CN203929627U - 固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪。它包括铝制散热器、半导体致冷片、ITO玻璃加热片、固体蛋白质样品压片、贴片式铂热电阻、高阻硅片、飞秒激光器、斩波器、分束器、光电导天线、第一抛面镜、分束硅片、聚四氟乙烯透镜、延迟线、反射镜、薄膜分束镜、ZnTe晶体、四分之一波片、沃拉斯顿棱镜、光电平衡探测器、锁相放大器、温度采集模块、可调电源、计算机、第二抛面镜。本实用新型可以充分利用太赫兹无损检测的优势，在不破坏蛋白质活性的情况下测量其热稳定性。

Description

固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪

技术领域

本实用新型属于太赫兹波技术领域，具体涉及一种固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪。

背景技术

太赫兹（Terahertz or THz）波通常是指频率在0.1～10THz区间的电磁波，其光子的能量约为1～10meV，正好与分子振动及转动能级之间跃迁的能量大致相当。大多数极性分子如水分子、氨分子等对THz辐射有强烈的吸收，许多有机大分子(DNA、蛋白质等)的振动能级和转动能级之间的跃迁也正好在THz波段范围。因此，物质的THz光谱(包括发射、反射和透射光谱)包含有丰富的物理质和化学信息，其吸收和色散特性可以用来做爆炸物、药物等化学及生物样品的探测和识别，在物理学、化学、生物医学、天文学、材料科学和环境科学等方面具有重要的应用价值。

THz光谱和成像技术对生物分子、水、非极性物体等独特的作用形式，可使得这种新型检测技术在材料检测领域取得突破。相对于近红外和中红外波段，THz辐射的优势在于其波长较长，物体的散射较小，THz辐射能透射大多数非极性物体，而只有极少的介质对近红外和中红外辐射是透明的。同时，利用THz时域光谱技术(THz-TDS)可同时获得样品的折射率、吸收系数和介电常数等全面的光学参数，为定量和全面分析提供更多有用信息。

目前用于蛋白质结构研究的有示差扫描量热法(Differential ScanningCalorimetry,DSC)、NMR、X射线衍射、微波介电谱和各类光谱法。介电谱和光谱法具有快速、无损的特点而更具应用潜力。目前已应用到蛋白质药物检测的光谱法包括紫外吸收谱、可见光吸收谱、圆二色谱(CD)、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和拉曼光谱等等。其中大部分技术缺乏提供对蛋白质功能起决定性作用的分子整体构象和分子间作用信息的能力。

人们发现反映DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结构和构象的分子集体振动转动能级位于THz波段，虽然我们可以用FTIR、自由电子激光、可调谐p-Ge激光和(Terahertz Time Domain Spectroscopy,THz-TDS)等多种技术得到物质的宽带THz谱，但THz-TDS技术的出现才真正改变了THz谱研究的面貌。THz-TDS系统不仅工作在常温下，系统体积小，并可方便的对样品用激励源进行激发，光路灵活，可随时监测。尤其是可以同时测量得到太赫兹波电场的幅度和相位，

这样可以直接得到样品的样品的吸收系数和折射率，或复介电常数，比单一的吸收谱可提供更多的样品信息。这利于对分子的振动/转动模式进行极化响应建模，利用各种动力学理论在THz波段研究蛋白质热变性问题。THz-TDS除了可对物质的复介电响应表征以外，还可以进行具有时间分辨率的测量，即对分子构象改变而引起的振动/转动模式演化进行实时测量。

在研究胶原蛋白等蛋白质从室温到120℃升温过程THz的介电谱研究发现，可以用单一弛豫时间Debye模型拟合这些介电谱以获得相应的弛豫时间，这些弛豫时间随温度升高逐渐变大，与在加热过程中分子内部构象的解折叠变性过程对应，并可以用Arrhenius方程拟合，得到活化能，获得了评价蛋白质加热变性难易程度的定量指标。并可以在此基础上预测蛋白质药物在不同温度下稳定储存时间。表明THz-TDS技术是研究蛋白质药物热稳定性的有力工具。

