CN201130152Y - 荧光pcr微流控芯片微通道中微流体荧光测速控速装置 - Google Patents
荧光pcr微流控芯片微通道中微流体荧光测速控速装置 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型是荧光PCR微流控芯片微通道中微流体荧光测速控速装置，属于生物学和分析化学及医学检测领域。包括有光源(1)、激发光分光系统(2)、发射光分光系统(4)、流速调控执行元件、与计算机相连接的光电检测器(3)、丝杠和与丝杠相连接的步进电机。在生物PCR荧光微流控芯片的每个微通道的同一位置设置有检测点。激发光光纤传导系统和发射光光纤传导系统均固定在丝杠上，计算机通过步进电机控制丝杠移动，流速调控执行元件的输入端与计算机相连接，输出端与生物PCR微流控芯片的微通道相连接。通过本装置可以测量每个微通道的流速，通过实际流速与理论流速的差值，能够通过流速调控执行元件调控下一个微通道的流速。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种荧光PCR微流控芯片微通道中微流体荧光测速控速装置，主要用于测量生物荧光PCR微流控芯片的微通道中的工作微流体流速，达到控制实际微流体流速的目的，属于生物学和分析化学及医学检测领域。
背景技术
微全分析系统(Miniaturized Total Analysis System，μ-TAS)的概念，于20世纪90年代初首次提出，在此后十余年中该领域已发展为当前世界上最前沿的科技领域之一。μ-TAS概念是，将目前现代宏观实验室中的生物化学分析技术的许多过程与步骤，在生物化学分析技术的功能缩微化的基础上，实现生物化学分析技术全分析过程结构集成化，即将传统成熟的生物化学分析技术实验室各种器具和仪器的结构进行缩微，同时将现代宏观实验室中的生物化学分析技术实验室各种器具和仪器具有的功能进行集成，在100平方毫米左右(甚至更小的面积)的芯片上，实现微型化的全过程与步骤的生物化学分析系统，达到生物化学分析目的。微全分析系统具有检测速度快、试样用量少、通量高等显著的特点，因此深受世界各国的极为关注，并开展了大量相关研究。
微流控技术很快成为实现μTAS的理念的实用技术。已涉及到了许多方面，如日常的打印机墨水喷头、化工反应过程、燃料电池直等。同时，与生命科学应用密切相关的生物工程、临床检验医学、卫生防疫、国防防化、农业、林业、畜牧兽医、海洋渔业、法医、运动医学、食品监督检验、制药、化工、环境监测、生化反恐等，更是其应用最为密切和紧密的领域。在产业化方面，全球基于微流控技术的产品的年利润以每年20％的增长率迅速突破150亿欧元。
微流控技术是在微米级结构中操控纳升和皮升体积流体的技术和科学。微流控技术在实现μ-TAS整套理念和目标的过程中，主要是以实现现代宏观实验室中的生物和化学分析检验系统的“功能缩微和结构集成”为具体目的的。其特征是，其各类导流和容纳流体的有效结构(包括微通道，反应室和其他某些功能部件)至少在一个维度上为微米尺度。与现代实验室宏观尺度全过程与步骤的实验装置相比，微米级结构的流体环境的面积/体积比例显著增加，也就是说，连接各类有效结构(包括反应室和其他某些功能部件)完成分析检验全过程与步骤的主要方式是，以微通道为各类功能部件连接微结构，以微通道中微体积流体的流动为各类功能部件产生功能作用基本条件的。
因此，从技术层面看，在承载微流动液体的微通道中，对微流动液体进行实际流速测速，按需要进行调控流速，是在微米级结构中操控纳升和皮升体积流体，完成分析检验全过程与步骤的核心之一，也是微流控技术的核心之一。
目前，据有关文献报道的微流体流速测量技术有：化学标记物测速方法，流体温度差异量标记方法测速方法，示踪微粒子成像测速方法和共焦荧光示踪物检测测速方法等。但是上述的测速方法，存在以下缺陷：
