CN203133081U - 一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种检测血清中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球上包被捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的颜色，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。悬浮芯片技术利用微球在溶液中反应，利用激光检测技术，提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

Description

一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片系统

技术领域

本实用新型涉及一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片系统。

背景技术

登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。登革热病毒属B组虫媒病毒，现在归入披盖病毒科(togaviridae)黄热病毒属(flavivirus)。病毒颗粒呈哑铃状(700×20--40nm)、棒状或球形(直径为20--50nm)。髓核为单股线状核糖核酸(RNA)。病毒颗粒与乙型脑炎病毒相似，最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原，用中和试验可鉴定其型别。登革病毒可分为4个血清型，与其他B组虫媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。

免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。

目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测人血清中的登革热抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种检测血清中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片系统，该芯片系统包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。

进一步，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。

进一步，所述编码微球优选为031号编码微球。

进一步，所述捕获抗原优选为登革热E2蛋白。

进一步，所述待测抗体为血清样品。

进一步，所述生物素标记的二抗和/或SPA优选为Biotin-羊抗鼠和/或Biotin-SPA。

进一步，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。

进一步，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。

进一步，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。

经过大量和深入的研究，对登革热抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点：

1、抗原包被量的改进

登革热E2蛋白的包被量是成功检测的关键，本实用新型对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原包被量很低，本实用新型的登革热E2蛋白抗原包被量为0.1～100μg/1.25×10⁶个编码微球或0.02～400ng/2500～5000个微球/测试，而一般的ELISA试验所需抗原的包被量为1μg/测试。

2、生物素标记的改进

通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μL。

3、检测的灵敏度及动态范围

本实用新型的血清样品登革热抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法和悬浮芯片的灵敏度为18.3ng/mL；并且悬浮芯片方法动态检测范围为4.14～265ng/mL。

4、方法的特异性

本实用新型通过选用登革热的E2蛋白为包被抗原，以鼠抗登革热IgG为待测抗体，以生物素化-SPA为检测物。本研究试验证明，在存在兔抗土拉血清、兔抗禽流感H5血清、兔抗西尼罗抗体等干扰抗体存在条件下本方法具有良好的特异性。

5、样品的检测能力

本实用新型评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中登革热抗体的实用性。

附图说明：

图1为本实用新型结构示意图；

图2为031号微球包被登革热E2蛋白检测登革热抗体示意图；

图3为蛋白悬浮芯片方法检测鼠抗登革热IgG剂量-反应标准曲线。

具体实施方式

如图1至图3所示，本实用新型一种检测血清样本中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括芯片基体1、加液系统2、悬浮芯片检测仪3和计算机4，其中，芯片基体1为96孔滤板或者微量离心管，其内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球(图中未示)，编码微球上包被有登革热E2蛋白，用于捕获待检测血清样品中的待测抗体，如果样品中有登革热抗体，登革热抗体与编码微球上的登革热E2蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗和/或SPA，形成编码微球-登革热E2蛋白-登革热抗体-二抗/SPA-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-登革热E2蛋白-登革热抗体-二抗/SPA-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中登革热抗体的检测，如果血清样品中没有登革热抗体，包被有登革热E2蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗和/或SPA、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。

上述芯片系统中，编码微球在微球稀释液，待测抗体在样品稀释液中，生物素标记的二抗和/或SPA在抗体稀释液中，荧光信号检测物在SA-PE稀释液中，悬浮芯片检测仪检测时编码微球复合物在检测缓冲液中，每步结合之后均用微球清洗液洗涤微球，使得没有结合的物质清除体系。

悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

本实用新型一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片系统，通过下面的具体实施方式作进一步说明，但本实用新型不以任何方式受该实施例的限定。

一、材料

1.蛋白悬浮芯片的相关缓冲液：

(1)PBS缓冲液(pH7.4)：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄10mmol/L；KH₂PO₄ 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm2)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

(2)微球清洗液：PBS(pH7.4)，0.05％TWEEN-20。

(3)微球活化缓冲液100mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄，5N NaOH 1.5mL，定容于250mL，pH 6.2。

(4)微球包被缓冲液0.05M MES，pH 5.0：2.44g MES，5N NaOH0.15mL，定容于250mL。

(5)微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％叠氮化物，pH 7.4。

(6)微球封闭液PBS-BN：PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(7)检测缓冲液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(8)抗体稀释液PBS，pH7.4。。

(9)微球稀释液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(10)样品稀释液PVX：PBS，0.5％PVA，0.8％PVP；

(11)SA-PE稀释液：PBS(pH7.4)，1％BSA。

2.抗原与抗体

本实用新型所使用抗原登革热E2蛋白，其可购自军事医学科学院微生物流行病研究所。

本实用新型所使用待测抗体为鼠抗登革热E2IgG，其可购自军事医学科学院微生物流行病研究所，检测抗体为生物素化羊抗鼠IgG和生物素化SPA，羊抗鼠IgG和SPA，其可购自北京欣经科生物有限公司。

二、待测样品的制备

1、目标分析物样品的制备

目标分析物为鼠抗登革热IgG，干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括兔抗土拉血清、兔抗禽流感H5血清、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上述待分析样品均溶于样品稀释液液中，4℃保存。鼠抗登革热E2IgG的储备液浓度为1.06μg/mL。

将待分析的鼠抗登革热IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。

2、人血清样本的处理

将人血清样本用样品稀释1∶10稀释，例如人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀后，作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。