发明内容

本实用新型的目的是克服现有检测固体蛋白质热稳定性方法的不足，提供一种固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪。

固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪包括铝制散热器、半导体致冷片、ITO玻璃加热片、固体蛋白质样品压片、贴片式铂热电阻、高阻硅片、飞秒激光器、斩波器、分束器、光电导天线、第一抛面镜、分束硅片、聚四氟乙烯透镜、延迟线、反射镜、薄膜分束镜、ZnTe晶体、四分之一波片、沃拉斯顿棱镜、光电平衡探测器、锁相放大器、温度采集模块、可调电源、计算机、第二抛面镜；高阻硅片上放置圆片形固体蛋白质样品，在圆片形固体蛋白质样品上紧贴ITO玻璃加热器，在ITO玻璃加热器上面放置半导体致冷片,ITO玻璃加热器下表面边缘布置贴片式铂热电阻，半导体致冷片的制冷面向下，在半导体致冷片的制热面上放置铝制散热器；飞秒激光器产生激光光源，经过斩波器，被分束器分为较强的泵浦光和较弱的探测光，泵浦光射向光电导天线激发THz脉冲，THz脉冲经过经第一抛面镜准直，被分束硅片反射，再经聚四氟乙烯透镜聚焦入射到载有固体蛋白质样品的高阻硅片下表面上，经高阻硅片的上下表面反射，被聚四氟乙烯透镜准直后，再透过分束硅片，被第二抛面镜聚焦，并透过薄膜分束镜到达ZnTe晶体，与经过延迟线、反射镜并被薄膜分束镜反射的探测光汇合，探测光透过ZnTe晶体、四分之一波片、沃拉斯顿棱镜后被光电平衡探测器探测，所测电信号被锁相放大器放大后显示，同时根据铂热电阻经温度采集模块采集的温度数据控制可调电源进而控制半导体致冷片制冷或ITO玻璃加热器制热使蛋白质样品稳定达到目标温度。

本实用新型可以充分利用太赫兹无损检测的优势，在不破坏蛋白质活性的情况下测量其热稳定性。

附图说明

图1为固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪；

图2为太赫兹脉冲垂直入射高阻硅片时传播示意图；

图3为胶原蛋白从25℃到120℃加热变性过程(空心符号)及从120℃返回25℃的THz复介电谱(实心符号)((a)和(b)来自测量数据,(c)和(d)是单一弛豫时间Debye模型拟合)；

图4为ln(τ)和1000/T(K)的关系及Arrihenius方程拟合曲线

图中，铝制散热器1、半导体致冷片2、ITO玻璃加热片3、固体蛋白质样品压片4、贴片式铂热电阻5、高阻硅片6、飞秒激光器7、斩波器8、分束器9、光电导天线10、第一抛面镜11、分束硅片12、聚四氟乙烯透镜13、延迟线14、反射镜15、薄膜分束镜16、ZnTe晶体17、四分之一波片18、沃拉斯顿棱镜19、光电平衡探测器20、锁相放大器21、温度采集模块22、可调电源23和第二抛面镜24。