1)测速方法中都需显示踪迹的物质来进行测速，也就是说，这些方法对理论和实验研究有一定的作用，但对在微通道中的具体微流动液体实际工作的监测，并没有更多的作用。不能实现对微流动液体在微通道中实际的工作流体和介质流速情况进行实时反馈和流速控制。
这是因为在上述的测速方法中，使用一些非实际工作流体和介质，并在微通道中对这些非实际的工作流体和介质，进行非实际工作状况模拟测速和调控流速。实际上，微米级结构微通道中操控纳升和皮升体积流体的技术和科学，已经有一系列与物体表面有关的特有效应，影响分析性能：如，层流效应，表面张力及毛细效应，快速热导效应和扩散效应等。因此，只有对微通道中实际的工作流体和介质，进行实际工作状况测速和调控流速，才能对在微米级结构微通道中的纳升和皮升体积流体，进行有实际意义的操控，才能保障具体实际的工作微流体流完成分析检验全过程与步骤。
2)实现上述测速方法的外围设备，由于其体积大，很难在将来的器件发展过程中，实现功能缩微结构集成的微型全分析系统理念。
实用新型内容
本实用新型的目的在于克服了现有的微流体流速测量方法都需附加显示踪迹的物质，从而不能实现对微通道中的实际工作流体和介质流速情况进行实时反馈和流速控制的缺陷，提供了一种荧光PCR微流控芯片微流体荧光测速控速装置及方法，本装置能够对微通道中微流体的实际工作流速进行实时测量，并能根据测量结果对流速进行控制，使其尽可能与理论设计流速相吻合，从而保障分析检验全过程与步骤的顺利完成。
本实用新型的理论依据：使用现有的微通道动态检测系统对空微通道和有荧光PCR试剂的微通道(有阳性荧光PCR试剂微通道和有阴性荧光PCR试剂微通道)进行检测试验。具体为对39个循环的生物PCR微流控芯片中不同的微通道进行荧光检测，结果发现充满阳性荧光PCR试剂微通道的荧光信号值为空微通道的荧光信号值的4倍左右，而为充满阴性荧光PCR试剂微通道荧光信号值的10倍左右，具体数据见图3。在图3中，荧光信号值是平均值，其检测的重复性偏差为2.6％和稳定性偏差为2.7％。
荧光检测是直接测量被激发对象所产生的荧光强度，只要检测器有足够的灵敏度，可在很低的基底(空白值)上检测信号的微弱变化。由于阴性荧光PCR试剂(或未过荧光信号抬升域值(CT值))和纯水，对激发光有较强的吸收，而反射和被激发出的发射光较少。尽管分光系统对激发光和发射光在互相干扰的光谱范围进行了高截止深度的分光，但空微通道由于其固体的特性，对激发光的反射较强，还是能因小部分激发光反射到探测器上，使荧光信号值增大。因此，经过多次测试发现，充满阴性荧光PCR试剂微通道荧光信号值为空微通道的荧光信号值的0.4倍左右。
阳性荧光PCR试剂在充分扩增后，其带有荧光的基因拷贝数已为10的7-8次方，其强荧光发射光使探测器很容易探测到，在现有的检测仪器上都可获得阳性荧光PCR试剂微通道的荧光信号值，其为充满阴性荧光PCR试剂微通道荧光信号值的10倍左右。
不同的检测仪器灵敏度不一样，一般来说，充满阳性荧光PCR试剂微通道荧光信号值为充满阴性荧光PCR试剂微通道荧光信号值的10(±1)倍，已可满足分子生物学检测技术的相对测量信号分辨率技术要求。
由于空微通道和有荧光PCR试剂的微通道的荧光检测信号有较大的差异，所以根据荧光检测信号值可以判断：哪些循环的微通道是空微通道(即荧光PCR试剂的前端流未到的微通道)，哪些循环的微通道是有荧光PCR试剂的微通道(即荧光PCR试剂的前端流到和已流经的微通道位置)。
基于上述理论，本实用新型采取的技术方案如下。荧光PCR微流控芯片微通道中微流体荧光测速控速装置，包括有光源1、激发光分光系统2、激发光光纤传导系统5、发射光光纤传导系统6、发射光分光系统4、流速调控执行元件12、计算机10、与计算机10相连接的光电检测器3、与生物PCR荧光微流控芯片11平行布置的丝杠8和与丝杠8相连接的步进电机9。其中，激发光光纤传导系统5和发射光光纤传导系统6均固定在丝杠9上，计算机10通过步进电机9控制丝杠8移动，流速调控执行元件12的输入端与计算机10相连接，输出端与生物荧光PCR微流控芯片微通道的生物PCR荧光试剂进样口13相连通。光源1发出的光通过激发光分光系统2分光后经激发光光纤传导系统5传到生物PCR荧光微流控芯片11的微通道进行荧光激发，被激发出的荧光发射光经发射光光纤传导系统6和发射光分光系统4后被光电检测器3接收并转换成电信号，送入计算机10进行检测数据处理；计算机10根据数据处理结果控制流速调控执行元件12调节微通道的流速。
