CN1997402B - 化学连接基团及其缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了药物-配体缀合物，它是有效的细胞毒素，其中，药物通过肽基、肼或二硫化物连接基团与配体相连。本发明的公开还涉及包含药物-配体缀合物的组合物，和使用它们治疗的方法。

Description

化学连接基团及其缀合物

本申请请求享有美国临时专利申请系列第60/572,667、60/661,174和60/669,871号的权益，它们被引入本文作为参考。

发明领域

本发明提供了与药物和配体相连且在体内裂解的连接基团。该连接基团在形成本发明的前药和细胞毒素缀合物以及其它诊断和治疗部分中是有用的。

发明背景

很多治疗剂、特别是在癌症化学疗法中尤其有效的那些经常表现出体内急性毒性，尤其是骨髓和粘膜毒性，以及慢性心脏和神经病学毒性。这么高的毒性限制了它们的应用。开发更多和更安全的特异性治疗剂、特别是抗肿瘤剂需要对肿瘤细胞具有更大的有效性，并且减少这些产品的副作用(毒性、对非肿瘤细胞的破坏等)的数量和严重性。有些现有治疗剂的另一种困难是它们在血浆中的稳定性不太理想。为了稳定这些化合物而加入的官能团导致活性的显著降低。因此，需要确定在稳定化合物的同时维持可接受的治疗活性水平的方法。

对于更高选择性的细胞毒素剂的研究几十年来一直是极为活跃的，限制剂量的毒性(也就是细胞毒素对正常组织的不可取的活性)是癌症疗法失败的主要原因之一。例如，已知CC-1065和双联霉素(duocarmycins)是极有效的细胞毒素。

CC-106 5首先是由Upjohn Company于1981年从Streptomyceszelensis分离的(Hanka等人，J.Antibiot.31：1211(1978)；Martin等人，J.Antibiot.33：902(1980)；Martin等人，J.Antibiot.34：1119(1981))，并且发现在体外和实验动物中都有有效的抗肿瘤和抗微生物活性(Li等人，Cancer Res.42：999(1982))。CC-1065在小沟内与双链B-DNA结合(Swenson等人，Cancer Res.42：2821(1982))，具有5’-d(A/GNTTA)-3’和5’-d(AAAAA)-3’的序列优选，并且通过其分子中的CPI左手单位烷化3’-腺嘌呤的N3位(Hurley等人，Science 226：843(1984))。尽管具有有效和广泛的抗肿瘤活性，CC-1065也不能用于人，因为它导致延迟的实验动物死亡。

CC-1065和双联霉素的很多类似物和衍生物是本领域已知的。已经综述了很多化合物的结构、合成和性质的研究。例如参见Boger等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；Boger等人，Chem.Rev.97：787(1997)。

Kyowa Hakko Kogya Co.，Ltd.的一个小组已经制备了大量CC-1065衍生物。例如参见美国专利第5,101,038、5,641,780、5,187,186、5,070,092、5,703,080、5,070,092、5,641,780、5,101,038、5,084,468号，公开的PCT申请WO 96/10405和公开的欧洲申请0537575 A1。

Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)也一直积极地制备CC-1065的衍生物。例如参见美国专利第5,739,350、4,978,757、5,332,837和4,912,227号。

也有研究集中于开发新的治疗剂，它们是前体药物的形式，也就是通过对它们的结构进行某些化学或酶学修饰能够体内转化为药物(活性治疗性化合物)的化合物。出于减少毒性的目的，这种转化作用优选地限于作用部位或靶组织而不是循环系统或非靶组织。不过，即使前体药物也是成问题的，因为由于酶的存在，很多是以血液和血清中的低稳定性为特征的，这些酶在前体药物到达患者体内所需部位之前降解或者激活前体药物。

勃列斯多·迈耶施贵宝(Bristol-Myers Squibb)已经描述了特殊的溶酶体酶可裂解的抗肿瘤药物缀合物。参见例如美国专利第6,214,345号。该专利提供了氨苄基氧羰基。

Seattle Genetics已经出版了美国专利申请第2003/0096743号和美国专利申请第2003/0130189号，其中描述了药物递送剂中的对氨基苄基醚。在这些申请中所述的连接基团仅限于氨基苄基醚组合物。

其它研究小组也已经描述了连接基团。参见例如de Groot等人，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot等人J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot等人，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO02/083180；Carl等人，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik等人，Bioorg & Med.Chem.Lett.8，3347(1998)。这些连接基团包括氨基苄基醚间隔基团、延长的电子级联和环化间隔基团系统、环化消除间隔基团，例如w-氨基氨基羰基，和对氨苄基氧羰基连接基团。

细胞毒素药物的稳定性，包括体内稳定性，仍然是需要解决的重要问题。另外，很多化合物的毒性使得它们没有功用，因此需要降低药物毒性例如形成可裂解的前药的组合物。因此，尽管本领域已经取得了一定进展，也仍然需要开发改进的治疗剂，用于治疗哺乳动物，特别是人，治疗剂更具体为细胞毒素，它们相对于相似结构的已知化合物而言表现较高的作用特异性、减少的毒性和提高的血液稳定性。本发明致力于这些需求。

发明概述

本发明涉及药物-配体缀合物，其中，药物和配体通过肽基、肼或二硫化物连接基团相连。这些缀合物是可以以活性形式选择性递送到感兴趣作用部位，然后裂解释放出活性药物的有效的细胞毒素。本发明的新的连接基团臂可以在体内通过例如酶裂解或还原裂解的方式从细胞毒性药物中裂解出来，从前药衍生物中释放活性药物部分。此外，本发明包括在本发明连接基团臂与细胞毒素之间的缀合物，和连接基团臂、细胞毒素与靶向剂之间的缀合物，其中，靶向剂例如是抗体或肽。

本发明还涉及可用于稳定治疗剂和标记物的基团。稳定基团是这样选择的，例如以限制治疗剂或标记物被可能存在于血液或非靶组织中的酶所清除和代谢。稳定基团可以起到阻止药物或标记物降解的作用，还可用于提供药物或标记物的其它物理特征，例如增加化合物的溶解度或降低化合物的聚集性质。稳定基团还可提高药物或标记物在贮存期间的稳定性，无论是经过制剂的形式还是未经过制剂的形式。

在第一方面，本发明提供了具有任何式1-3中任一结构的细胞毒性药物-配体化合物：

X⁴

L⁴ _pFL¹

_m

D    (1)

x⁴

L⁴ _pH

L¹ _m D    (2)

x⁴

L⁴ _pJ

L¹

_m

D    (3)

其中，符号D是在其主链化学反应性官能团上有悬挂基团的药物部分，所述官能团选自伯胺或仲胺、羟基、巯基、羧基、醛和酮。

符号L¹代表自我牺牲型(self-immolative)间隔基团，其中，m是0、1、2、3、4、5或6的整数。

符号X⁴代表选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂。

符号L⁴代表连接基团部分，且p是0或1。L⁴是使缀合物溶解度提高或聚集性质降低的部分。L⁴部分的实例包括取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基或未取代的杂烷基，它们中的任何一个可为直链、支链或环状，荷正电或荷负电的氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸或聚精氨酸，或其它聚合物，例如聚乙二醇。

符号F、H和J代表如本文进一步描述的连接基团。

在一个实施方案中，本发明涉及下列结构的肽连接基团缀合物：

X⁴ (L⁴)_p-F-(L¹)_m D

其中，

D是在其主链化学反应性官能团上有悬挂基团的药物部分，所述官能团选自伯胺或仲胺、羟基、硫醇、羧基、醛和酮；

L¹是自我牺牲型连接基团；

m是0、1、2、3、4、5或6的整数；

F是包含下列结构的连接基团：

或

其中，

AA¹是一个或多个独立地选自天然氨基酸和非天然α-氨基酸的基团；

c是1到20的整数；

L²是自我牺牲型连接基团；

L³是包含伯胺或仲胺或者羧基官能团的间隔基团；其中，如果L³存在，则m是0，且或者L³的胺与D的悬挂羧基官能团形成酰胺键，或者L³的羧基与D的悬挂胺官能团形成酰胺键；

o是0或1；

L⁴是连接基团部分，其中，L⁴不包含直接与(AA¹)_c的N末端相连的羧酸酰基；

p是0或1；和

X⁴选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂的基团。

在一个实施方案中，肽连接基团缀合物包含以下结构：

在另一个实施方案中，肽连接基团缀合物包含以下结构：

在优选实施方案中，L³包含芳香基团。例如，L³可以包含苯甲酸基团，苯胺基团或吲哚基团。-L³-NH-的非限制性实例包括选自以下的结构：

其中，Z选自O、S和NR²³，和

其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基。

在肽连接基团的优选实施方案中，(AA¹)_c是可被肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽序列。优选的蛋白酶是溶酶体蛋白酶。在优选实施方案中，c是2到6的整数，或c是2、3或4。在某些实施方案中，与药物部分位置最近的(AA¹)_c中的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。在优选实施方案中，(AA¹)_c是选自以下的肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、phe-N⁹-甲苯磺酰基-Arg、phe-N⁹-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：1)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：2)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：3)。在特别优选的实施方案中，(AA¹)_c是Val-Cit或Val-Lys。

在一些优选实施方案中，肽连接基团，F，包含以下结构：

其中，

R²⁴选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基和未取代的杂烷基；

每个K独立地选自取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹和OR²¹

其中，

R²¹和R²²独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基；和

a是0、1、2、3或4的整数。

在其它优选实施方案中，-F-(L¹)_m-包含以下结构：

其中，每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基和未取代的杂烷基。

在另一个方面中，本发明涉及如下结构的肼连接基团缀合物：

X⁴-(L⁴)_p-H-(L¹)_m-D

其中，

D是在其主链化学反应性官能团上有悬挂基团的药物部分，所述官能团选自伯胺或仲胺、羟基、硫醇、羧基、醛和酮；

L¹是自我牺牲型连接基团；

m是选自0、1、2、3、4、5或6的整数；

X⁴选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂；

L⁴是连接基团部分；

p是0或1；

H是包含以下结构的连接基团：

其中，n₁是从1-10的整数；

n₂是0、1或2；

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基和未取代的杂烷基；和

I或者是键，或者是：

其中，n₃是0或1，条件是当n₃是0时，n₂不是0；和n₄是1、2或3，

其中，当I是键，n₁是3，且n₂是1时，D不可能是

其中，R是Me或CH₂-CH₂-NMe₂。

在一些优选实施方案中，苯基环上的取代是对位取代。在一些优选实施方案中，n₁是2、3或4，或者n₁是3或n₂是1。

在某些实施方案中，I是键。在其它实施方案中，n₃是0且n₄是2。

在不同的方面中，本发明提供了肼连接基团，H，它可以通过裂解形成6-元自我牺牲型连接基团，或通过裂解形成两个5-元自我牺牲型连接基团，或通过裂解形成单个5-元自我牺牲型连接基团，或通过裂解形成单个7-元自我牺牲型连接基团，或通过裂解形成5-元自我牺牲型连接基团和6-元自我牺牲型连接基团。

在优选实施方案中，H包含双二甲基取代。

在优选实施方案中，H包含以下结构：

优选地，n₁是2、3或4，更优选地，n₁是3。优选地，每个R₂₄独立地选自CH₃和H。在某些优选实施方案中，每个R₂₄是H。

在另一个优选实施方案中，H包含以下结构：

优选地，n₁是3。优选地，每个R²⁴独立地选自CH₃和H。

在又一个优选实施方案中，H包含以下结构：

优选地，每个R²⁴独立地是H或取代或未取代的烷基。

在另一个方面中，本发明涉及如下结构的肼连接基团缀合物：

X⁴-(L⁴)_p-H-(L¹)_m-D

其中，

D是在其主链化学反应性官能团上有悬挂基团的药物部分，所述官能团选自伯胺或仲胺、羟基、硫醇、羧基、醛和酮；

L¹是自我牺牲型连接基团；

m是选自0、1、2、3、4、5或6的整数；

X⁴选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂；

L⁴是连接基团部分；

p是0或1；和

H包含以下结构：

其中，q是0、1、2、3、4、5或6；和

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基和未取代的杂烷基。

在又一个方面中，本发明涉及下列结构的二硫化物连接基团缀合物：

X⁴

(L⁴)_p-J-(L¹)_m

D

其中，

D是在其主链化学反应性官能团上有悬挂基团的药物部分，所述官能团选自伯胺或仲胺、羟基、硫醇、羧基、醛和酮；

L¹是自我牺牲型连接基团；

m是选自0、1、2、3、4、5或6的整数；

X⁴选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂；

L⁴是连接基团部分；

P是0或1；

J是包含下列结构的连接基团：

其中，

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基和未取代的杂烷基；

每个K独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹和OR²¹

其中，

R²¹和R²²独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基和未取代的杂环烷基；

a是0、1、2、3或4的整数；和

d是0、1、2、3、4、5或6的整数。

在不同的实施方案中，J可以包含以下结构之一：

其中，d是1或2；

或

在所有上述连接基团缀合物中，D优选是细胞毒性药物。在优选实施方案中，D具有选自以下的化学反应性官能团：伯胺或仲胺、羟基、巯基和羧基。优选药物D的非限制性实例包括双联霉素和双联霉素类似物和衍生物，CC-1065、以CBI为基础的双联霉素类似物、以MCBI为基础的双联霉素类似物、以CCBI为基础的双联霉素类似物、多柔比星、多柔比星缀合物、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、多拉司他汀、多拉司他汀-10、考布他汀、刺孢霉素(calicheamicin)、美坦新(maytansine)、美坦新类似物、DM-1、auristatin E、auristatin EB(AEB)、auristatin EFP(AEFP)、单甲基auristatin E(MMAE)、5-苯甲酰戊酸-AE酯(AEVB)、tubulysins、disorazole、依普西龙(epothilones)、紫杉醇、多西紫杉醇，SN-38、托泊替康、根霉素、棘霉素、秋水仙碱、长春碱、长春地辛、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素(eleutherobin)、甲氨蝶呤、甲基叶酸(methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、洛诺生(leurosine)、洛诺西丁(leurosideine)、放线菌素、柔红霉素、柔红霉素缀合物、丝裂霉素C、丝裂霉素A、卡柔比星、氨蝶呤、他利霉素、鬼臼毒素、鬼臼毒素衍生物、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、长春新碱、泰素、泰索帝维A酸、丁酸、N⁸-乙酰亚精胺和喜树碱。

在优选实施方案中，D是具有下列结构的双联霉素类似物或衍生物：

其中，环系A选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基。

E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或E和G相连形成环系，该环系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基；

X选自O、S和NR²³；

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R³选自(＝O)、SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，

其中，

R¹¹选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²和SiR¹²R¹³R¹⁴，

其中，

R¹²、R¹³和R¹⁴独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和取代或未取代的芳基，其中，R¹²和R¹³与它们所连接的氮原子或碳原子一起任选连接形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选含有两个或多个杂原子；

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶和O(CH₂)_nN(CH₃)₂

其中

n是1到20的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

R⁶是单键，它可以存在也可以不存在，当R⁶存在时，R⁶和R⁷相连形成环丙基环；和

R⁷是CH₂-X¹，或在所述环丙基环中与R⁶相连的-CH₂-，其中，

X¹是离去基团，

其中，R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个连接所述药物到L¹，如果存在的话，或者连接到F、H或J。

在优选实施方案中，D具有下列结构：

其中，

Z选自O、S和NR²³

其中，

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸、或CO₂R⁸，其中，R⁸选自取代的烷基、未取代的烷基、NR⁹R¹⁰、NR⁹NHR¹⁰和OR⁹

其中

R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基；和

R²是H、取代的烷基或未取代的低级烷基；

其中，R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个连接所述药物到L¹，如果存在的话，或者连接到F、H或J。

在以上的优选实施方案中，R²是未取代的低级烷基。

在另一个优选实施方案中，D具有以下结构：

其中，

Z选自O、S和NR²³

其中，

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸或CO₂R⁸，其中，R⁸选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，

其中，

R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R¹′是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R⁸，其中，R⁸选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，

其中，

R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R²是H、或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基或氰基或烷氧基；和

R²′是H、或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基，

其中，R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个连接所述药物到L¹，如果存在的话，或者连接到F、H或J。

在所有上述连接基团缀合物结构中，L⁴优选包含非环状部分。与不含L⁴的化合物相比，L⁴优选增大了化合物的溶解度，和/或与不含L⁴的化合物相比，L⁴降低了化合物的聚集。在优选实施方案中，L⁴包含聚乙二醇部分。聚乙二醇部分可以包含例如，3-12个重复单位，或2-6个重复单位，或更优选地，4个重复单位。

