CN204356318U - 三维微流体装置 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于以高准确度和高效率进行平行的一个或多个微流体反应的装置。该微流体反应可包括化学合成，如核酸分子的合成。提供了用于以高密度进行小体积液体的分隔、组合和混合的方法和装置。本文的方法和装置允许以高密度进行大量的平行反应。

Description

三维微流体装置

技术领域

本实用新型涉及从头的核酸或基因合成，例如通过在此公开的微通道设备的从头的核酸或基因合成。

背景技术

具有高保真度和低成本的高效化学基因合成在生物技术和医学以及基础生物医学研究中发挥核心作用。

从头的基因合成是基础生物学研究和生物技术应用的强大工具。尽管已知用于以小规模合成相对较短片段的各种方法，但这些技术在可扩展性、自动化、速度、精确度和成本方面却不尽人意。需要用于保证对期望基因的成功合成并适于自动化的简单、可重现、可扩展、不易出错并具成本效益的方法的装置。

实用新型内容

如上所述，迫切需要能够以较小的误差快速而高效地合成大基因文库或相对较长的寡核苷酸片段的方法、装置和系统。类似地，还需要能够以微流体规模分隔和混合液体试剂以供并行的大量可单独寻址反应的方法。本发明解决了这些需要，并且还提供了相关优势。

在与如本文所述包围体(enclosures)阵列有关的一些实施方案中，可分辨的(resolved)座位(loci)位于制造到支持表面中的微结构上。在一些实施方案中，该微结构包括彼此流体连通的至少两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包括具有不同宽度的两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包括具有不同长度的两个通道。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个通道长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个通道短于1000μm。在一 些实施方案中，所述通道中的至少一个通道的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个通道的直径窄于100μm。在一些实施方案中，所述微结构包括具有至少0.01μm/μm²的密度的所述至少两个通道的周界的标称弧长。在一些实施方案中，所述微结构包括具有至少0.001μm/μm²的密度的所述至少两个通道的周界的标称弧长。在一些实施方案中，用可释放密封来分隔开可分辨的(resolved)反应器。在一些实施方案中，密封包括毛细管被动阀(burst valve)。

在与如本文所述包围体阵列有关的一些实施方案中，第一衬底(substrate)的多个可分辨的座位包含试剂涂层。在一些实施方案中，第二衬底的多个可分辨的座位包含试剂涂层。在一些实施方案中，所述试剂涂层共价连接至所述第一表面或第二表面。在一些实施方案中，所述试剂涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，所述试剂涂层具有每1.0μm²平面表面积至少1μm²的表面积。在一些实施方案中，所述试剂涂层具有每1.0μm²平面表面积至少1.25um²的表面积。在一些实施方案中，所述试剂涂层具有每1.0μm²平面表面积至少1.45μm²的表面积。在一些实施方案中，所述第一衬底的多个可分辨的座位包含高能表面。在一些实施方案中，第一衬底和第二衬底包括给定液体的不同的表面张力。在一些实施方案中，表面能对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，多个可分辨的座位或反应器帽位于固体衬底上，该固体衬底包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃之中的材料。应当注意，本文所描述的任何实施方案均可与本发明中所提供的任何方法、装置、阵列或系统相组合。

本文在一些实施方案中提供了用于核酸合成的微流体装置，该微流体装置包括基本上为平面的衬底部分，该衬底部分包括位于相对的两个表面之间的n个分组每组m个微流体的连接，其中n*m个微流体连接中的每一个包括第一通道和第二通道，并且其中n个分组中的每个分组的第一通道由所有m个微流体连接所共用，其中所述多个 微流体连接沿着衬底的最小维度跨越所述基本上为平面的衬底部分，并且其中n和m至少为2。在一些实施方案中，用能够促进寡核苷酸向装置附着的涂层来对第二通道进行功能化。在一些实施方案中，该装置还包括第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸附着至n个分组中的k个分组内的第二通道。在一些实施方案中，k为1。在一些实施方案中，该装置还包括第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸附着至n个分组中的L个分组。在一些实施方案中，L为1。在一些实施方案中，L个分组中的所有分组都不在k个分组中。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少为10个核苷酸、25个核苷酸、50个核苷酸、75个核苷酸、100个核苷酸、125个核苷酸、150个核苷酸或200个核苷酸长。 

在一些实施方案中，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸相差至少2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸或10个核苷酸。

在一些实施方案中，n*m个微流体连接至多为5mm、1.5mm、1.0mm或0.5mm长。在一些实施方案中，n个分组中的每一个内的第一通道至多为5mm、1.5mm、1.0mm或0.5mm长。在一些实施方案中，n个分组中的每一个内的第一通道至少为0.05mm、0.75mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm或0.4mm长。在一些实施方案中，n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道至多为0.2mm、0.1mm、0.05mm、0.04mm、或0.03mm长。在一些实施方案中，n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道至少为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm或0.03mm长。在一些实施方案中，n个分组中的每一个内的第一通道的横截面至少为0.01mm、0.025mm、0.05mm或0.075mm。在一些实施方案中，n个分组中的每一个内的第一通道的横截面至多为1mm、0.5mm、0.25mm、0.1mm或0.075mm。在一些实施方案中，n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道的横截面至少为0.001mm、0.05mm、0.01mm、0.015mm或0.02mm。在一些实施方案中，n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道的横截面至多为0.25mm、0.125mm、0.050mm、0.025mm、0.02mm。在一些实施方案中，n*m个微流体连 接中的每一个内的第二通道的横截面标准差小于横截面平均值的25％、20％、15％、10％、5％或1％。在一些实施方案中，n*m个微流体连接的至少90％的第二通道内的横截面变化(variation)至多为25％、20％、15％、10％、5％或1％。

在一些实施方案中，n至少为10、25、50、100、1000或10000。在一些实施方案中，m至少为3、4或5。

在一些实施方案中，该衬底包含至少5％、10％、25％、50％、80％、90％、95％或99％的硅。

在一些实施方案中，n*m个微流体连接的至少90％的第二通道用增大表面能的部分来功能化。在一些实施方案中，表面能增大到与小于75、50、30或20度的水接触角相对应的水平。

在一些实施方案中，n*m个微流体连接的至少90％的第二通道的宽深比(aspect ratio)小于1、0.5或0.3。在一些实施方案中，n个分组中的至少90％的第一通道的宽深比小于0.5、0.3或0.2。

在一些实施方案中，至少10％、25％、50％、75％、90％或95％的所述n*m个微流体连接的总长度处于基本上为平面的衬底的最小维度的10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、500％或1000％以内。

在一些实施方案中，该装置的基本上为平面的部分由SOI晶片制成。

相比于现有技术，本实用新型在诸如微流体和核酸合成的技术领域中，具有许多有益效果。本实用新型能够有效地以较小的误差快速而高效地合成大基因文库或相对较长的寡核苷酸片段。并且，本实用新型能够以微流体规模分隔和混合液体试剂以供并行的大量可单独寻址的反应。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入于此，程度犹如具体地和个别地指出要通过引用而并入每一个 别出版物、专利或专利申请。

附图说明

在所附权利要求书中具体阐述本发明的新颖特征。通过参考对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的以下详细描述和附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解；在附图中：

图1演示了概括基因合成和纳米反应器技术的示例过程。图1A图示了使用喷墨打印机在衬底上合成寡核苷酸的示例过程；图1B图示了可分辨的包围体或纳米反应器中的基因扩增的示例过程。图1C图示了使用多个晶片的示例，该晶片连接用于并行进行寡核苷酸合成和基因组装的微流体反应。图1C所示的基因打印和纳米反应器技术是有利的，因为喷墨DNA打印的通量可能较高而错误率可能较低，并且硅纳米反应器基因组装可以实现精确控制和低试剂用量。

图2A-图2B是演示示例性商业工艺流程的框图。可以跳过对所合成的基因的克隆(图2A)。图2A显示了示例性工艺“流程图-全部校正”，其具有在10kb中少于1个的错误。在图2B中，在运输之前克隆所合成的基因。图2B显示了示例性工艺“仅校正”，其用于1-3kb，质粒，且具有在100kb中少于1个的错误

图3演示了包括用于试剂沉积的打印机(例如，喷墨打印机)、衬底(晶片)在内的用于寡核苷酸合成的系统的示例性略图，概括系统元件在多个方向上的对准的示意图，以及试剂流的示例性设置。

图4图示了内建于衬底中的设计微结构(寡核苷酸晶片反应器)的示例。

图5是演示用于将试剂沉积到图4中所示微结构中的示例性过程的图示。用于表面功能化的选定区域可允许试剂在润湿条件下扩散到较小的功能化孔中。

图6A是进一步示例说明图4中所示微结构的示图。图6B是微结构的各个备选设计的示图。图6C图示了微结构在衬底(晶片)上的布局设计。

图7图示了封盖元件上的反应器帽的示例性布局。

图8是演示基因合成到运输的示例性处理工作流的示图。

图9A示出了在盖板打开或闭合时的示例性流通池的示图。图9B图示了示例性流通池和废物收集器组装件的剖视图。图9C图示了示例性流通池和废物收集器组装件的放大剖视图。

图10A图示了具有单一1-5mm、直径为198mm的沟槽的单槽真空吸盘的示例。图10B图示了衬底(晶片)与真空吸盘之间的烧结金属嵌件，以及并入至接收元件中的可选热控制元件。图10C图示了图10A中所示例说明的单槽真空吸盘(烧结金属吸盘)的剖视图。

图11图示了用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺化学法的示例性应用。

图12图示了具有10个喷墨头的喷墨组装件的示例，所述喷墨头具有硅孔板，该硅孔板具有各自中心相距254μm的256个喷嘴(每个头配置为可以接近每个其所贯穿的孔)，并且具有100μm的飞移高度。

图13A-图13C描绘了包含高密度分组的聚簇(cluster)的不同视图，其中图13A是装置视图，图13B是沿图13A的B-B的剖视图，图13C是处理视图。图13D-图13E描绘了包含基本上为平面的衬底部分的微流体装置的示图的不同视图。图13F描绘了包含基本上为平面的衬底部分的微流体装置的示图的装置视图，所述衬底部分具有108个聚簇和用于标签的指定区域。图13G是显示单个聚簇内的孔位置的装置视图，并且描绘了包含109个分组的聚簇的装置视图。

图14A描绘了纳米反应器的示图的剖面图，其中该视图沿图14B的A-A示出了包含11个孔的一行纳米反应器。图14B描绘了包含108个凸起的孔的纳米反应器的示图的装置视图。详图F描绘了纳米反应器一个孔的详细视图。图14C描绘了图14B中所示纳米反应器示图的成角度的装置视图。图14D描绘了纳米反应器的示图的处理视图。详图H描绘了纳米反应器的处理(handle)侧上的基准标记的详细视图。图14E描绘了包含108个孔和标签的纳米反应器的示图的 装置视图，示出了反应器孔位置。

图15详细图示了差异功能化的示例性寡核苷酸合成装置的设计特征。图15b是图15a的局部放大视图。在图15中，装置为30μm厚，具有20μm的孔穴；氧化物为1μm；处理侧为400μm厚，具有75um的孔穴。

图16图示了图15中的示例性装置的前端制造工艺的工作流程。图16a显示了SOI衬底氧化的过程。图16b显示了装置侧光刻的过程。图16c显示了装置侧深RIE的过程。图16d显示了光致抗蚀剂剥离的过程。图16e显示了处理侧光刻的过程。图16f显示了处理侧深RIE的过程。图16g显示了光致抗蚀剂剥离与BOX刻蚀的过程。图16h显示了氧化/剥离/氧化的过程。

图17图示了用于差异功能化的图15所示示例性寡核苷酸合成装置的后端制造的示例性基线工艺流程。图17a显示了清洗芯片(Piranha+O₂等离子体)的过程。图17b显示了用光致抗蚀剂涂覆芯片的过程。图17c显示了光刻及清除浮渣的过程。图17d显示了(例如用氟硅烷CVD)功能化的过程。图17e显示了光致抗蚀剂剥离的过程。图17f显示了主动功能化的过程。

图18图示了用于核酸合成的、具有受控密度的活性基团的功能化表面。在图18的主动功能化中，通过应用混合硅烷稀释大量被动基团中的羟基的浓度。

图19示出了根据本文所述方法制造的装置的图像。

图20图示了示例性纳米反应器装置的设计细节。(纳米孔芯片结构)

图21图示了图20中所述示例性装置的前端制造的示例性基线工艺流程。图21a显示了衬底氧化的过程。图21b显示了背侧光刻的过程。图21c显示了背侧刻蚀的过程。图21d显示了光致抗蚀剂剥离的过程。图21e显示了前侧光刻的过程。图21f显示了DRIE孔的过程。图21g显示了光致抗蚀剂剥离的过程。图21h显示了氧化物生长/剥离/氧化的过程。

图22图示了用于功能化的图20所示示例性纳米反应器装置的后端制造的示例性基线工艺流程。图22A显示了清洗(湿法+干法)的过程。图22B显示了抗蚀剂沉积的过程。图22C显示了功能化的过程。图22D显示了抗蚀剂剥离的过程。

图23图示了如本文所述制造的纳米反应器装置中的纳米孔。

具体实施方式

贯穿本公开，本发明的各个方面能够以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。相应地，对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的单个数值，除非上下文另有明确规定。例如，诸如从1至6的范围描述应被认为明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的单个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本发明之中，但受制于所声称范围中的任何被明确排除的限值。当所声称范围包括所述限值中之一或全部两者时，排除了这些包括的限值中之一或全部二者的范围也被包括在本发明中，除非上下文另有明确规定。

鉴于以上所述，对出于示例说明目的而示出在图1-图2中的组合物、系统和方法中体现的本发明的附图作出更具体的参考。应当理解，在本发明的各个实施方案中，所述方法、系统和组合物在配置上和单个部分的细节上可能有所不同。此外，所述方法在事件或动作的细节和顺序上可有所不同。在各个实施方案中，主要在随核酸，特别是随DNA寡聚体和多核苷酸一起使用的方面描述本发明。然而应当理解，本发明亦可随多种不同类型的分子一起使用，这些分子包括RNA或其他核酸、肽、蛋白质或所关注的其他分子。这些所关注的较大分子中的每一种的适当结构单元是本领域中已知的。

本发明提供在所关注的分子文库的制备和合成中有用的组合物、 系统和方法，其中所关注的分子包括核酸、多肽、蛋白质及其组合。在各个实施方案中，本发明考虑到使用静态和动态晶片，例如，由硅衬底制成的晶片，用于并行地进行微米级、纳米级或皮米级反应。此外，该晶片可适用于对流体进行微米级、纳米级或皮米级的并行操纵，以便允许连接多个分解体积内的多个反应。流体操纵可包括流动、组合、混合、分馏、液滴生成、加热、冷凝、蒸发、密封、分层、加压、干燥或本领域中已知的任何其他合适的流体操纵。在各个实施方案中，所述晶片提供内建于表面中的、用于流体操纵的结构。在晶片衬底内或贯穿晶片衬底可建构出不同形状和尺寸的特征。在各个实施方案中，本发明的方法和组合物使用在本文中进一步详细举例说明的专门建构的装置用于生物分子的合成。具体而言，本发明提供例如使用标准亚磷酰胺化学法和适当的基因组装技术，通过精确控制诸如时间、剂量和温度等反应条件，对包含较长的高质量寡核苷酸和多聚核苷酸的较大的高密度基因文库的从头合成。

现参考图1C，本发明在各个实施方案中考虑到使用一个或多个静态或动态晶片进行流体操纵。晶片可由如本文进一步描述的多种合适的材料(例如，硅)构建而成。纳米反应器晶片可被配置用于在多个特征中接收和容纳液体。附加的晶片，例如用于原位合成反应的晶片，可与纳米反应器晶片相接触，以便收集和/或混合液体。纳米反应器可从多个附加晶片收集液体。通常，当接触纳米反应器晶片时，纳米反应器与附加晶片上的一个或多个可分辨的座位对准。在接触之前，可在纳米反应器内提供试剂和溶剂。或者，在接触附加晶片之前，纳米反应器可以是空的。在一些实施方案中，纳米反应器收集在DNA合成晶片的一个或多个可分辨的座位中合成的寡核苷酸。这些寡核苷酸可在纳米反应器内组装成更大的基因。在附加晶片的对准和接触后，纳米反应器可通过任何合适的方式密封，例如毛细管被动阀、压力、粘合剂或本领域中已知的任何其他合适的密封手段。密封可以是可释放的。纳米反应器晶片内的反应可在密封的容积中进行，并且可包括例如在PCR或PCA中适用的温度循环。诸如等温扩增之类的等温反 应也在本发明的范围内。DNA合成晶片可配置用于在精确控制下在表面之上或之内的可分辨的座位处进行寡核苷酸的原位合成。可使用喷墨打印头来向合成晶片的可分辨的座位上递送用于合成(例如，标准亚磷酰胺合成)的试剂滴。多个可分辨的座位所共用的其他试剂可以成批地通过这些座位。在一些实施方案中，如本文其他部分所进一步描述，以用于除DNA寡核苷酸之外的分子的原位合成的合成晶片来替代DNA合成晶片。因此，本发明考虑到通过对多个小容积中的反应条件的精确控制来高质量地进行寡核苷酸和长基因的大文库的快速合成。本发明的进一步益处在于，相比于本领域中已知的传统合成方法，减少了试剂用量。

考虑到用于以低错误率进行基因文库的从头合成的各种方法。图2图示了用于并行合成具有长序列的较大的高质量基因文库的本发明方法和组合物的示例性应用。在各个实施方案中，静态和动态晶片实现工艺流程中的多个反应。例如，在通常于DNA合成晶片上原位进行的寡核苷酸合成之后，可以跟随着基因组装反应，诸如经合成的寡核苷酸到更长序列的聚合酶循环组装(PCA)。组装的序列可例如通过PCR而扩增。可以使用本文所述或本领域已知的合适的差错校正反应来将偏离靶序列的组装序列的数目减到最小。可以构建测序文库并可以等分出产物的一部分用于测序，诸如新一代测序(NGS)。