具体实施方式

如图1所示，利用固体蛋白质热稳定性的太赫兹谱检测装置包括铝制散热器1、半导体致冷片2、ITO玻璃加热片3、固体蛋白质样品压片4、贴片式铂热电阻5、高阻硅片6、飞秒激光器7、斩波器8、分束器9、光电导天线10、第一抛面镜11、分束硅片12、聚四氟乙烯透镜13、延迟线14、反射镜15、薄膜分束镜16、ZnTe晶体17、四分之一波片18、沃拉斯顿棱镜19、光电平衡探测器20、锁相放大器21、温度采集模块22、可调电源23、第二抛面镜24；高阻硅片6上放置圆片形固体蛋白质样品4，在圆片形固体蛋白质样品4上紧贴ITO玻璃加热器3，在ITO玻璃加热器3上面放置半导体致冷片2,ITO玻璃加热器3下表面边缘布置贴片式铂热电阻5，半导体致冷片2的制冷面向下，在半导体致冷片2的制热面上放置铝制散热器1；飞秒激光器7产生激光光源，经过斩波器8，被分束器9分为较强的泵浦光和较弱的探测光，泵浦光射向光电导天线10激发THz脉冲，THz脉冲经过经第一抛面镜11准直，被分束硅片12反射，再经聚四氟乙烯透镜13聚焦入射到载有固体蛋白质样品的高阻硅片6下表面上，经高阻硅片6的上下表面反射，被聚四氟乙烯透镜13准直后，再透过分束硅片12，被第二抛面镜25聚焦，并透过薄膜分束镜16到达ZnTe晶体17，与经过延迟线14、反射镜15并被薄膜分束镜16反射的探测光汇合，探测光透过ZnTe晶体17、四分之一波片18、沃拉斯顿棱镜19后被光电平衡探测器20探测，所测电信号被锁相放大器21放大后显示，同时根据铂热电阻5经温度采集模块22采集的温度数据控制可调电源23进而控制半导体致冷片(2)制冷或ITO玻璃加热器3制热使蛋白质样品稳定达到目标温度。

固体蛋白质热稳定性的太赫兹谱检测方法的步骤如下：

1)在太赫兹时域谱反射测量装置上，探测器探测的反射信号中包含空气硅界面反射脉冲和硅样品界面反射脉冲两部分，其中空气硅界面反射脉冲为参考信号e_ref(t)，硅样品界面反射脉冲作为测量样品信号

2)计算参考信号的傅立叶变换E_ref(ω)，ω为角频率；

3)匀值材料的实折射率n和消光系数k均为频率的函数，用复折射率 $\tilde{n}\left(\mathrm{\ω}\right)=n\left(\mathrm{\ω}\right)-\mathrm{ik}\left(\mathrm{\ω}\right)$ 统一表示,而对应的复介电常数为 $\widetilde{\mathrm{\ϵ}}\left(\mathrm{\ω}\right)={\mathrm{\ϵ}}^{\′}\left(\mathrm{\ω}\right)+{\mathrm{i\ϵ}}^{\′\′}\left(\mathrm{\ω}\right)=\stackrel{~2}{n}\left(\mathrm{\ω}\right),$ 太赫兹波在材料中的传播系数为在材料和界面的透射和反射系数为和在折射率为的氮气中太赫兹波正入射厚度为d₁的高阻硅片，高阻硅片的折射率为与高阻硅片紧贴蛋白质样品的折射率为得到参考信号和样品信号之间传输函数的理论模型

$H_{\mathrm{theory}}\left(\mathrm{\ω}\right)=\frac{E_{\mathrm{sam}}^t\left(\mathrm{\ω}\right)}{E_{\mathrm{ref}}\left(\mathrm{\ω}\right)}=\frac{T_{01}{T}_{10}{R}_{12}}{R_{01}}\exp (-i\frac{2\mathrm{\ω}{\tilde{n}}_1{d}_1}{c}).---\left(1\right)$

其中T₀₁为氮气到硅片的透射系数，T₁₀为硅片到氮气的透射系数，R₀₁为氮气到硅片的反射系数，R₁₂为硅片到蛋白质样品的反射系数；

4)利用参考信号的傅立叶变换E_ref(ω)和传输函数H_theory(ω)重建样品信号

$e_{\mathrm{sam}}^t\left(t\right)=\frac{1}{2\mathrm{\π}}{\∫}_{-\∞}^{\∞}{E}_{\mathrm{ref}}\left(\mathrm{\ω}\right)H_{\mathrm{theory}}\left(\mathrm{\ω}\right)e^{\mathrm{j\ωt}}\mathrm{d\ω};---\left(2\right)$