在又一个方面中，本发明提供了具有下式结构的细胞毒性药物-配体化合物：

X⁴ L⁴

_pQL¹ _mD¹

其中，符号L¹代表自我牺牲型间隔基团，其中，m是0、1、2、3、4、5或6的整数。

符号X⁴代表选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂的成员。

符号L⁴代表连接基团部分，和p是0或1。L⁴是使缀合物溶解度增大或聚集性质减小的部分。L⁴部分的实例包括取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基或未取代的杂烷基，它们中的任何一个可为直链、支链或环状，荷正电或荷负电的氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸或聚精氨酸，或其它聚合物如聚乙二醇。

符号Q代表任何可裂解的连接基团，包括但不限于本文所述的任何肽基、腙和二硫化物连接基团。可裂解的连接基团包括可以选择性地从X⁴通过化学或生物学过程裂解和通过裂解分离药物，D¹，的那些。

符号D¹代表具有下式的药物：

其中，X和Z独立地选自O、S和NR²³；

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸或CO₂R⁸，

R¹′是H、取代或未取代的低级烷基或C(O)R⁸，

其中，R⁸选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，和R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基；

R²是H、或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基或氰基或烷氧基；

R²′是H、或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基，

R³选自SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，其中，R¹¹选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²和SiR¹²R¹³R¹⁴，其中，R¹²、R¹³和R¹⁴独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和取代或未取代的芳基，其中，R¹²和R¹³连同它们连接的氮或碳原子一起，任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

其中，R¹¹、R¹²和R¹³中的至少一个连接所述药物到L¹，如果存在的话，或者连接到Q，

R⁶是单键，它存在或不存在，且当存在时，R⁶和R⁷相连形成环丙基环；和

R⁷是CH₂-X¹，或在所述环丙基环中，与R⁶相连的-CH₂-，其中，

X¹是离去基团，

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶和O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵，其中，n是1到20的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

和R²⁴和R²⁵独立地选自未取代的烷基，和

其中，至少一个R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′是O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵。

又一个实施方案是具有式1结构的化合物：

其中，X和Z独立地选自O、S和NR²³，其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸或CO₂R⁸，

R¹′是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R⁸，

每个R⁸独立地选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，且R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R²是H、取代或未取代的低级烷基、未取代的杂烷基、氰基、或烷氧基；

R²′是H、取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基，

R³选自SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，其中，R¹¹选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²和SiR¹²R¹³R¹⁴，其中，R¹²、R¹³和R¹⁴独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和取代或未取代的芳基，或R¹²和R¹³与它们连接的氮或碳原子一起形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

R⁶是单键，它存在或不存在，且当存在时，R⁶和R⁷相连形成环丙基环；和

R⁷是CH₂-X¹，或在所述环丙基环中，与R⁶相连的-CH₂-，其中，X¹是离去基团，

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶和O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵，其中，n是1到20的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

和R²⁴和R²⁵独立地选自未取代的烷基，和

其中，至少一个R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′是O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵。

在又一个方面中，本发明涉及药物制剂。所述制剂通常包含本发明的缀合化合物和药学可接受的载体。

在更进一步的方面中，本发明涉及使用本发明的缀合化合物的方法。例如，本发明提供了杀死细胞的方法，其中，向细胞施用足以杀死该细胞的量的本发明的缀合化合物。在优选实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了延缓或阻止哺乳动物患者肿瘤生长的方法，其中，本发明的缀合化合物以足以延缓或阻止肿瘤生长的量对患者给药。

本发明的其它方面、优点和目的将从下面的详细说明书的综述中显而易见。

发明的详细描述

缩写

当用于本文中时，″Ala″指的是丙氨酸。

″Boc″指的是叔丁氧羰基。

″CPI″指的是环丙烷吡咯并吲哚。

″Cbz″是苄氧羰基。

当用于本文中时，″DCM″指的是二氯甲烷。

″DDQ″指的是2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌。

DIPEA是二异丙基乙胺

″DMDA″是N，N′-二甲基乙二胺

″RBF″是圆底烧瓶

″DMF″是N，B-二甲基甲酰胺

″HATU″是N-[[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-1-基]亚甲基]-N-甲基methanaminium六氟磷酸盐N-氧化物

当用于本文中时，符号″E″代表酶可裂解基团。

″EDCI″是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。

当用于本文中时，″FMOC″指的是9-芴基甲氧羰基。

″FMOC″指的是9-芴基甲氧羰基。

″HOAt″是7-氮杂-1-羟基苯并三唑。

″Leu″是亮氨酸。

″PABA″指的是对氨基苯甲酸。

PEG指的是聚乙二醇

″PMB″指的是对甲氧基苄基。

″TBAF″指的是氟化四丁铵。

缩写″TBSO″指的是叔丁基二甲基甲硅烷基醚。

当用于本文中时，″TEA″指的是三乙胺。

″TFA″指的是三氟乙酸。

符号″Q″指的是治疗剂、诊断剂或可检测的标记。

定义

除非另外的定义，本文所用的全部技术和科学术语一般具有本发明所属领域普通技术人员所公认的含义。一般而言，本文所用的命名法和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学与核酸化学和杂交中的实验室操作都是本领域公知的和常用的。采用标准技术进行核酸和肽的合成。一般而言，酶反应和纯化步骤是按照厂商的规范进行的。技术和操作一般是按照本领域和各种一般性参考文献中的常规方法进行的(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，它被引入本文作为参考)，这些方法遍及该文献。本文所用的命名法和下述分析化学和有机合成中的实验室操作都是本领域公知的和常用的。采用标准技术或其改进进行化学合成和化学分析。

术语“治疗剂”打算表示这样一种化合物，当存在治疗有效量时，对哺乳动物产生所需的治疗效果。对于治疗癌症来说，需要该治疗剂还能够进入靶细胞。

术语“细胞毒素”打算表示这样一种治疗剂，它对癌细胞具有所需的细胞毒性效果。细胞毒性指的是药剂阻止细胞生长或杀灭细胞。示范性细胞毒素包括--仅供举例而非限制--考布他汀类(combretastatins)、双联霉素、CC-1065抗肿瘤抗生素、蒽环类(anthracyclines)和相关化合物。其它细胞毒素包括霉菌毒素、蓖麻毒及其类似物、刺孢霉素、多柔比星和美登素类(maytansinoids)。

术语“前药”和术语“药物缀合物”在本文中可互换使用。二者都指的是对细胞相对无毒而仍然是缀合形式，但通过某些条件如位于靶细胞内或在靶细胞附近的酶而被选择性降解成药理学活性形式的化合物。

术语“标记物”打算表示可用于肿瘤或其它医学条件特征鉴别的化合物，例如诊断、肿瘤的进展和由肿瘤细胞分泌的因子的测定。标记物被视为“诊断剂”的子集。

术语“选择性”当与酶裂解产物联合使用时指的是连接基团部分的裂解速率大于含氨基酸随机序列的肽的裂解速率。

术语“靶向基团”和“靶向剂”打算表示这样一种部分，它(1)能够使它所连接的实体(例如治疗剂或标记物)指向靶细胞，例如特殊类型的肿瘤细胞，或者(2)优先在靶组织例如肿瘤处被激活。靶向基团或靶向剂可以是小分子，它打算包括非肽类和肽类两者。靶向基团还可以是大分子，包括糖、植物凝集素、受体、受体的配体、蛋白质(例如BSA)、抗体等。在本发明优选的实施方案中，靶向基团是抗体或抗体片段，更优选单克隆抗体或单克隆抗体片段。

术语″自我牺牲型间隔基团″指的是能够将两个化学部分共价连接成通常稳定的三部分分子的双功能化学部分。自我牺牲型间隔基团能够从第二部分中自发分离，如果与第一部分的键裂解的话。

术语“可检测的标记”打算表示具有可检测的物理或化学性质的部分。

术语“可裂解基团”打算表示在体内不稳定的部分。优选地，“可裂解基团”允许标记物或治疗剂通过从缀合物其余部分上裂解而被活化。有效的定义是连接基团优选地被生物环境体内裂解。裂解可以无限制地来自任意过程，例如酶的、还原性、pH等。优选地，可裂解基团是这样选择的，以便活化作用发生在所需的作用部位，这可以是靶细胞(例如癌细胞)或组织内部或附近的部位，例如治疗作用或标记物活性的部位。这样的裂解作用是酶的裂解作用，示范性酶可裂解基团包括天然氨基酸或终止于天然氨基酸的肽序列，在它们的羧基末端与连接基团连接。尽管裂解速率增强程度不是本发明的关键，不过可裂解连接基团的优选实例是这样的，其中在给药24小时内在血流中裂解至少约10％可裂解基团，最优选为至少约35％。

术语“配体”指的是与靶细胞或组织上的受体、底物、抗原决定簇或其它结合位点特异结合或反应性地缔合或复合的任何分子。配体的实例包括抗体或其片段(例如单克隆抗体或其片段)、酶(例如纤维蛋白溶酶)、生物反应调节剂(例如白介素、干扰素、erythropeoitin或集落刺激因子)、肽类激素、和其抗原结合片段。

术语“肼连接基团”和“自我环化肼连接基团”在本文中可互换使用。这些术语指的是通过条改变件例如pH变化将进行环化反应并形成一个或多个环的连接基团部分。当接触时，肼部分转化成腙。例如可以通过与L⁴部分上的酮基反应发生这种接触。由于通过接触而转化成腙，因此，术语腙连接基团也可以用于描述本发明的连接基团。

术语“五-元肼连接基团”或“5-元肼连接基团”指的是通过条件改变例如pH变化将进行环化反应并形成一个或多个5-元环的含肼的分子部分。择一地，该5元连接基团可类似地描述成五-元腙连接基团或5-元腙连接基团。

术语“六-元肼连接基团”或“6-元肼连接基团”指的是通过条件改变例如pH变化将进行环化反应并形成一个或多个6-元环的含肼的分子部分。该6元连接基团可类似地描述成六-元腙连接基团或6-元腙连接基团。

术语“环化反应”当指代肽、肼或二硫化物连接基团的环化时，表示那个连接基团环化成环，并开始启动药物-配体复合物的分离。这个速率可以在易地测量，当至少90％、95％或100％的产物形成时，它就完成了。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中是可互换使用的，表示氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。这些术语还涵盖术语“抗体。”

术语“氨基酸”指的是天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，它们发挥作用的方式类似于天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是被遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示这样的化合物，它们具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，也就是与氢键合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。尤其可使用的一种氨基酸是瓜氨酸，它是精氨酸前体，并且参与肝内脲的形成。氨基酸模拟物指的是具有这样一种结构的化合物，它不同于氨基酸的一般化学结构，但是发挥作用的方式类似于天然存在的氨基酸。术语“非天然氨基酸”打算代表上述二十种天然存在的氨基酸的“D”立体化学构型。进一步可以理解，术语非天然氨基酸包括天然氨基酸的同系物和天然氨基酸的合成修饰形式。合成修饰形式包括但不限于亚烷基链缩短或延长至多两个碳原子的氨基酸、包含可选被取代的芳基的氨基酸和包含卤代基团、优选为卤代烷基和芳基的氨基酸。当与本发明的连接基团或缀合物连接时，氨基酸是“氨基酸侧链”的形式，其中氨基酸的羧酸基团已经被酮基(C(O))代替。因而例如，丙氨酸侧链是-C(O)-CH(NH₂)-CH₃，等等。

氨基酸和肽可通过阻断基团而被保护。阻断基团是保护氨基酸或肽N-末端免于进行不希望的反应的原子或化学部分，并且可以在药物-配体缀合物合成过程中使用。它在整个合成过程中将保持连接到N-末端，并且在药物缀合物合成完了以后可通过选择性地实现它的除去的化学条件或其它条件除去。适合于N-末端保护的阻断基团是肽化学领域公知的。示范性的阻断基团包括但不限于氢、D-氨基酸和苄氧羰基(Cbz)氯。

“核酸”表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经过修饰的骨架残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合性质，被代谢的方式也类似于参考核苷酸。这类类似物的实例无限制地包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNAs)。

除非另外指示，特定的核酸序列还隐含地涵盖其经过保守修饰的变体(例如退化的密码子取代)和补充序列以及详细指出的序列。具体而言，退化的密码子取代可以通过生成这样的序列加以实现，其中一个或多个选定的(或全部的)密码子的第三位被混合的碱和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell Probes 8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。

符号

无论用作一条键还是显示一条键的垂直位置都表示所显示的部分与分子、固体载体等其余部分连接的点。

术语“烷基”独自或者作为另一个取代基的一部分表示--除非另外规定--直链或支链或环状烃原子团或其组合，它可以是完全饱和的、单-或多-不饱和的，可以包括二-和多-价原子团，具有所指定的碳原子数(即C₁-C₁₀表示一至十个碳)。饱和烃原子团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和的烷基是具有一条或多条双键或叁键者。不饱和的烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高级同系物和异构体。术语“烷基”除非另外注解，还意味着包括下列详细定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃类基团的烷基也称“同烷基”。

术语“亚烷基”独自或者作为另一取代基的一部分表示从烷烃衍生的二价原子团，例如但不限于-CH₂CH₂CH₂CH₂-，进一步包括下述“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，具有10个或更少碳原子的那些基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是短链烷基或亚烷基，一般具有八个或更少碳原子。

术语“杂烷基”独自或者与另一个术语联合表示--除非另外规定--稳定的直链或支链或环状烃原子团或其组合，由规定数量的碳原子和至少一个杂原子组成，杂原子选自由O、N、Si和S组成的组，其中氮、碳和硫原子可任选地被氧化，氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N、S和Si可以位于杂烷基的任意内部位置或烷基与分子其余部分连接的位置。  实例包括但不限于-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“杂亚烷基”独自或者作为另一个取代基的一部分表示从杂烷基衍生的二价原子团，例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。关于杂亚烷基，杂原子也可以占据一个或两个链末端(例如亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷氨基、亚烷二氨基等)。术语“杂烷基”和“杂亚烷基”涵盖聚(乙二醇)及其衍生物(例如参见Shearwater聚合物Catalog，2001)。进一步地，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团来说，连接基团结构式书写的方向并不意味着连接基团的取向。例如，式-C(O)₂R’-代表-C(O)₂R’-和-R’C(O)₂-。

与术语“烷基”或“杂烷基”联合的术语“低级”表示具有1至6个碳原子的部分。

术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)使用它们的常规含义，表示分别经由氧原子、氨基SO₂基团或硫原子与分子其余部分连接的那些烷基。术语″芳基磺酰基″指的是经由SO₂基团与分子剩余部分相连的芳基，术语″巯基″指的是SH基团。

一般而言，“酰基取代基”也选自上述基团。本文所用的术语“酰基取代基”表示与羰基碳连接并且满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接与本发明化合物的多环核连接。

术语“环烷基”和“杂环烷基”独自或者与其它术语联合分别代表--除非另外规定--取代或未取代的“烷基”和取代或未取代的“杂烷基”的环状变型。另外，关于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。环状结构的杂原子和碳原子任选被氧化。

术语“卤代”或“卤素”独自或者作为另一个取代基的一部分表示--除非另外规定--氟、氯、溴或碘原子。另外，“卤代烷基”等术语意味着包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C₁-C₄)烷基”意味着包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

术语“芳基”表示--除非另外规定--取代或未取代的、多不饱和的、芳族烃取代基，它可以是单一的环或多个稠合在一起或共价连接的环(优选1至3个环)。术语“杂芳基”表示含有一至四个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮、碳和硫原子任选地是氧化的，氮原子任选地是季铵化的。杂芳基可以通过杂原子与分子其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。每个上述芳基和杂芳基环系的取代基选自下述可接受的取代基。“芳基”和“杂芳基”还涵盖这样的环系，其中一个或多个非芳族环系与芳基或杂芳基系统稠合或者另外键合。

为简便起见，术语“芳基”当与其它术语联合使用时(例如芳氧基、芳硫基、芳烷基)包括如上所定义的芳基和杂芳基环。因而，术语“芳烷基”意味着包括这样的原子团，其中芳基与烷基连接(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，该烷基包括这样的烷基，其中碳原子(例如亚甲基)已经例如被氧原子取代(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

以上每个术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括所示原子团的取代和未取代的形式。下面提供每种类型原子团的优选取代基。

烷基和杂烷基原子团(包括经常被称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基一般分别称为“烷基取代基”和“杂烷基取代基，它们可以是选自但不限于以下的各种基团的一种或多种：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R

、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂，数量范围从0至(2m’+1 )，其中m’是这类原子团中碳原子的总数。R’、R”、R

和R””各自优选独立地表示氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基--例如被1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳烷基。当本发明化合物包括一个以上R基团时，例如每个R基团是独立地加以选择的，当存在一个以上R’、R”、R