衬底/晶片

在一方面，本文描述通过本文所述的任何方法制成的具有功能化表面的衬底，和在具有功能化表面的衬底上合成寡核苷酸的方法。衬底可包括具有多个可分辨的座位的固体支持体。所述多个可分辨的座位可具有任何几何结构、取向或组构。可分辨的座位可为任何尺度(例如，微米尺度或纳米尺度)，或者含有制造到衬底表面中的微结构。可分辨的座位可定位于具有至少一个维度的微通道上。衬底中的单个可分辨的座位可彼此流体分离，例如，用于合成第一寡核苷酸的第一可分辨的座位可位于衬底的两个表面之间的第一通孔上，而用于合成第二寡核苷酸的第二可分辨的座位可位于衬底的两个表面之间 的第二通孔上，所述第一通孔和第二通孔未在衬底内流体连通，但都始于并终于该衬底的相同的两个表面。在一些情况下，可分辨的座位的微结构可为2D或3D的微通道或微孔。3D微通道可意指该微通道的腔体在固体支持体内互连或延伸。在微通道或微孔内，可存在具有任何几何结构、取向或组构的次级微结构或特征。次级特征的表面可利用能够降低次级特征的表面的表面能的部分进行功能化。用于合成寡核苷酸的试剂小滴可沉积到微通道或微孔中。本文所使用的“微孔”是指能够容纳液体的微流体尺度的结构。在各个实施方案中，微孔允许液体在顶端与底端之间通过每端上的流体开口而流动，因此发挥像微通道那样的作用。在这些背景下，术语“微孔”和“微通道”在整个说明书中可互换使用。

图3图示了包括第一衬底并可选地包括如本文所述的第二衬底的用于寡核苷酸合成的系统的示例。喷墨打印机打印头可在X-Y方向上移动至第一衬底的位置。第二衬底可在Z方向上移动以便与第一衬底密封，从而形成可分辨的反应器。合成的寡核苷酸可从第一衬底递送到第二衬底。在另一方面，本发明还涉及用于寡核苷酸组装的系统。所述用于寡核苷酸组装的系统可包括用于晶片处理的系统。图4图示了根据本发明各个实施方案的衬底布局设计的示例。衬底可包括多个微孔，并且微孔可按均匀间距(例如，1.5mm间距)排列。或者，可在布局的不同方向上挑选多个间距，例如，可由第一间距限定微结构的行，而在每行之内，微结构可隔开第二间距。间距可包括任何合适的尺寸，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5或5mm。微孔可设计成具有任何合适的尺度，例如，如图4中所示例的80μm直径，或者任何合适的直径，包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500μm，并且微孔可连接至多个较小的微孔。所述较小的微孔的表面可在选定区域中得到功能化，从而例如经由高能表面功能化而促进试剂液体流 入。如图4中所示，所述较小的微孔的直径可为大约20μm，或者为任何合适的直径，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80μm。图5图示了当试剂小滴由喷墨打印机沉积到微孔中时的情况。液滴可分散在较小的微孔各处并填充较小的微孔，这在一些情况下通过微孔表面与相邻表面相比的高能表面修饰而得到促进。

衬底的功能化表面可包含任何合适的可分辨的座位密度(例如，适合于以给定的所要合成的不同寡核苷酸总数、给定的合成过程时间量或者给定的每一寡核苷酸、基因或文库的成本来合成寡核苷酸的密度)。在一些实施方案中，表面具有的可分辨的座位密度为每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点。在一些实施方案中，表面具有的可分辨的座位密度为每1mm²至少约50、至少75、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1500、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000或至少约500000个位点。衬底上的可分辨的座位可具有任何不同组构。可分辨的座位可例如但不限于彼此紧密聚集以形成一个或多个圆形区域、矩形区域、椭圆形区域、不规则区域等。在一方面，可分辨的座位紧密堆积并具有低交叉污染量或者无交叉污染量(例如，沉积到一个可分辨的座位中的试剂小滴基本上不会与沉积到另一最靠近的可分辨的座位中的试剂小滴相混合)。可将衬底上的可分辨的座位的组构设计成使得其允 许每个子区域或整个区域被一起覆盖从而创造出密封腔体，其中在所述密封腔体中有受控的湿度、压力或气体含量以使得每个子区域或整个区域可具有与流体相连条件下所允许的相同的湿度、压力或气体含量或基本上相似的湿度、压力或气体含量。在图6中图示了衬底上的可分辨的座位的不同设计的一些示例。例如，图6Ab是图6Aa的截面C的局部放大视图；图6Ac是沿图6Aa的A-A的剖视图；图6Ad是图6Ac的截面B的局部放大视图。例如，图6Bb是被称为孔穴阵列(Array of Holes)的布局设计；图6Bc是被称为花朵(Flowers)的布局设计；图6Bd是被称为瞄准器(Gunsight)的布局设计；并且图6Be是被称为径向花朵(Radial Flower)的布局设计。图6C示例说明了覆盖有位于97.765μm漏板(stencil)上的一系列微孔的衬底的设计。如图6C中所示例说明的微孔聚集成岛。微孔可由来自喷墨头的试剂所填充。

衬底上的每个可分辨的座位可具有本领域中已知的任何形状，或者具有可由本领域中已知的方法制成的任何形状。例如，每个可分辨的座位可具有圆形、矩形、椭圆形或不规则形状的区域。在一些实施方案中，可分辨的座位可为允许液体容易地流过而不产生气泡的形状。在一些实施方案中，可分辨的座位可为圆形，其直径可约为、至少约为或小于约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm或750μm。可分辨的座位可具有单分散尺寸分布，即，所有微结构可具有大致相同的宽度、高度和/长度。或者，可分辨的座位可具有有限数目的形状和/或尺寸，例如，可分辨的座位可表示为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多种不同形状，每种形状具有单分 散尺寸。在一些实施方案中，相同的形状能够以多个单分散尺寸分布(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多个单分散尺寸分布)重复。单分散分布可反映为具有小于模式的25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更小的标准差的幺模分布(monodisperse distribution)。

具有高密度可分辨的座位的衬底通常导致在小区域内有可分辨的座位。因此，其可产生较小的微通道。所述微通道可容纳不同体积的沉积的试剂小滴。微通道可具有允许针对本发明各种实施方案的足够大的表面积和/或容积的任何合适的尺度。在一方面，微通道的容积适当地大，使得沉积在微通道内的小滴中的试剂不会在寡核苷酸合成过程中完全耗尽。除其他方面之外，在这些方面中，孔结构的容积可指导可用以合成寡核苷酸的时间周期或密度。

每个可分辨的座位可具有任何合适的面积来进行根据本文所述发明的各种实施方案的反应。在一些情况下，多个可分辨的座位可占据衬底总表面积的任何合适的百分比。在一些情况下，可分辨的座位的面积可为内建于衬底中的微通道或微孔的横截面积。在一些实施方案中，多个微结构或可分辨的座位可直接占据约、至少约或小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的衬底表面。在一些实施方案中，多个可分辨的座位可占据约、至少约或小于约10mm²、11mm²、12mm²、13mm²、14mm²、15mm²、16mm²、17mm²、18mm²、19mm²、20mm²、25mm²、30mm²、35mm²、40mm²、50mm²、75mm²、100mm²、200mm²、300mm²、400mm²、500mm²、600mm²、700mm²、800mm²、900mm²、1000mm²、1500mm²、2000mm²、3000mm²、4000mm²、5000mm²、7500mm²、10000mm²、15000mm²、20000mm²、25000mm²、30000mm²、35000mm²、40000mm²、50000mm²、60000mm²、70000mm²、80000mm²、90000mm²、100000mm²、200000mm²、300000mm²或更大的总面积。

内建于衬底中的微结构可包括微通道或微孔，其中微结构始于衬底的顶面或底面，并且在一些情况下流体连接至通常相对的表面(例如，底面或顶面)。术语“顶”和“底”并不一定涉及衬底在任何给定时间相对于重力的位置，而是一般为了方便和清楚而使用的。微通道或微孔可具有任何合适的深度或长度。在一些情况下，微通道或微孔的深度或长度是从衬底的表面(和/或固体支持体的底部)到固体支持体的顶部测量的。在一些情况下，微通道或微孔的深度或长度大致等于固体支持体的厚度。在一些实施方案中，微通道或微孔约为、小于约或大于约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、300μm、400μm或500μm长或深。微通道或微孔可具有适合于本文所述发明实施方案的任何长度的周长。在一些情况下，微通道或微孔的周长按横截面积(例如，垂直于流体经过所述微通道或微孔的流动方向的横截面积)的周长测量。在一些实施方案中，微通道或微孔的周长约为、小于约或至少约为1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、31μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、300μm、400μm或500μm。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可具有任何合适的每μm²平面衬底面积的弧长。本文所述的弧长密度是指微通道或微孔横截面的周长长度/平面衬底的表面积。微通道或微孔的标称弧长密度可例如但不限于至少为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μm/μm²或更大。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可为0.036μm/μm²。在一些实施方案 中，微通道或微孔的标称弧长密度可至少为0.001μm/μm²。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可至少为0.01μm/μm²。此外，适合于本文所述反应的微通道或微孔的标称表面积可例如通过表面涂覆合适的部分而得到最大化。如本文所述涂覆有合适的部分的微通道或微孔的表面积可促进寡核苷酸与表面的附着。在一些实施方案中，适合于本文所述反应(诸如寡核苷酸合成)的微通道或微孔的标称表面积至少为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5或5μm²的平面衬底面积。

微通道或微孔可具有适合于本文所述方法和组合物的任何容积。在一些实施方案中，微通道或微孔的容积小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950皮升(pl)，小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或990纳升(nl)，小于约0.5微升(μl)、小于约1μl、小于约1.5μl、小于约2μl、小于约2.5μl、小于约3μl、小于约3.5μl、小于约4μl、小于约4.5μl、小于约5μl、小于约5.5μl、小于约6μl、小于约6.5μl、小于约7μl、小于约7.5μl、小于约8μl、小于约8.5μl、小于约9μl、小于约9.5μl、小于约10μl、小于约11μl、小于约12μl、小于约13μl、小于约14μl、小于约15μl、小于约16μl、小于约17μl、小于约18μl、小于约19μl、小于约20μl、小于约25μl、小于约30μl、小于约35μl、小于约40μl、小于约45μl、小于约50μl、小于约55μl、小于约60μl、小于约65μl、小于约70μl、小于约75μl、小于约80μl、小于约85μl、小于约90μl、小于约95μl或小于约100μl。在一些实施方案中，微通道或微孔的容积等于或大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950皮升(pl)，等于或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或990纳升(nl)，等于或大于约0.5微升(μl)，约1μl、约1.5μl、约2μl、约2.5μl、约3μl、约3.5μl、约4μl、约4.5μl、约5μl、约5.5μl、约6μl、约6.5μl、约7μl、约7.5μl、约8μl、约8.5μl、约9μl、约9.5μl、约10μl、约11μl、约12μl、约13μl、约14μl、约15μl、约16μl、约17μl、约18μl、约19μl、约20μl、约25μl、约30μl、约35μl、约40μl、约45μl、约50μl、约55μl、约60μl、约65μl、约70μl、约75μl、约80μl、约85μl、约90μl、约95μl或约100μl。

微通道或微孔可具有小于1的宽深比。本文所使用的术语“宽深比”是指通道的宽度与该通道的深度的比值。因此，具有小于1的宽深比的通道的深度大于其宽度，而具有大于1的宽深比的通道的宽度大于其深度。在一些方面，微通道或微孔的宽深比可小于或等于约0.5、约0.2、约0.1、约0.05或更小。在一些实施方案中，微通道或微孔的宽深比可为约0.1。在一些实施方案中，微通道或通道的宽深比可为约0.05。本文所述的微结构，例如具有小于1、0.1或0.05的宽深比的微通道或微孔，可包括具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个转角、转弯等的通道。本文所述的微结构可包括关于特定可分辨的座位内所包含的所有微通道或微孔(例如，一个或多个交叉通道、这些通道中的一些通道、单一通道，以及甚至一个或多个微通道或微孔的一个部分或多个部分)所述的宽深比，例如小于1、0.1或0.05。美国专利号5,842,787中描述了制造具有低宽深比的微通道的其他设计和方法，该专利通过引用而并入于此。

位于具有多个可分辨的座位的衬底上的诸如微通道或微孔等微结构可通过本文所述的或除此之外在本领域中已知的任何方法(例如，微制造工艺)制造而成。可用于制造本文所公开的衬底的微制造工艺 包括但不限于：光刻；刻蚀技术，诸如湿化学法、干法和光致抗蚀剂脱除法；微机电(MEMS)技术，包括微流体/芯片实验室、光学MEMS(亦称MOEMS)、RF MEMS、PowerMEMS和BioMEMS技术，以及深反应离子刻蚀(DRIE)；纳米机电(NEMS)技术；硅的热氧化；电镀和无电镀；扩散过程，诸如硼、磷、砷和锑扩散；离子注入；薄膜沉积，诸如蒸发(细丝、电子束、闪光(flash)、遮蔽(shadowing)和阶梯覆盖(step coverage))、溅射、化学气相沉积(CVD)、外延(气相、液相和分子束)、电镀、丝网印刷和层压。总体参见Jaeger，Introduction to Microelectronic Fabrication(Addison-Wesley Publishing Co.，Reading Mass.1988)；Runyan等人，Semiconductor Integrated Circuit Processing Technology(Addison-Wesley Publishing Co.，Reading Mass.1990)；Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987-1998；Rai-Choudhury编著，Handbook of Microlithography，Micromachining&Microfabrication(SPIE Optical Engineering Press，Bellingham，Wash.1997)。

在一方面，具有多个可分辨的座位的衬底可使用本领域中已知的任何方法制成。在一些实施方案中，具有多个可分辨的座位的衬底的材料可为半导体衬底，诸如二氧化硅。衬底的材料还可为其他III-V族或II-VI族化合物材料，诸如砷化镓——一种通过丘克拉斯基法(Czochralski process)生产的半导体(Grovenor，C.(1989).Microelectronic Materials.CRC Press.pp.113-123)。材料可呈现硬的平面，该平面展现出针对与其表面相接触的溶液的反应性氧化物(-OH)基团的均匀覆盖。这些氧化物基团可作为后续硅烷化过程的附着点。或者，可以沉积模拟硅氧化物的刻蚀特性的亲脂性和疏水性表面材料。根据本发明各个实施方案，还可利用氮化硅和碳化硅表面来制造合适的衬底。

在一些实施方案中，可在衬底上沉积钝化层，该钝化层可具有或者可不具有反应性氧化物基团。钝化层可包含氮化硅(Si₃N₄)或聚酰亚胺。在一些情况下，可使用光刻步骤来限定在钝化层上形成可分 辨的座位的区域。

用于生产具有多个可分辨的座位的衬底的方法可由衬底开始。衬底(例如，硅)可具有安置于其上的任何数目的层，包括但不限于诸如金属等导电层。在一些情况下，导电层可为铝。在一些情况下，衬底可具有保护层(例如，氮化钛)。在一些情况下，衬底可具有拥有高表面能的化学层。所述层可借助于各种沉积技术来沉积，所述沉积技术诸如有：化学气相沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热丝CVD(HWCVD)、引发CVD(iCVD)、改进型CVD(MCVD)、汽相轴向沉积(VAD)、外气相沉积(OVD)以及物理气相沉积(例如，溅射沉积、蒸发沉积)。

在一些情况下，在衬底上沉积氧化物层。在一些情况下，氧化物层可包含二氧化硅。二氧化硅可使用原硅酸乙酯(TEOS)、高密度等离子体(HDP)或者其任何组合来沉积。

在一些情况下，可使用低温技术来沉积二氧化硅。在一些情况下，该工艺是二氧化硅的低温化学气相沉积。温度一般低至足以使芯片上预先存在的金属不受损坏。沉积温度可为约50℃、约100℃、约150℃、约200℃、约250℃、约300℃、约350℃等。在一些实施方案中，沉积温度低于约50℃、低于约100℃、低于约150℃、低于约200℃、低于约250℃、低于约300℃、低于约350℃等。沉积可在任何合适的压强下进行。在一些情况下，沉积工艺使用RF等离子能。

在一些情况下，通过干燥热生长氧化物程序(例如，可使用接近或超过1000℃温度的程序)来沉积氧化物。在一些情况下，通过湿蒸汽工艺来产生硅氧化物。

二氧化硅可沉积到适合于制造本文其他部分进一步详细描述的合适的微结构的厚度。

二氧化硅可沉积到任何合适的厚度。在一些实施方案中，二氧化硅的厚度约为、至少约为或小于约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1纳米(nm)、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、300nm、400nm或500nm。

可分辨的座位(例如，微通道或微孔)可使用本领域中已知的各种制造技术创建在二氧化硅衬底中。此类技术可包括半导体制造技术。在一些情况下，使用光刻技术(诸如在半导体行业中使用的技术)创建可分辨的座位。例如，可向二氧化硅上涂覆(例如通过晶片的旋涂)光致抗蚀剂(例如，当暴露于电磁辐射时会改变性质的材料)以达到任何合适的厚度。可将包括光致抗蚀剂的衬底暴露于电磁辐射源。可以使用掩模来从光致抗蚀剂的一些部分屏蔽辐射，以便限定可分辨的座位的区域。光致抗蚀剂可为负性抗蚀剂或正性抗蚀剂(例如，可将可分辨的座位的区域暴露于电磁辐射，或者可将除可分辨的座位之外的区域暴露于如由掩模所限定的电磁辐射)。将覆盖要在其中创建可分辨的座位的位置的区域暴露于电磁辐射，以限定对应于二氧化硅层中的可分辨的座位的位置和分布的图案。光致抗蚀剂可通过限定与可分辨的座位相对应的图案的掩模而暴露于电磁辐射。接下来，可例如借助于洗涤操作(例如，去离子水)来移除光致抗蚀剂的暴露部分。继而可将掩模的被移除部分暴露于化学刻蚀剂，以刻蚀衬底并将可分辨的座位的图案转移到二氧化硅层中。刻蚀剂可包括酸，例如，硫酸(H₂SO₄)。可通过各向异性的方式来刻蚀二氧化硅层。使用本文所述的方法，可应用诸如DRIE等高各向异性制造方法来在衬底上或衬底内制造微结构，诸如包含合成座位的微孔或微通道，其中所述微结构具有相对于衬底的表面偏差小于约±3°、2°、1°、0.5°、0.1°或更小的侧壁。可以实现小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1μm或更小的底切值，从而产生高度均匀的微结构。

可以使用各种刻蚀程序来在要形成可分辨的座位的区域中刻蚀二氧化硅。刻蚀可以是各向同性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率 基本上等于或等于沿着正交方向的刻蚀速率)，或各向异性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率低于沿着正交方向的刻蚀速率)，或者它们的变化形式。刻蚀技术可以是湿法硅刻蚀(诸如KOH、TMAH、EDP等)，和干法等离子体刻蚀(例如DRIE)。这两者都可用于通过互连来刻蚀微结构晶片。

