抗体、猪圆环病毒抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被猪圆环病毒抗原通过双抗原夹心法来检测猪血样本中猪圆环病毒抗体。
7.根据权利要求1所述的猪圆环病毒抗体检测卡，其特征在于：本检测卡为定量层析检测卡，它是通过检测仪检测层析后检测卡的检测线和质控线发出的荧光信号，然后根据此批检测卡的IC卡储存的标准曲线，再由检测线和质控线的荧光信号从标准曲线计算出待检物的浓度。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of utility model: Porcine circovirus antibody detection card and preparation method thereof Effective date of registration: 20171018 Granted publication date: 20160622 Pledgee: Tonglu Zhejiang rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: CHENGDU WEIRUI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: 2017330000124 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230515 Granted publication date: 20160622 Pledgee: Tonglu Zhejiang rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: CHENGDU WEIRUI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: 2017330000124 |
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