和R””基团时，它们也是如此。当R’和R”与相同的氮原子连接时，它们可以与氮原子联合构成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意味着包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。本领域技术人员从上述取代基的讨论将理解到，术语“烷基”意味着包括其中碳原子与除氢以外的基团键合的基团，例如卤代烷基(例如-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

类似于关于烷基原子团所述的取代基，芳基的取代基和杂芳基的取代基一般分别称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，并且是各不相同的，例如选自：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R

、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”)＝NR、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂、-R’、-N₃、-CH(Ph)₂、氟代(C₁-C₄)烷氧基和氟代(C₁-C₄)烷基，数量范围从零至芳族环系上开放化合价的总数；其中R’、R”、R

和R””优选独立地选自氢、(C₁-C₈)烷基与杂烷基、未取代的芳基与杂芳基、(未取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。当本发明化合物包括一个以上R基团时，例如每个R基团是独立地加以选择的，当存在一个以上R’、R”、R和R””基团时，它们也是如此。

芳基或杂芳基环的相邻原子上两个芳基取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CRR’)_q-U-取代基代替，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，q是0至3的整数。择一地，芳基或杂芳基环的相邻原子上两个取代基可以任选地被式-A-(CH₂)_r-B-取代基代替，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或单键，r是1至4的整数。如此构成的新环的单键之一可以任选地被双键代替。择一地，芳基或杂芳基环的相邻原子上两个取代基可以任选地被式-(CRR’)_s-X-(CR”R)_d-取代基代替，其中s和d独立地是0至3的整数，X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR’-。取代基R、R’、R”和R优选独立地选自氢或取代或未取代的(C₁-C₆)烷基。

当用于本文中时，术语“二磷酸酯”包括但不限于包含两个磷酸基的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不限于包含三个磷酸基的磷酸的酯。例如，含二磷酸酯或三磷酸酯的具体药物包括：

本文所用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

符号“R”是代表取代基的通用缩写，取代基选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环基。

术语″药学可接受的载体″当用于本文中时，指的是参与运输或转运化学药剂的药学可接受的物质、组合物或载体，例如液体填充剂或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。药学可接受的载体包括药学可接受的盐，其中，术语“药学可接受的盐”包括活性化合物的盐，它们是利用相对无毒性的酸或碱制备的，这取决于本文所述化合物上的特定取代基。当本发明化合物含有相对酸性的官能团时，可以这样得到碱加成盐，使这类化合物的中性形式与足量所需的碱接触，纯净地或者在适合的惰性溶剂中。药学可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或相似的盐。当本发明化合物含有相对碱性的官能团时，可以这样得到酸加成盐，使这类化合物的中性形式与足量所需的酸接触，纯净地或者在适合的惰性溶剂中。药学可接受的酸加成盐的实例包括从无机酸衍生的那些，酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或磷酸等，以及从相对无毒性的有机酸衍生的盐，酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，例如精氨酸盐等，和葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等有机酸的盐(例如参见Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些具体化合物含有碱性和酸性官能团，允许化合物转化为碱或酸加成盐。

化合物的中性形式优选地这样再生，使盐与碱或酸接触，再按常规方式分离母体化合物。化合物的母体形式在某些物理性质上不同于各种盐形式，例如在极性溶剂中的溶解度，但是出于本发明的目的，盐等同于化合物的母体形式。

除了盐形式以外，本发明提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是这样的化合物，它们在生理条件下容易经历化学变化，提供本发明的化合物。另外，前药可以在离体环境中通过化学或生化方法转化为本发明的化合物。例如，当置于含有适合的酶或化学试剂的透皮贴剂药库中时，前药可以缓慢地转化为本发明的化合物。

某些本发明化合物可以存在未溶剂化的形式以及溶剂化的形式，包括水合的形式。一般而言，溶剂化的形式等同于未溶剂化的形式，都涵盖在本发明的范围内。某些本发明化合物可以存在多晶型或无定形。一般而言，所有物理形式在本发明所涉及的用途上都是等同的，都属于本发明的范围。

某些本发明化合物具有不对称的碳原子(旋光中心)或双键；外消旋物、非对映体、几何异构体和个别的异构体都涵盖在本发明的范围内。

本发明的化合物还可以在构成这类化合物的一个或多个原子上含有非天然部分的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素放射性标记，例如氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)或碳-14(¹⁴C)。本发明化合物的所有同位素变体无论是否是放射性的都打算涵盖在本发明的范围内。

术语“连接部分”或“连接靶向基团的部分”表示允许靶向基团与连接基团连接的部分。典型的连接基团包括--仅供阐述而非限制--烷基、氨基烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、羟基烷基、烷基-马来酰亚胺、烷基-N-羟基琥珀酰亚胺、聚(乙二醇)-马来酰亚胺和聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺，它们全部可以被进一步取代。连接基团还可以使连接部分事实上附于靶向基团。

本文所用的术语“离去基团”表示在反应中从底物上裂解的底物部分。

本文所用的术语“抗体”包括整个抗体和任何抗原结合片段(即″抗原-结合部分″)或其单链。″抗体″指的是包含通过二硫化物键或其抗原结合部分互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个域，C_H1、C_H2和C_H3、且可为μ、δ、γ、α或ζ同种型。每个轻链包含轻链可变区(V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个区，C_L，它可为κ或λ同种型。V_H和V_L区可以进一步细分成高变区，它也被称为互补决定区(CDR)，其中分散有更保守的被称为框架区(FR)的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序从氨基末端排列到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。

术语“抗体片段”或抗体的“抗原-结合部分”(或单纯的“抗体部分”)当用于本文中时指的是保留与抗原特异性结合能力的一个或多个抗体片段。已经显示，抗体的抗原-结合功能可以通过全长抗体片段来完成。在术语“抗体片段”或抗体的“抗原-结合部分”中包括的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含由二硫化物桥在铰链区相连的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H区组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature             341：544-546)，它由V_H区组成；和(vi)分离出来的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个区，V_L和V_H，由单独的基因编码，但是它们可以用重组的方法通过合成的连接基团相连，该连接基团能使它们成为单个的蛋白链，其中，V_L和V_H区对形成单价分子(也称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science             242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA             85：5879-5883)。这样的单链抗体也打算包括在术语抗体的“抗原-结合部分”之内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，筛选片段，以用相同方式作为完整抗体使用。

术语“单克隆抗体”当用在本文中时指的是单分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物显示出了对特定抗原表位的单一的结合特异性和亲和力。

为了制备单克隆或多克隆抗体，可以使用现有技术已知的任何技术(参见例如Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的第77-96页)。

多克隆抗体的生产方法是本领域技术人员已知的。将同系繁殖的小鼠(例如BALB/C小鼠)或家兔用蛋白质致免疫，使用标准的佐剂，例如Freund’s佐剂，和标准的致免疫方案。动物对免疫原制备物的免疫应答是这样监测的，进行试验性放血，测定对β亚单位的反应性效价。当得到适当高的抗体对免疫原的效价时，采集动物的血液，制备抗血清。如果需要的话可以进行抗血清的进一步分离，以富集对蛋白质呈反应性的抗体。

单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术得到。简而言之，使被所需抗原致免疫的动物的脾细胞不死化，普遍通过与骨髓瘤细胞融合(Kohler & Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976))。不死化的替代方法包括用EB病毒、致癌基因或逆转录病毒，或本领域公知的其它方法。

在优选实施方案中，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以以鼠单克隆抗体序列为基础制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤获得，并用标准分子生物学技术设计成包含非鼠类(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了制造嵌合抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠可变区连接到人恒定区(参见例如授予Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)。为了制造人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠CDR区插入人框架(参见例如授予Winter的美国专利第5,225,539号和授予Queen等人的美国专利第5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370号)。

在另一个优选实施方案中，抗体是人抗体。可以通过免疫的转基因或转染色体小鼠来生产这种人抗体，在这种小鼠中，内源性小鼠免疫球蛋白基因已经被灭活，且外源性人免疫球蛋白基因已经被引入。这种小鼠是现有技术已知的(参见例如美国专利第5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429号，所有这些专利都授予Lonberg和Kay；授予Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和6,162,963号；和Ishida等人的PCT公报WO 02/43478)。人抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示法来制备。用于分离人抗体的这种噬菌体展示法也是现有技术已知的(参见例如授予Ladner等人的美国专利第5,223,409、5,403,484和5,571,698号；授予Dower等人的美国专利第5,427,908和5,580,717号；授予McCafferty等人的美国专利第5,969,108和6,172,197号；和授予Griffiths等人的美国专利第5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081号)。

本文所用的“固体载体”表示这样一种材料，它基本上不溶于所选择的溶剂系统，或者可以容易从所选择的可溶性溶剂系统中分离(例如通过沉淀法)。可用于实施本发明的固体载体可以包括活化的或者能够活化的基团，以允许所选择的种类与固体载体结合。固体载体还可以是一种底物，例如芯片、晶片或孔，本发明的个体或一种以上化合物结合其上。

本文所用的“反应性官能团”表示这样的基团，包括但不限于烯烃、炔烃、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸盐、异氰酸盐、硫氰酸盐、异硫氰酸盐、胺、肼、腙、酰肼、重氮、重氮盐、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸盐、次磺酸、异腈、脒、亚酰胺、亚胺酸盐、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等(例如参见Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic press，San Diego，1996)。制备每种这些官能团的方法是本领域公知的，它们应用于特定的目的或者根据特定的目的而修改都在本领域技术人员的能力范围内(例如参见Sandler andKaro，eds.有机官能团制剂，Academic Press，San Diego，1989)。反应性官能团可被保护或不被保护。

本发明的化合物被制成单一的异构体(例如对映体、顺-反式、位置的、非对映体)或异构体的混合物。在优选的实施方案中，化合物被制成基本单一的异构体。制备基本异构体纯的化合物的方法是本领域已知的。例如，富集对映体的混合物和纯的对映体化合物可以这样制备，利用对映体纯的合成中间体与这类反应的组合，这些反应维持手性中心的立体化学不变，或者导致其完全反转。择一地，终产物或合成沿途的中间体可以被拆分为单一的立体异构体。用于反转特定的立体中心或者维持其不变的技术和用于拆分立体异构体混合物的技术是本领域公知的，本领域技术人员完全在其能力范围内根据特定的情形选择适当的方法。一般参见Furniss等人(编辑)，VOGEL’SENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY第5版，LongmanScientific and Technical Ltd.，Essex，1991，第809-816页；Heller，Acc.Chem.Res.23：128(1990)。

连接基团

本发明提供了药物-配体缀合物，其中，药物通过化学连接基团与配体相连。该连接基团是肽基、肼或二硫化物连接基团，它们在本文中分别被描述成(L⁴)_p-F-(L¹)_m、(L⁴)_p-H-(L^I)_m或(L⁴)_p-J-(L^I)_m。除了与药物相连的连接基团，本发明还提供了适用于与基本上任何分子类型相连的可裂解的连接基团臂。本发明的连接基团臂在本文中参考它与治疗部分的连接进行解释。然而，对于本领域技术人员来说是显而易见的是，连接基团可以连接到不同的种类，包括但不限于诊断剂、分析试剂、生物分子、靶向剂和可检测的标记等。

本发明一方面涉及可用于连接靶向基团与治疗剂和标记物的连接基团。本发明另一方面提供了这样的连接基团，它们赋予化合物以稳定性，减少它们的体内毒性，或者有利地影响它们的药动学、生物利用度和/或药效学。一般优选的是在这类实施方案中，一旦药物被释放至它的作用部位，连接基团即被裂解，释放活性药物。因而，在本发明的一种实施方案中，本发明的连接基团是无痕迹的，以便一旦从治疗剂或标记物上除去(例如在活化期间)，不再存在连接基团的痕迹。

在本发明的另一种实施方案中，连接基团是以它们在靶细胞内或附近的部位被裂解的能力为特征的，例如治疗作用或标记物活性的部位。这类裂解作用实际上是酶的作用。这种特性有助于减少治疗剂或标记物的全身活化作用，减少毒性和全身副作用。酶裂解产物的优选的可裂解基团包括肽键、酯键和二硫化物键。在其它实施方案中，连接基团对pH敏感，且通过pH改变而裂解。

本发明的重要方面是能够控制连接基团裂解的速度。例如，本文所述的肼连接基团是特别有用的，因为根据所用的特定结构，人们可以改变连接基团的成环速度，从而将药物从配体中裂解出来。WO02/096910提供了数种含肼连接基团的配体-药物复合物。然而，根据所需的成环速度没有办法″协调″连接基团组成，且所述的特定化合物以相对于很多药物-连接基团缀合物优选的较慢的速度从药物裂解配体。相反，本发明的肼连接基团提供了一定范围的成环速度，从非常快到非常慢，从而根据所需的成环速度能够选择特定的肼连接基团。例如，可以用通过裂解产生单个5-元环的肼连接基团实现非常快的成环。使用肼连接基团实现了将细胞毒素剂靶向递送到细胞的优选成化速度，由于连接基团在成对位置具有两个甲基，该肼连接基团通过裂解产生了两个5-元环或单个6-元环。与在成对位置没有两个甲基的单个6-元环相比，双二甲基效应已经显示出加快了环化反应速度。这是由于环内减轻的拉紧。然而有时候，取代基可减慢反应，而不是使其加快。阻滞的原因常常可以追踪至位阻现象。如实施例2.4中所示，相对于双碳是CH₂来说，双二甲基取代导致了快得多的环化反应发生。

然而，重要要注意的是，在一些实施方案中，可能优选裂解较慢的连接基团。例如，在持续释放剂型中，或在既含速释又含缓释组成的剂型中，提供裂解较慢的连接基团可能是有用的。在某些实施方案中，使用肼连接基团实现了较慢的成环速度，该肼连接基团通过裂解产生了单个6-元环，在没有双二甲基取代的情况下，或者产生了单个7-元环。

连接基团还起到稳定治疗剂或标记物的作用，抵抗处于循环中的降解作用。这种特性提供显著的益处，因为这类稳定作用延长所连接的药物或标记物的循环半衰期。连接基团还起到减弱所连接的药物或标记物活性的作用，以便缀合物处于循环中是相对良性的，并且在所需作用部位活化后具有所需的效果，例如是毒性的。关于治疗剂缀合物，连接基团的这种特性起到提高药物治疗指数的作用。

稳定基团优选地是这样选择的，以限制治疗剂或标记物被可能存在于血液或非靶组织中的酶所廓清和代谢，并且进一步是这样选择的，以限制药物或标记物转运进入细胞。稳定基团起到阻滞药物或标记物降解的作用，还可以提供药物或标记物的其它物理特征。稳定基团还可以提高药物或标记物在贮存期间的稳定性，无论是经过配制的形式还是未经过配制的形式。

理想地，如果稳定基团起到防护药物或标记物降解的作用，那么当药物或标记物在37℃人血液中贮存2小时后，导致少于20％、优选少于10％、优选少于5％、更优选少于2％的药物或标记物在给定测定条件下被存在于人血液中的酶裂解，说明它可用于稳定治疗剂或标记物。

本发明还涉及含有这些连接基团的缀合物。更确切地，本发明涉及可以用于治疗疾病、尤其是癌症化疗法的前药。具体而言，本文所述连接基团的使用为前药提供相对于相似结构的前药而言更高的作用特异性、减少的毒性和提高的血液稳定性。

本文所述的本发明的连接基团可存在于细胞毒性缀合物内的任何位置。

因而，所提供的连接基团可以含有任意各种基团作为其链的一部分，它们将在体内裂解，例如在血流中，速率高于缺少这类基团的构成物。还提供了连接基团臂与治疗剂和诊断剂的缀合物。连接基团可用于生成治疗剂的前药类似物，可逆地连接治疗或诊断剂与靶向剂、可检测的标记或固体载体。连接基团可以结合成包括本发明细胞毒素的配合物。

除了可裂解的肽、肼或二硫化物基团以外，在细胞毒素和靶向剂之间任选引入一个或多个自我牺牲型连接基团L¹。这些连接基团也可描述成间隔基团，并包含至少两个反应性官能团。典型地，间隔基团的一个化学官能团与治疗剂例如细胞毒素的化学官能团相键合，而间隔基团的其它化学官能团则用于与靶向剂的化学官能团或可裂解的连接基团相键合。间隔基团的化学官能团的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮基和巯基。

用L¹表示的自我牺牲型连接基团通常是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂烷基。在一个实施方案中，烷基或芳基可包含1到20个碳原子。它们也可包含聚乙二醇部分。

示范性的间隔基团包括例如，6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸和其它氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、巯乙胺(2-氨基乙烷硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺苯甲酸、苯酞、α-取代的苯酞、羰基、缩醛胺酯、核酸和肽等。

间隔基团可以用于引入另外的分子量和化学官能团到细胞毒素-靶向剂复合物内。一般地，另外的质量和官能团会影响复合物的血清半衰期和其它性质。因此，通过仔细选择间隔基团，可以生成具有一定范围血清半衰期的细胞毒素复合物。