5)用单一弛豫时间Debye介电驰豫模型来表征固态蛋白质分子在温度变化过程中由于分子结构改变导致的介电弛豫响应过程，其表达式为

$\widetilde{\mathrm{\ϵ}}\left(\mathrm{\ω}\right)={\mathrm{\ϵ}}_{\∞}+\frac{{\mathrm{\ϵ}}_S-{\mathrm{\ϵ}}_{\∞}}{1+\mathrm{i\ω\τ}}---\left(3\right)$

其中ε_S为直流介电常数，ε_∞为高频介电常数，τ为驰豫时间，

蛋白质在温度升高时越过能垒ΔE，对应一个激活反应，相应分子结构变化和键的破坏与重排导致偶极子运动变化，则弛豫时间τ描述为：

$\mathrm{\τ}={\mathrm{\τ}}_0{e}^{\mathrm{\ΔE}/k_{b}T}---\left(4\right)$

其中k_b是玻尔兹曼常数，T为绝对温度，τ₀称为指前因子，ΔE称为活化能，在蛋白质加热变性过程中τ符合Arrhenius方程描述的规律，活化能ΔE作为固体蛋白质热稳定性的衡量指标；

6)假设高阻硅片的吸收率为零，取折射率n₁＝3.42，通过公式(1)得到蛋白质样品折射率和吸收系数的为

$n_2^0=\frac{n_1(1-R^2)}{1+R^2+2R\cos \mathrm{\φ}}.---\left(5\right)$

$k_2^0=\frac{-2n_{1}R\sin \mathrm{\φ}}{1+R^2+2R\cos \mathrm{\φ}}.---\left(6\right)$

其中R和φ来自公式 $\mathrm{Rexp}\left(\mathrm{i\φ}\right)=\frac{E_{\mathrm{sam}}^m\left(\mathrm{\ω}\right)}{E_{\mathrm{ref}}\left(\mathrm{\ω}\right)}\frac{R_{01}}{T_{01}{T}_{10}}\exp \left(i\frac{2{\mathrm{\ωn}}_1{d}_1}{c}\right),$

代入得到当前测量温度下的样品复介电常数，测量20℃时0.2-2.0THz的蛋白质介电常数，用公式(3)拟合得到单一弛豫时间Debye模型参数记为和把和作为初始值，并以用公式(3)换算成样品的折射率，代入H_theory(ω)并根据公式(2)重建然后定义重建样品信号和测量样品信号代价函数

$J=\underset{t}{\mathrm{\Σ}}{(e_{\mathrm{sam}}^t\left(t\right)-e_{\mathrm{sam}}^m\left(t\right))}^2---\left(7\right)$

并使用Nelder-Mead寻优法得到蛋白质样品在20℃时0.2-2.0THz太赫兹波段的精确的单一弛豫时间Debye模型参数ε_∞,20、ε_S,20和τ₂₀；

7)测量20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下蛋白质样品的THz时域反射脉冲信号，模型参数ε_∞,20、ε_S,20作为公式(3)中单一弛豫时间Debye模型的固定参数，并用同样的代价函数拟合优化得到这些温度下的弛豫时间参数τ₂₀、τ₂₅、τ₃₀、τ₃₅和τ₄₀，然后利用公式(4)拟合各温度下的弛豫时间参数得到固体蛋白质样品的活化能ΔE，用于衡量样品蛋白质热稳定性。

实施例

利用固体蛋白质热稳定性的太赫兹谱检测装置测量胶原蛋白的热稳定性。钛蓝宝石飞秒锁模脉冲激光器产生中心波长为800nm、重复频率为80MHz、脉冲宽度为100fs的激光光源，输出功率960mW。进入THz系统后，光束经分束镜分为较强的泵浦光和较弱的探测光。泵浦光被斩波器调制，经透镜聚焦后射向光电导天线砷化镓(GaAs)晶体激发THz脉冲。THz脉冲经过一个离轴金属抛面镜准直，然后被一片高阻硅片反射，经聚四氟乙烯透镜聚焦入射到载有固体蛋白质样品的另一片高阻硅片的下表面上。经高阻硅片的上下表面反射，被四氟乙烯透镜准直后，再透过作为THz波半透半反镜的第一片高阻硅片，最后被另一个金属抛面镜聚焦，并透过薄膜分束镜到达2mm厚的碲化锌ZnTe晶体，与经过延迟线并反射的探测光汇合。这时THz电磁辐射脉冲的电场通过线性电光效应调制电光晶体ZnTe的折射率椭球,探测光偏振态随之发生改变，由平衡二极管进行探测，信号送入锁相放大器进行放大。并通过改变延迟线长度的方法探测THz信号的整个时域波形。为了防止空气中水蒸气对THz信号的影响，从产生THz信号的GaAs、样品池到探测晶体ZnTe的这一段光路被密封在充有氮气的箱体内。箱内的相对湿度小于1%,在信号扫描过程中，实验系统的信噪比为60dB，谱分辨率好于40GHz。