在一些情况下，各向异性刻蚀移除可分辨的座位的大部分体积。可以移除可分辨的座位的体积的任何合适的百分比，包括约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。在一些情况下，在各向异性刻蚀中移除至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的材料。在一些情况下，在各向异性刻蚀中移除至多约60％、至多约70％、至多约80％、至多约90％或至多约95％的材料。在一些实施方案中，各向异性刻蚀不贯穿衬底移除二氧化硅材料。根据一些实施方案，使用各向同性刻蚀来贯穿衬底移除材料从而创造出孔穴。

在一些情况下，使用光刻步骤来刻蚀出孔以限定可分辨的座位，随后进行混合干-湿刻蚀。光刻步骤可包括用光致抗蚀剂涂覆二氧化硅，以及通过具有限定可分辨的座位的图案的掩模(或中间掩模(reticle))来将光致抗蚀剂暴露于电磁辐射。在一些情况下，混合干-湿刻蚀包括：(a)干法刻蚀，以移除位于通过光刻步骤在光致抗蚀剂中所限定出的可分辨的座位的区域中的大部分二氧化硅；(b)清洗衬底；以及(c)湿法刻蚀，以从衬底的可分辨的座位的区域中移除剩余的二氧化硅。

衬底可借助于等离子体刻蚀化学或者暴露于氧化剂而得到清洗，所述氧化剂例如为H₂O₂、O₂、O₃、H₂SO₄或它们的组合，诸如H₂O₂和H₂SO₄的组合。清洗可包括移除残留聚合物、移除可能阻碍湿法刻蚀的材料，或者它们的组合。在一些情况下，清洗为等离子体清洗。清洗步骤可进行任何合适的时间段(例如，15至20秒)。在一个示例中，清洗可使用具有100mT、200W、20G、20O₂的设置的Applied Materials eMAx-CT机器进行20秒。

干法刻蚀可为基本上垂直地(例如，朝向衬底)而非横向地或 基本上横向地(例如，平行于衬底)进行刻蚀的各向异性刻蚀。在一些情况下，干法刻蚀包括用诸如CF₄、CHF₃、C₂F₆、C₃F₆或其任意组合等基于氟的刻蚀剂来进行刻蚀。在一个实例中，刻蚀使用具有100mT、1000W、20G和50CF4的设置的Applied Materials eMax-CT机器进行400秒。本文所述的衬底可通过深反应性离子刻蚀(DRIE)来刻蚀。DRIE是一种高度各向异性的刻蚀工艺，用于在晶片/衬底中创造出通常具有高宽深比的深穿透、陡边孔穴和沟槽。可以使用两种主要的高速率DRIE技术刻蚀衬底：低温技术和Bosch技术。美国专利号5501893中描述了应用DRIE的方法，该专利通过引用而全文并入于此。

湿法刻蚀可为在所有方向上移除材料的各向同性刻蚀。在一些情况下，湿法刻蚀对光致抗蚀剂进行底切。底切光致抗蚀剂可使光致抗蚀剂在后续步骤中更容易移除(例如，光致抗蚀剂“剥离”)。在一个实施方案中，湿法刻蚀为缓冲氧化物刻蚀(BOE)。在一些情况下，使用可被(例如，利用氟化铵)缓冲以减慢刻蚀速率的氢氟酸基质在室温下进行湿法氧化物刻蚀。刻蚀速率可取决于被刻蚀的薄膜以及HF和/或NH₄F的比浓度。完全移除氧化物层所需的刻蚀时间通常凭经验确定。在一个实例中，在22℃下，以15∶1的BOE(缓冲氧化物刻蚀)进行刻蚀。

二氧化硅层可被刻蚀至深达下面的材料层。例如，可刻蚀二氧化硅层直至氮化钛层。

在一方面，用于制备具有多个可分辨的座位的衬底的方法包括：使用(a)光刻步骤以限定可分辨的座位；(b)干法刻蚀以移除通过光刻步骤所限定的可分辨的座位的区域中的大部分二氧化硅；以及(c)湿法刻蚀以从衬底的可分辨的座位的区域中移除剩余的二氧化硅，向诸如包含涂覆于其上的二氧化硅层的硅衬底之类的衬底中刻蚀出诸如微孔或微通道等可分辨的座位。在一些情况下，该方法还包括移除残留聚合物、移除可阻碍湿法刻蚀的材料，或者它们的组合。该方法可包括等离子体清洗步骤。

在一些实施方案中，不在光刻步骤或一些情况下的混合干-湿刻蚀之后从二氧化硅移除光致抗蚀剂。留下光致抗蚀剂可用于在后续步骤中将金属选择性地引导至可分辨的座位中，而不是二氧化硅层的上表面上。在一些情况下，衬底涂覆有金属(例如，铝)，并且湿法刻蚀不移除金属上的某些成分，例如，保护金属免遭腐蚀的成分(例如，氮化钛(TiN))。然而在一些情况下，可诸如借助于化学机械平坦化(CMP)而移除光致抗蚀剂层。

包括基本上为平面的衬底部分的示例性微流体装置被显示为图13D中的示图。图13E中示出了该示图的横截面。衬底包括多个聚簇，其中每个聚簇包括多个分组的微流体连接。每个分组包括从第一通道延伸的多个第二通道。图13A是包括高密度分组的聚簇的装置视图。图13C是图13A的聚簇的处理视图。图13B是沿图13A的B-B的剖视图。

分组聚簇可布置成任何数目的构形。在图13A中，分组布置成偏移的行，以形成圈状图案的聚簇。图13C描绘了多个这样的聚簇在示例性微流体装置上的布置。在一些实施方案中，单个聚簇被包含在单个聚簇区域内，所述聚簇区域的内部形成凸集(convex set)。在一些实施方案中，单个聚簇区域互不重叠。单个聚簇区域可为圆形或任何其他合适的多边形，例如，三角形、正方形、矩形、平行四边形、六边形等。如2503所表示，从每个分组的中心测量，三行分组之间的示例性距离可为约0.05mm至约1.25mm。2、3、4、5行或更多行的分组之间的距离可约为或至少约为0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm、0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm或1.3mm。2、3、4、5行或更多行的分组之间的距离可约为或至多约为1.3mm、1.2mm、1.1mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.75mm、0.65mm、0.6mm、0.55mm、0.5mm、0.45mm、0.4mm、0.35mm、0.3mm、0.25mm、0.2mm、0.15mm、0.1mm、0.05mm或更小。2、3、4、5行或更多行的分组之间的距离的范围可 在0.05-1.3mm、0.1-1.2mm、0.15-1.1mm、0.2-1mm、0.25-0.9mm、0.3-0.8mm、0.35-0.8mm、0.4-0.7mm、0.45-0.75mm、0.5-0.6mm、0.55-0.65mm或0.6-0.65mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如，0.05mm-0.8mm。如2506所示，从每个分组的中心测量，在一行分组中的两个分组之间的示例性距离可为从约0.02mm至约0.5mm。在一行分组中的两个分组之间的距离可约为或至少约为0.02mm、0.04mm、0.06mm、0.08mm、0.1mm、0.12mm、0.14mm、0.16mm、0.18mm、0.2mm、0.22mm、0.24mm、0.26mm、0.28mm、0.3mm、0.32mm、0.34mm、0.36mm、0.38mm、0.4mm、0.42mm、0.44mm、0.46mm、0.48mm或0.5mm。在一行分组中的两个分组之间的距离可约为或至多约为0.5mm、0.48mm、0.46mm、0.44mm、0.42mm、0.4mm、0.38mm、0.36mm、0.34mm、0.32mm、0.3mm、0.28mm、0.26mm、0.24mm、0.22mm、0.2mm、0.18mm、0.16mm、0.14mm、0.12mm、0.1mm、0.08mm、0.06mm、0.04mm或0.02mm或者更小。两个分组之间的距离的范围可在0.02-0.5mm、0.04-0.4mm、0.06-0.3mm或0.08-0.2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如，0.04mm-0.2mm。

每个分组的第一通道和第二通道的长度和宽度可根据实验条件进行优化。在一些实施方案中，如2504所表示，分组中的第一通道的横截面约为或至少约为0.01mm、0.015mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm、0.05mm、0.055mm、0.06mm、0.065mm、0.07mm、0.075mm、0.08mm、0.085mm、0.09mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm或0.5mm。在一些实施方案中，分组中的第一通道的横截面约为或至多约为0.5mm、0.45mm、0.4mm、0.35mm、0.3mm、0.25mm、0.2mm、0.15mm、0.1mm、0.09mm、0.085mm、0.08mm、0.075mm、0.07mm、0.065mm、0.06mm、0.055mm、0.05mm、0.045mm、0.04mm、0.035mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.015mm 或0.01mm或更小。分组中的第一通道的横截面的范围可在0.01-0.5mm、0.02-0.45mm、0.03-0.4mm、0.04-0.35mm、0.05-0.3mm、0.06-0.25mm或0.07-0.2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.04mm-0.2mm。在一些实施方案中，如2505所表示，分组中的第二通道的横截面约为或至少约为0.001mm、0.002mm、0.004mm、0.006mm、0.008mm、0.01mm、0.012mm、0.014mm、0.016mm、0.018mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm、0.05mm、0.055mm、0.06mm、0.065mm、0.07mm、0.075mm或0.08mm。在一些实施方案中，分组中的第二通道的横截面约为或至多约为0.08mm、0.075mm、0.07mm、0.065mm、0.06mm、0.055mm、0.05mm、0.045mm、0.04mm、0.035mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.018mm、0.016mm、0.014mm、0.012mm、0.01mm、0.008mm、0.006mm、0.004mm、0.002mm、0.001mm或更小。分组中的第二通道的横截面的范围可在0.001-0.08mm、0.004-0.07mm、0.008-0.06mm、0.01-0.05mm、0.015-0.04mm、0.018-0.03mm或0.02-0.025mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.008mm-0.04mm。图13B描述了包括一行11个分组的聚簇的示例性横截面。在一些实施方案中，每个分组中的第二通道的高度约为或至少约为0.005mm、0.008mm、0.01mm、0.015mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.1mm、0.12mm、0.14mm、0.16mm、0.18mm或0.2mm。在一些实施方案中，如2501所示，每个分组中的第二通道的高度约为或至多约为0.2mm、0.18mm、0.16mm、0.14mm、0.12mm、0.1mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.015mm、0.01mm、0.008mm或0.005mm。每个分组中的第二通道的高度的范围可在0.005-0.2mm、0.008-.018mm、0.01-0.16mm、0.015-0.1mm、0.02-0.08mm或0.025-0.04mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内， 例如0.01mm-0.04mm。在一些实施方案中，如2502所示，每个分组内的第一通道的高度约为或至多约为5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1.0mm、0.8mm、0.5mm、0.4mm、0.375mm、0.35mm、0.3mm、0.275mm、0.25mm、0.225mm、0.2mm、0.175mm、0.15mm、0.125mm、0.1mm、0.075mm或0.05mm。在一些实施方案中，如2502所示，每个分组内的第一通道的高度约为或至少约为0.05mm、0.075mm、0.1mm、0.125mm、0.15mm、0.175mm、0.2mm、0.225mm、0.25mm、0.275mm、0.3mm、0.325mm、0.35mm、0.375mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。每个分组内的第一通道的高度的范围可在0.05-5mm、0.075-4mm、0.1-3mm、0.15-2mm、0.2-1mm或0.3-0.8mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-1mm。

分组的聚簇可布置成适合于在另一微流体装置例如图14C所示的纳米反应器装置的单一反应孔中放置的构形。图13D是包括108个聚簇的微流体装置的基本上为平面的衬底部分的示图，其中每个聚簇包括多个分组。衬底可包括任何数目的聚簇，包括但不限于在约2至约5000之间的任何数目。在一些实施方案中，衬底包括至少或至少约2、3、4、5、10、20、50、100、125、175、200、250、300、400、500、750、1000、5000个或更多的聚簇。在一些实施方案中，衬底包括至多或至多约5000、1000、750、500、400、300、250、200、175、125、100、75、50、40、30、20个或更少的聚簇。在一些实施方案中，聚簇的数目处于从约2个至约1000个聚簇、从约2个至约500个聚簇、从约2个至约200个聚簇、从约2个至约150个聚簇、从约2个至约125个聚簇、从约2个至约100个聚簇、从约2个至约75个聚簇、从约2个至约50个聚簇、从约2个至约25个聚簇、从约25个至约250个聚簇、从约50个至约250个聚簇、从约75个至约250个聚簇、从约100个至约250个聚簇、从约125个至约250个聚簇、从 约150个至约250个聚簇、从约175个至约250个聚簇、从约200个至约250个聚簇或者从约225个至约250个聚簇。本领域技术人员知晓，聚簇的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-125个。另外，每个聚簇可包括任何数目的分组，包括但不限于在约2个到约1000个分组之间的任何数目。在一些实施方案中，聚簇包含至少或至少约2、3、4、5、10、20、50、100、125、175、200、250、300、400、500、750、1000个或更多的分组。在一些实施方案中，聚簇包含至多或至多约1000、750、500、400、300、250、200、175、125、100、75、50、40、30、20个或更少的分组。在一些实施方案中，聚簇包含从约2个至约225个分组、从约2个至约200个分组、从约2个至约175个分组、从约2个至约150个分组、从约2个至约125个分组、从约2个至约100个分组、从约2个至约75个分组、从约2个至约50个分组、从约2个至约25个分组、从约25个至约250个分组、从约50个至约250个分组、从约75个至约250个分组、从约100个至约250个分组、从约125个至约250个分组、从约150个至约250个分组、从约175个至约250个分组、从约200个至约250个分组或者从约225个至约250个分组。本领域技术人员知晓，分组的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-125个。作为示例，图13D中所示衬底的108个聚簇中的每个孔可包括图13A中所示的109个分组的聚簇，从而产生存在于微流体装置中的基本上为平面的衬底部分中的11772个分组。

图13D包括由0，0(X，Y)轴所指示的参考原点，其中示出了微流体装置的示例性的基本上为平面的衬底部分的左下角。在一些实施方案中，如2508所表示，从原点测量，基本上为平面的衬底的宽度沿着一个维度为从约5mm至约150mm。在一些实施方案中，如2519所表示，从原点测量，基本上为平面的衬底的宽度沿着另一维度为从约5mm至约150mm。在一些实施方案中，在任何维度上的衬底的宽度为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约 25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或者从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-100mm。图13D中所示的基本上为平面的衬底部分包括108个分组聚簇。所述聚簇可布置成任何配置。在图13D中，聚簇布置成行，从而形成正方形。无论如何布置，在X轴或Y轴上测量，聚簇均可开始于离原点约0.1mm至约149mm的距离处。长度2518和2509分别表示聚簇中心在X轴和Y轴上的最远距离。长度2517和2512分别表示聚簇中心在X轴和Y轴上的最近距离。在一些实施方案中，聚簇布置成使得存在两个聚簇之间的重复距离。如2507和2522所示，两个聚簇之间的距离可相距约0.3mm至约9mm。在一些实施方案中，两个聚簇之间的距离约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，两个聚簇之间的距离约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。两个聚簇之间的距离的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。

可以在本文所述的微流体装置上放置基准标记，以促进这样的装置与系统的其他组件的对准。本发明的微流体装置可具有一个或多个基准标记，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基准标记。图13D中所示的示例性微流体装置的基本上为平面的衬底部分包括三个对于将装置与系统的其他组件对准有用的基准标记。基准标记可位于微流体装置的基本上为平面的衬底部分内的任何位置。如2513和2516所示，基准标记可位于原点附近，其中基准标记比任一聚簇都更加靠近原点。在一些实施方案中，如2511和2521所示，基准标记位于衬底部分的边缘附近，其中离边缘的距离分别由2510和2520所指示。基准标记可位于离衬底部分的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离衬底部分的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离衬底部分约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。基准标记可位于离衬底的边缘0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm处。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。基准标记可位于距离靠近聚簇之处，其中2515和 2514分别指示出示例性X轴距离和Y轴距离。在一些实施方案中，聚簇与基准标记之间的距离约为或至少约为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm或8mm。在一些实施方案中，聚簇与基准标记之间的距离约为或至多约为8mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.7mm、2.5mm、2.2mm、2mm、1.7mm、1.5mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.005mm或0.001mm。聚簇与基准标记之间的距离的范围可在0.001-8mm、0.01-7mm、0.05-6mm、0.1-5mm、0.5-4mm、0.6-3mm、0.7-2mm或0.8-1.7mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。

图13E沿图13D的A-A截面描绘了图13D中所示的示例性微流体装置的基本上为平面的衬底部分的横截面。该截面示出了一行11个分组，各自包括分组聚簇，其中每个分组包括从第一通道延伸的多个第二通道。如2523所示例，分组的总长度可为从约0.05mm至约5mm长。在一些实施方案中，分组的总长度约为或至少约为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm、3mm、3.2mm、3.5mm、3.7mm、4mm、4.2mm、4.5mm、4.7mm或5mm。在一些实施方案中，分组的总长度约为或至多约为5mm、4.7mm、4.5mm、4.2mm、4mm、3.7mm、3.5mm、3.2mm、3mm、2.7mm、2.5mm、2.2mm、2mm、1.7mm、1.5mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09 mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm或者更小。分组的总长度的范围可在0.05-5mm、0.06-4mm、0.07-3mm、0.08-2mm、0.09-1mm、0.1-0.9mm、0.2-0.8mm或0.3-0.7mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1-0.7mm。在一些实施方案中，如描绘微流体装置中的聚簇的示例性布局的图13F中所示例，微流体装置可具有用于标签或序号标签的位置。如距离2603所示例，标签可位于衬底的边缘附近。在一些实施方案中，标签位于离衬底的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，标签位于离衬底的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，标签位于离衬底的边缘约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。该距离可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm、0.9-2mm或1.5mm之间的范围内。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。如2602所示例，标签可开始于离原点约0.1mm至约20mm的位置。如2601所示例，标签的长度可为约1mm至约32mm。

反应器

在另一方面，本文描述了包围体阵列。该包围体阵列可包括多个可分辨的反应器，所述可分辨的反应器包括第一衬底和构成反应器帽的第二衬底。在一些情况下，每个反应器中至少包含两个可分辨的座位。可分辨的反应器可使用可释放密封隔开。反应器帽可在从第一衬底释放第二衬底时保留反应器的内容物。所述多个可分辨的反应器可为任何合适的密度，其密度至少为每mm²1个。所述多个反应器帽可涂覆有部分。该部分可为化学惰性部分或化学活性部分。涂覆到反应器帽上的部分可以是能够使寡核苷酸的附着最小化的部分。本文其他部分进一步详细地描述化学部分的类型。