直接与药物部分相邻的间隔基团也表示成(L¹)_m，其中，m是选自0、1、2、3、4、5或6的整数。当存在多个L¹间隔基团时，可使用相同或不同的间隔基团。L¹可为任何自我牺牲型基团。在一个实施方案中，L¹优选是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、和取代的杂环烷基。当药物-配体缀合物包含肼连接基团时，L¹不含二硫化物键。

L⁴是利用包含该部分的连接基团使缀合物溶解度增大或聚集性质减小的连接基团部分。L⁴连接基团不一定是自我牺牲型。在一个实施方案中，L⁴部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基或未取代的杂烷基，它们中的任何一个可为直链、支链或环状。取代基可为例如，低级(C¹-C⁶)烷基、烷氧基、烷硫基、烷氨基或二烷氨基。在某些实施方案中，L⁴包含非环状部分。在另一个实施方案中，L⁴包含任何荷正电或荷负电的氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸或聚精氨酸。L⁴可以包含聚合物，例如聚乙二醇部分。另外，L⁴连接基团包含例如聚合物成分和些微化学部分。

在优选实施方案中，L⁴包含聚乙二醇(PEG)部分。L⁴的PEG部分可为1到50个单位长。优选地，PEG具有1-12个重复单位，更优选地，3-12个重复单位，更优选地，2-6个重复单位，或甚至更优选地，3-5个重复单位，最优选4个重复单位。L⁴可由单独的PEG部分组成，或它还可包含另外的取代或未取代的烷基或杂烷基。结合PEG作为L⁴部分的一部分对于提高复合物的水溶性是有用的。另外，PEG部分降低了可能在药物与抗体结合过程中发生的聚集度。

(1)肽连接基团(F)

如上面所讨论的，本发明的肽基连接基团可以用下式表示：(L⁴)_p-F-(L¹)_m，其中，F代表包含肽基部分的连接基团部分。在一个实施方案中，F部分包含任选另外的自我牺牲型连接基团L²、和羰基。在另一个实施方案中，F部分包含氨基和任选的间隔基团L³。

相应地，在一个实施方案中，包含肽基连接基团的缀合物包含式4结构：

在该实施方案中，L¹是如上所述的自我牺牲型连接基团，和L⁴是如上所述使溶解度增大或聚集性质减小的部分。L²代表自我牺牲型连接基团。m是0、1、2、3、4、5或6；o和p独立地是0或1。在一个实施方案中，m是3、4、5或6.AA¹代表一个或多个天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸；c是1到20的整数。

在上式4的本发明肽连接基团中，AA¹在其氨基末端直接连接到L⁴，或当L⁴不存在时，直接连接到X⁴基团(即靶向剂、可检测的标记、受保护的反应性官能团或未受保护的反应性官能团)。在一些实施方案中，当存在L⁴时，L⁴不包含与(AA¹)_c的N-末端直接相连的羧酸酰基。因而，在这些实施方案中，在L⁴或X⁴和AA¹之间直接存在羧酸酰基单元不是必需的，而这在美国专利第6,214,345号的肽连接基团中却所必需的。

在另一个实施方案中，包含肽基连接基团的缀合物包含式5结构：

在该实施方案中，L⁴是如上所述增大溶解度或减小聚集性质的部分；L³是包含伯胺或仲胺或羧基官能团的间隔基团，L³的胺与D的悬挂羧基官能团形成酰胺键，或者L³的羧基与D的悬挂胺官能团形成酰胺键；和o和p独立地是0或1。AA¹代表一个或多个天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸；c是1到20之间的整数。在该实施方案中，不存在L¹(即m是通式中的0)。

在以上式5的本发明肽连接基团中，AA¹在它的氨基末端直接与L⁴相连，或者当L⁴不存在时，直接与X⁴基团相连(即靶向剂、可检测的标记、受保护的反应性官能团或未受保护的反应性官能团)。在一些实施方案中，当存在L⁴时，L⁴不包含直接与(AA¹)_c的N-末端相连的羧酸酰基。因此，在这些实施方案中，在L⁴或X⁴和AA¹之间直接存在羧酸酰基单元并不是必需的，而这在美国专利第6,214,345号的肽连接基团中却所必需的。

自我牺牲型连接基团L²

自我牺牲型连接基团L²是双功能化学部分，它能够将两个间隔的化学部分共价连接在一起形成通常稳定的三部分分子，通过酶裂解的方式将所述间隔的化学部分从三部分分子中释放出来；并在所述酶裂解之后，同时从分子的剩余部分中裂解释放所述间隔的化学部分的其它部分。根据本发明，自我牺牲型间隔基团在其一个末端与肽部分共价相连，并在另一个末端与药物部分的化学反应位置共价相连，该药物部分的衍生化抑制了药理学活性，以将肽部分和药物部分间隔开并共价连接成三部分分子，在不存在靶酶的情况下，该三部分分子是稳定的和药理学无活性的，但通过该靶酶，在共价连接间隔基团部分和肽部分的键的地方，该三部分分子是酶可裂解的，从而影响肽部分从三部分分子中释放。该酶裂解产物将依次激活间隔基团部分的自我牺牲特性，并启动共价连接间隔基团部分到药物部分的键自发裂解，从而影响药理学活性形式的药物的释放。

自我牺牲型连接基团L²可为任何自我牺牲型基团。优选地，L²是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代和未取代的芳基、以及取代和未取代的杂芳基。

一个特别优选的自我牺牲型间隔基团L²可用式6表示：

氨苄基的芳环可被一个或多个″K″基团取代。″K″基团是芳环上的取代基，它取代了与属于环结构的一部分的四个未取代的碳中的一个另外相连的氢。″K″基团可为单个原子，例如卤素，或可为多原子基团，例如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤代烷基和氰基。每个K独立地选自取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹和OR²¹，其中，R²¹和R²²独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基和未取代的杂环烷基。示范性的K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO₂、OH、OCH₃、NHCOCH₃、N(CH₃)₂、NHCOCF₃和甲基。对于″Ka″来说，a是0、1、2、3或4的整数。在一个优选实施方案中，a是0。

以上结构的醚氧原子与羰基相连。从NR²⁴官能团到芳环中的连线表明胺官能团可与5个碳原子中的任何一个相键合，5个碳原子既形成环又不被-CH₂-O-基团取代。优选地，X的NR²⁴官能团在相对于-CH₂-O-基团的对位与芳环共价相连。R²⁴选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基。在特定实施方案中，R²⁴是氢。

在优选实施方案中，本发明提供了上式(4)的肽连接基团，其中，F包含以下结构：

其中，

R²⁴选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基；

每个K独立地选自取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹和OR²¹

其中，

R²¹和R²²独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基；和

a是0、1、2、3或4的整数。

在另一个实施方案中，上式(4)的肽连接基团包含包括以下结构的-F-(L¹)_m-：

其中，

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基。

间隔基团L³

间隔基团L³的特征在于它包含伯胺或仲胺或者羧基官能团，或者L³基团的胺与D的悬挂羧基官能团形成酰胺键，或者L³的羧基与D的悬挂胺官能团形成酰胺键。L³可以选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的杂环烷基。在优选实施方案中，L³包含芳香基团。更优选地，L³包含苯甲酸基团、苯胺基团或吲哚基团。可以用作-L³-NH-间隔基团的非限制性实例包括以下结构：

其中，Z选自O、S和NR²³，和

其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基。

通过包含L³的本发明连接基团的裂解，L³部分保持与药物D相连。相应地，选择L³部分，使得与D相连的它的存在不会显著改变D的活性。在另一个实施方案中，药物D部分本身起到L³间隔基团的作用。例如，在一个实施方案中，药物D是双联霉素衍生物，其中，药物部分起到L³间隔基团的作用。该实施方案的非限制性实例包括，其中NH₂-(L³)-D具有选自以下的结构的哪些：

和

其中，Z选自O、S和NR²³，

其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基；和

其中，每个结构上的NH₂基团与(AA¹)_c反应形成-(AA¹)_c-NH-。

肽序列 AA¹

基团AA¹代表单个氨基酸或通过酰胺键连接在一起的多个氨基酸。氨基酸可为天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸。

肽序列(AA¹)_c在功能上是单个氨基酸(当c＝1时)或通过酰胺键连接在一起的多个氨基酸的酰胺化修饰的(amidification)残基。选择本发明的肽，以通过生物系统中感兴趣部位的酶定向酶催化裂解肽。例如，对于使用靶向剂对细胞靶向然后被细胞吸收的缀合物来说，选择被一个或多个溶酶体蛋白酶裂解的肽，使得肽在溶酶体内被胞内裂解。肽内的氨基酸数目可以从1到20；但更优选地，将有2-8个氨基酸、2-6个氨基酸或2、3或4个氨基酸，这些氨基酸都包含(AA¹)_c。易于被特定的酶或酶类裂解的肽序列是现有技术公知的。

被血清、肝、肠等内的酶裂解的很多肽序列是现有技术公知的。本发明示范性的肽序列包括被蛋白酶裂解的肽序列。经过一段时间继续使用蛋白酶-敏感的序列以后，讨论的焦点在于解释的澄清，并不用于限制本发明的范围。

当裂解肽的酶是蛋白酶时，连接基团通常包括包含可裂解的蛋白酶识别序列的肽。可裂解的蛋白酶识别序列是在溶蛋白性裂解过程中被蛋白酶识别的特定的氨基酸序列。很多蛋白酶切割位点是现有技术已知的，并且这些和其它切割位点可以被包括在连接基团部分内。参见例如Matayoshi等人Science 247：954(1990)；Dunn等人Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等人Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等人Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等人Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier等人Meth.Enzymol.248：614(1995)；Hardy等人，in AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT，AGING，ANDALZHEIMER′SDI SEASE，ed.Masters等人，第190-198页(1994)。

根据它被特定分子例如肿瘤相关的蛋白酶选择性酶裂解的适合性而选择肽序列(AA¹)_c的氨基酸。所用的氨基酸可为天然或非天然氨基酸。它们可为L或D构型。在一个实施方案中，使用至少三个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，只使用两个氨基酸。

在优选实施方案中，根据它被溶酶体蛋白酶裂解的能力而选择肽序列(AA¹)_c，它的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L和S。优选地，肽序列(AA¹)_c能够在体外被组织蛋白酶B裂解，它们可以使用现有技术已知的体外蛋白酶裂解测定法来测试。

在另一个实施方案中，根据它被肿瘤相关的蛋白酶裂解的能力而选择肽序列(AA¹)_c，其中的肿瘤相关的蛋白酶例如是在肿瘤细胞附近的细胞外发现的蛋白酶，它的非限制性实例包括thimet oligopeptidase(TOP)和CD10。肽被TOP或CD10裂解的能力可以用现有技术已知的体外蛋白酶裂解测定法来测试。

适用于本发明缀合物的肽序列的合适的非限制性实例包括Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N⁹-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N⁹-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：1)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：2)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：3)。优选的肽序列是Val-Cit和Val-Lys。

在另一个实施方案中，从下组中选择位于药物部分附近的氨基酸：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。在其它实施方案中，从下组中选择位于药物部分附近的氨基酸：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。

蛋白酶已经参与癌症转移。蛋白酶尿激酶的合成增加与很多癌症中转移能力提高有关。尿激酶把类胰蛋白酶原激活成类胰蛋白酶，类胰蛋白酶原无所不在地位于细胞外间隙中，它的激活可以引起细胞外基质蛋白的降解，通过该过程而转移肿瘤细胞侵入。类胰蛋白酶也可以激活胶原酶，从而促进毛细血管和淋巴系统周围基底膜内的胶原降解，从而使得肿瘤细胞侵入到靶组织内(Dano等人Adv.Cancer.Res.，44：139(1985))。因此，利用可被尿激酶裂解的肽序列作为连接基团也在本发明的范围之内。

本发明还提供了对类胰蛋白酶裂解敏感的肽序列的用途。人肥大细胞表达至少四种不同的类胰蛋白酶，称为αβI、βII和βIII。这些酶不受血浆蛋白酶抑制剂的控制，并且体外仅裂解少数生理学底物。丝氨酸蛋白酶的类胰蛋白酶家族已经参与各种牵涉肥大细胞的变应性和炎性疾病，因为在患有这些障碍的患者生物体液中发现类胰蛋白酶水平升高。不过，类胰蛋白酶在疾病病理生理学中的确切角色仍然有待描绘。类胰蛋白酶的生物学功能和对应生理学后果的范围基本上是由它们的底物特异性所定义的。

类胰蛋白酶是前尿激酶类胰蛋白酶原激活物(uPA)的有力激活物，即与肿瘤转移和侵袭有关的蛋白酶的酶原形式。类胰蛋白酶原级联的活化作用导致用于细胞外渗和移行的细胞外基质的破坏，这种活化作用可能是前尿激酶类胰蛋白酶原激活物在Pro-Arg-Phe-Lys的P4-P1序列(SEQ ID NO：4)类胰蛋白酶活化作用的函数(Stack等人，Journalof Biological Chemistry 269(13)：9416-9419(1994))。作用于血管的肠肽即神经肽参与血管透过性的调节，也被类胰蛋白酶裂解，主要在Thr-Arg-Leu-Arg(SEQ ID NO：5)序列(Tam等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.3：27-32(1990))。与G蛋白偶联的受体PAR-2能够在Ser-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)序列被类胰蛋白酶裂解和激活，驱动成纤维细胞的增殖，而被凝血酶激活的受体PAR-1在Pro-Asn-Asp-Lys(SEQ ID NO：7)序列被类胰蛋白酶灭活(Molino等，Journal of Biological Chemistry 272(7)：4043-4049(1997))。总之，该证据提示了类胰蛋白酶在作为疾病后果的组织改型中的中心角色。这与在若干肥大细胞介导的障碍中所观察到的深刻变化是一致的。慢性气喘和其它长期呼吸疾病的一种证明是纤维变性和病变组织增厚，这可能是类胰蛋白酶对其生理靶的活化作用的结果。类似地，一系列报道已经显示，在各种癌症中，血管生成与肥大细胞密度、类胰蛋白酶活性和预后不良有关(Coussens等人，Genes and Development13(11)：1382-97(1999))；Takanami等人，Cancer 88(12)：2686-92(2000)；Toth-Jakatics等人，Human Pathology 31(8)：955-960(2000)；Ribatti等人，International Journal of Cancer85(2)：171-5(2000))。

用于评价特定的蛋白酶是否裂解所选择的肽序列的方法是本领域已知的。例如，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)荧光肽底物的使用是关于蛋白酶特异性测定的成熟方法(Zimmerman，M.等人，(1977)Analytical Biochemistry 78：47-51)。N-酰苯胺键的特异性裂解释放荧光AMC离去基团，允许简单地测定单个底物的裂解速率。最近，通过在单一的实验中取广泛的样本，已经采用AMC肽底物文库的数组(Lee，D.等人，(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters9：1667-72)和位置扫描文库(Rano，T.A.等人，(1997)Chemistry andBiology 4：149-55)来快速描绘蛋白酶的N-末端特异性。因而，本领域技术人员可以容易评价一组肽序列，以确定它们在本发明中的实用性，无需诉诸过多的实验方法。

(2)肼连接基团(H)

在第二个实施方案中，本发明的缀合物包含肼自我牺牲型连接基团，其中，缀合物具有如下结构：

其中，D、L¹、L⁴和X⁴如上定义，并在本文中进一步描述，且H是包含以下结构的连接基团：

其中，

n₁是1-10的整数；

n₂是0、1或2；

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基；和

I或者是键(即主链碳和相邻氮之间的键)，或者是

其中，n₃是0或1，条件是当n₃是0时，n₂不是0；和

n₄是1、2或3，

其中，当I是键时，n₁是3且n₂是1，D不可能是

其中，R是Me或CH₂-CH₂-NMe₂。

在一个实施方案中，苯基环上的取代是对位取代。在优选实施方案中，n₁是2、3或4，或n₁是3。在优选实施方案中，n₂是1。在优选实施方案中，I是键(即主链碳和相邻氮之间的键)。在一个方面中，肼连接基团，H，可以通过裂解形成6-元自我牺牲型连接基团，例如，当n₃是0且n₄是2时。在另一个方面中，肼连接基团，H，可以通过裂解形成两个5-元自我牺牲型连接基团。在其它方面中，通过裂解，H形成5-元自我牺牲型连接基团，H形成7-元自我牺牲型连接基团，或H形成5-元自我牺牲型连接基团和6-元自我牺牲型连接基团。裂解速度受通过裂解形成环的大小而影响。因此，根据所需的裂解速度，可以选择通过裂解形成的适当大小的环。