在生物PCR荧光微流控芯片11上的每个微通道上都设置有检测点，每相邻的两个荧光检测点在微流体流动方向上的距离为一个微通道长度，第一个微通道的荧光检测点和生物PCR试剂进样口13之间的微通道长度，不视为生物PCR微通道工作长度。
还包括有多光路校准光纤系统7，是为了保证每次每个PCR扩增循环的荧光实时定点检测基准的“一致性”，进行检测背景噪声调零的系统。
生物荧光PCR微流控芯片微通道中微流体的荧光测速控速方法，该方法是按以下步骤进行的：
1)计算机10通过步进电机9控制丝杠8移动，使激发光光纤传导系统5照射至第一个荧光检测点，计算机10通过光电检测器3动态扫描该检测点的荧光信号值，当该点的荧光信号值为空微通道的荧光信号值的N倍时，记录此刻的时间t1；
计算机10在通过步进电机9控制丝杠8移动，使激发光光纤传导系统5照射至第二个荧光检测点，计算机10通过光电检测器3动态扫描该检测点的荧光信号值，当该点的荧光信号值为空微通道的荧光信号值的N倍时，记录此刻的时间t2；
则第一通道的流速v为：
v＝L/T
其中：v为第一个微通道中微流体的流速，L为一个微通道的长度，T为荧光PCR试剂流经第一个微通道所需的时间，即T＝t2-t1；
当微通道内为阳性荧光PCR试剂时，所述的N的取值范围为3～5；
当微通道内为阴性荧光PCR试剂时，所述的N的取值范围为0.3～0.5；
计算机10计算第一个微通道中的微流体的流速和理论设计流速的差值，并将该差值传送给流速调控执行元件12来调节下一个微通道内的流速使其为理论设计流速；
2)计算机10控制步进电机9使激发光光纤传导系统5和发射光光纤传导系统6依次照射到各个循环微通道上的检测点，微流体从一个微通道上的检测点流到其相邻微通道上的检测点时流经的距离为一个微通道长度；计算机10重复步骤1中的检测计算方法，能够对各个微通道的流速进行检测及对下一个微通道的流速进行控制。
本实用新型是利用微全分析系统微流控生物荧光PCR芯片的微通道中荧光实时检测信号的差异，对实际的工作流体和介质流速进行测量，并实时反馈和对流速进行控制。
本实用新型能够对微通道中的微流动液体的实际工作流速进行实时反馈和控制。在体积上，随着“功能集成结构缩微”的荧光检测技术发展和嵌入芯片中光谱检测器出现，在PCR循环扩增荧光检测上，还满足微型全分析系统(μ-TAS)概念的“功能缩微和结构集成”的技术要求，为实时测速方法提供了一种全新的实用化手段。
附图说明
图1本实用新型的结构示意框图
图2 39个循环的生物PCR微流控芯片
图3 39个循环的生物PCR微流控芯片中不同的微通道荧光检测信号值(原始值未单位标定)
图4流速调控执行元件12的具体结构
图中：1、光源，2、激发光分光系统，3、光电检测器，4、发射光分光系统，5、激发光光纤传导系统，6、发射光光纤传导系统，7、多光路校准光纤系统，8、丝杠，9、步进电机，10、计算机，11、-生物PCR微流控芯片，12、流速调控执行元件，13、生物PCR试剂进样口，14、微流控芯片的微通道，15、风冷隔温孔，16、生物PCR试剂出样口，17、为在每次PCR循环实时扩增检测点，18、注射活塞，19、平移注射杆系统，20、生物PCR试剂。
具体实施方式
下面结合附图1～2详细说明本实施例。