在一些实施方案中，本文所描述的反应器帽可涉及在封盖元件衬底的表面上具有敞开的顶部的包围体。例如，反应器帽可类似于在衬底表面之上突出的圆柱体。反应器帽的内径可约为、至少约为或小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、115、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500μm。反应器帽的外径可约为、至少约为或小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、115、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或600μm。所述圆柱体的边缘的宽度可约为、至少约为或小于约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或400μm。反应器帽在内部测量的高度可约为、至少约为或小于约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、60、70、80、90或100μm。图7图示了封盖元件上的反应器帽的示例性实施方案。

可以使用本文其他部分进一步详细描述的和本领域中已知的合适的表面修饰方法来修饰整个反应器帽表面或其一部分，诸如边缘表面。在一些情况下，对表面不规则性进行工程设计。化学表面修饰和不规则性可帮助调整边缘的水接触角。类似的表面处理还可应用于衬 底的表面上，该衬底表面紧靠反应器帽，从而形成密封，例如可逆密封。如本文其他部分进一步详细描述，可在两个表面之间采用毛细管被动阀。表面处理在对此类包含毛细管被动阀的密封的精确控制中可能是有用的。

包含在衬底中的反应器帽可为本领域中已知的任何形状或设计。反应器帽可含有一定体积的腔体，该腔体能够围合反应器的内容物。反应器的内容物可来源于相邻衬底上的多个可分辨的座位。反应器帽可以是圆形、椭圆形、矩形或不规则形状。反应器帽可具有尖锐边角。在一些情况下，反应器帽可具有圆滑边角，以将保留的任何气泡减到最少，并促进反应器内容物更好地混合。反应器帽可制造成允许反应器内容物的可控转移或混合的任何形状、组构或设计。反应器帽的设计可与如本申请中所描述的位于衬底上的可分辨的座位相似。在一些实施方案中，反应器帽可为允许液体容易地流入而不产生气泡的形状。在一些实施方案中，反应器帽可为圆形，其直径可约为、至少约为或小于约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm或750μm。反应器帽可具有单分散尺寸分布，即，所有的微结构可具有大致相同的宽度、高度和/或长度。或者，反应器帽可具有有限数目的形状和/或尺寸，例如，反应器帽可表示为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多种不同形状，每种形状具有单分散尺寸。在一些实施方案中实施方案中，相同的形状能够以多个单分散尺寸分布(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多个单分散尺寸分布)重复。单分散分布可反映为具有小于模式的25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更小的标准差 的幺模分布。

根据本文描述的本发明的各个实施方案，每个反应器帽可具有用于进行反应的任何适合的面积。在一些情况下，所述多个反应器帽可占据衬底的总表面积的任何合适的百分比。在一些实施方案中，所述多个反应器帽可占据衬底的表面的约、至少约或小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，反应器帽可占据约、至少约或小于约0.1mm²、0.15mm²、0.2mm²、0.25mm²、0.3mm²、0.35mm²、0.4mm²、0.45mm²、0.5mm²、0.55mm²、0.6mm²、0.65mm²、0.7mm²、0.75mm²、0.8mm²、0.85mm²、0.9mm²、0.95mm²、1mm²、2mm²、3mm²、4mm²、5mm²、6mm²、7mm²、8mm²、9mm²、10mm²、11mm²、12mm²、13mm²、14mm²、15mm²、16mm²、17mm²、18mm²、19mm²、20mm²、25mm²、30mm²、35mm²、40mm²、50mm²、75mm²、100mm²、200mm²、300mm²、400mm²、500mm²、600mm²、700mm²、800mm²、900mm²、1000mm²、1500mm²、2000mm²、3000mm²、4000mm²、5000mm²、7500mm²、10000mm²、15000mm²、20000mm²、25000mm²、30000mm²、35000mm²、40000mm²、50000mm²、60000mm²、70000mm²、80000mm²、90000mm²、100000mm²、200000mm²、300000mm²或者更大的总面积。可分辨的反应器、可分辨的座位和反应器帽可为任何密度。在一些实施方案中，表面可具有每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个位点的可分辨的反应器、可分辨的座位或反应器帽密度。在一些实施方案中，表面具有每1mm²至少约50、至少约75、至少 约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1500、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000或至少约500000个位点的可分辨的反应器、可分辨的座位或反应器帽密度。

将相邻衬底表面上的可分辨的座位的密度纳入考虑，可相应地设计反应器帽的密度、分布和形状，以便将其配置成与每个反应器中的优选数目的可分辨的座位对准。所述多个可分辨的反应器中的每一个可包含多个可分辨的座位。每个反应器可例如但不限于包含约、至少约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个可分辨的座位。在一些情况下，每个反应器可包含至少100个可分辨的座位。

包含在多个包围体的阵列内的可分辨的座位或反应器帽可位于被制造到支持表面中的微结构上。如本文其他段落中所描述，该微结构可通过本领域中的任何已知方法制造而成。微结构可以是具有任何2D或3D形状和设计的微通道或微孔。该微结构(例如，微通道或微孔)可包含至少两个彼此流体连通的通道。例如，微通道可互连起来，从而允许流体在给定条件(诸如真空抽吸)下灌流穿过。单个微结构可以是可单独寻址和分辨的，使得两个可分辨的座位的内容物保持不被混合。微通道可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个以任何组合流体连通的通道，从而允许流体的受控混合、连通或分布。微通道的连通性可由微流体设计领域中已知的阀系统来控制。例如，可以直接在衬底的流体连通层之上制造衬底的流体控制层。在Marc A.Unger等人的″Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography″(Science，vol.288，no.7，pp.113-116，2000年4月)，以及David C.Duffy等人的″Rapid Prototyping of Microfluidic  Systems in Poly(dimethylsiloxane)″(Analytical Chemistry，vol.70，no.23，pp.4974-4984，1998年12月)中描述了不同的微流体阀系统。

包含在多个包围体的阵列内的可分辨的座位或反应器帽可位于诸如微通道或通道等微结构上。在本文其他部分描述了相邻衬底表面上的可分辨的座位的微通道的尺寸和设计。该微结构可包含至少两个流体连通的通道，其中所述至少两个通道可包括至少两个具有不同宽度的通道。在一些情况下，所述至少两个通道可具有相同的宽度，或者相同宽度或不同宽度的组合。通道或微通道的宽度可例如但不限于为约、至少约或小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。通道或微通道可具有允许可分辨的座位的流体连通的任何长度。至少一个通道可包括约为、至少约、小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的表面积与长度或周长的比。至少一个通道可具有圆形的横截面，并且可包括约为、至少约、小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的横截面半径。

如本文所述，包围体阵列可包含多个可分辨的反应器，所述可分辨的反应器包含第一衬底和构成反应器帽的第二衬底。可分辨的反应器可通过将第二衬底结合或封盖至第一衬底上并将它们密封在一起而形成。密封可以是可逆的或不可逆的。在优选实施方案中，密封是可逆的或可释放的。当密封可分辨的反应器后，可将诸如扩增或其他下游反应所需的寡核苷酸或试剂等反应器内容物释放和混合在可分辨的反应器内。可分辨的反应器可以用可释放密封隔开，并且其中反应器帽可在从第一衬底释放第二衬底之后保留反应器的所有内容 物或其一部分。根据第一衬底和第二衬底的材料，可以不同地设计密封，以允许在第一衬底与第二衬底之间的可逆密封，并形成可分辨的反应器。第一衬底和第二衬底可在形成密封时直接物理接触。在一些情况下，第一衬底和第二衬底可以紧密靠近，但它们的紧紧围绕纳米反应器或处于两个纳米反应器之间的相应表面却不直接物理接触。密封可包括毛细管被动阀。当形成密封时第一衬底与第二衬底之间的距离可为约、至少约、小于约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm或10μm。密封可包括毛细管被动阀。

在一些情况下，可分辨的包围体可包含压力释放孔。所述压力释放孔可允许第一衬底和第二衬底的分隔。在通过引用而全文并入于此的欧洲专利号EP 1987275 A1中描述了带有压力释放系统的微流体系统的设计。

可以使用针对衬底/晶片和本文其他部分描述的制造、涂覆、表面修饰和功能化方法以及本领域中已知的任何其他合适的方法来制造纳米反应器。

图14A-图14D以各种视图示出了示例性纳米反应器。该纳米反应器包括108个孔，所述孔单个地从纳米反应器的基底凸起。图14A示出了纳米反应器的横截面。图14B和图14C示出了纳米反应器的装置视图。图14D示出了纳米反应器的处理视图。纳米反应器可配置用于在多个特征中接收和容纳液体。图14中的纳米反应器被设计用于在108个孔中的任何数目的孔中容纳液体。如图13中所示例，纳米反应器可与衬底接触和/或对准。纳米反应器的孔并不限于图14中所示的配置，这是因为可将任何配置的任何数目的孔布置在纳米反应器内。在一些实施方案中，纳米反应器的孔布置成与衬底配置对准的配置。如2701所表示，纳米反应器的高度可约为或至少约为0.1mm、 0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm。在一些实施方案中，纳米反应器的高度可约为或至多约为10mm、9.5mm、9mm、8.5mm、8mm、7.5mm、7mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm或者更小。在一些实施方案中，纳米反应器的高度的范围可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.2mm-0.8mm。如2702所表示，纳米反应器的孔的高度可约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm。在一些实施方案中，纳米反应器的孔的高度可约为或至多约为10mm、9.5mm、9mm、8.5mm、8mm、7.5mm、7mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm或者更小。在一些实施方案中，纳米反应器的孔的高度的范围可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-0.6mm。

图14B包括由0，0(X，Y)轴所指示的参考原点，其中示出了示例性纳米反应器的左上角。在一些实施方案中，如2703所表示，从原点测量，纳米反应器的宽度沿着一个维度为约5mm至约150mm。在一些实施方案中，如2704所表示，从原点测量，纳米反应器的宽 度沿着另一维度为约5mm至约150mm。在一些实施方案中，在任何维度上的纳米反应器的宽度为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或者从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-25mm。在一些实施方案中，在任何维度上的纳米反应器的宽度约为或至少约为5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。在一些实施方案中，在任何维度上的纳米反应器的宽度约为或至多约为150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm或5mm或者更小。

图14B中所示的纳米反应器包括108个孔。孔可布置成任何配置。在图14B中，孔布置成行，从而形成正方形。无论如何布置，在X轴或Y轴上测量，孔均可开始于离原点约0.1mm至约149mm的距离处，并终止于离原点约1mm至约150mm的距离处。长度2706和2705分别表示孔的中心在X轴和Y轴上离原点的最远距离。长度2710和2709分别表示孔的中心在X轴和Y轴上离原点的最近距离。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上离原点的最远距离约为或至少约为1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最远距离约为或至多约为150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、1mm或更小。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最远距离为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约 5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-25mm。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上离原点的最近距离约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或149mm。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最近距离约为或至多约为149mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm或更小。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最近距离为从约0.1mm至约125mm、从约0.5mm至约100mm、从约0.5mm至约75mm、从约0.5mm至约50mm、从约0.5mm至约25mm、从约1mm至约50mm、从约1mm至约40mm、从约1mm至约30mm、从约1mm至约20mm或从约1mm至约5mm。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1-5mm。

纳米反应器的孔可位于离纳米反应器的边缘的任何距离处。2707和2708示出了孔与纳米反应器的边缘之间的示例距离。在一些实施方案中，孔的中心与纳米反应器的边缘之间在任何维度上的距离约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或149mm。在一些实施方案中，孔的中心与纳米反应器的边缘之间在任 何维度上的距离约为或至多约为149mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm或更小。在一些实施方案中，孔的中心与纳米反应器的边缘之间在任何维度上的距离为从约0.1mm至约125mm、从约0.5mm至约100mm、从约0.5mm至约75mm、从约0.5mm至约50mm、从约0.5mm至约25mm、从约1mm至约50mm、从约1mm至约40mm、从约1mm至约30mm、从约1mm至约20mm或从约1mm至约5mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1-5mm。

在一些实施方案中，孔布置成使得在两个孔之间存在重复的距离。如2711和2712所示，两个孔之间的距离可相距约0.3mm至约9mm。在一些实施方案中，两个孔之间的距离约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，两个孔之间的距离约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。两个孔之间的距离的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓， 该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。

在一些实施方案中，如2721所示，孔的内部的横截面约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，孔的内部的横截面约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。孔的内部的横截面的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该横截面可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。在一些实施方案中，如2720所示，包括孔的边沿在内的孔的横截面约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，包括孔的边沿在内的孔的横截面约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、 6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。包括孔的边沿在内的孔的横截面的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该横截面可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。

纳米反应器可包括任何数目的孔，包括但不限于约2个至约250个之间的任何数目。在一些实施方案中，孔的数目包括从约2个至约225个孔、从约2个至约200个孔、从约2个至约175个孔、从约2个至约150个孔、从约2个至约125个孔、从约2个至约100个孔、从约2个至约75个孔、从约2个至约50个孔、从约2个至约25个孔、从约25个至约250个孔、从约50个至约250个孔、从约75个至约250个孔、从约100个至约250个孔、从约125个至约250个孔、从约150个至约250个孔、从约175个至约250个孔、从约200个至约250个孔或者从约225个至约250个孔。本领域技术人员知晓，孔的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-125个。

可以在本文所述的纳米反应器上放置基准标记，以促进纳米反应器与系统的其他组件(例如，微流体装置或微流体装置的组件)的对准。本发明的纳米反应器可具有一个或多个基准标记，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基准标记。图13B中所示的纳米反应器的装置视图包括三个对于将装置与系统的其他组件对准有用的基准标记。基准标记可位于纳米反应器内的任何位置上。如2716和2717所示，基准标记可位于原点附近，其中基准标记比任一孔都更为靠近原点。在一些实施方案中，如2713所示，基准标记位于纳米反应器的边缘附近，其中2714和2715示例了离边缘的距离。基准 标记可位于离纳米反应器的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边缘约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。基准标记可位于离纳米反应器的边缘0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm处。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。基准标记可位于靠近孔的距离处，其中2719和2718分别指示出示例性X轴距离和Y轴距离。在一些实施方案中，孔与基准标记之间的距离约为或至少约为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm或8mm。在一些实施方案中，孔与基准标记之间的距离约为或至多约为8mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.7mm、2.5mm、 2.2mm、2mm、1.7mm、1.5mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.005mm或0.001mm。孔与基准标记之间的距离的范围可在0.001-8mm、0.01-7mm、0.05-6mm、0.1-5mm、0.5-4mm、0.6-3mm、0.7-2mm或0.8-1.7mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。

图14D中所示的纳米反应器的处理视图包括四个对于将装置与系统的其他组件对准有用的基准标记。基准标记可位于纳米反应器内的任何位置。如基准标记H的详细视图上的2722和2723所示，基准标记可位于处理侧上的纳米反应器的边角附近。基准标记可位于离纳米反应器的边角约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边角约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边角约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。基准标记可位于离纳米反应器的边角0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、 0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm处。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。基准标记可具有适合于功能的任何宽度。在一些实施方案中，如2724和2725所示例，基准标记的宽度约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm。在一些实施方案中，基准标记的宽度约为或至多约为10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm。基准标记的宽度的范围可为0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm长。本领域技术人员知晓，该宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。如2726所示，基准标记的横截面可为任何合适的尺寸。在一些实施方案中，基准标记的横截面约为或至少约为0.001mm、0.002mm、0.004mm、0.006mm、0.008mm、0.01mm、0.012mm、0.014mm、0.016mm、0.018mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm、0.05mm、0.055mm、0.06mm、0.065mm、0.07mm、0.075mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm。在一些实施方案中，基准标记的横截面约为或至多约为0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.075mm、0.07mm、 0.065mm、0.06mm、0.055mm、0.05mm、0.045mm、0.04mm、0.035mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.018mm、0.016mm、0.014mm、0.012mm、0.01mm、0.008mm、0.006mm、0.004mm、0.002mm、0.001mm或更小。基准标记的横截面的范围可在0.001-0.5mm、0.004-0.4mm、0.008-0.3mm、0.01-0.2mm、0.015-0.1mm、0.018-0.1mm或0.02-0.05mm之间。本领域技术人员知晓，该横截面可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.02mm-0.1mm。

在一些实施方案中，如在描绘纳米反应器中的孔的示例性布局的图14E中所示例，纳米反应器可具有用于标签或序号标签的位置。在一些实施方案中，标签为序号。如距离2728和2727所示例，标签可位于纳米反应器的边缘附近。在一些实施方案中，标签的任何部分位于离纳米反应器的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，标签的任何部分位于离纳米反应器的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，标签的任何部分位于离纳米反应器的边缘约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。该距离的范围可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm、0.9-2mm或1.5mm之间。本领域技术人 员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。如2726所示例，标签可具有任何长度，包括从约1mm至约25mm。在一些实施方案中，标签的长度约为或至少约为1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。在一些实施方案中，标签的长度约为或至多约为150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、1mm或更小。在一些实施方案中，标签的长度为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或者从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-25mm。

材料

衬底、固体支持体或其中的微结构或反应器可由适合于本文所述发明的方法和组合物的多种材料制造而成。在某些实施方案中，用于制造构成本发明的衬底/固体支持体的材料展现出低水平的寡核苷酸结合。在一些情况下，可采用对可见光和/或紫外光透明的材料。可以使用具有足够的导电性的材料，例如，能够穿过本文所述衬底/固体支持体的整体或部分形成均匀电场的材料。在一些实施方案中，此类材料可接地。在一些情况下，衬底或者固体支持体可以是导热的或隔热的。该材料可以是耐化学品和耐热的，以支持化学反应或生化反应，诸如一系列寡核苷酸合成反应。对于柔性材料而言，关注的材料可包括：改性或未改性的尼龙、硝酸纤维素、聚丙烯等。对于刚性材料而言，关注的特定材料包括：玻璃；熔融石英；硅、塑料(例如，聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸脂，以及其混合物等)；金属(例如，金、铂等)。衬底、固体支持体或反应器可由选自以下材料之中 的材料加工而成：硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃。衬底/固体支持体或者其中的微结构、反应器可使用本文所列材料或本领域中已知的任何其他合适材料的组合制造而成。