5元肼连接基团

在一个实施方案中，肼连接基团包括5-元肼连接基团，其中，H包含以下结构：

在优选实施方案中，n₁是2、3或4。在另一个优选实施方案中，n₁是3。在以上结构中，每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基。在一个实施方案中，每个R²⁴独立地是H或C₁-C₆烷基。在另一个实施方案中，每个R²⁴独立地是H或C₁-C₃烷基，更优选地，是H或CH₃。在另一个实施方案中，至少一个R²⁴是甲基。在另一个实施方案中，每个R²⁴是H。选择每个R²⁴以配合化合物的空间效应和改变溶解度。

5-元肼连接基团可以进行从连接基团分离药物的一个或多个环化反应，和可以用例如下式来描述：

本发明的5元连接基团的示范性的合成路线是：

Cbz-保护的DMDA b与2，2-二甲基-丙二酸a在亚硫酰氯溶液中反应形成Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸c。化合物c与Boc-N-甲基肼d在氢的存在下反应形成DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N-甲基肼e。

六元肼连接基团

在另一个实施方案中，肼连接基团包括6-元肼连接基团，其中，H包含以下结构：

在优选实施方案中，n₁是3。在以上结构中，每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基。在一个实施方案中，每个R²⁴独立地是H或C₁-C₆烷基。在另一个实施方案中，每个R²⁴独立地是H或C₁-C₃烷基、更优选地，H或CH₃。在另一个实施方案中，至少一个R²⁴是甲基。在另一个实施方案中，每个R²⁴是H。选择每个R²⁴以配合化合物的空间效应和改变溶解度。在优选实施方案中，H包含以下结构：

在一个实施方案中，H包含双二甲基取代。在以上结构的一个实施方案中，每个R²⁴独立地是H或取代或未取代的烷基。

6-元肼连接基团将经历从连接基团分离药物的环化反应，和可以用例如下式来描述：

制备本发明的6元连接基团的示范性的合成路线是：

Cbz-保护的二甲基丙氨酸a在二氯甲烷溶液中与HOAt和CPI反应形成Cbz-保护的二甲基丙氨酸肼b。肼b被甲醇的作用去保护，形成化合物c。

其它肼连接基团

关注于本发明包含7元连接基团。该连接基团不可能象5元或6元连接基团那样快地成环，但该连接基团对于某些药物-配体缀合物来说是优选的。类似地，肼连接基团可包含两个6元环或具有一个6元和一个5元环产物的肼连接基团。还关注于5元和7元连接基团以及6元和7元连接基团。

另外的肼结构，H，具有下式结构：

其中，q是0、1、2、3、4、5或6；和

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基。该肼结构也可以形成5元、6元或7元环，且可以加入另外的组分形成多元环。

(3)二硫化物连接基团(J)

在又一个实施方案中，连接基团包含酶可裂解的二硫化物基团。在一个实施方案中，本发明提供了具有式3结构的细胞毒性药物-配体化合物：

X⁴

L⁴ _pJ

L¹ _m

D    (3)

其中，D、L¹、L⁴和X⁴如上定义并在本文中进一步描述，和J是包含以下结构基团的二硫化物连接基团：

其中，

每个R²⁴独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、和未取代的杂烷基；

每个K独立地选自取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹和OR²¹

其中，

R²¹和R²²独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基和未取代的杂环烷基；

a是0、1、2、3或4的整数；和

d是0、1、2、3、4、5或6的整数。

二硫化物连接基团的芳环可被一个或多个″K″基团取代。″K″基团是芳环上的取代基，它取代了另外连接到四个非取代碳中的一个的氢，这四个非取代的碳是环结构的一部分。″K″基团可为单个原子，例如卤素，或可为多原子基团，例如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤代烷基和氰基。示范性的K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO₂、OH、OCH₃、NHCOCH₃、N(CH₃)₂、NHCOCF₃和甲基。对于″Ka″来说，a是0、1、2、3或4的整数。在一个具体实施方案中，a是0。

在优选实施方案中，连接基团包括下式的酶可裂解的二硫化物基团：

在该实施方案中，L⁴、X⁴、p和R²⁴的鉴别如上所述，且d是0、1、2、3、4、5或6。在特定实施方案中，d是1或2。

更具体的二硫化物连接基团显示在下式中：

该实施方案的具体实例如下：

优选地，d是1或2。

另一个二硫化物连接基团显示在下式中：

该实施方案的具体实例如下：

优选地，d是1或2。

在不同的实施方案中，二硫化物与胺邻位。在另一个具体实施方案中，a是0。在优选实施方案中，R²⁴独立地选自H和CH₃。

制备本发明二硫化物连接基团的示范性合成路线如下：

3-巯基丙酸a溶液与aldrithiol-2反应形成3-甲基苯并噻唑鎓碘化物(3-methyl benzothiazolium iodide)b。3-甲基苯并噻唑鎓碘化物c与氢氧化钠反应形成化合物d。化合物d的甲醇溶液进一步与化合物b反应形成化合物e。化合物e被乙酰氯和甲醇的作用脱保护形成化合物f。

本发明的药物-配体缀合物可任选包含两个或多个连接基团。这些连接基团可相同或不同。例如，肽基连接基团可用于将药物连接到配体，且第二个肽基连接基团可连接诊断剂到复合物。择一地，任何一个肽基、肼或二硫化物连接基团可连接药物和配体复合物，且任何一个肽基、肼或二硫化物连接基团可连接诊断剂到复合物。另外的连接基团的其它应用包括连接分析剂、生物分子、靶向剂和可检测的标记到药物-配体复合物。

多价的本发明化合物也在本发明范围之内，包括例如本发明化合物或其反应性类似物的二聚体、三聚体、四聚体和高级同系物。多价物可以从单一或一个以上本发明化合物聚集而成。例如，二聚构成物可以是“均二聚的”或“杂二聚的”。而且，其中本发明化合物或其反应性类似物与低聚或聚合框架(例如聚赖氨酸、葡聚糖、羟乙基淀粉等)连接的多价构成物也在本发明的范围内。框架优选地是多官能性的(例如具有用于连接本发明化合物的一组反应性部位)。而且，框架可以是利用单一或一个以上本发明化合物衍生的。

而且，本发明包括这样的化合物，它们被官能化后，所得化合物的水溶性相对于没有被类似官能化的相似化合物增强了。因而，本文所述的任意取代基都可以被水溶性更强的相似原子团代替。例如，在本发明范围内的是，用二醇代替羟基，或者用季胺、羟胺或水溶性更高的相似部分代替胺。在优选的实施方案中，对本文所述化合物离子通道而言不是活性必需的部位用增强母体化合物水溶性的部分取代，赋予额外的水溶性。增强有机化合物水溶性的方法是本领域已知的。这类方法包括但不限于将有机核用永久带电的部分官能化，例如季铵，或者用在生理学有关的pH下带电的基团官能化，例如羧酸、胺。其他方法包括向有机核附加含有羟基或胺的基团，例如醇、多元醇、聚醚等。代表性实例包括但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(乙二醇)和聚(丙二醇)。适合于这些化合物的官能化化学和策略是本领域已知的。例如参见Dunn，R.L.，等人，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991。

药物

药物，在本文中描述为″D″，在本发明中提供作为药物-配体缀合物的一部分，其中，药物通过肽基、肼或二硫化物连接基团连接到配体。药物必须具有想要的生物学活性，且包含反应性官能团以与配体连接。想要的生物学活性包括诊断、治愈、减轻、治疗或预防动物如人的疾病。因此，只要它具有所需的反应性官能团，术语″药物″指的是在法定的美国药典、法定的美国顺势疗法药典、或法定的国家处方集或其任何增刊中被认可的化学药品。示范性的药物列举在Physician′s Desk Reference(PDR)中和在美国食品和药品监督管理局(FDA)维护的橙皮书中。新药在持续被发现和开发，本发明提供了这些新药也可掺入本发明的药物-配体复合物中。

优选的官能团包括伯胺或仲胺、羟基、巯基、羧基、醛和酮。更优选的官能团包括羟基、伯胺或仲胺、巯基和羧酸官能团。甚至更优选的官能团包括羟基、伯胺和仲胺、和羧酸官能团。药物必须具有至少一个，但可具有2、3、4、5、6或多个反应性官能团。另外，自我牺牲型间隔基团，L¹，可掺入到药物的反应性官能团和肽、肼或二硫化物连接基团之间。

药物-配体缀合物对于通常目的来说是有效的，在该目的中，相应的药物是有效的，但由于配体固有的将药物转移到期望细胞中的能力(在该细胞中药物是特别有益的)，相应的药物具有更优越的效力。

示范性的药物包括包含连接到配体的官能团的蛋白质、肽和小分子药物。更特别地，这些药物包括例如，酶抑制剂，例如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸腺嘧啶核苷酸合酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类药物家族、长春花属药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒素核苷、蝶啶药物家族、diynenes、鬼臼毒素、分化诱导剂和泰素。

本发明优选的药物包括用于癌症治疗的细胞毒性药物和具有所需生物学活性的其它小分子、蛋白质或多肽，例如毒素。可选择药物以在肿瘤细胞中通过结合到肿瘤特异性配体而激活。这些肿瘤特异性药物-配体缀合物具有由于配体特异性而带来的肿瘤特异性。其实例是如下药物-配体缀合物，它是肿瘤特异性酶的高度选择性底物，其中，这些酶以足以在肿瘤附近生成细胞毒性水平的游离药物的量存在于肿瘤附近。这些肿瘤特异性药物-配体复合物的一个优点在于它们对人血清中偶发的蛋白酶是稳定的。药物-配体复合物的另一个优点在于它们比相应的游离药物具有较低的毒性；另外，复合物的特异性可允许使用相对于游离药物较低的全身浓度，由于特异性提高会导致更高百分比的复合物存在于肿瘤部位。

细胞毒素

用于本发明的细胞毒性药物包括例如，双联霉素和CC-1065及其类似物，包括双联霉素和CC-1065的以CBI(1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)为基础的类似物、以MCBI(7-甲氧基-1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)为基础的类似物、和以CCBI(7-氰基-1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)为基础的类似物，多柔比星和多柔比星缀合物，例如吗啉代-多柔比星和氰基吗啉代-多柔比星，多拉司他汀，例如多拉司他汀-10，考布他汀，刺孢霉素，美坦新，美坦新类似物，DM-1，auristatin E，auristatin EB(AEB)，auristatin EFP(AEFP)，单甲基auristatin E(MMAE)，5-苯甲酰戊酸-AE酯(AEVB)，tubulysins，disorazole，依普西龙，紫杉醇，多西紫杉醇，SN-38，托泊替康，根霉素，棘霉素，秋水仙碱，长春碱，长春地辛，雌莫司汀，西马多丁，艾榴塞洛素，甲氨蝶呤，甲基叶酸，二氯甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-巯嘌呤，阿糖胞苷，美法仑，洛诺生，洛诺西丁，放线菌素，柔红霉素和柔红霉素缀合物，丝裂霉素C，丝裂霉素A，卡柔比星，氨蝶呤，他利霉素，鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或依托泊苷磷酸酯，长春新碱，泰素，泰索帝维A酸，丁酸，N⁸-乙酰亚精胺，喜树碱及其类似物。可修饰其它已知的药物，以提供用于与本文所述连接基团结合的官能团。这样的化学修饰是本领域已知的。

优选用于本发明的细胞毒素包括：双联霉素和CC-1065以及其以CCBI为基础的和以MCBI为基础的类似物，吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，多拉司他汀-10，考布他汀，刺孢霉素，美坦新，DM-1，auristatin E，AEB，AEFP，MMAE，Tubulysin A，Disorazole，依普西龙A和依普西龙B。

本发明特别优选的细胞毒素是有效的双联霉素衍生物和CC-1065。母体化合物是特别有效的抗肿瘤抗生素，它通过可逆的受立体选择性控制的DNA序列选择性烷化而发挥其生物学作用(Boger等人J.Org.Chem.55：4499(1990)；Boge r等人J.Am.Chem.Soc.112：8961(1990)；Boger等人，J.Am.Chem.Soc.113：6645(1991)；Boger等人J.Am.Chem.Soc.115：9872(1993)；Boger等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2：759(1992))。在双联霉素最初公开之后，已经做了很多努力致力于阐明双联霉素的DNA烷化选择及其结构起源。

本发明特别优选的方面提供了具有式7结构的细胞毒性化合物：

其中环系A选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基。示范性环系包括苯基和吡咯。

符号E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或E和G任选相连形成环系，该环系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基。

符号X选自O、S和NR²³。R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基。

符号R³选自(＝O)、SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，其中，R¹¹选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²或SiR¹²R¹³R¹⁴。符号R¹²、R¹³和R¹⁴独立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和取代或未取代的芳基，其中，R¹²和R¹³与它们所连接的氮原子或碳原子一起任选连接形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选含有两个或多个杂原子。R¹²、R¹³和R¹⁴中的一个或多个可以包括其结构内的可裂解基团。

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶和O(CH₂)_nN(CH₃)₂，其中，n是1到20的整数。R¹⁵和R¹⁶独立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子。一个示范性结构是苯胺。

R⁴、R⁴′、R⁵、R⁵′、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵和R¹⁶任选包含其结构内的一个或多个可裂解基团。示范性可裂解基团包括但不限于肽类、氨基酸、肼和二硫化物。

R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵和R¹⁶中的至少一个用于连接药物到本发明的连接基团，如本文所述，例如连接到L¹，如果存在的话，或者连接到F、H或J。

在更进一步的示范性实施方案中，至少一个R⁴、R⁴′、R⁵、R⁵′、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵和R¹⁶携带适合于缀合该化合物的反应性基团。在进一步的示范性实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵、R⁵′、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代的烷基和取代的杂烷基，并且在烷基或杂烷基部分的游离末端具有反应性官能团。一个或多个R⁴、R⁴′、R⁵、R⁵′、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵和R¹⁶可与另一种分子缀合，例如靶向剂、可检测的标记、固体载体等。

从本文的讨论可以明显看出，当R¹⁵和R¹⁶中的至少一个包含反应性官能团时，该官能团可以是在药物与另一种分子之间的键的组分。在示范性实施方案中，其中，R¹⁵和R¹⁶中的至少一个包含药物与另一种分子之间的连接，R¹⁵和R¹⁶中的至少一个是被酶裂解的部分。在进一步的示范性实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的至少一个是：

在式8中，符号X²和Z¹独立地代表选自O、S和NR²³的成员。基团R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁹R²⁰、NC(O)R¹⁹、OC(O)NR¹⁹、OC(O)OR¹⁹、C(O)R¹⁹、SR¹⁹或OR¹⁹，条件是R¹²、R¹³、R¹⁹或R²⁰中的至少一个包含本发明的连接基团，如本文所公开的。

符号R¹⁹和R²⁰独立地代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的肽基，其中R¹⁹和R²⁰与它们所连接的氮原子一起任选形成4至6元取代或未取代的杂环烷基环系，任选含有两个或多个杂原子，其条件是当Z¹是NH时，R¹⁷和R¹⁸都不是H，且R¹⁷不是NH₂。遍及本说明书的符号R¹⁹和R²⁰还涵盖R⁴和R⁵所述基团。因而例如，在本发明的范围内提供这样的化合物，它具有两个或多个如上刚才所述的相连的稠合苯基-杂环环系或稠合环与连接基团的组合。而且，在存在连接基团的那些实施方案中，连接基团可作为R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′取代基存在或者作为R¹⁷或R¹⁸取代基存在。

R⁶是单键，它可以存在也可以不存在。当R⁶存在时，R⁶和R⁷连接构成环丙基环。R⁷是CH₂-X¹或-CH₂-。当R⁷是-CH₂-时，它是环丙烷环的组分。符号X¹代表离去基团，例如卤素，如Cl、Br或F。技术人员将理解R⁶和R⁷的组合方式不会违反化合价的原理。

六元环内的曲线表示该环可以具有一个或多个不饱和度，并且可为芳香性的。因而，例如下述等环结构和有关的结构都属于式(9)的范围：

和

在示范性实施方案中，环系A是取代或未取代的苯基环。环系A优选地被一个或多个如本文定义一节所述的芳基取代基取代。在一种优选的实施方案中，苯基环被CN或甲氧基部分取代。

在另一个示范性实施方案中，本发明提供具有式10结构的化合物：

在这个实施方案中，原子团R³、R⁴、R⁴′、R⁵、R⁵′、R⁶、R⁷和X是如上所述的取代基。符号Z是独立地选自O、S和NR²³的成员。符号R²³代表选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基的成员。每个R²³是独立地加以选择的。符号R¹代表H、取代或未取代的低级烷基或C(O)R⁸或CO₂R⁸。R⁸选自取代的烷基、未取代的烷基、NR⁹R¹⁰、NR⁹NHR¹⁰和OR⁹。R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基。原子团R²是H或取代或未取代的低级烷基。一般优选的是当R²是取代的烷基时，它不是全氟烷基，例如CF₃。在一个实施方案中，R²是取代的烷基，其中，取代基不是卤素。在另一个实施方案中，R²是未取代的烷基。