本实施例的结构示意框图如图1，激发光光纤传导系统5和发射光光纤传导系统6均固定在丝杠9上，计算机10通过步进电机9控制丝杠8移动，流速调控执行元件12的输入端与计算机10相连接，输出端与生物PCR微流控芯片微通道的生物PCR荧光试剂进样口13相连接。从光源1发出的激发光，经激发光分光系统2分光和激发光光纤传导系统5，能够到达39个循环的生物PCR荧光微流控芯片11(其主视图如图2)进行PCR扩增循环微通道的荧光激发。被激发出的荧光发射光，经发射光光纤传导系统6和发射光分光系统4后，被光电检测器(PMT)3接收并进行光电转换，进入计算机10进行检测数据处理。
多光路校准光纤系统7是为了保证每次每个PCR扩增循环的荧光实时定点检测基准的“一致性”，进行检测背景噪声调零的系统。
由于在39个PCR扩增循环中，对每个PCR扩增循环的时间和流过三温度区域的微通道长短和布局有“一致性”要求，因此在设计和制备微流控生物荧光PCR芯片时，其上的每个PCR扩增循环微通道的长短和布局是一样的。本实施例在39个循环的生物PCR荧光微流控芯片11的每个微通道上的同一位置都设置有检测点，每相邻的两个荧光实时检测点在微流体流动方向上的长度为一个微通道长度，第一个微通道的荧光检测点和生物PCR试剂进样口13之间的微通道长度，不视为生物PCR微通道工作长度。而一个微通道的长度可根据理论计算设计的每个PCR扩增循环的微通道得知。各个荧光检测点在同一直线上，丝杠8与该直线平行布置。
从第一个PCR扩增循环开始，通过检测到的微通道内的实际荧光信号值，获得荧光PCR试剂的前端是否流到正在检测的荧光检测点，计算机记录微流体流经该通道的时间，就可获得微流体在该通道内的实际的工作流速和实际流速需调整量，实际的工作流速＝一个微通道的长度/微流体流经该通道实际所需时间，实际流速需调整量＝理论设计流速-实际的工作流速，结果为正，说明实际的工作流速需增加；反之需减少；结果为零，说明实际的工作流速与理论计算设计的工作流速吻合，实际流速不需调整。计算机10将实际流速调整量反馈到流速调控执行元件12，即可对下一个循环的进行流速调控，实现生物荧光PCR微流控芯片中每一个微通道中微流体的荧光测速控速，使实际的工作微流体流速与理论计算设计的工作流速相吻合。
具体的测速方法为：
1)计算机10通过步进电机9控制丝杠8移动，使激发光光纤传导系统5照射至第一个荧光检测点，计算机10通过光电检测器3动态扫描该检测点的荧光信号值，当该点的荧光信号值为空微通道的荧光信号值的N倍时，记录此刻的时间t1；
计算机10在通过步进电机9控制丝杠8移动，使激发光光纤传导系统5照射至第二个荧光检测点，计算机10通过光电检测器3动态扫描该检测点的荧光信号值，当该点的荧光信号值为空微通道的荧光信号值的N倍时，记录此刻的时间t2；
则第一通道的流速v为：
v＝L/T
其中：v为第一个微通道中微流体的流速，L为一个微通道的长度，T为荧光PCR试剂流经第一个微通道所需的时间，即T＝t2-t1；
当微通道内为阳性荧光PCR试剂时，所述的N的取值为3～5；
当微通道内为阴性荧光PCR试剂时，所述的N的取值为0.3～0.5；
计算机10计算第一个微通道中的微流体的流速和理论设计流速的差值，并将该差值传送给流速调控执行元件12来调节下一个微通道内的流速使其为理论设计流速。流速调控执行元件12的具体结构如图4，包括有用于盛放PCR试剂20的容器和设置在容器内的、用于向微通道中注射生物PCR试剂和维持PCR试剂在微通道中流速的注射活塞18、带有步进电机的平移注射杆系统19。其中，平移注射杆系统19中的步进电机与计算机相连，容器的出液口与微流控芯片的微通道14相连通。计算机通过微通道中的微流体的实际流速和理论设计流速的差值来控制平移杆注射系统19的移动速度，进而调节微流控芯片中的试剂的流速。
2)步进电机9的步长为相邻的两个荧光检测点的间距，该间距是已知的(在设计和制备微流控生物荧光PCR芯片时，已经设定，一般是以微通道长度为依据，等值分布的)，计算机10通过步进电机9控制丝杠8移动，使激发光光纤传导系统5和发射光光纤传导系统移至第三个荧光检测点。微流体从步骤1中的第二个检测点流到本步骤中的第三个荧光检测点时流经的距离为一个微通道长度。计算机10控制光电检测器3动态扫描检测该点的荧光信号值并记录此刻的时间t3，当该点的荧光信号值为空微通道的荧光信号值的N倍时，则第二通道的流速v为：