表面修饰

在各个实施方案中，利用表面修饰来通过加成工艺或减成工艺进行对表面的化学和/或物理改变，以改变衬底表面或衬底表面的选定位点或区域的一个或多个化学和/或物理性质。例如，表面修饰可涉及：(1)改变表面的润湿性质；(2)对表面进行功能化，即，提供、修改或取代表面官能团；(3)对表面进行去功能化，即，移除表面官能团；(4)以其他方式例如通过刻蚀来改变表面的化学组成；(5)增大或减小表面粗糙度；(6)在表面上提供涂层，例如，展现出与表面的润湿性质不同的润湿性质的涂层；和/或(7)在表面上沉积微粒。

寡核苷酸或其他部分沉积到其上的衬底表面或可分辨的座位可以是光滑的或基本上平坦的，或者具有不规则性，诸如凹陷或升高。可以用有助于以期望的方式改变表面的性质的一个或多个不同化合物层来修饰表面。所关注的此类修饰层包括：无机层和有机层，诸如金属、金属氧化物、聚合物、有机小分子等。所关注的聚合物层包括如下材料的层：肽、蛋白质、核酸或其模拟物(例如，肽核酸等)；多糖、磷脂、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳硫醚(polyarylene sulfide)、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯等，或者本文所述的或除此之外本领域中已知的任何其他合适的化合物，其中聚合物可为杂聚物或均聚物，并且可能具有或者可能不具有附着于其上的单独的功能部分(例如，缀合的)。在通过引用而全文并入于此的美国专利号6,773,888和美国公开号2007/0054127中描述了用于衬底的表面修饰或固体支持体的涂覆的其他材料和方法。

可分辨的座位可使用能够增大或减小固体支持体的表面能的部分进行功能化。所述部分可以是化学惰性的，或者替代地，为适于支 持期望的化学反应的部分。表面的表面能或表面的疏水性可决定寡核苷酸附着到该表面上的亲和力。用于制备衬底的方法可包括：(a)提供具有包含二氧化硅的表面的衬底；和(b)使用本文所述的或除此之外本领域中已知的合适的硅烷化剂，例如，有机官能烷氧基硅烷分子，来对表面进行硅烷化。在一些情况下，该有机官能烷氧基硅烷分子可为二甲基氯十八烷基硅烷、甲基二氯十八烷基硅烷、三氯十八烷基硅烷、三甲基十八烷基硅烷、三乙基十八烷基硅烷或其任何组合。

还可使用本领域中已知的任何方法来准备衬底的表面以使之具有低表面能。降低表面能可促进寡核苷酸向表面的附着。可对表面进行功能化，以实现可降低表面能的分子部分的共价结合，由此润湿性能够降低。在一些实施方案中，表面的功能化实现了表面能和润湿性的增大。

在一些实施方案中，通常经由存在于衬底表面上的反应性亲水部分，在有效地将硅烷偶联至衬底表面的反应条件下，使衬底的表面与含有硅烷混合物的衍生化组合物相接触。硅烷化一般可用于通过使用有机官能烷氧基硅烷分子的自组装来覆盖表面。还可如本领域中当前所知使用多种硅氧烷功能化试剂，例如，用于降低或增大表面能。有机官能烷氧基硅烷根据其有机功能来分类。硅氧烷功能化试剂的非限制性示例包括：羟烷基硅氧烷(甲硅烷基化表面，用乙硼烷功能化，并通过过氧化氢来氧化该醇)、二醇(二羟基烷基)硅氧烷(甲硅烷基化表面，并水解成二醇)、氨基烷基硅氧烷(胺不需要中间功能化步骤)、缩水甘油氧基硅烷(3-缩水甘油氧基丙基-二甲基-乙氧基硅烷、缩水甘油氧基-三甲氧基硅烷)、巯基硅烷(3-巯基丙基-三甲氧基硅烷，3-4环氧环己基-乙基三甲氧基硅烷或3-巯基丙基-甲基-二甲氧基硅烷)、二环庚烯基-三氯硅烷、丁基-醛基-三甲氧基硅烷或二聚仲氨基烷基硅氧烷。羟烷基硅氧烷可包括变成3-羟基丙基的烯丙基三氯氯硅烷或变成8-羟基辛基的7-辛-1-烯基三氯氯硅烷。二醇(二羟基烷基)硅氧烷包括缩水甘油基三甲氧基硅烷衍生的(2，3-二羟基丙氧基)丙基。氨基烷基硅氧烷包括变成3-氨丙基的3-氨丙基三甲氧基 硅烷(3-氨丙基-三乙氧基硅烷、3-氨丙基-二乙氧基-甲基硅烷、3-氨丙基-二甲基-乙氧基硅烷或3-氨丙基-三甲氧基硅烷)。二聚仲氨基烷基硅氧烷可以是变成双(甲硅烷基氧基丙基)胺的双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。此外，在本发明中可以使用许多种替代的功能化表面。非限制性示例包括以下各项：1.聚乙烯/聚丙烯(通过γ辐射或铬酸氧化并还原为羟烷基表面而功能化)；2.高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯(通过氯甲基化衍生化，并胺化为苄胺功能表面)；3.尼龙(末端氨基己基直接是反应性的)；或4.刻蚀的、还原的聚四氟乙烯。在通过引用而全文并入于此的美国专利号5474796中描述了其他方法和功能化剂。功能化基团(例如，硅烷)的混合物可为任何不同比率。混合物可例如但不限于包含至少两种不同类型的功能化剂，例如硅烷。混合物中的至少两种类型的表面功能化剂(例如，硅烷)的比率可约为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、2∶3、2∶5、2∶7、2∶9、2∶11、2∶13、2∶15、2∶17、2∶19、3∶5、3∶7、3∶8、3∶10、3∶11、3∶13、3∶14、3∶16、3∶17、3∶19、4∶5、4∶7、4∶9、4∶11、4∶13、4∶15、4∶17、4∶19、5∶6、5∶8、5∶9、5∶11、5∶12、5∶13、5∶14、5∶16、5∶17、5∶18、5∶19、6∶7、6∶11、6∶13、6∶17、6∶19、7∶8、7∶9、7∶10、7∶11、7∶12、7∶13、7∶15、7∶16、7∶18、7∶19、8∶9、8∶11、8∶13、8∶15、8∶17、8∶19、9∶10、9∶11、9∶13、9∶14、9∶16、9∶17、9∶19、10∶11、10∶13、10∶17、10∶19、11∶12、11∶13、11∶14、11∶15、11∶16、11∶17、11∶18、11∶19、11∶20、12∶13、12∶17、12∶19、13∶14、13∶15、13∶16、13∶17、13∶18、13∶19、13∶20、14∶15、14∶17、14∶19、15∶16、15∶17、15∶19、16∶17、16∶19、17∶18、17∶19、17∶20、18∶19、19∶20或任何其他用以达到两种基团的期望表面表示的比率。不受理论制约，应当理解表面表示将会高度地与混合物中两种基团的比率成正比。通过提供功能化剂的比率，可以实现根据本发明的方法和组合物的期望的表面张力、润湿性、水接触角或对于其他合适的溶剂的接触角。此外，混合物中的试剂可从用于下游反应的合适的反应性和惰性部分之中选择，从而将反应性基团的表面密度稀释成根据本发明的方法和组合物的期望水平。在一些实施方案中， 在寡核苷酸合成反应中发生反应以形成生长的寡核苷酸的表面官能团部分的密度为约、小于约或大于约0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、50.0、75.0、100.0μMol/m²。

在各个实施方案中，用反应性亲水部分的涂层来修饰表面，以使之具有更高的表面能，或者变得更加亲水。通过改变衬底表面的不同部分的表面能，可以调节并且在一些情况下促进沉积的试剂液体的扩散。例如，图5图示了当通过喷墨打印机将试剂小滴沉积到微孔中时的情况。由于在该情况下微孔的表面与附近其他表面相比具有更高的表面能，因此液滴可在更小的微孔上扩散并填充更小的微孔。衬底表面上的反应性亲水部分可为羟基、羧基、硫醇基和/或取代或未取代的氨基。合适的材料包括但不限于可用于固相化学合成的支持体，例如，交联的聚合物材料(例如，基于二乙烯基苯苯乙烯的聚合物)、琼脂糖(例如，)、葡聚糖(例如，)、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、二氧化硅、玻璃(特别是可控多孔玻璃，或“CPG”)、陶瓷等。支持体可从市场购得并直接使用，或者可在功能化之前对它们加以处理或涂覆。

亲水性表面和疏水性表面

表面的表面能或疏水性可通过测量水接触角而得到评估或测量。水接触角是当小水滴与固体表面相遇时水滴表面与固体表面之间的角度。固体表面可以是光滑、平坦或平面表面。这可经由杨氏方程(Young equation)来量化液体(例如，水)对固体表面的润湿。在一些情况下，可以观察到水接触角滞后，范围从所谓的前进(最大)水接触角到后退(最小)水接触角。在这些数值中可以找到并可由其计算平衡水接触。疏水性和亲水性可使用水接触角以相对定量的方式表达。若表面具有小于90°的水接触角，则可认为固体表面是亲水性的或极性的。若表面具有大于90°的水接触角，则可认为固体表面是疏水性的或非极性的。具有低表面能的高度疏水性表面可具有大于 120°的水接触角。

可以通过适合于寡核苷酸合成的各种方式来调节涂覆表面的表面特征。可将表面选择成对普通寡核苷酸合成的条件呈惰性；例如，根据选定的化学，固体表面可在单体添加期间缺乏对本体溶剂界面的游离羟基、氨基或羧基。或者，表面可在寡核苷酸合成的第一循环或前几个循环开始之前包含反应性部分，而这些反应性部分可在寡核苷酸合成反应的一个、两个、三个、四个、五个或更多个循环之后很快被耗尽到不可测量的密度。可以针对例如由诸如乙腈和乙二醇醚或水性溶剂等常用有机溶剂引起的更好或更差的润湿，来相对于周围表面对表面进一步优化。

可使用硅烷表面修饰来生成宽范围的临界表面张力。相应地，本发明的方法和组合物可使用表面涂层，例如，包含硅烷的表面涂层，来获得小于5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、115、120mN/m或更高的表面张力。此外，本发明的方法和组合物可使用表面涂层，例如包含硅烷的表面涂层，来获得大于115、110、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6mN/m或更小的表面张力。在通过引用而整体并入于此的Arkles等人(Silanes and Other Coupling Agents.V0l.5v：The Role of Polarity in the Structure of Silanes Employed in Surface Modification.2009)的表1和表2中描述了表面涂层(例如，包含硅烷的表面涂层)的非限制性示例的水接触角和表面张力。所述表复制如下。

表1

水在光滑表面上的接触角(度)

注：表1中，硅烷的接触角是指硅烷向光滑表面上的水解沉积。这里的数据提取自多方面文献来源和作者著作。衬底之间的精确对比未考 虑测试方法的差异，或者所报告的是前进、后退还是平衡接触角。

表2

临界表面张力(mN/m)

用以测量水接触角的方法可使用本领域中已知的任何方法，包括静态座滴法、动态座滴法、动态吊片法、单纤维吊片法、粉末接触角法等。在一些情况下，可将本发明中在此所描述的衬底的表面或衬底的表面的一部分功能化或修饰成疏水性的，以具有低表面能，或者以具有在所述衬底的相关功能化表面的非弯曲的、光滑的或平面等效物上测得的大于约90°、95°、100°、105°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°或150°的如本文所述的水接触角。本文所描述的功能化表面的水接触角可以指小水滴在非弯曲、平滑、平坦和平面几何形状的功能化表面上的接触角。在一些情况下，可将本发明中在此描述的衬底的表面或者衬底的表面的一部分功能化或修饰成亲水性的，以具有高表面能，或者以具有在所述衬底的相关功能化表面的非弯曲的、光滑的或平面等效物上测得的小于约90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角。可以将衬底的表面或者衬底的表面的一部分功能化或修饰成与在功能化或修饰之前的表面或表面的部分相比更加亲水或疏水。

在一些情况下，可将一个或多个表面修饰成具有在一个或多个 非弯曲、光滑或平面等效表面上测得的大于90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角差异°在一些情况下，可将微结构、通道、可分辨的座位、可分辨的反应器帽或衬底的其他部分的表面修饰成具有差别疏水性，该差别疏水性对应于在此类结构的非弯曲、光滑或平面等效表面上测得的大于90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角差异。除非另有说明，本文提及的水接触角对应于在所讨论的表面的非弯曲、光滑或平面等效物上进行的测量。

在通过引用而整体并入于此的美国专利号6,028,189中描述了用于对表面进行功能化的其他方法。例如，可以通过首先在衬底内的每个座位上应用保护剂或抗蚀剂来生成亲水性可分辨的座位。继而可以用疏水剂来涂覆无保护区域，以产生非反应性表面。例如，可以通过向受保护圈周围的暴露氧化物上化学气相沉积(十三氟四氢辛基)-三乙氧基硅烷来创造疏水涂层。最后，可移除保护剂或抗蚀剂，暴露出衬底的座位区以供进一步的修饰和寡核苷酸合成。在一些实施方案中，此类无保护区的最初修饰可抵抗进一步的修饰并保留其表面功能化，而新的无保护区域可经受后续的修饰步骤。

多重平行微流体反应

在另一方面，本文描述了用于进行一组平行反应的系统和方法。所述系统可包括两个或更多个衬底，所述衬底可彼此密封(例如，可释放地密封)，在密封时形成多个可单独寻址的反应容积或反应器。通过从第二衬底释放第一衬底并将其与第三衬底对准，可以形成新的反应器组。每个衬底可携载用于期望反应的试剂，例如，寡核苷酸、酶、缓中液或溶剂。在一些实施方案中，该系统包括第一表面和封盖元件，其中所述第一表面带有处于第一适当密度的多个可分辨的座位，而所述封盖元件带有处于第二适当密度的多个可分辨的反应器帽。该系统可将所述多个可分辨的反应器帽与所述第一表面上的多个可分辨的座位对准，在第一表面与封盖元件之间形成暂时密封。在对准的 衬底之间的暂时密封可物理地将第一表面上的座位划分成约、至少约或小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200个座位或者更多个座位的组。本文所述的一组平行反应可根据本发明的方法和组合物来进行。可以将带有处于第一密度的多个可分辨的座位的第一表面与带有处于第二密度的多个可分辨的反应器帽的封盖元件对准，使得所述多个可分辨的反应器帽与所述第一表面上的多个可分辨的座位在第一表面与封盖元件之间形成暂时密封，从而物理地将第一表面上的座位划分成约、至少约或小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200个座位或者更多个座位的组。可以进行第一反应，形成第一组试剂。可以从第一表面释放封盖元件。在释放之后，反应器帽可各自保留先前密封的反应容积中的所述第一组试剂的至少一部分。所述多个可分辨的座位的密度可为约、至少约或小于约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个每1mm²。在一些实施方案中，所述多个可分辨的座位的密度可为约、至少约、小于约100个每mm²。所述多个可分辨的反应器帽的密度可为约、至少约、小于约1个每mm²。在一些实施方案中，所述多个可分辨的反应器帽的密度可为约、至少约或小于约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、 约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个每1mm²。本文所述的方法还可包括提供带有处于第三密度的多个可分辨的座位的第二表面，以及将所述多个可分辨的反应器帽与该第二表面上的多个可分辨的座位对准，并在第二表面与封盖元件之间形成密封，通常是暂时的或可释放的密封。新形成的密封可物理地将第二表面上的座位划分成约、至少约或小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200个座位或者更多个座位的组。可以可选地使用第一组试剂的一部分来进行第二反应，从而形成第二组试剂。可以从第二表面释放封盖元件。在释放之后，反应器帽可各自保留先前密封的第二反应容积中的第二组试剂的至少一部分。在一些情况下，带有多个可分辨的座位的第二表面的座位密度可至少为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个每1mm²。本文描述了系统、方法和仪器的实施方案的各个方面。

系统组装件可包括任何数目的静态晶片和任何数目的动态晶片。例如，该系统可包括位于一列中的三个衬底和一行中的四个衬底。传送系统可包括三个静态晶片(或衬底)和一个动态晶片(或衬底)。动态晶片可在多个静态晶片之间移动或传送。动态晶片可在三个静态安装的晶片之间传送。在一些实施方案中，动态晶片可具有约50、100、150、200或250mm或者2、4、6、8英寸或更大的直径。动态晶片可安装在温控真空吸盘中。本发明的系统允许如下配置：其中动态晶片可以在Z方向上移动(Z方向可为与要面对第二晶片的表面的晶片的表面相垂直的方向)，并具有约或小于约0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3μm的Z-位置控制，并可例如通过将动态晶片上的图 案与静态晶片上的另一图案在容差范围内相匹配来对准晶片的theta_z(两个晶片的要彼此面对的表面的法线之间的角度)。

在一些情况下，用于进行一组平行反应的系统和方法还可包括带有多个可分辨的座位的第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十表面和/或带有多个可分辨的反应器帽的封盖元件。所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十表面可对准，并可在两个表面与对应的封盖元件之间形成临时密封，从而物理地划分表面上的座位和/或反应器帽。可以使用从先前反应保留的试剂(亦即，第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九组试剂)的一部分来进行第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十反应，从而形成第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组试剂。可将本文所述的每个封盖元件从其对应的表面释放，其中反应器帽可保留另一反应容积的上一组试剂的至少一部分。在一些情况下，带有多个可分辨的座位的第二表面的密度可为至少2个/mm²。在一些实施方案中，带有多个可分辨的座位的第二表面的座位密度至少为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个每1mm²。每次保留的试剂的部分可根据所要进行的反应而不同，并被控制成期望的部分。

在各个实施方案中，本发明考虑到用于进行一组平行反应的系统，其包括带有多个可分辨的座位的第一表面和带有多个可分辨的反应器帽的封盖元件。如本文其他部分所进一步详细描述的，可将多个可分辨的座位与带有多个可分辨的反应器帽的封盖元件相组合以形成多个可分辨的反应器。在一些情况下，第一衬底的第一表面的可分辨的座位可包含试剂涂层。第二衬底的第二表面的可分辨的座位可包含试剂涂层。在一些实施方案中，所述试剂涂层可共价连接至第一表 面或第二表面。在存在第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十表面时的情况下，每个表面可包含试剂涂层。

第一表面或第二表面上的试剂涂层可包含寡核苷酸。如本文其他部分所进一步描述的，寡核苷酸可为任何长度，例如，至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300bp，或者更长。当用可分辨的反应器帽密封可分辨的座位时，可释放被包含在试剂涂层内的寡核苷酸。可以在多个可分辨的反应器内进行多种反应，例如，寡核苷酸扩增反应、PCA、测序文库的生成或差错校正。