正如上面所讨论的，X¹可为离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺酸酯(例如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、烷基高氯酸酯、铵烷磺酸酯、烷基氟代磺酸酯和氟代化合物(例如三氟甲磺酸酯、nonaflates、甲苯磺酸酯)等。用作离去基团的特别的卤素是F、Cl和Br。适合于特定的一套反应条件的这些与其它离去基团的选择在本领域技术人员的能力范围内(例如参见March J，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第2版，John Wiley and Sons，1992；Sandler SR，Karo W，ORGANIC官能团PREPARATIONS，第2版，AcademicPress，Inc.，1983；Wade LG，COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETICMETHODS，John Wiley and Sons，1980)。

在示范性实施方案中，R¹是酯部分，例如CO₂CH₃。在进一步的示范性实施方案中，R²是低级烷基，它可以是取代或未取代的。目前优选的低级烷基是CH₃。在进一步的实施方案中，R¹是CO₂CH₃，且R²是CH₃。

在另一个示范性实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、卤素、NH₂、OMe、O(CH₂)₂N(Me)₂和NO₂。

在一个实施方案中，选择药物，以使得离去基团X¹选自卤素、烷基磺酰基、芳基磺酰基和叠氮化物。在另一个实施方案中，Z是O。在某些实施方案中，R¹可为CO₂CH₃或R²可为CH₃；另外，R¹可为CO₂CH₃和R²可为CH₃。R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的一个可为C(O)R¹⁵，且R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的其它三个是H。另外，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的至少一个可为不同于选自H和OCH₃的成员。在一个实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、卤素、NH₂、O(CH₂)₂N(Me)₂和NO₂。

在优选实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的一个是O(CH₂)₂N(Me)₂，且另外的R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′是H。在另一个实施方案中，R⁷是CH₂-X¹，其中，X¹是F、Cl或Br，且R⁶不存在。

在又一个示范性的实施方案中，本发明提供了具有式11和12结构的化合物：

和

在上式的一个实施方案中，X优选是O；和Z优选是O。在另一个实施方案中，Z是NR²³或O。择一地，R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的一个可为O(CH₂)₂N(Me)₂，而R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的其它三个是H。在一个实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′可选自R²⁹、COOR²⁹、C(O)NR²⁹、C(O)NNR²⁹，其中，R²⁹选自H、OH、取代的烷基、未取代的烷基、取代的环烷基、未取代的环烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的环杂烷基、未取代的环杂烷基、取代的杂芳基、和未取代的杂芳基。

在上式的另一个实施方案中，X优选是O，Z优选是O，R₁优选是CO₂CH₃，R₇优选是CH₂-Cl，R₂优选是CH₃，R₃优选是OH。择一地，R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的一个可为NHC(O)(C₆H₄)NH₂，而R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的其它三个是H。

在一个实施方案中，R²⁹可选自：

和

在药物的又一个实施方案中，选自R⁴和R⁵的一个成员是：

其中，X²和Z¹独立地选自O、S和NR²³；R¹⁷和R¹⁸独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁹R²⁰、NC(O)R¹⁹、OC(O)NR¹⁹、OC(O)OR¹⁹、C(O)R¹⁹、OR¹⁹和O(CH₂)_nN(CH₃)₂。在该实施方案中，n是1到20的整数；R¹⁹和R²⁰独立地选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基，其中，R¹⁹和R²⁰与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子，其中，R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁹或R²⁰中的一个连接所述药物到L¹，如果存在的话，或者连接到F。在一个优选实施方案中，X²是O且Z¹是O或NR²³。

式7双联霉素类似物的另一个优选的结构是，其中，环系A是未取代的或取代的苯基环。对于当环系A是吡咯时的式7结构来说，上文所述的药物分子上的优选取代基也是当环系A是未取代或取代的苯基环时的优选取代基。

例如，在优选实施方案中，药物(D)包括以下结构：

在该结构中，R³、R⁶、R⁷、X如以上式7所述。此外，Z选自O、S和NR²³，其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸或CO₂R⁸，其中，R⁸选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，其中，R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R¹′是H、取代或未取代的低级烷基或C(O)R⁸，其中，R⁸选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，其中，R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R²是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基、或氰基、或烷氧基；和R²′是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基。

R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个连接药物到L¹，如果存在的话，或者连接到F、H或J。

在优选实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的一个是O(CH₂)₂N(Me)₂，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的其它几个是H。在另一个实施方案中，R⁷是CH₂-X¹，其中，X¹是F、Cl或Br，和R⁶不存在。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下式结构的细胞毒性药物-配体化合物：

X⁴ L⁴

_pQ

L¹

_m D¹

其中，符号L¹代表自我牺牲型间隔基团，其中，m是0、1、2、3、4、5或6的整数。

符号X⁴代表选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂。

符号L⁴代表连接基团部分，和p是0或1。L⁴是使缀合物溶解度提高和聚集性质降低的部分。L⁴部分的实例包括取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基或未取代的杂烷基，它们中的任何一个可为直链、支链或环状，荷正电或荷负电的氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸或聚精氨酸或其它聚合物如聚乙二醇。

符号Q代表任何可裂解的连接基团，包括但不限于本文所述的任何肽基、腙和二硫化物连接基团。其它合适的连接基团包括但不限于在以下文献中描述的哪些：美国专利第6,214,345号；美国专利申请公布第2003/0096743、2003/0130189和2004/121940号；PCT专利申请公布第WO 03/026577和WO 04/043493号；和欧洲专利申请公布第EP1243276和EP1370298号，它们全部都引入文本作为参考。可裂解的连接基团包括可以被化学或生物学方法选择性裂解和通过裂解从X⁴分离出药物D¹的哪些。裂解可以随处发生，根据连接基团的长度或在连接基团的任何一个末端。

符号D¹代表具有以下结构的药物：

其中，X和Z独立地选自O、S和NR²³；

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸或CO₂R⁸，

R¹′是H、取代或未取代的低级烷基或C(O)R⁸，

其中，R⁸选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，且R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R²是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基、或氰基、或烷氧基；

R²′是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基，

R³选自SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，其中，R¹¹选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²和SiR¹²R¹³R¹⁴，其中，R¹²、R¹³和R¹⁴独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和取代或未取代的芳基、其中，R¹²和R¹³与它们连接的氮或碳原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

其中，R¹¹、R¹²和R¹³中的至少一个连接所述药物到L¹，如果存在的话，或者连接到Q，

R⁶是单键，它存在或不存在，且当存在时，R⁶和R⁷相连形成环丙基环；和

R⁷是CH₂-X¹或在所述环丙基环中与R⁶相连的-CH₂-，其中，

X¹是离去基团，

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶，和O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵其中n是1到20的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H，取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

和R²⁴和R²⁵独立地选自未取代的烷基，和其中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的至少一个是O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵。

在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，R²⁴和R²⁵是甲基。在一些实施方案中，R⁴是O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵，和R⁴′、R⁵和R⁵′是H。在一些实施方案中，R⁴是O(CH₂)₂N(CH₃)₂，和R⁴′、R⁵和R⁵′是H。在一些实施方案中，Q是选自如上所述的F、H和J的连接基团。在一些实施方案中，R¹、R¹′、R²和R²′是H。

药物D¹的优选结构式如下：

药物D¹的另一个优选结构式如下：

药物D¹的又一个优选结构式如下：

和

在本发明另一个示范性的实施方案中，细胞毒性药物可为tubulysin类似物或相关化合物，例如，式13结构所述的化合物：

其中，R₁和R₂是H或低级烷基，或更特别地是异丁基、乙基、丙基或叔丁基，且R₃是H或OH。Tubulysin及其在治疗癌症中的用途已经描述在例如，PCT公报WO 2004/005327和WO 2004/005326中。tubulysin化合物的生产描述在DE10008089中。可用于连接tubulysin到本发明各种连接基团的方法在实施例中提供。优选的tubulysin类似物是Tubulysin A-F。

CBI类似物

这些特殊的化合物是CBI类似物，在于它们掺入了1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮(CBI)烷化区域或烷化亚单位。该化合物可用作药物。本发明优选的药物包括用于癌症治疗的细胞毒性药物。这些化合物可能被或不被缀合，或包括上述连接基团。用于本发明的细胞毒性药物包括例如，以CBI(1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)为基础的类似物、以MCBI(7-甲氧基-1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)为基础的类似物、和以CCBI(7-氰基-1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)为基础的类似物。

在一个实施方案中，本发明化合物具有下式(14)：

其中，X和Z独立地选自O、S和NR²³，其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸、CO₂R⁸，

R¹′是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R⁸，

每个R⁸独立地选自NR⁹R¹⁰和OR⁹，且R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基；

R²是H、取代或未取代的低级烷基、未取代的杂烷基、氰基或烷氧基；

R²′是H、取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基，

R³选自SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，其中，R¹¹选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²和SiR¹²R¹³R¹⁴，其中，R¹²、R¹³和R¹⁴独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和取代或未取代的芳基，或R¹²和R¹³与它们连接的氮或碳原子一起形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

R⁶是单键，它存在或不存在，且当存在时，R⁶和R⁷相目连形成环丙基环；和

R⁷是CH₂-X¹，或在所述环丙烷基环中与R⁶相连的-CH₂-，其中，X¹是离去基团，

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶和O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵，其中，n是1到20的整数，优选地，n是2到6的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

和R²⁴和R²⁵独立地选自未取代的烷基，和

其中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的至少一个是O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵。

如上所讨论的，X¹可为离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺酸酯类(例如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、高氯酸烷基酯、铵烷烃磺酸酯(ammonioalkanesulfonate esters)、烷基氟代磺酸酯和氟化物(例如triflates、nonaflates、tresylates)等。用作离去基团的特定的卤素是F、Cl和Br。适合于特定组合的反应条件的这些和其它离去基团的选择在本领域技术人员的能力范围之内(参见例如，March J，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第2版，JohnWiley and Sons，1992；Sandler SR，Karo W，ORGANIC FUNCTIONALGROUP PREPARATIONS，第2版，Academic Press，Inc.，1983；和WadeLG，COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS，John Wiley and Sons，1980)。

在一些实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、卤素、NH₂、OMe、O(CH₂)₂N(Me)₂和NO₂。在一些实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′中的至少一个是O(CH₂)₂N(Me)₂。在一些实施方案中，R⁴、R⁴′、R⁵或R⁵′中的至少一个是O(CH₂)₂N(Me)₂，而其它的R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′则是H。在其它实施方案中，R⁴是O(CH₂)₂N(Me)₂，且R⁴′、R⁵和R⁵′是H。

在一些实施方案中，R⁷是CH₂-X¹，其中，X¹是F、Cl或Br，且R⁶不存在。在一些实施方案中，选择药物，使得离去基团X¹选自卤素、烷基磺酰基、芳基磺酰基和叠氮化物。在一些实施方案中，X¹是Cl或Br。

在一些实施方案中，Z是O。在一些实施方案中，X和Z是O。

在一些实施方案中，R²是H、甲基或氰基，且R¹、R¹′和R²′是H。在一些实施方案中，R¹、R¹′、R²和R²′是H。在一些实施方案中，R¹、R¹′和R²′是H。

在一些实施方案中，R³是下述反应性基团。

式(14)化合物优选的结构式如下：

式(14)化合物另一个优选的实施方案如下：

式(14)化合物又一个优选的实施方案如下：

和

优选的双联霉素和CBI缀合物

本发明的肽、肼或二硫化物连接基团可以用于包含双联霉素或CBI类似物作为细胞毒素剂的缀合物。优选的本发明缀合物在下面将进一步描述。除非特别说明，取代基如以上在关于细胞毒素、肽连接基团、肼连接基团和二硫化物连接基团的部分中的定义。

A.肽连接基团缀合物

在优选实施方案中，本发明提供了具有以下结构的肽连接基团缀合物：

或

其中，X¹是卤素；

X选自O、S和NR²³；

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；和

R⁴、R⁴′、R⁵和R⁵′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、OR¹⁵和O(CH₂)_nN(CH₃)₂，

其中，

n是1到20的整数；和

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子。

这样的缀合物的非限制性实例包括以下结构

和

其中，X¹是Cl或Br；

和其中，Ab是抗体或其片段。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了具有以下结构的缀合物：

其中，X¹是离去基团；

Z和X独立地选自O、S和NR²³，

其中，R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；和

R³选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、OR¹⁵和O(CH₂)_nN(CH₃)₂，

其中，

n是1到20的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H，取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子。

这样的缀合物的非限制性实例包括以下结构：

和

其中，每个b独立地是0到20的整数，且Ab是抗体，或其片段。

在又一个优选实施方案中，本发明提供了具有选自以下结构的肽连接基团缀合物：

其中，X¹是Cl或Br，且Ab是抗体，或其片段。

在其它的实施方案中，本发明提供了具有选自以下结构的肽连接基团缀合物：

和

其中，X¹是Cl或Br，且Ab是抗体，或其片段。

在其它的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的肽连接基团缀合物：

其中，X¹是Cl或Br，且Ab是抗体，或其片段。

B.肼连接基团缀合物

在优选实施方案中，本发明提供了具有以下结构的肼连接基团缀合物：

在另一个优选实施方案中，本发明提供了具有以下结构的肼连接基团缀合物：

和

在又一个优选实施方案中，本发明提供了具有选自以下结构的肼连接基团缀合物：

和

其中，PEG是聚乙二醇部分，且X¹是Cl或Br。

在其它优选实施方案中，本发明提供了具有选自以下结构的肼连接基团缀合物：

和

其中，X¹是Cl或Br，且Ab是抗体，或其片段。

在又一个实施方案中，肼连接基团缀合物选自以下结构：

和

C.二硫化物连接基团缀合物

在优选实施方案中，本发明提供了具有以下结构的二硫化物连接基团缀合物：

和

该结构的非限制性实例包括如下：

和

其中，X¹是Cl或Br，且Ab是抗体，或其片段。

配体

本发明的配体表示为″X⁴″。在本发明中，X⁴代表选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂。优选的配体是靶向剂，例如抗体及其片段。

在优选实施方案中，基团X⁴可以描述为选自R²⁹、COOR²⁹、C(O)NR²⁹和C(O)NNR²⁹，其中，R²⁹选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和取代或未取代的杂芳基。在又一个示范性的实施方案中，R²⁹选自H；OH；NHNH₂；

和

其中，R³⁰代表被反应性官能团封端的取代或未取代的烷基、被官能团封端的取代或未取代的杂芳基。以上结构用作反应性保护基，该保护基可以与例如靶向剂如抗体的氨基酸侧链反应，由此将靶向剂连接到连接基团-药物部分。

靶向剂

本发明的连接基团臂和细胞毒素可以与靶向剂连接，后者选择性递送负载至细胞、器官或机体区域。示范性靶向剂例如抗体(例如嵌合的、人源化的和人抗体)、受体的配体、凝集素、糖、抗体等，是本领域所公认的，没有限制地可用于实施本发明。其它靶向剂包括一类化合物，它们不包括特异性分子识别基序，包括大分子，例如聚(乙二醇)、多糖、聚氨基酸等，它们增加细胞毒素的分子质量。额外的分子质量影响细胞毒素的药动学，例如血清半衰期。

在示范性实施方案中，本发明提供细胞毒素、连接基团或细胞毒素-连接基团与靶向剂的缀合物，靶向剂是一种生物分子，例如抗体、受体、肽、凝集素、糖、核酸或其组合。本发明的示范性缀合物途径如上流程所述。

可用于实施本发明的生物分子可以是从任意来源衍生的。生物分子可以是从天然来源分离的，或者可以利用合成方法制备。蛋白质可以是天然的蛋白质或突变的蛋白质。突变作用可以通过化学诱变、指向位点的诱变或本领域技术人员已知的其它诱导突变的手段加以进行。可用于实施本发明的蛋白质例如包括酶、抗原、抗体和受体。抗体可以是多克隆的或单克隆的，但最优选的是单克隆的。肽和核酸可以是从天然来源分离的，或者可以原本是完全或部分合成的。

在优选实施方案中，靶向剂是抗体或抗体片段，它是根据对感兴趣的靶细胞上或靶位处表达的抗原的特异性而选择的。已经鉴定了很多肿瘤特异的或其他疾病特异的抗原，并且那些抗原的抗体也已经使用或被提议用于治疗该肿瘤或其它疾病。现有技术已知的抗体可以用于本发明的缀合物，尤其用于治疗与靶抗原相关的疾病。本发明的抗体-连接基团-药物缀合物可以靶向的靶抗原的非限制性实例(及其相关疾病)包括：Her2(乳腺癌)、CD20(淋巴瘤)、EGFR(实体肿瘤)、CD22(淋巴瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤)、CD52(慢性淋巴性白血病)、CD33(急性骨髓性白血病)、CD4(淋巴瘤、自体免疫疾病，包括类风湿性关节炎)、CD30(淋巴瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤)、Muc18(黑素瘤)、整合素(实体肿瘤)、PSMA(前列腺癌、良性前列腺增生)、CEA(结肠直肠癌)、CD11a(银屑病)、CD80(银屑病)、CD23(哮喘)、CD40L(immune thromobcytopenic purpura)、CTLA4(T细胞淋巴瘤)和BLys(自体免疫疾病，包括系统性红斑狼疮).