图3(a)-(d)分别由计算和公式(3)拟合的胶原蛋白的THz介电谱虚部和实部。可以更加清晰的看到胶原蛋白分子的脱水过程和解折叠期间发生了显著的偶极矩变化，对应的弛豫时间相应变化。图3(c)(d)拟合的结果说明可以用单一弛豫时间Debye模型来表征固态蛋白质分子在加热过程中由于分子结构改变导致的介电弛豫响应过程加热过程中样品在温度25℃、50℃、75℃、120℃以及返回25℃时拟合得到的单一弛豫时间τ的单一弛豫时间Debye模型的各个参数。本文发现可以利用公式(4)给出Arrhenius方程拟合加热过程中的弛豫时间τ(如图4所示)，计算得到了热变性过程的活化能为5.53kJ/(K·mol)，可以定量刻画加热变性过程的难易程度。

Claims (1)

1. 一种固体蛋白质热稳定性太赫兹谱检测仪，其特征在于包括铝制散热器（1）、半导体致冷片（2）、ITO玻璃加热片（3）、固体蛋白质样品压片（4）、贴片式铂热电阻（5）、高阻硅片（6）、飞秒激光器（7）、斩波器（8）、分束器（9）、光电导天线（10）、第一抛面镜（11）、分束硅片（12）、聚四氟乙烯透镜（13）、延迟线（14）、反射镜（15）、薄膜分束镜（16）、ZnTe晶体（17）、四分之一波片（18）、沃拉斯顿棱镜（19）、光电平衡探测器（20）、锁相放大器（21）、温度采集模块（22）、可调电源（23）、第二抛面镜（24）；高阻硅片(6)上放置圆片形固体蛋白质样品(4)，在圆片形固体蛋白质样品(4)上紧贴ITO玻璃加热器(3)，在ITO玻璃加热器(3)上面放置半导体致冷片(2), ITO玻璃加热器(3)下表面边缘布置贴片式铂热电阻(5)，半导体致冷片(2)的制冷面向下，在半导体致冷片(2)的制热面上放置铝制散热器 (1)；飞秒激光器（7）产生激光光源，经过斩波器（8），被分束器（9）分为较强的泵浦光和较弱的探测光，泵浦光射向光电导天线（10）激发THz脉冲，THz脉冲经过经第一抛面镜（11）准直，被分束硅片（12）反射，再经聚四氟乙烯透镜（13）聚焦入射到载有固体蛋白质样品的高阻硅片（6）下表面上，经高阻硅片（6）的上下表面反射，被聚四氟乙烯透镜（13）准直后，再透过分束硅片（12），被第二抛面镜（24聚焦，并透过薄膜分束镜（16）到达ZnTe晶体（17），与经过延迟线（14）、反射镜（15）并被薄膜分束镜（16）反射的探测光汇合，探测光透过ZnTe晶体（17）、四分之一波片（18）、沃拉斯顿棱镜（19）后被光电平衡探测器（20）探测，所测电信号被锁相放大器（21）放大后进行显示，同时根据铂热电阻(5)经温度采集模块（22）采集的温度数据控制可调电源（23）进而控制半导体致冷片(2)制冷或ITO玻璃加热器(3)制热使蛋白质样品稳定达到目标温度。