v＝L/T
其中：v为第二个微通道中微流体的流速，L为单个微通道的长度，T为微流体流经第二个微通道所需的时间，即T＝t3-t2；
当微通道内为强阳性荧光PCR试剂时，所述的N的取值范围为3～5；
当微通道内为阴性荧光PCR试剂时，所述的N的取值范围为03～0.5。
计算机10计算第二个微通道中的微流体的流速和理论设计流速的差值，并将该差值传送给流速调控执行元件12来调节下一个微通道内的流速使其为理论设计流速；
重复步骤2，能够对各个微通道的流速进行检测及控制。
由于生物PCR微流控芯片上的微通道是根据生物PCR的技术要求、三温度工作区的大小、微通道长短以及在芯片上的布局等要求设计和制备成的，因此微流控芯片一旦制备成后，以上各参数在实际试验中是不能改变的。而在实际的微通道中实际荧光PCR试剂流速与理论计算设计的试剂流速是否吻合，是决定微流控芯片生物PCR扩增效果成败的唯一的实际工作状态中可调控的参数。经实验验证，使用本装置可实现对生物荧光PCR微流控芯片微通道中的微流体的荧光测速控速，可使具体实际的工作微流体流速与理论计算设计的工作流速相吻合，保障了荧光PCR扩增循环的外部工作条件，进而保证了芯片分析检验全过程与步骤的准确完成。
在39个PCR扩增循环中，要求对每个PCR扩增循环(每一个PCR扩增循环是指，荧光PCR试剂按设定的时间沿微通道流过55度，72度和92度的温度区域，实现基因体外按2的n次方自我复制)都要进行一次微通道中的荧光信号检测，这样构成在基因体外按2的n次方自我复制过程，即PCR扩增循环过程中，荧光信号变化曲线，分子生物学可以根据该曲线，获得被检测对象的多种生物基因信息和诊断依据。使用本装置进行荧光实时定点检测时，可以获得PCR扩增循环过程中的荧光信号变化曲线，
经实验验证，使用本实用新型可实现对PCR扩增循环微流控生物荧光PCR芯片微通道中实际的工作流速情况进行实时荧光信息反馈，将实际流速调整量反馈到流速调控执行元件，实现生物荧光PCR微流控芯片微通道中微流体的荧光测速控速，使具体实际的工作微流体流速与理论计算设计的工作流速相吻合，从而保障荧光PCR扩增循环的外部工作条件，保证了芯片的分析检验全过程与步骤的完成。
Claims (1)
1、荧光PCR微流控芯片微通道中微流体荧光测速控速装置，其特征在于：包括有光源(1)、激发光分光系统(2)、激发光光纤传导系统(5)、发射光光纤传导系统(6)、发射光分光系统(4)、流速调控执行元件(12)、计算机(10)、与计算机(10)相连接的光电检测器(3)、与生物PCR荧光微流控芯片(11)平行布置的丝杠(8)和与丝杠(8)相连接的步进电机(9)，步进电机(9)与计算机(10)相连；在生物PCR荧光微流控芯片(11)的每个微通道上都设置有检测点，每相邻的两个荧光检测点在微流体流动方向上的距离为一个微通道长度；其中，激发光光纤传导系统(5)和发射光光纤传导系统(6)均固定在丝杠(9)上，计算机(10)能够通过步进电机(9)控制丝杠(8)移动，流速调控执行元件(12)的输入端与计算机(10)相连接，输出端与生物PCR微流控芯片的微通道相连通；光源(1)发出的光通过激发光分光系统(2)分光后经激发光光纤传导系统(5)传到生物PCR荧光微流控芯片(11)上的检测点进行荧光激发，被激发出的荧光发射光经发射光光纤传导系统(6)和发射光分光系统(4)后被光电检测器(3)接收并转换成电信号，送入计算机(10)进行检测数据处理；计算机(10)根据数据处理结果控制流速调控执行元件(12)调节微通道的流速。
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