在其中识别部分是蛋白质或抗体的那些实施方案中，蛋白质可以通过蛋白质表面上任意可利用的反应性肽残基通过间隔基团臂与表面或自体聚集单层(SAM)组分连接或相连。在优选的实施方案中，反应性基团是胺或羧酸酯。在特别优选的实施方案中，反应性基团是赖氨酸残基的ε-胺基。此外，这些分子可以被非特异性相互作用(例如化学吸附、物理吸附)吸附在底物或SAM的表面上。

抗体识别部分可以用于识别分析物，它们是蛋白质、肽、核酸、糖或小分子，例如药物、除草剂、农药、工业化学品和弹药。唤起抗体对特异性分子活性的方法是本领域技术人员公知的。参见1992年9月15日授予Feng等人的美国专利第5/147,786号；1994年8月2日授予Stanker等人的美国专利第5/334,528号；1997年11月11日授予A1-Bayati，M.A.S.的美国专利第5/686,237号和1996年11月12日授予Hoess等人的美国专利第5/573,922号。用于连接抗体与表面的方法也是本领域已知的。参见Delamarche等人，Langmuir12：1944-1946(1996)。

靶向剂可以通过任意可利用的反应性基团连接本发明的连接基团。例如，通过胺、羧基、巯基或羟基可以连接肽。这样一种基团可以位于肽链的末端或内部位置。通过碱(例如环外胺)上的反应性基团或糖部分上的可利用的羟基(例如3’-或5’-羟基)可以连接核酸。肽和核酸链可以进一步在一个或多个位置被衍生，以便在链上连接适当的反应性基团。参见Chrisey等人，Nucleic Acids Res.24：3031-3039(1996)。

当肽或核酸是完全或部分合成的分子时，可以在合成过程期间结合反应性基团或被掩蔽的反应性基团。很多适合于在肽和核酸中结合反应性基团的经过衍生的单体都是本领域技术人员已知的。例如参见The PEPTIDES：ANALYSIS，SYNTHESIS，BIOLOGY，Vol.2：“SpecialMethods in Peptide Synthesis”，Gross，E.and Melenhofer，J.，Eds.，Academic Press，New York(1980)。很多有用的单体是商业上可得到的(Bachem，Sigma等公司)。这种被掩蔽的基团然后可以在合成后去除掩蔽，此时它可以与本发明化合物组分反应。

示范性核酸靶向剂包括适体、反义化合物和构成三螺旋的核酸。通常，糖残基的羟基、来自碱残基的氨基或核苷酸的磷酸氧用作必要的化学官能团，使核苷酸类靶向剂与细胞毒素偶联。不过，本领域技术人员将容易领会到，其它“非天然”反应性官能团能够利用常规技术附加于核酸上。例如，糖残基的羟基可以利用本领域公知的技术转化为巯基或氨基。

适体(或核酸抗体)是结合特异性分子靶的单链或双链DNA或单链RNA分子。一般而言，适体通过抑制分子靶--例如蛋白质--的作用、结合在血液中循环的靶集合而发挥作用。适体具有化学官能团，因而能够与细胞毒素共价键合，如本文所述。

尽管各种分子靶能够与适体生成非共价性而特殊的缔合作用，包括小分子药物、代谢产物、辅因子、毒素、糖类药物、核苷酸类药物、糖蛋白等，不过一般而言分子靶将包含蛋白质或肽，包括血清蛋白、激肽、二十碳化合物、细胞表面分子等。适体的实例包括Gilead氏抗凝血酶抑制剂GS 522及其衍生物(Gilead Science，Foster City，Calif.)。另见Macaya等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3745-9(1993)；Bock等人，Nature(London)355：564-566(1992)和Wang等人，Biochem.32：1899-904(1993)。

对特定生物分子呈特异性的适体可以利用本领域已知的技术鉴别。例如参见Toole等人，(1992)PCT公报第92/14843号；Tuerk和Gold(1991)PCT公报第WO 91/19813号；Weintraub和Hutchinson(1992)PCT公报第92/05285号和Ellington and Szostak，Nature346：818(1990)。简而言之，这些技术通常牵涉分子靶与寡核苷酸随机混合物的配合作用。适体-分子靶配合物是从未配合的寡核苷酸中分离的。将适体从所分离的配合物中回收，扩增。重复这种循环，以鉴别对分子靶具有最高亲合性的适体序列。

关于由基因的不适当表达所引起的疾病，特异性防止或减少这类基因的表达代表了理想的疗法。原则上，特定基因产物的产生可以被单链脱氧核苷酸或核糖脱氧核苷酸的杂交所抑制、减少或切断，这些核苷酸与mRNA中的可用序列或前-mRNA加工所必需的转录体内的序列是互补性的，或者与基因本身内的序列是互补性的。这种遗传控制范例经常称为反义或反基因抑制。烷化剂与核酸的缀合作用赋予额外的功效，例如本发明的那些烷化剂。

反义化合物是核酸，被设计用来结合mRNA，使mRNA失去能力，或者防止mRNA的产生，该mRNA负责生成特定的蛋白质。反义化合物包括反义RNA或DNA，单链或双链的，寡核苷酸或它们的类似物，它们能够与单个的mRNA特异性杂交，防止mRNA的转录和/或RNA加工和/或所编码的多肽的转译，由此减少各自所编码的多肽的数量(Ching等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder等人，Ann.Int.Med.113：604-618(1990)；Loreau等人，FEBS Letters 274：53-56(1990)；Holcenberg等人，WO 91/11535；WO 91/09865；WO 91/04753；WO 90/13641；WO 91/13080；WO 91/06629和EP 386563)。由于它们的敏锐的靶敏感性和选择性，反义寡核苷酸可用于递送治疗剂至所需分子靶，例如本发明的细胞毒素。

其他人已经报道，核酸能够经由三螺旋形成与双螺旋DNA结合，抑制转录和/或DNA合成。三螺旋化合物(也称为三链药物)是这样的寡核苷酸，它们结合双链DNA的序列，打算选择性抑制致病基因的转录，例如病毒基因，例如HIV和单纯性疱疹病毒，和致癌基因，也就是说它们终止细胞核上的蛋白质产生。这些药物直接结合细胞基因组中的双链DNA，形成三螺旋体，防止细胞制备靶蛋白。例如参见PCT公报第WO 92/10590、WO 92/09705、WO 91/06626号和美国专利第5,176,996号。因而，本发明的细胞毒素还与构成三螺旋的核酸序列缀合。

核酸(例如反义化合物和三螺旋药物)的位点特异性并不显著地受磷酸二酯键的修饰或寡核苷酸末端的化学修饰的显著影响。所以，这些核酸能够被化学修饰；增强总体的结合稳定性，增加关于化学降解的稳定性，增加寡核苷酸转运进入细胞的速率，赋予分子以化学反应性。构建各种可用于反义疗法的核酸的通用方法已经总结在van derKrol等人，Biotechniques 6：958-976(1988)和Stein等人，CancerRes.48：2659-2668(1988)。因此，在示范性实施方案中，本发明的细胞毒素通过磷酸二酯键的修饰作用与核酸缀合。

而且，携带本发明细胞毒素的适体、反义化合物和三螺旋药物还可以包括核苷酸的取代、加成、删去或移位，只要保留与有关靶序列的特异性杂交或缔合作用作为寡核苷酸的功能性质即可。例如，有些实施方案将采用硫代磷酸酯类似物，它们比它们的天然存在的磷酸二酯相应物更加耐受核酶的降解作用，因而预期具有更高的体内持续性和更大的效力(例如参见Campbell等人，J.Biochem.Biophys.Methods 20：259-267(1990))。寡核苷酸的氨基磷酸酯衍生物也已知结合互补性多核苷酸，具有另外容纳共价连接的配体的能力，将适用于本发明的方法。例如参见Froehler等人，Nucleic Acids Res.16(11)：4831(1988)。

在有些实施方案中，适体、反义化合物和三螺旋药物将包含O-甲基核糖核苷酸(EP公报第360609号)。还可以使用嵌合的寡核苷酸(Dagle等人，Nucleic Acids Res.18：4751(1990))。关于有些应用，反义寡核苷酸和三螺旋可以包含聚酰胺核酸(Nielsen等人，Science254：1497(1991)和PCT公报第WO 90/15065号)或其它阳离子衍生物(Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471(1988))。其它应用可以利用这样的寡核苷酸，其中一个或多个磷酸二酯键已经被等排基团取代，例如2-4个原子长的核苷酸间键，如PCT公报第WO92/05186和91/06556号所述，或者被甲缩醛基团(Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.113：7767-7768(1991))或酰胺基团(Nielsen等人，Science 254：1497-1500(1991))取代。

另外，本发明可以采用核苷酸类似物，例如其中糖或碱是被化学修饰的。嘌呤和嘧啶的“类似物”形式是本领域公知的那些，它们很多用作化疗剂。示范性而非详尽的列表包括4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。另外，常规的碱例如卤代的碱。此外，碱上的2’-呋喃糖位置可以被不带电的大体积基团取代。不带电的大体积基团的实例包括支链烷基、糖和支链糖。

末端修饰也提供有用的技术，可用于缀合细胞毒素与核酸，修改寡核苷酸药物的细胞类型特异性、药动学、核透过性和绝对细胞摄取速率。例如，为包括反应性基团而在5’和3’末端取代是已知的，这样允许共价连接细胞毒素。例如参见OLIGODEOXYNUCLEOTIDES：ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION，(1989)Cohen，Ed.，CRC Press；PROSPECTIS FOR ANTISENSE NUCLEIC ACID THERAPEUTICSFOR CANCER AND AIDS，(1991)，Wickstrom，Ed.，Wiley-Liss；GENEREGULATION：BIOLOGY OF ANTISENSE RNA AND DNA，(1992)，Ericksonand Izant，Eds.，Raven Press and ANTISENSE RNA AND DNA，(1992)，Murray，Ed.，Wiley-Liss。关于涉及反义化合物的通用方法，参见ANTISENSE RNA AND DNA，(1988)，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.。

可检测的标记

用于本发明化合物和方法的特定标记或可检测的基团一般不是本发明的关键所在，只要它不会显著干扰本发明化合物的活性或实用性即可。可检测的基团可以是具有可检测的物理或化学性质的任意材料。这类可检测的标记在免疫测定领域已经是成熟的，一般而言大多数任意可用于这类方法的标记都可以适用于本发明。因而，标记是任意可被光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的组合物。可用于本发明的标记包括磁性珠粒(例如DYNABEADS^TM)、荧光染剂(例如荧光素异硫氰酸酯、德克萨斯红、若丹明等)、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和其它ELISA常用的酶)、和比色标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。

按照本领域公知的方法，标记可以直接或间接与本发明化合物偶联。如上所示，可以使用各种标记，标记的选择取决于所需敏感性、与化合物缀合的容易程度、稳定性要求、可利用的器械操作和处理规定。

当本发明化合物与可检测的标记相缀合时，该标记优选自放射性同位素、荧光剂、荧光剂前体、生色团、酶及其组合。将各种基团缀合到抗体的方法是本领域公知的。例如，经常与抗体缀合的可检测的标记是酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。

非放射性标记经常借助间接手段连接。一般而言，使配体分子(例如生物素)与缀合物组分共价键合。配体然后结合另一种分子(例如链霉抗生物素)，后者本来是可检测的或者与信号系统共价键合，例如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。

本发明缀合物的组分还可以与信号发生化合物直接缀合，例如与酶或荧光团缀合。作为标记的有关酶将主要是水解酶，确切为磷酸酶、酯酶或糖苷酶，或氧化酶，确切为过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物包括虫荧光素、和2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。关于各种可以使用的标记系统或信号产生系统的评论，参见美国专利第4,391,904号。

检测标记的手段是本领域技术人员公知的。因而，例如，若标记是放射性标记，检测手段包括闪烁计数器或照相膜，如同放射自显影法。若标记是荧光标记，它可以这样检测，用适当波长的光激发荧光染料，再检测所得荧光。荧光在检测时可以用肉眼、借助照相膜、利用电子检测器，例如电荷耦合设备(CCDs)或光电倍增管等。类似地，酶标记可以这样检测，为酶提供适当的底物，再检测所得反应产物。最后，简单的比色标记可以简单地通过观察与标记有关的颜色进行检测。因而，在各种浸量尺测定法中，所缀合的金经常呈现粉红色，而各种所缀合的珠粒呈现珠粒的颜色。

荧光标记是目前优选的，因为它们的优点是在操作上需要很少的预防措施和适用于高通量造影技术(光学分析，包括分析图象在包含计算机的集成系统中的数字化)。优选的标记通常具有一个或多个下列特征：高敏感性、高稳定性、低背景、低环境敏感性和标记时的高特异性。很多荧光标记都是商业上可得到的：SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)、Molecular Probes(Eugene，OR)、R&D systems(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Chem Genes Corp.，AldrichChemical Company(Milwaukee，WI)、Glen Research，Inc.，GIBCOBRL Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)、FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)和Applied Biosystems(Foster City，CA)，以及技术人员已知的很多其它商业来源。此外，本领域技术人员将确认如何根据特定的应用选择适当的荧光团，并且如果不是商业上容易得到的话，也将能够重新合成必要的荧光团或者借助合成手段修饰商业上可得到的荧光化合物，以得到所需的荧光标记。

除了小分子荧光团以外，天然存在的荧光蛋白和这类蛋白的人工类似物也可用于本发明。这类蛋白例如包括刺胞动物门的绿荧光蛋白(Ward等人，Photochem.Photobiol.35：803-808(1982)；Levine等人，Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85(1982))、来自弧菌属fischeri种的黄荧光蛋白(Baldwin等人，Biochemistry 29：5509-15(1990))、来自腰鞭毛目共生甲藻属的多甲藻黄素-叶绿素(Morris等人，Plant Molecular Biology 24：673-77(1994))、来自海洋蓝细菌(例如蓝细菌聚球藻(Synechococcus))的藻胆蛋白(例如藻红蛋白和藻蓝蛋白)(Wilbanks等人，J.Biol.Chem.268：1226-35(1993))等。

一般而言，在细胞毒素和靶向剂(或其它试剂)和任选的间隔基团之间形成连接之前，将激活至少一个化学官能团。本领域技术人员将会认识到，各种化学官能团，包括羟基、氨基和羧基可以用各种标准方法和条件激活。例如，细胞毒素或靶向剂的羟基可以通过光气处理而激活，形成相应的氯甲酸酯，或用氯甲酸对硝基苯酯激活形成相应的碳酸酯

在示范性实施方案中，本发明使用的靶向剂包括羧基官能团。羧基可被激活，例如转化成相应的酰基卤或活性酯。该反应可在不同条件下进行，如在March，出处同上，第388-89页中所阐明的。在示范性实施方案中，通过含羧基的基团与草酰氯反应而制备酰基卤。激活的试剂与细胞毒素或细胞毒素-连接基团臂的组合反应，形成本发明的缀合物。本领域技术人员将会认识到，使用含羧基的靶向剂只不过是说明性的，含有很多其它官能团的试剂也可以与本发明的连接基团缀合。

反应性官能团

为了清楚起见，后续讨论集中于本发明细胞毒素与靶向剂的缀合作用。以本发明的一种实施方案为例，由此本领域技术人员容易推导出其它实施方案。讨论集中于单一的实施方案并不限制本发明。

本发明的示范性化合物携带反应性官能团，它一般位于取代或未取代的烷基或杂烷基链，允许它们容易连接另一种基团。反应性基团的常规位置是链的末端位置。

可用于实施本发明的反应性基团和反应种类一般是生物缀合物化学领域公知的那些。反应性官能团可被保护或不被保护，可通过有机合成领域的已知方法改变基团的保护性质。目前可取的可与反应性细胞毒素类似物进行的反应种类是在相对温和的条件下进行的那些。它们包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)和向碳-碳与碳-杂原子多重键的加成(例如Michael反应、Diels-Alder加成)。这些和其它有用的反应例如讨论在March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，AcademicPress，SanDiego，1996和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS，Advances in Chemistry Series，Vol.198，American ChemicalSociety，Washington，D.C.，1982。