图8中图示了使用本文所述系统的本发明的方法和组合物的总体处理工作流。

辅助仪器

在一方面，本发明涉及用于寡核苷酸合成的系统和方法。用于寡核苷酸合成的系统可包括扫描沉积系统。用于寡核苷酸合成的系统可包括第一衬底(例如，寡核苷酸合成晶片)和喷墨打印机，所述衬底具有功能化表面和多个可分辨的座位，而所述喷墨打印机通常包括多个打印头。每个打印头通常配置用于沉积多种用于在第一衬底的可分辨的座位中进行的反应的结构单元之一，例如，用于亚磷酰胺合成的核苷酸结构单元。如本文其他部分所进一步详细描述的，寡核苷酸合成晶片的可分辨的座位可位于微通道中。可以例如通过提供液体的持续流动而将衬底密封在流通池内，该液体例如是含有用于可分辨的座位内的反应的必要试剂(例如，甲苯中的氧化剂)或允许对合成位置(例如，寡核苷酸合成晶片的可分辨的座位)处的试剂剂量和浓度进行精确控制的溶剂(例如，乙腈)的液体。可以使用诸如氮气等惰性气体的流动，通常是通过增强挥发性衬底的蒸发来干燥衬底。可以使用多种手段，例如真空源/减压泵或真空罐，来创造降低的相对压强(负压)或真空，从而改善干燥以及减少表面上的残余含水量和任何小液滴。相应地，紧靠衬底或其可分辨的座位周围的压强可测得为约或小于约100、75、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01毫托(mTorr)，或者更小。

图3图示了用于寡核苷酸合成的系统的示例。相应地，寡核苷酸合成晶片被配置用于通过入口歧管以及可选地通过出口歧管来为用于寡核苷酸合成的可分辨的座位提供必要的本体试剂。在另一方面，本发明涉及包括晶片处理的用于寡核苷酸组装的系统。

在各个实施方案中，本发明利用到用于扫描沉积的系统。扫描沉积系统可包括喷墨打印机(inkiet)，该喷墨打印机可用于向刻蚀到衬底中的可分辨的座位或微孔沉积试剂。在一些实施方案中，扫描沉积系统可使用有机溶剂或墨水。在一些情况下，扫描沉积系统可包括多个晶片，诸如硅晶片，其直径通常为约200mm。在一些情况下，整个系统可放置在气压控制的包围体内并在其内发挥功能。扫描沉积系统可包括工作包封、打印头组装件、流通池组装件和/或服务包封。扫描沉积系统可包括服务于一个或多个衬底/晶片(诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50个或更多个衬底/晶片)的一个或多个(诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50个或更多个)流通池。

多个可分辨的座位和多个可分辨的反应器帽可位于具有互连性或流体连通的微结构上。这样的流体连通允许针对反应的不同步骤进行清洗和以小滴形式或使用连续流来灌注新试剂。流体连通微通道可含有通往和/或来自多个可分辨的座位和多个可分辨的反应器的入口和出口。如图9A中所示，本文所述的衬底可形成流通池的一部分。通过在衬底(即，晶片)顶部上滑动盖板可以闭合流通池，并且可将其夹持到位从而围绕衬底的边缘形成压力密封。在一些实施方案中，密封可足以抗真空或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个大气压密封。如图9B中所示，衬底/晶片可安装成使废物歧管侧向移置。这种设置可允许喷墨打印机更容易接近晶片。图9B和图9C中的箭头表示试剂的示例性流动方向。在一些情况下，如图9C中所示，试剂可通过底部上的薄间隙进入，穿过衬底(例如，硅晶片)中的孔穴，并被收集在废物收集器中。在一些情况下，可以通过上部歧管或底部歧管吹扫气体，以便例如通过流通池的底部或顶部逐出液体。出口或 入口端口可连接至真空以完成干燥。如图10中所示，真空端口可连接至废物侧或入口侧。在一些实施方案中，可存在穿过衬底(即，晶片)的多个压力释放孔。所述多个孔可多于约1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000或2000000个。在一些情况下，所述多个孔可多于五百万个。在一些情况下，本文其他部分所进一步详细描述的用于合成的微结构充当压力释放孔。这些孔可允许气体在可分辨的包围体(resolved enclosure)被抽空时从晶片的一侧穿过，以使衬底干燥。

本文所述的系统，诸如上文所述具有受控环境组装件的系统可包括真空装置/吸盘和/或可操作地与多个可分辨的反应器相连接的温度控制系统。衬底可放置在真空吸盘上。真空吸盘可包括位于衬底正下方的表面不规则性。在各个实施方案中，表面不规则性可包括通道或凹陷。真空吸盘可与衬底流体连通，以将气体从由通道所限定的空间抽出。在通过引用而整体并入于此的美国专利号8247221中进一步详细描述了将衬底保持在真空装置上的方法。

在各个实施方案中，衬底(例如，硅晶片)可以放置到吸盘上，诸如上文所述的真空吸盘上。图10举例说明了单槽真空吸盘和位于衬底与温度控制装置之间的烧结金属件的系统组装件。真空吸盘可包括具有用以容纳衬底的合适尺寸的单个沟槽。在一些实施方案中，将真空吸盘设计成使得衬底可在本文所述的一个或多个方法的过程中被保持就位。在图10A中作为示例而图示的真空吸盘包括直径大致为198mm的单个1-5mm沟槽。在一些情况下，单槽真空吸盘设计可用于提供改善的向衬底的热传递。图10B图示了位于衬底(例如，硅晶片)与真空吸盘之间的烧结金属嵌件，该烧结金属嵌件用粘合剂固定就位。在一些实施方案中，如在通过引用而整体并入于此的美国专利号5,530,516中所进一步描述的，该吸盘可为静电吸盘。

如在全都通过引用而整体并入于此的美国专利号8,367,016和欧洲专利号EP 0126621 B1中所描述的，可以使用本领域中已知的任何方法将多个可分辨的反应器帽与第一表面上的多个可分辨的座位 对准，在第一表面与封盖元件之间形成临时密封。例如，对于带有具有x、y和z维度以及沿着z维度定位的座位深度中心点的多个可分辨的座位的衬底，该座位深度中心点可位于离嵌入在衬底内的基准标记的已知z维度距离处。衬底可放置在成像系统内，该成像系统可包括能够检测基准标记的光学器件。所述光学器件可限定与z维度轴向对准的光路，并可具有垂直于该光路的焦平面。当焦平面沿着光路移动时，与当焦平面基本上不与z深度共面时相比，当焦平面处于z深度时可最大程度地检测到基准标记。基准标记可选择性地以合适的空间布置放置在第一衬底(例如，包括多个可分辨的座位的合成晶片)和/或第二衬底(例如，包括多个封盖元件的反应器元件)上。在一些实施方案中，全局对准基准标记可形成于可分辨的座位附近。根据应用，可能存在变化、改变和修改。例如，基准标记中的两个可位于可分辨的座位附近，而第三基准标记可位于衬底的边缘。举另一例而言，本文所述衬底中的微结构的图案本身可以适合于对准的可识别方式来选择，例如为非对称图案，并且可用于对准。在一些情况下，基准标记充当用以校正景深或其他光学特性的对准点。通过引用而整体并入于此的美国专利号4,123,661公开了位于衬底上的电子束对准标记，该标记彼此相邻但隔开一定距离，使得标记的上升斜面和下降斜面可由视频信号所检测，从而允许对准。

该系统可包括加热组件、冷却组件或者温度控制元件(例如，热循环器件)。在各个实施方案中，可将用以随多个可分辨的反应器使用的热循环器件配置用于进行核酸扩增或组装，诸如PCR或PCA，或者本文所述或本领域中已知的任何其他合适的核酸反应。

本文所述的任何系统均能够可操作地连接至计算机，并且可以本地或远程地通过计算机进行自动化。

主要组合物——寡核苷酸

本文所使用的术语“预选序列”、“预定序列”或“预确定序列”可互换使用。所述术语意味着聚合物的序列是已知的，并且是在聚合物的合成或组装之前选择的。在一个实施方案中，寡核苷酸为短核酸分 子。例如，寡核苷酸可为从约10个到约300个核苷酸、从约20个到约400个核苷酸、从约30个至约500个核苷酸、从约40个到约600个核苷酸，或者多于约600个核苷酸长。本领域技术人员知晓，寡核苷酸长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，从约10个到约400个核苷酸，或者从约300个到约400个核苷酸等)。根据特定应用的需要，可使用适当短或长的寡核苷酸。单个寡核苷酸可被设计成具有与文库中的另一寡核苷酸不同的长度。寡核苷酸可相对较短，例如更具体而言，短于200、100、80、60、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。还考虑到相对较长的寡核苷酸；在一些实施方案中，寡核苷酸长于或等于7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、500、600个核苷酸，或者更长。通常，寡核苷酸为单链DNA或RNA分子。

在本发明的一个方面，提供了用于合成多个具有预定序列的核酸的装置。该装置可包括具有多个特征的支持体，每个特征都具有多个寡核苷酸。在一些实施方案中，所述具有预定序列的多个寡核苷酸固定于固体支持体的不同离散特征上。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是单链的。在一些实施方案中，所述多个寡核苷酸序列可包含简并序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是与支持体结合的。在一些实施方案中，所述装置包含具有多个斑点(spot)或特征的固体支持体，所述多个斑点中的每一个包括多个与支持体结合的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸通过其3’末端共价连接至固体支持体上。然而，在其他实施方案中，所述寡核苷酸通过其5’末端共价连接至固体支持体上。

在一些实施方案中，与表面或者支持体结合的寡核苷酸通过其3’末端固定。应当理解，所谓3’末端，意指位于5’末端下游的序列，例如，在5’末端的2个、3个、4个、5个、6个、7个、10个、15个、20个或更多个核苷酸下游，再如，在该序列的3’半部、三分之一或者四分之一上，又如，远离绝对3’末端不到2个、3个、4个、5 个、6个、7个、10个、15个或20个核苷酸；而所谓5’末端，意指位于3’末端上游的序列，例如，在3’末端的2个、3个、4个、5个、6个、7个、10个、15个、20个或更多个核苷酸上游，再如，在该序列的5’半部、三分之一或者四分之一上，又如，远离绝对5’末端不到2个、3个、4个、5个、6个、7个、10个、15个或20个核苷酸。例如，寡核苷酸可通过核苷酸序列(例如，简并结合序列)、连接体或者间隔区(例如，不参与杂交的部分)固定在支持体上。在一些实施方案中，寡核苷酸包含间隔区或者连接体以将寡核苷酸序列与支持体隔开。有用的间隔区或连接体包括可光切割的连接体或者其他传统的化学连接体。在一个实施方案中，寡核苷酸可通过可切割的连接部分附着到固体支持体上。例如，可将固体支持体功能化以提供用于共价连接至寡核苷酸的可切割的连接体。连接体部分可以是六个或更多个原子的长度。或者，所述可切割部分可在寡核苷酸内，并可在原位合成过程中引入。众多的可切割部分在固相和微阵列寡核苷酸合成领域中是可获得的(参见，例如Pon，R.，Methods Mol.Biol.20：465-496(1993)；Verma等人，Annu.Rev.Biochem.67：99-134(1998)；美国专利号5,739,386、5,700,642和5,830,655；以及美国专利公布号2003/0186226和2004/0106728)。

在一些实施方案中，在支持体的不同特征上提供多个核苷酸构建体。在一些实施方案中，核酸构建体(包括短的寡核苷酸和较长的/组装的多核苷酸)是部分双链的或双链体寡核苷酸。如本文所使用的，术语“双链体”是指至少部分地为双链的核酸分子。术语“核苷”或“核苷酸”意在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有其他经过修饰的杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖，或其他杂环化合物，或本文所描述的或本领域已知的任何其他合适的修饰。此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不仅含有常规的核糖和脱氧核糖而且还含有其他糖的部分。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”应当为以下物质的统称：多 聚脱氧核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其他类型的为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的多核苷酸，以及其他含有非核苷酸骨架的聚合物(例如，PNA)，条件是该聚合物含有构造为允许碱基配对和碱基堆积的核碱基，如在DNA和RNA中所发现的。因此，这些术语包括已知类型的寡核苷酸修饰。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间在长度上并没有有意的区别，这些术语可以互换使用。

术语“附着”，如在例如具有“附着”至其上的部分的衬底表面中所使用的，包括共价结合、吸附和物理固定。术语“结合”与术语“附着”在含义上是相同的。

在一些实例中，所述装置在特定位置(即，“地址”)具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、50、100、1000、4000、10000、100000、1000000个或更多个不同的特征(或“区域”或“斑点”)。应当理解，装置可包含一个或多个固体支持体。装置的每个可寻址的位置可保持不同的组合物，如不同的寡核苷酸。或者，装置的成组可寻址位置可保持完全或基本相似的组合物，如寡核苷酸，该组合物不同于保持在装置的其他组显微结构中的那些组合物。

可利用本发明的方法在可单独寻址的位置和/或在混合群体中制备的每一种寡核苷酸的数目的范围可以为5到500000、500到500000、1000至500000、5000至500000、10000至500000、20000至500000、30000至500000、5000至250000、5000至100000、5至5000、5至50000、5000至800000、5000至1000000、5000至2000000、10000到2000000、20000到1000000、30000到2000000等。在各个实施方案中，每种寡核苷酸可合成大约或超过约5、10、20、50、100、500、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000个或更多个拷贝。在一些情况下，可以合成寡核苷酸的少于100000000、10000000、1000000、100000、10000、1000、100个或更少的拷贝。

基因

在各个实施方案中，本发明的方法和组合物允许构建包含一些 受关注的可单独获取的多核苷酸的基因文库。基因文库可包含至少约10、100、200、300、400、500、600、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000、15000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000个或更多个成员。

可以得到或容易确定可单独获取的成员的位置。可单独获取的成员可以容易地从文库中检索得到。

在一些实施方案中，文库的子区段可包含编码合成生物体(例如病毒或细菌)的基因组的一部分或者全部的基因、由该基因组成或者基本上由该基因组成。因此，术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换使用并且指代核苷酸聚合物。除非另有限制，这些术语包括天然核苷酸的已知的类似物，这些类似物能够以与天然存在的核苷酸相似的方式起作用(如，杂交)。

如本文所使用的，术语“互补”是指在两个核苷酸之间精确配对的能力。如果核酸中给定位置处的核苷酸能与另一个核酸中的核苷酸氢键键合，则认为这两个核酸在该位置上是互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有部分的核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，它可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率以及强度具有显著的影响。

“杂交”和“退火”是指这样的反应：其中一个或多个多核苷酸发生反应以形成复合体，该复合体通过核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而得到稳定。氢键键合可通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合体可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合体的三条或更多条链、自杂交的单链，或它们的任何组合。杂交反应可构成更广泛的过程中的一步，如PCR或其他扩增反应的启动，或者核酶对多核苷酸的酶切。可通过与第二序列的核苷酸残基的碱基进行氢键键合而被稳定的第一序列被称为与所述第二序列“可杂交”。在这种情况下，第二序列也同样可以被称为可与第一序列杂交。

术语“引物”指这样的寡核苷酸：它能与核酸杂交(也称为“退 火”)，并能在适当的条件下(即，在四种不同核苷三磷酸和用于聚合的试剂，如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的存在下)在适当的缓中液和合适的温度下充当核苷酸(RNA或DNA)聚合的起始位点。

寡核苷酸合成 

在本文中所描述的衬底上合成的寡核苷酸可优选在小于20、10、5、1、0.1cm²或更小的表面积内包含多于约100个，优选多于约1000个，更优选多于约16000个，且最优选多于约50000个或250000个或甚至多于约1000000个不同的寡核苷酸探针。

在各个实施方案中，本文进一步描述了在衬底上快速合成n聚体，如约为或至少约100-、150-、200、250-、300、350-或更长的核苷酸、寡核苷酸的方法。该方法可使用具有可分辨的座位的衬底，该衬底用适于核苷酸偶联的化学部分进行功能化。在一些情况下可使用标准亚磷酰胺化学法。在一些实施方案中，n聚体寡核苷酸的大文库在衬底上平行合成，例如，衬底具有约为或至少约100、1000、10000、100000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000个承接(hosting)寡核苷酸合成的可分辨的座位。各个座位可承接彼此不同的寡核苷酸的合成。该衬底可包含通孔，如至少约100、1000、10000、100000、1000000个或者更多个通孔，来提供衬底的第一表面和衬底的第二表面之间的流体连通。

常用的制备合成核酸的方法是基于Caruther_s的基础研究，被称为亚磷酰胺法(M.H.Caruthers，Methods in Enzymology 154，287-313，1987；其通过引用而全文并入于此)。所得到的分子的序列可通过合成的顺序来控制。诸如H-膦酸酯法等其他方法用于同样的从聚合物的亚单元连续合成聚合物的目的。

通常情况下，通过本发明的方法进行的DNA寡聚体的合成可通过传统的亚磷酰胺化学法实现。基于亚磷酰胺的核酸的化学合成是本领域技术人员公知的，综述于Streyer，Biochemistry(1988)第123-124页以及美国专利号4,415,732中，这些文献通过引用而并入于此。包括可与本发明一起使用的B-氰乙基(CE)亚磷酰胺单体和CPG (可控多孔玻璃)试剂在内的亚磷酰胺试剂可从包括American International Chemical(Natick Mass.)、BD Biosciences(Palo Alto Calif.)等众多商业来源购买得到。

亚磷酰胺化学法已适用于DNA在诸如微阵列的固体衬底上的原位合成。这样的合成通常是通过对合成循环的一个步骤的空间控制来实现的，这种空间控制导致数千至数十万个独特的寡核苷酸分布在小区域，如数平方厘米的区域内。用于合成寡核苷酸的区域和衬底结构将会在本文的其他部分进一步更详细地描述。用于实现空间控制的合适的方法可包括(i)通过喷墨打印或物理掩模对偶联步骤的控制，(ii)通过对光不稳定单体进行的经典的、无掩模光刻脱保护而对5’-羟基去封闭(deblock)步骤的控制，(iii)光生酸(photogenerated acid)的数字活化，以进行标准的脱三苯甲基。