实施例1、检测登革热抗体的蛋白悬浮芯片的制备

1、捕获抗原包被编码微球

本实用新型采用的031号编码微球购自美国Bio-Rad公司，编码微球用于标记可以捕获登革热抗体的登革热E2蛋白抗原，即利用登革热E2蛋白包被微球。

A、编码微球的活化

取100μL(1.25×10⁶个)编码微球到1.5mL离心管中，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球活化缓冲液，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20分钟。加入150μL的PBS(pH7.4)，震荡后，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球。

B、用抗原包被编码微球

取捕获抗原登革热E2蛋白抗原1～50μg加入到活化后的编码微球中，用PBS缓冲液定容至500μL，室温震摇2小时。14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的微球保存液洗涤编码微球，16000×g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于4℃避光保存备用。

C、包被微球的计数

吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；1/400mm²)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数×10⁴×稀释倍数×体积(mL))计算微球数量。

2、检测抗体标记生物素

A、生物素的标记

分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-20℃冻存备用。

B、抗体的用量

以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μl。

实施例2、悬浮芯片制备法条件的优化

1、微球包被抗原包被量的选择

分别以1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg的量包被100μL编码为031号的微球。经检测效果比较，以1～50μg/1.25×10⁶个编码微球即0.2～200ng/2500～5000个微球/包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，包被登革热E2蛋白抗原的031号微球均落在其正确检测区域内，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统可成功用于登革热抗体的检测。

2、生物素化抗体的优化

本实用新型分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体，经质控过程检测效果比较，本实验中Sulfo-NHS-生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的方法。

本实用新型人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的羊抗鼠抗体以1∶1000稀释作为检测抗体进行检测鼠血清中登革热抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-羊抗鼠抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化SPA以1∶2500稀释作为检测人血清中登革热抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-SPA可获得高检测值和低背景值的检测效果。

实施例3、样品的制备、检测及结果判定

1、待测样品制备

用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。

2、样品的检测及结果判定

检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下：

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。

3、检测结果判定

根据试验研究结果与相关研究报道，本实用新型定义蛋白悬浮芯片方法检测登革热抗体的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为＝MFI(空白对照)+3倍标准差。若检测结果高于Cutoff对应荧光强度值则判定为登革热抗体检测结果阳性；若检测结果低于Cutoff对应荧光强度值则判定为结登革热体检测结果阴性。

实施例4、悬浮芯片对登革热E2蛋白抗原的特异性试验

应用悬浮芯片检测方法分别对鼠抗登革热E2IgG、兔抗结核IgG、兔抗SARS IgG、兔抗禽登革热H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等进行检测，根据实施例3中检测结果判定标准，仅兔鼠抗登革热E2 IgG为阳性，其余干扰抗体或蛋白均为阴性。说明本实用新型所建立的登革热抗体的悬浮芯片检测方法与其它测试抗体均不发生交叉反应或非特异反应。

实施例5、对血清样品中登革热抗体的悬浮芯片定量检测

1、鼠抗登革热E2 IgG标准曲线样品制备

用样品稀释液将鼠抗登革热E2IgG标准品由1.06μg/mL以4倍倍比梯度稀释至0.004ng/mL成系列浓度样品。

2、剂量-反应标准曲线的绘制

按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表抗体的浓度(ng/mL)，Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图2中鼠抗登革热E2的浓度(ng/mL)分别为做4倍比稀释范围为：S1：0.004，S2：0.0162，S3：0.647，S4：0.259，S5：1.04，S6：4.14，S7：16.56，S8：66.25，S9：265，S10：1060。

悬浮芯片系统根据检测结果拟合鼠抗登革热E2 IgG剂量-反应标准曲线方程为：

FI＝-2.98016+(8993.39+2.98016)/[(1+(Conc/13386.5)^-1.32899]^1.84993

3、本实用新型悬浮芯片法检测血清中鼠抗登革热E2 IgG的灵敏度和动态范围

根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本实用新型即蛋白悬浮芯片方法检测鼠抗登革热E2IgG的灵敏度为：18.3ng/mL(Cutoff＝65，MFI(空白对照)＝55.75，标准差＝3.0606)。

本实用新型定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着鼠抗登革热E2抗体浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当鼠抗登革热E2抗体浓度超过265ng/mL时，抗原抗体的免疫反应未达到饱和状态，MFI值还没进入平台期，说明样品中的待检物浓度还没达到使MFI值饱和的浓度，需要高浓度的样品再检测，但受样品浓度只能达到265ng/mL的限制未能确定最高检测限，但可初步判定本实用新型即悬浮芯片定量检测鼠抗登革热E2IgG的动态范围为4.14～265ng/mL。

实施例6、人血清样品的检测

1、人血清样品的准备

将人血清样品用样品稀释液1∶10稀释(人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀)后用于蛋白悬浮芯片检测。

2、人血清样品的检测

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL待检测人血清样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中登革热抗体的浓度。

经过多次重复试验，生物素化SPA稀释比例选用1∶2500稀释，SA-PE稀释比例选用1∶300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值与其标准差的3倍之和为作为判断阴阳性的界值，即Cutoff值为792，检测得到的MFI值如果大于792，即血清中的登革热抗体浓度过高，可视为登革热抗体阳性可能被登革热病毒感染，如果MFI值小于792，即血清中的登革热抗体浓度低正常值可判断为登革热抗体阴性，未感染登革热病毒或登革热病毒隐性携带者。

Claims (8)

1.一种检测血清中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，该芯片系统包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体用于承载待测抗体及其内装有相关缓冲溶液，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球为031号编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。 

2.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。 

3.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述捕获抗原为登革热E2蛋白。 

4.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述待测抗体为血清样品。 

5.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述生物素标记的二抗和/或SPA为Biotin-羊抗鼠和/或Biotin-SPA。 

6.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。 

7.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。 

8.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。 

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