在各个实施方案中，本发明的方法和组合物提供条件，以实现高偶联率、低脱嘌呤化以及保护基团的有效去除，从而允许以低错误率并行地合成长寡核苷酸。

在各个实施方案中，本文所描述的本发明的方法和组合物依赖于本领域已知的在功能化衬底上进行的标准亚磷酰胺化学法，该功能化衬底例如是可选地采用合适的修饰的甲烷硅基化晶片。通常，在用于亚磷酰胺化学法的单体如单核苷酸、二核苷酸或具有适当修饰的更长寡核苷酸沉积之后，可至少一次地进行下列步骤中的一个或多个，以实现高质量聚合物的原位分步合成：1)偶联，2)加帽，3)氧化，4)硫化，5)去封闭(脱三苯甲基)，和6)洗涤。通常，使用氧化或硫化作为一个步骤，而不是两个都使用。图11例示了包括偶联、加帽、氧化和去封闭步骤的四步亚磷酰胺合成法。

为了承接亚磷酰胺化学法，衬底中寡核苷酸合成座位的表面可经化学修饰，以提供用于将正在生长的核苷酸链连接至表面的合适的位点。存在允许将核苷酸附着至衬底表面的不同类型的表面修饰化学法。表面修饰在其实施上可不同，这取决于寡核苷酸链是伴随着核酸碱基的脱保护而从表面上切下，还是在脱保护之后保持附着在表面上。 不同类型的合适的表面修饰化学法是本领域已知的，并在www.glenresearch.com描述，其通过引用而全文并入于此。存在一种表面修饰技术，其允许在寡核苷酸链保持附着在衬底的同时，A、G和C碱基的环外N原子被脱保护。

另一个方案包括使三烷氧基甲硅烷基胺(例如(CH₃CH₂0)₃Si-(CH₂)₂-NH₂)与玻璃或二氧化硅表面SiOH基团反应，随后与琥珀酸酐与胺反应，以产生酰胺键和游离的OH，可在该游离OH上开始核苷酸链生长。

第三类型的连接体基团可基于可光切割的引物。这种类型的连接体允许将寡核苷酸从衬底上去除(通过用光，例如用约350nm的光照射)，而不切割每个碱基上的含氮官能团上的保护基团。典型的氨或NH₃处理在用作从衬底上切割寡聚体的试剂时将所有基团脱保护。这种类型的可光切割的连接体的应用在www.glenresearch.com描述。其他各种合适的可切割的连接体基团是本领域已知的，并可替代使用。

在各个实施方案中，本发明的方法和组合物考虑了在衬底上合成的寡核苷酸文库，其中该文库包含不同大小的寡核苷酸，正如在本文的其他部分进一步详细描述的。此外，本发明的方法和组合物允许在衬底上合成不同大小、序列或核苷酸组成的基本相似量的寡核苷酸，或者在一些情况下，不同的预选定的量的寡核苷酸。任意两种合成的寡核苷酸之间量的差异可限制为少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或者更少，或者，作为整个文库中的相对误差或偏差百分比。正如本文其他部分进一步详细描述的，本文所描述的本发明的方法和组合物考虑在衬底上以期望的量合成的寡核苷酸。

这样的原位合成方法可基本看作是对以下小滴沉积顺序进行重复：受保护的单体沉积至衬底上的预定位置上，以与适当活化的衬底表面(或与先前沉积的脱保护单体)连接；对沉积的单体进行脱保护，以使它能与随后沉积的受保护单体反应；以及沉积另外的受保护的单体以供连接。在任何一个循环中，不同的单体可在衬底上的不同区域 沉积，从而使所完成的阵列的不同区域会如所期望的在所完成的阵列中携带不同的生物聚合物序列。每次重复时可能需要另外的一个或多个中间步骤，如氧化、硫化和/或洗涤步骤。

可通过将本领域已知的各种合适的合成方法应用到本文所描述的方法和组合物中来实现寡核苷酸的原位合成。一种这样的方法是基于光刻技术，该技术涉及通过使用光不稳定的保护基团，在固体或者聚合物表面上的预定的可分辨的位点处直接原位合成寡核苷酸(Kumar等人，2003)。

固体支持体上高密度寡核苷酸如阵列的制备和应用之前已进一步公开于例如PCT公布号WO 97/10365、WO 92/10588、在1996年12月23日提交的美国专利号6,309,822、在1995年9月15日提交的序列号6,040,138、在1993年12月15日提交的序列号08/168,904、在1990年12月6日提交的序列号07/624,114、在1990年6月7日提交的序列号07/362,901，以及美国5,677,195中，上述所有文献均通过引用而并入于此以用于各种目的。在一些采用高密度阵列的实施方案中，使用诸如在美国专利号5,445,934和6,566,495(均通过引用而并入于此以用于各种目的)中所公开的超大规模固定化聚合物合成(VLSIPS)等方法合成高密度寡核苷酸阵列。每个寡核苷酸都占用衬底上的一个已知位置。

以最少数目的合成步骤形成寡核苷酸、肽和其他聚合物序列的高密度阵列的其他各种合适的方法是本领域已知的。寡核苷酸类似物阵列可通过多种方法在固体衬底上合成，该方法包括但不限于光引导的化学偶联和机械引导的偶联。参见Pirrung等人，美国专利号5,143,854(也可参见PCT申请WO 90/15070)；和Fodor等人，PCT公布号WO 92/10092和WO 93/09668和美国序列号07/980,523，这些文献公开了使用例如光引导的合成技术来形成肽、寡核苷酸以及其他分子的巨大阵列的方法。也可参见Fodor等人，Science，251，767-77(1991)。这些用于合成聚合物阵列的程序现在被称为VLSIPS方法。使用VLSIPS方法，通过在多个反应位点上同时偶联，将聚合物的一 个非均质阵列转化为不同的非均质阵列。参见美国申请序列号07/796,243和07/980,523。

到目前为止已知的用于阵列原位合成的方法的实例为：基于光的光刻合成(McGall，G.等人；J.Amer.Chem.Soc.119；5081-5090；1997)，基于投影仪基于光的合成(PCT/EP99/06317)，利用反应空间的物理分离而进行的流体合成(本领域技术人员从英国牛津的E.Southern教授以及英国牛津的Oxford Gene Technologies公司的研究可知)，通过光活化的光酸(photo-acid)和在反应支持体中的合适的反应室或者物理分离的反应空间而进行的基于投影仪的光控制的间接合成，利用由电极诱导的质子产生通过支持体上各个电极上的空间可分辨的脱保护而进行的电诱导合成，以及通过活化的合成单体的空间可分辨的沉积而进行的流体合成(从A.Blanchard，Genetic Engineering中，Principles and Methods，Vol.20，Ed.J.Sedlow，111-124，Plenum Press；A.P.Blanchard，R.J.Kaiser，L.E.Hood，High-Density Oligonucleotide Arrays，Biosens.&Bioelectronics 11，687，1996中可知)。

在各个实施方案中，可使用先前获得的生物聚合物的沉积或者原位合成方法来制备衬底上或衬底内的生物聚合物阵列。该沉积方法通常包括在衬底之上或之内的预定位置处沉积生物聚合物，该位置已被适当地活化，从而使生物聚合物可与之连接。不同序列的生物聚合物可在衬底之上或之内的不同区域沉积。本领域已知的用于沉积先前获得的多核苷酸，尤其是诸如完整寡聚体或cDNA的DNA的典型程序包括但不限于将多核苷酸以脉冲喷射头的形式装载到液滴分配器内，并发射到衬底上。这种技术已经在WO 95/25116和WO 98/41531中描述，这两篇文献均通过引用而全文并入于此。用于将液滴沉积至衬底的可分辨的位点的各种合适的喷墨形式是本领域已知的。

在一些实施方案中，本发明可以依赖于在整个寡核苷酸文库或其部分内，例如在固定在表面上的寡核苷酸文库内使用预先合成的寡核苷酸。可通过在衬底之上、之内或穿过衬底的预定位置上沉积预先 合成的或天然的核酸来制备支持高密度核酸阵列的衬底。可通过光引导的靶向、寡核苷酸引导的靶向或者本领域已知的任何其他合适的方法将合成的或天然的核酸沉积在衬底的特定位置上。也可将核酸引导至特定的位置。可使用在不同的区域之间移动以将核酸沉积在特定斑点中的分配器。该分配器可通过通向选定区域的微通道来沉积核酸。典型的分配器包括用于将核酸递送至衬底的微量移液管或毛细管针，和用于控制微量移液管相对于衬底的位置的机器人系统。在其他实施方案中，该分配器包括一系列的管、歧管、移液管或毛细管针阵列等，以便能将各种试剂同时递送到反应区。

使用光引导的方法、流动通道和点样法(spotting method)、喷墨法、基于针的方法、基于珠的方法进行的、预先合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列与支持体的附着及其原位合成均在本发明的范围内。

本文所描述的系统可进一步包括用于向具有多个与支持体结合的寡核苷酸的第一斑点(或特征)提供小滴的构件。在一些实施方案中，该小滴可包括一种或多种组合物，该组合物包含具有待添加的特定或预定核苷酸的核苷酸或寡核苷酸(本文中也称为核苷酸添加构建体)，和/或允许进行杂交、变性、链延伸反应、连接以及消化中的一个或多个的试剂。在一些实施方案中，在任一个重复中，可将不同的组合物或不同的核苷酸添加构建体沉积在支持体上的不同位置处，以便产生预定的寡核苷酸序列的阵列(具有不同的预定寡核苷酸序列的支持体的不同特征)。一种特别有用的组合物沉积方法是将一个或多个小滴(每个小滴都含有所需试剂(例如核苷酸添加构建体))从与支持体表面间隔开的脉冲喷射装置沉积到支持体表面上或者内建于支持体表面的特征上。

为使由亚单位合成聚合物的化学方法的自动化成为可能，通常采用固相，在该固相上锚定正在生长的分子链。一旦合成结束，就可以将其分离，这可通过断裂实际聚合物与固相之间的适宜连接体来实现。为了自动化，该方法可直接采用衬底表面，或者该方法可采用活化粒子形式的固相的衬底表面，这些活化粒子填充在诸如可控多孔玻 璃(CPG)的衬底的圆柱(column)或微通道中。衬底表面有时会携带一种可特定移除类型的、具有预定序列的寡聚体(oligo)。然后可将各种合成试剂以可控的方式添加。可通过各种因素控制合成的分子的量，这些因素包括但不限于，专用的衬底表面的大小、支持体材料的量、反应批量的大小、用于合成的可用功能化衬底面积、功能化程度或合成反应的持续时间。

因此，本发明的各个实施方案涉及容纳组合物(通常为寡核苷酸)文库的衬底的制造和使用。当具有可分辨的特征的衬底具有不同部分(例如，不同的多核苷酸序列)的多个区域，使得在衬底上的特定的预定位置(即，“地址”)处的区域(即，衬底的“特征”或“斑点”)将检测特定的靶标或特定类别的靶标(尽管特征可能偶然检测到该位置上的非靶标)时，该衬底是“可寻址的”。衬底特征通常，但并不需要，由间隙来隔开。在一些情况中，特征可以内建于衬底中并且可创造出一维、二维或三维微流体几何结构。“衬底布局”指特征如位于衬底上的特征的一个或多个特点、一个或多个特征维度以及在给定位置处的部分的指示。

基因组装

在各个实施方案中，本发明涉及多核苷酸序列(也称为“基因”)的制备，其中采用在衬底表面上合成的或点样的重叠的较短寡核苷酸的组装，或具有(housing)用于合成或点样寡核苷酸的适宜表面的衬底，例如珠子。利用具有互补区的寡核苷酸与组装的连续寡核苷酸的退火，例如，使用缺乏链置换活性的聚合酶、连接酶、点击(Click)化学或本领域已知的任何其他合适的组装方法，可以将较短的寡核苷酸在同一条链上拼凑在一起。以这种方式，退火的核苷酸的序列可在相对链的连续寡核苷酸之间进行复制。在一些情况下，例如使用连接酶、点击化学或本领域已知的任何其他合适的组装化学方法，可以将同一条链的连续寡核苷酸缝接在一起，而不引入来自退火的寡核苷酸的序列元素。在一些情况下，可通过涉及较短的多核苷酸/寡核苷酸的数轮组装而分层合成较长的多核苷酸。

基因可由合并的大量合成的寡核苷酸组装而成。例如，可应用如Tian等人(Tian等人，Nature，432：1050，2004)所述的、使用具有600种不同寡核苷酸的池(pool)的基因合成。组装的基因的长度可通过使用较长的寡核苷酸进一步延长。对于甚至更大的基因和DNA片段，例如大于约0.5、1、1.5、2、3、4、5kb或更大，通常在分层基因组装过程内，可以应用多于一轮合成。如下文所述，如本文所公开的从寡核苷酸进行的PCR组装和合成可适于串联使用。

根据本发明的方法和组合物，可使用多种基因组装方法，从诸如连接酶链反应(LCR)(Chalmers和Curnow，Biotechniques，30(2)，249-52，2001；Wosnick等人，Gene，60(1)，115-27，1987)等方法到成套PCR策略(Stemmer等人，164，Gene，49-53，1995；Prodromou和L.H.Pearl，5(8)，Protein Engineering，827-9，1992；Sandhu等人，12(1)，BioTechniques，14-6，1992；Young和Dong，Nucleic Acids Research，32(7)，e59，2004；Gao等人，Nucleic Acids Res.，31，e143，2003；Xiong等人，Nucleic Acids Research，32(12)，e98，2004)(图11)。

在各个实施方案中，聚合酶介导的组装技术的变化形式(统称为聚合酶构建和扩增)用于多核苷酸的化学合成。一些本领域已知的用于定制基因合成的常用技术是基于聚合酶循环组装，并且通过寡核苷酸池的组装可实现较长寡核苷酸的从头合成。可合成寡核苷酸池作为结构单元，以用于各种基因合成技术。寡核苷酸的序列、长度和精确分布，以及该池内的任何序列重叠，可根据所需要的多核苷酸序列和使用的组装方法来设计。例如，采用对于重叠寡核苷酸的变性、退火和延伸必要的温度条件，通过数个PCR步骤，可获得所需要的全长DNA。

条形码

条形码为通常已知的核酸序列，其允许鉴别与该条形码相关联的多核苷酸的一些特征。在一些实施方案中，条形码包含核酸序列，该核酸序列在连接到靶多核苷酸时用作该靶多核苷酸所源自的样品的标识物。

条形码可设计成合适的长度，以允许足够的识别度，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55个或更多个核苷酸的长度。同一个分子上可使用多个条形码，如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个条形码，这些条形码可选地由非条形码序列隔开。在一些实施方案中，条形码的长度短于10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。在一些实施方案中，多个条形码中的每一个条形码与所述多个条形码中的所有其他条形码在至少3个核苷酸位置上不同，例如在至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位置上不同。

喷墨沉积

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物利用将组合物沉积、定位或放置在支持体表面之上或之内的特定位置处。沉积可包括使一种组合物与另一种组合物相接触。沉积可以是手动的或自动的，例如，沉积可通过自动化的机器人装置来完成。脉冲喷射或喷墨可用于将流体组合物的液滴分配到支持体上。脉冲喷射通常通过将压力脉中(例如通过压电或热电元件)递送到与出口或孔口相邻的液体，从而使液滴可由此进行分配来运行。

可使用本领域已知的各种方法或系统将试剂液体沉积到在本文其他部分进一步详细描述的衬底的可分辨的座位上。流体的微滴可以以亚微米精度递送至在本发明描述的衬底之上或之内的表面或可分辨的座位上。

用于将试剂沉积或递送至可分辨的座位的系统可包含一个或多个子系统，包括但不限于：微型喷射分配头、流体递送系统或喷墨泵、X-Y定位系统、视觉系统或系统控制器。微型喷射分配头可以是多个微型喷射(MicroJet)装置(例如，8个微型喷射装置)和所需要的驱动电子设备的组装件。通过使用驱动电子设备的单一通道来多路复用8或10个分配装置可使系统的复杂度最小化。针对每个单独装置 的驱动波形的要求可从系统控制器下载。驱动电子设备可使用本领域已知的常规方法构建。流体递送系统或喷墨泵可以是经过改进以充当多试剂输入系统的Beckman Biomec。在流体递送系统和微型喷射分配头之间可以是电磁阀系统，其由系统控制器控制。它们提供加压冲洗流体和空气以从系统中排除试剂，并且提供真空以将试剂加载到系统内。X-Y定位系统可以是任何市售的带有控制器的精确X-Y定位系统。定位系统的尺寸可设置为容纳多个传感器。视觉系统可用于校准每个微型喷射装置相对于定位系统的“着陆区(landing zone)”。校准可发生在每个试剂加载循环之后。此外，当传感器托盘通过传感器上的基准标记首次加载时，该视觉系统可以定位每个传感器上的各个分配位点。可使用基于软件的系统或基于硬件的视觉系统。系统控制器可以是用作总体系统控制器的标准计算机系统。视觉系统的图像捕捉和处理也存在于系统控制器上。用于将试剂沉积或递送至可分辨的座位的系统进一步详细描述于PCT公布号W02000039344，其通过引用而全文并入于此。

图12示出了喷墨组装件的一个实例。在一些实施方案中，喷墨组装件可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、45、48、50、56、60、64、72、75、80、85、90、95、100个或更多个喷墨头。喷墨头可各自沉积不同的密码子(三核苷酸)结构单元。在一个示例性的实施方案中，喷墨头可具有硅孔板，该硅孔板具有各自中心相距254μm的256个喷嘴，并且具有100μm的飞移高度。每个喷墨头可接近每个贯穿的孔。喷墨组装件可具有约100mm/s的扫描速度，其在移动(x，y)平面内的精度约为2μm。在一些情况下，喷墨组装件在晶片以上的扫描高度可以约为100μtm，且具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μm的平整度偏差(flatness runout)。在一些情况下，喷墨组装件可包含用以将喷墨打印机与吸持在真空吸盘上的衬底(例如，硅晶片)对准的视觉系统，在某些情况下作为流 通池组装件的一部分。

如在本文其他部分所描述的，微结构可包含彼此流体连通的多个通道。在一些情况下，微结构可包含至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个流体连通的通道。如在本文其他部分进一步详细描述的，这些通道可具有不同的尺寸，例如宽度或长度。在一些实施方案中，微结构的流体连接的通道可包含两个或更多个具有相同的宽度、长度和/或其他维度的通道。

可程序化的拆分(split)

本文所描述的系统可包含多个可分辨的座位和多个可分辨的反应器帽，它们可密封在一起以形成多个可分辨的反应器。多个可分辨的反应器可含有试剂。密封可以是可逆的或松动的，并且所述多个可分辨的反应器帽可从所述多个可分辨的座位上释放。一旦从包含多个可分辨的座位的第一表面上释放，所述反应器帽可保留至少一部分试剂。通过控制反应器帽从所述多个可分辨的座位上的释放，可以控制液体或试剂的分隔。在本发明的一个方面，本文描述了分隔方法。该方法可包括使包含第一多个可分辨的座位处的液体的第一表面与包含第二多个可分辨的座位的第二表面如反应器帽相接触，其中第一表面可包含与液体间的第一表面张力，第二表面可包含与液体间的第二表面张力，并且确定释放速度，以使所需比例的液体可从所述第一多个可分辨的座位转移到所述第二多个可分辨的座位。一旦第二表面以这种计算出的速度与第一表面分离，所需比例的反应器内容物可保留在反应器中。包括第一多个可分辨的座位的第一表面可包含涂覆有寡核苷酸的多个可分辨的座位。包括第二多个可分辨的座位的第二表面可以是包含多个反应器帽的封盖元件。在一些情况下，该方法可进一步包括接触具有第三多个可分辨的座位的第三表面。本文中描述了各个方面或实施方案。

保留在第二表面上的液体可通过本领域已知的任何方法来保持。在一些情况下，第一或第二表面可包括保持至少一部分液体的微通道。在一些情况下，第一或第二表面可包括保持至少一部分液体的纳米反 应器。在一些情况下，液体可由于第一和第二表面之间的表面张力差而得到保留。不受理论制约，对于基于水的液体，较高比例的液体可保留在具有较高表面能或较低疏水性的表面上。

可对液体进行分隔，以使所需比例的试剂在释放后可以保留到第一或第二表面上。例如，非限制性地，所需比例可以为约、至少约或大于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

平行的微流体混合方法

在本发明的另一个方面，本文中描述了混合液体的方法。该方法可包括：提供第一衬底，其包括多个在其上制作的微结构；提供第二衬底，其包括多个可分辨的反应器帽；将第一衬底和第二衬底对准，以使所述多个反应器帽中的第一反应器帽配置为从第一衬底中的n个微结构接收液体；以及将液体从所述n个微结构递送至第一反应器帽内，从而混合来自所述n个微结构的液体，形成混合物。本文中描述了各种实施方案和变化形式。

可分辨的反应器帽的密度可以是使第一衬底的微结构与第二衬底的反应器帽达到所需要的对准的任何合适的密度。在一些情况下，可分辨的反应器帽的密度可以是至少1个/mm²。在一些情况下，可分辨的反应器的密度可以是每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500或约2000个位点。在一些实施方案中，可分辨的反应器的密度可以是每1mm²至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约75、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、 至少约1000、至少约1500、至少约2000或至少约3000个位点。

微结构可以是根据本发明的方法和组合物可用的任何密度。在一些情况下，微结构可以是约、至少约或小于每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000或约3000个位点的密度。在一些实施方案中，微结构可以是每1mm²至少100个的密度。在一些情况下，微结构可具有与可分辨的反应器的密度大约相同的表面密度。

在一些情况下，在将第一衬底和第二衬底对准后可使第一衬底和第二衬底之间存在间隙，例如小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的间隙，以使所述多个反应器帽中的第一反应器帽配置为从第一衬底中的n个微结构接收液体。

在一些情况下，在将第一衬底与第二衬底对准后，混合物或液体可部分地扩散到第一衬底和第二衬底之间的间隙中，以使所述多个反应器帽中的第一反应器帽配置为从第一衬底中的n个微结构接收液体。部分扩散到间隙中的液体或混合物可形成毛细管被动阀。混合方法可进一步包括通过使第一和第二衬底更加紧靠在一起来密封该间隙。在一些情况下，所述第一和第二衬底可直接物理接触。

如在本文其他部分进一步详细描述的，所述多个微结构和反应器帽可具有任何合适的设计或尺寸。至少一个通道可具有圆形形状的横截面，其可包含约为、至少约、小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的横截面半径。

在一些情况下，通道可涂覆有诸如化学惰性部分的部分，该部分增加对应于如本文其他部分所述的所需水接触角的表面能。

在一些情况下，总混合液的体积可大于反应器帽的容积。全部或部分反应器帽表面，如边缘表面，可利用本文其他部分进一步详细描述的以及本领域已知的合适的表面修饰方法进行修饰。在一些情况下，对表面不规则性进行工程设计。化学表面修饰和不规则性可用于调节边缘的水接触角。类似的表面处理也可应用于衬底的表面上，该衬底表面紧靠反应器帽，从而形成密封，例如可逆密封。如本文其他部分进一步详细描述的，可在两个表面之间使用毛细管被动阀。表面处理在对此类包含毛细管被动阀的密封的精确控制中可能是有用的。

虽然本文已示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅仅是通过示例的方式提供的。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，可在实施本发明时采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

实施例1.微流体装置。

如图13D中所示，根据本发明的方法和组合物制造出包括基本上为平面的衬底部分的微流体装置。图13E中示出了该衬底的横截面。该衬底包括108个聚簇，其中每个聚簇包括109个流体连接分组。每个分组包括从第一通道延伸的5个第二通道。图13A为每个包括109个分组的聚簇的装置视图。图13C为图13A的聚簇的处理视图。图13B为图13A的剖面图，图中示出一行11个分组。图13F为图13D中所示衬底的另一视图，其中可见标签的位置。图13G为图13A的放大图，图中指示出聚簇的109个分组。

如图13A和图13C中所示，109个分组布置成偏移的行，以形成圈状图案的聚簇，其中单个区域彼此不重叠。单个分组形成圈。如2503所表示，这些分组的3个行之间的距离为0.254mm。如2506所示，一行分组中的两个分组之间的距离为0.0978mm。如2504所示，分组中的第一通道的横截面为0.075mm。如2505所示，分组中的每个第二通道的横截面为0.020mm宽。如2502所示，分组中的第一通 道的长度为0.400mm。如2501所示，分组中的每个第二通道的长度为0.030mm。

图13A和图13C中所示的109个分组的聚簇布置成适合于在可放置于图13A和图13C中的聚簇附近的单一反应孔中放置的构形。图13D中的其余聚簇类似地以促进向诸如图14和实施例2中所述纳米反应器板等多个反应孔中递送的方式布置。该衬底包括108个聚簇，从而提供11772个分组。

如2508所指示，该衬底沿着一个维度的宽度为32.000mm。如2519所指示，该衬底沿着另一维度的宽度为32.000mm。

如图13D中所示，基本上为平面的衬底部分包括108个分组聚簇。聚簇布置成行，从而形成正方形形状。如2518所指示，在一个维度上从聚簇的中心到原点的最远距离为24.467mm。如2509所指示，在另一维度上从聚簇的中心到原点的最远距离为23.620mm。如2517所示，在一个维度上从聚簇的中心到原点的最近距离为7.533mm。如2512所示，在另一维度上从聚簇的中心到原点的最近距离为8.380mm。如2507和2522所示，同一行中两个聚簇的中心之间的距离为1.69334mm。

该衬底包括3个基准标记，以促进微流体装置与系统的其他组件的对准。第一基准标记位于原点附近，其中该基准标记比任一聚簇都更为靠近原点。第一基准标记在一个维度上位于离原点5.840mm处(2516)并且在另一维度上位于离原点6.687mm处(2513)。第一基准标记在一个维度上位于离聚簇1.69334mm处(2515)并且在另一维度上位于离同一聚簇1.69344mm处(2514)。另外两个基准标记各自位于离衬底边缘0.500mm处(2510和2520)以及离原点16.000mm处(2511和2521)。

图13E中示出了衬底的横截面，其中如2523所指示，分组的总长度为0.430mm。

图13F中示出了衬底的另一视图，图中示出109个聚簇的布置和标签的位置。标签位于离衬底边缘1.5mm处(2603)。如从原点 所测量的，标签位于4.0mm(2602)至9.0mm(2601)之间的距离处。

实施例2.纳米反应器。

如图14B和图14C中所示，根据本发明的方法和组合物制造出纳米反应器。图14A中示出纳米反应器的横截面。该纳米反应器包括108个孔。图14D为该纳米反应器的处理视图。图14E为图14B中所示纳米反应器的另一视图，其中可见标签的位置。

如图14B中所示，108个孔布置成行以形成正方形图案，其中单个孔在纳米反应器基底上凸起。如2711所示，一行孔中的两个孔的中心之间的距离为1.69334mm。如2721所示，孔的内部的横截面为1.15mm。如2720所示，包括孔的边缘在内的孔的横截面为1.450mm。如2702所示，纳米反应器中的孔的高度为0.450mm。如2701所示，纳米反应器的总高度为0.725mm。

图14B中的孔以促进从如图13所示例说明的具有108个聚簇的微流体装置向纳米反应器的108个反应孔中的递送的方式布置。

如2703所指示，纳米反应器沿着一个维度的宽度为24.000mm。如2704所指示，纳米反应器沿着另一维度的宽度为24.000mm。

如图14B中所示，纳米反应器包括108个孔。孔布置成行从而形成正方形形状。如2706所指示，在一个维度上从孔的中心到原点的最远距离为20.467mm。如2705所指示，在另一维度上从孔的中心到原点的最远距离为19.620mm。如2710所示，在一个维度上从孔的中心到原点的最近距离为3.533mm。如2709所示，在另一维度上从孔的中心到原点的最近距离为4.380mm。如2711和2712所示，同一行中两个孔的中心之间的距离为1.69334mm。如2707所示，在一个维度上从孔的中心到纳米反应器的边缘的距离为3.387mm。如2708所示，在另一维度上从孔的中心到纳米反应器的边缘的距离为2.540mm。

该纳米反应器包括位于装置面上的3个基准标记，以促进纳米反应器与系统的其他组件(例如，图1中所描述的微流体装置)的对 准。第一基准标记位于原点附近，其中该基准标记比任一孔都更为靠近原点。第一基准标记在一个维度上位于离原点1.840mm处(2717)并且在另一维度上位于离原点2.687mm处(2716)。第一基准标记在一个维度上位于离孔1.6933mm处(2719)并且在另一维度上位于离同一孔1.6934mm处(2718)。另外两个基准标记各自位于离纳米反应器的边缘0.500mm处(2714和2715)以及离原点12.000mm处(2713)。

如图14D中所示，该纳米反应器包括位于处理面上的4个基准标记。在一个维度上从基准标记的中心到纳米反应器的最近边角的距离为1.000mm(2722和2723)。基准标记在一个维度上的长度为1.000mm(2724和2725)。如2726所示，基准标记的宽度为0.050mm。

图14E中示出该纳米反应器的另一视图，图中示出108个孔的布置和标签的位置。标签位于离纳米反应器的边缘1.5mm处(2728)。标签位于离纳米反应器的边角1.0mm处(2727)。标签的长度为9.0mm。

实施例3.寡核苷酸合成装置的制造。

使用如图16中所示的前端处理方法刻蚀出具有夹着二氧化硅电绝缘体层的约30μm厚装置层和约400μm厚处理层的绝缘体上硅(SOI)晶片，以创造出实施例1中所描述的包括具有三维微流体连接的多个特征的示例性衬底。图15详细图示了该装置的设计特征。对SOI晶片进行氧化，以在全部两个表面用热氧化物将其覆盖(图16A)。如图16B中所示，对装置侧施加光刻，以创造出光致抗蚀剂掩模(红色)。使用深反应离子刻蚀(DRIE)步骤来将垂直侧壁刻蚀到约30μm以上的深度，直至位于没有光致抗蚀剂的位置上的SOI氧化物层(图16C)。使用本领域中已知的标准抗蚀剂剥离工艺来剥离光致抗蚀剂。

在处理侧上重复进行光刻、DRIE和光致抗蚀剂剥离(图16E-图16G)，以生成根据实施例1中所述装置的期望图案。使用湿法刻蚀工艺来移除隐埋的氧化物(BOX)(图16G)。通过热氧化来移除 可能已经沉积在微流体特征的侧壁上的污染含氟聚合物。使用湿法刻蚀工艺来剥离在热氧化过程中沉积的热氧化层。

经刻蚀的S0I晶片经受如图17中所描述的处理步骤。

首先，通过使用Piranha溶液的湿法清洗步骤并于随后进行干O₂等离子体暴露来清洗晶片。在受向约20μm宽的装置层通道中的芯吸所支配的工艺中用光致抗蚀剂涂覆芯片的装置层(在图17B的顶部)。使用光刻来对光致抗蚀剂进行图案化，以暴露期望为惰性(将来无寡核苷酸合成)的区域。该工艺通过将抗蚀剂经具有所关注的图案的二元掩模暴露于光而工作。在暴露之后，在显影液中移除暴露区中的抗蚀剂(图17C)。

通过化学气相沉积(CVD)将无光致抗蚀剂的表面暴露于氟硅烷气体。这导致碳氟化合物在无光致抗蚀剂的表面上的沉积。在替代的应用中，将烃硅烷用于该步骤。经硅烷化的表面对附加的硅烷层无反应，从而在表面上创造出单层。继而，在有机溶剂中溶解光致抗蚀剂，从而在表面上留下氟化并暴露处于光致抗蚀剂下面的硅/二氧化硅。进行最后的主动功能化步骤，以准备用于寡核苷酸生长的表面(图17F)。

通过使用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺在乙醇和乙酸中的1％溶液进行4小时的湿法工艺，随后将芯片置于150℃的热板上达14小时，在表面上获得受控的羟基表面密度(图18)。在替代的应用中，通过向表面递送气态硅烷并施加约200mTor的受控沉积压强和约150℃的受控温度来进行CVD工艺。CVD工艺允许原位等离子体清洗，并且很适合于产生高度有序的自组装单层(SAM)。

图19示出根据上述方法制造的装置的图片。

实施例4.纳米反应器装置的制造。

制造出如图20中所描述的具有纳米孔的纳米反应器芯片。对尺寸合适的硅晶片进行氧化，以在全部两个表面上用热氧化物将其覆盖(图21A)。

如图21B中所示，向背侧施加光刻以创造出光致抗蚀剂掩模(红 色)。背侧在没有光致抗蚀剂的位置上进行刻蚀，超出热氧化物层，从而创造出浅孔(图21C)。使用本领域中已知的标准抗蚀剂剥离工艺来剥离光致抗蚀剂(图21D)。

根据图21E中的图案在前侧上重复光刻步骤。通过使用定时刻蚀，使用深反应性离子刻蚀(DRIE)步骤来将垂直侧壁刻蚀至约450μm的深度。在其他情况下，使用SOI晶片，并将处理层向下刻蚀至BOX，其中BOX可充当刻蚀终止物(图21F)。剥离前侧上的光致抗蚀剂(图21G)，从而生成根据图20中所描述的装置的期望图案。通过热氧化来移除可能已经沉积在微流体特征的侧壁上的污染含氟聚合物，并且使用湿法刻蚀工艺来剥离在热氧化过程中沉积的热氧化层(图21H)。

接下来，通过使用Piranha溶液的湿法清洗步骤并于随后进行干O₂等离子体暴露来清洗晶片(图22A)。使用微滴沉积系统向单个孔中沉积抗蚀剂(图22B中的顶部)。通过化学气相沉积(CVD；图22C)将无抗蚀剂的表面暴露于氟硅烷气体。这导致碳氟化合物在无抗蚀剂的表面上的沉积。在替代的应用中，将烃硅烷或其他类型的硅烷用于该步骤。经硅烷化的表面对附加的硅烷层无反应，从而在表面上创造出单层。继而，在有机溶剂中溶解抗蚀剂，从而在表面上留下氟化并暴露处于抗蚀剂下面的硅表面。

图23A-图23B图示了如上所述制造的纳米反应器装置中的纳米孔。

Claims (26)

1.一种用于核酸合成的微流体装置，其特征在于，包括基本上为平面的衬底部分，该衬底部分包括位于相对表面之间的n个分组每组m个的微流体连接，

其中n*m个微流体连接中的每一个包括第一通道和第二通道，并且

其中所述n个分组中的每一个的第一通道由所有m个微流体连接所共用，

其中所述多个微流体连接沿着所述衬底的最小维度跨过所述基本上为平面的衬底部分，并且

其中n和m至少为2。

2.根据权利要求1的装置，其特征在于，所述第二通道包括高表面能涂层。

3.根据权利要求1的装置，其特征在于，还包括第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸附着至所述n个分组中的k个分组的第二通道。

4.根据权利要求3的装置，其特征在于，k为1。

5.根据权利要求3的装置，其特征在于，还包括第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸附着至所述n个分组中的L个分组。

6.根据权利要求5的装置，其特征在于，L为1。

7.根据权利要求5的装置，其特征在于，所述L个分组中没有任何分组在所述k个分组中。

8.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接至多为5mm、1.5mm、1.0mm或0.5mm长。

9.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n个分组中的每一个的第一通道至多为5mm、1.5mm、1.0mm或0.5mm长。

10.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n个分组中的每一个的第一通道至少为0.05mm、0.75mm、0.1mm、 0.2mm、0.3mm或0.4mm长。

11.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接中的每一个的第二通道至多为0.2mm、0.1mm、0.05mm、0.04mm或0.03mm长。

12.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接中的每一个的第二通道至少为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm或0.03mm长。

13.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n个分组中的每一个的第一通道的横截面至少为0.01mm、0.025mm、0.05mm或0.075mm。

14.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n个分组中的每一个的第一通道的横截面至多为1mm、0.5mm、0.25mm、0.1mm或0.075mm。

15.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接中的每一个的第二通道的横截面至少为0.001mm、0.05mm、0.01mm、0.015mm或0.02mm。

16.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接中的每一个的第二通道的横截面至多为0.25mm、0.125mm、0.050mm、0.025mm、或0.02mm。

17.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接中的每一个的第二通道的横截面的标准差小于横截面平均值的25％、20％、15％、10％、5％或1％。

18.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接的至少90％的第二通道的横截面变化至多为该横截面的25％、20％、15％、10％、5％或1％。

19.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，n至少为10、25、50、100、1000或10000。

20.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，m至少为3。

21.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接的至少90％的第二通道包括增大表面能的部分。

22.根据权利要求21的装置，其中所述表面能被增大到与小于75度的水接触角相对应的水平。

23.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n*m个微流体连接的至少90％的第二通道的宽深比小于1、0.5或0.3。

24.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述n个分组中的至少90％的第一通道的宽深比小于0.5、0.3或0.2。

25.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，至少10％、25％、50％、75％、90％或95％的所述n*m个流体连接的总长度处于所述基本上为平面的衬底的最小维度的10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、500％或1000％之内。

26.根据权利要求1-7中任何一项的装置，其特征在于，所述装置的所述基本上为平面的部分由SOI晶片制成。