示范性反应类型包括羧基及其各种衍生物的反应，羧基衍生物包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫代酸酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基与芳族酯。羟基可以转化为酯、醚、醛等。卤代烷基转化为新的基团，例如通过与胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、阴碳离子或醇化物离子的反应。亲双烯体(例如马来酰亚胺)基团参与Diels-Alder反应。醛或酮基可以转化为亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或者经由Grignard加成或烷基锂加成等机理。磺酰卤容易与胺反应，例如生成磺酰胺。胺或巯基例如是酰化的、烷化的或氧化的。利用环加成、酰化、Michael加成等，烯烃可以转化为一组新的化合物。环氧化物容易与胺和羟基化合物反应。

本领域技术人员将容易领会到，这些键很多都可以按各种方式和利用各种条件生成。关于酯的制备，例如参见March，出处同上，在1157页；关于硫代酸酯的制备，参见March，出处同上，在362-363，491，720-722，829，941和1172页；关于碳酸酯的制备，参见March，出处同上，在346-347页；关于氨基甲酸酯的制备，参见March，出处同上，在1156-57页；关于酰胺的制备，参见March，出处同上，在1152页；关于脲和硫脲的制备，参见March，出处同上，在1174页；关于缩醛和缩酮的制备，参见Greene等，出处同上，在178-210页和March，出处同上，在1146页；关于酰氧基烷基衍生物的制备，参见前药：TOPICAL AND OCULAR DRUG DELIVERY，K.B.Sloan，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；关于烯醇酯的制备，参见March，出处同上，在1160页；关于N-磺酰亚胺酸盐的制备，参见Bundgaard等人，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；关于酸酐的制备，参见March，出处同上，在355-56，636-37，990-91和1154页；关于N-酰基酰胺的制备，参见March，出处同上，在379页；关于N-曼尼希碱的制备，参见March，出处同上，在800-02和828页；关于羟甲基酮酯的制备，参见Petracek等人，Annals NY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；关于二硫化物的制备，参见March，出处同上，在1160页；关于膦酸酯和氨基膦酸酯的制备。

反应性官能团可以未被保护，和可以是这样选择的，以使它们不参与或不干扰反应。择一地，通过保护基团的存在，可以保护反应性官能团不参与反应。本领域技术人员将理解如何保护特定的官能团不干扰所选择的一套反应条件。关于有用的保护基团的实例，参见Greene等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley& Sons，New York，1991。

通常，利用标准的化学技术，使靶向剂与细胞毒素通过它们各自的化学官能团共价连接。任选地，连接基团或药物与该试剂通过一个或多个间隔基团偶联。间隔基团当联合使用时，可以是相同的或不同的。

一般而言，在细胞毒素与反应性官能团和任选的间隔基团之间生成键之前，至少一个化学官能团将被激活。本领域技术人员将领会到，各种化学官能团--包括羟基、氨基和羧基--都可以利用各种标准方法和条件激活。在示范性实施方案中，本发明包含羧基官能团作为反应性官能团。羧基可如上文所述被激活。

药物制剂和给药

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了药物制剂，它包含本发明化合物和药学可接受的载体。

包括药学可接受的载体如其加成盐或水合物的本文所述的化合物可以利用各种给药途径或方式递送至患者。适合的给药途径包括但不限于吸入、透皮、口服、直肠、经粘膜、肠内和胃肠外给药，胃肠外给药包括肌内、皮下和静脉内注射。优选地，包含抗体或抗体片段作为靶向部分的本发明的缀合物是胃肠外给药，更优选地静脉内。

当用于本文中时，术语“给药”打算涵盖所有直接和间接递送化合物至其预期作用部位的手段。

本文所述的化合物或其药学可接受的盐和/或水合物可以单独给药，与其它本发明化合物联合给药，和/或以与其它治疗剂联合的鸡尾酒形式给药。当然，能够与本发明化合物共同给药的治疗剂的选择将在部分程度上取决于所治疗的疾病。

例如，当对患有由依赖于自诱导剂的生物体导致的疾病状态的患者给药时，本发明化合物可以以鸡尾酒形式给药，其中含有用于治疗疼痛、感染和与疾病有关的其它症状和副作用的药物。这类药物例如包括止痛剂、抗生素等。

当对接受癌症治疗的患者给药时，化合物可以以鸡尾酒形式给药，其中含有抗癌剂和/或补充强化剂。化合物还可以以鸡尾酒形式给药，其中含有治疗放射疗法副作用的药物，例如止吐剂、放射保护剂等。

能够与本发明化合物共同给药的补充强化剂例如包括三环类抗抑郁药(例如米帕明、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普罗替林、阿莫沙平和马普替林)；非三环类抗抑郁药(例如舍曲林、曲唑酮和西酞普兰)；Ca⁺²拮抗剂(例如维拉帕米、硝苯地平、尼群地平和卡罗维林)；两性霉素；曲帕拉醇类似物(例如他莫昔芬)；抗心律失常药(例如奎尼丁)；抗高血压药(例如利血平)；硫醇耗竭剂(例如丁硫氨酸亚砜胺)；和亚叶酸钙。

本发明的活性化合物是以本身形式给药的，或者以药物组合物形式给药，其中活性化合物与一种或多种药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。用于本发明的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制备物。适当的制剂取决于所选择的给药途径。

对于经粘膜给药来说，在制剂中使用适用于所要渗透的屏障的渗透促进剂。这类渗透促进剂是本领域公知的。

对于口服给药来说，化合物可以很容易地这样配制，即将活性化合物与本领域公知的药学可接受的载体结合。这类载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等，用于所要治疗的患者口服。口服使用的药物制剂可以这样得到，与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，加工颗粒的混合物，如果需要的话加入适合的助剂，得到片剂或锭剂芯。适合的赋形剂确切地是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。

为锭剂芯提供适合的包衣。为此，可以使用浓糖溶液，其中可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、Carbopol凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛；漆溶液；和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或锭剂芯加入染料或色素，用于鉴别或区分不同的活性化合物剂量组合。

可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的适合推压的胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。适合推压的胶囊可以含有活性成分与下列成分的混合物：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉；和/或润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁；和任选的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以是溶解或悬浮在适合的液体中的，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有口服给药制剂都应当是适合于这类给药的剂量。

关于口颊给药，组合物可采取按常规方式配制的片剂或糖锭剂的形式。

对于吸入给药来说，按照本发明使用的化合物适宜以气雾剂的形式从加压装置或雾化器中释放出来，其中利用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况下，通过提供计量释放的阀门可以确定剂量单位。用在吸入器或吹入器内的明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物与适合的粉末基质的粉末混合物，例如乳糖或淀粉。

化合物可以配制成通过注射用于胃肠外给药，例如快速推注或连续输注。注射是本发明组合物的优选给药方法。注射用制剂可以是单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器内，其中加入防腐剂。组合物可以采取在油性或水性载体中的混悬剂、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制用试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。

胃肠外给药用药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，可适当制备活性化合物的油性注射混悬剂。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以便制备高浓缩的溶液。对于注射来说，本发明的药物可制成水溶液，优选地在生理学相容的缓冲液例如Hanks′s液、Ringer′s液或生理盐水缓冲液中。

择一地，活性成分可为粉末形式，在使用前用适合的赋形剂构成，例如无菌无热原的水。

化合物还可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯。

除了前述制剂以外，化合物还可以配制成药库制备物。这类长效制剂可以通过植入或经皮递送(例如皮下或肌内)、肌内注射或透皮贴剂给药。因而，例如，化合物可以与适合的聚合或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。

药物组合物还可以包含适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶、和聚合物，例如聚乙二醇。

优选的药物组合物是配制用于注射的组合物，例如静脉内注射剂，根据药物组合物100％总重，它包括约0.01％到约100％重量的药物配体缀合物。药物配体缀合物可为抗体-细胞毒素缀合物，其中，已经选择了抗体来以特定癌症为靶

文库

在本发明范围内还包括本发明的细胞毒素、细胞毒素与连接基团的细胞毒素-连接基团与药物-连接基团缀合物的文库。示范性文库包括至少10种化合物，更优选至少100种化合物，进而更优选至少1,000种化合物，进而更优选至少100,000种化合物。文库的形式容易就特定性质进行查询，例如细胞毒性、酶或其它裂解试剂对连接基团的裂解作用。示范性形式包括芯片格式、微阵列(microarray)等。

平行或组合合成的主要目的是生成不同分子的文库，它们共享一个共同的特性，在本说明书中称为脚手架。通过在脚手架分子的每个可变部分上取代不同的部分，文库中可开发的空间数量增加了。理论和现代医药化学主张所占据的空间的概念，它是测定给定化合物对给定生物靶的功效的关键因素。通过创建不同的分子文库，开发大比例的所靶向的空间，开发高效的前导化合物的几率戏剧性地增加了。

平行合成一般是在固相载体上进行的，例如聚合树脂。脚手架或其它适合的中间体被化学连接基团可裂解地连接在树脂上。进行反应，以修饰连接在树脂上的脚手架。试剂和/或反应条件的变化产生结构多样性，这是每个文库的品质所在。

“小”分子(分子量200-1000的非低聚物)的平行合成在1990年以前鲜有尝试。例如参见Camps等人，Annaks de Quimica，70：848(1990)。最近，Ellmann公开了十一种苯并二氮杂卓类似物以及一些前列腺素和β-旋转模拟物的固相支撑的平行(也称“组合”)合成。这些公开文献例如美国专利第5,288,514号。小分子平行合成的另一份相关公开文献可以参见美国专利第5,324,483号。该专利公开了在十六种不同的脚手架中各自合成了4至40种化合物。Chen等人也应用有机合成策略，在聚合物载体上利用多步过程合成非肽文库(Chen等人，J.Am.Chem.Soc.，116：2661-2662(1994))。

一旦制备了独特化合物的文库，就可以使用自诱导剂的文库作为起点，利用本文所述的方法制备免疫缀合物或抗体的文库。

药盒

另一方面，本发明提供了含有一种或多种本发明化合物或组合物和关于使用化合物或组合物的说明书的药盒。在示范性实施方案中，本发明提供了用于缀合本发明的连接基团臂与另一种分子的药盒。药盒包括连接基团，和将连接基团与特定官能团相连的说明书。药盒还可包括一种或多种细胞毒性药物、靶向剂、可检测的标记、药物盐或缓冲液。药盒还可包括容器，和任选地一个或多个小瓶、试管、烧瓶或注射器。其它药盒形式将为本领域技术人员所显而易见，也属于本发明的范围。

纯化

在另一个示范性实施方案中，本发明提供了分离本发明配体-细胞毒素的分子靶的方法，它与配体X⁴结合。该方法优选包括使包括靶的细胞制备物与固定化化合物接触，由此在受体与固定化化合物之间生成配合物。

本发明的细胞毒素可以利用任何本领域公认的手段固定在亲合载体上。择一地，细胞毒素可以利用一种或多种本发明的连接基团加以固定。

在另一个示范性实施方案中，本发明提供包括本发明连接基团的亲合纯化基质。

用于分离靶的本发明方法通常将采用一种或多种亲合色谱技术。亲合色谱法利用生物分子或生物聚合物对某些支撑的化学结构的具有高度选择性的识别部位，能够有效分离它们。文献中有很多文章、专刊和书籍是关于亲合色谱法的，包括亲合色谱法载体、交联成员、配体和它们的制备与用途等主题。这些参考文献的实例包括：Ostrove，Methods Enzymol.182：357-71(1990)；Ferment，Bioeng.70：199-209(1990)；Huang等人，J.Chromatogr.492：431-69(1989)；“Purification of enzymes by heparin-Sepharose affinitychromatography”，J.Chromatogr.，184：335-45(1980)；Farooqi，Enzyme Eng.，4：441-2(1978)；Nishikawa，Chem.Technol.，5(9)：564-71(1975)；Guilford等人，PRACT.HIGH PERFORM.LIQ.CHROMATOGR，Simpson(ed.)，193-206(1976)；Nishikawa，Proc.Int.WorkshopTechnol.Protein Sep.Improv.Blood Plasma Fractionation，Sandberg(ed.)，422-35(1977)；“Affinity chroma tography ofenzymes”，Affinity Chromatogr.，Proc.Int.Symp.25-38(1977)(Pub.1978)；AFFINITY CHROMATOGRAPHY：A PRACTICALAPPROACH，Dean等人，(ed.)，IRL Press Limited，Oxford，England(1985)。本领域技术人员在开发采用本发明材料的特定亲合色谱方法时具有大量教导。

在本方法中，可以使用各种化学结构的亲合色谱介质作为载体。例如，琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶可用作载体材料，因为它们的亲水性使它们相对不存在非特异性键合。其它有用的载体例如包括受控多孔玻璃(CPG)珠粒、纤维素粒子、聚丙烯酰胺凝胶珠粒和由葡聚糖和环氧氯丙烷制成的Sephadex^TM凝胶珠粒。

药物-配体缀合物的使用方法

除了上述组合物和构成物以外，本发明还提供了可以利用本发明化合物和缀合物进行实践的数种方法。使用本发明药物-配体缀合物的方法包括：杀灭或抑制肿瘤细胞或癌细胞生长或复制、治疗癌症、治疗癌前症状、杀灭或抑制表达自体免疫抗体的细胞生长或复制、治疗自体免疫疾病、治疗感染性疾病、阻止肿瘤细胞或癌细胞增殖、预防癌症、阻止表达自体免疫抗体的细胞增殖、预防自体免疫疾病和预防感染性疾病。这些使用方法包括给有需求的动物如哺乳动物或人施用有效量的药物-配体缀合物。本文所述的很多使用方法的优选配体包括抗体和抗体片段，它以特定肿瘤细胞、癌细胞或其它靶区为靶。

本发明的药物-配体复合物用于治疗动物的癌症、自体免疫疾病和感染性疾病。提供了通过以药学可接受的方式给患者提供组合物，和药学有效量的本发明组合物而治疗肿瘤的组合物和方法。

本发明尤其在动物中用于治疗癌症和用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖。癌症或癌前症状，包括但不限于，肿瘤、转移或以不受控制的细胞生长为特征的任何疾病或病症，可以通过施用本发明的药物-配体复合物来治疗或预防。复合物递送药物到肿瘤细胞或癌细胞。在一个实施方案中，配体特异性地结合或联合到癌细胞或肿瘤细胞相关的抗原。由于它接近配体，药物可以通过例如受体介导的细胞内吞作用而被吸收到肿瘤细胞或癌细胞内。抗原可以粘附到肿瘤细胞或癌细胞，或者可以是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。一旦进入细胞，连接基团就被肿瘤细胞或癌细胞相关的蛋白酶水解裂解，由此释放出药物。所释放出的药物然后游离扩散，并引起细胞毒性。在可替代的实施方案中，药物在肿瘤细胞或癌细胞外从药物-配体复合物中裂解，并且药物随后渗透入细胞。

配体可结合到例如肿瘤细胞或癌细胞，肿瘤细胞或癌细胞表面上的肿瘤细胞或癌细胞抗原，或者属于与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白的肿瘤细胞或癌细胞抗原。配体可以设计成对特定的肿瘤细胞或癌细胞类型有特异性。因此，可以被有效治疗的肿瘤或癌的类型可以通过选择配体而改变。

可被药物-配体缀合物作为靶的癌前症状的示范性实例包括但不限于：化生、增生、发育异常、结肠直肠息肉、actinic ketatosis、光化性唇炎、人乳头瘤病毒、白斑、lychen planus和博温病。

可被药物-配体缀合物作为靶的癌或肿瘤的示范性实例包括但不限于：肺癌、结肠癌、前列腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、CNS癌、renal cancer、kidney cancer、胰腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、子宫颈癌和白血病。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，用于缀合物中的特定的靶向配体可以被选择，使得它将药物靶向递送到用该药物治疗的肿瘤组织中(即选择对肿瘤特异性抗原特异的靶向剂)。该靶向配体的实例是现有技术公知的，其非限制性实例包括治疗乳腺癌的抗-Her2，治疗淋巴瘤的抗-CD20，治疗前列腺癌的抗-PSMA，和治疗淋巴瘤包括非何杰金氏淋巴瘤的抗-CD30。

在实施方案中，本发明提供了杀死细胞的方法。该方法包括给细胞施用足以杀死所述细胞的一定量的本发明化合物。在示范性实施方案中，将化合物对有该细胞的患者给药。在进一步的示范性实施方案中，给药用于延缓或阻止包括细胞(例如，细胞可以是肿瘤细胞)的肿瘤的生长。对于给药延缓生长来说，细胞的生长速度应当比给药前的生长速度慢至少10％。优选地，生长速度将延缓至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或完全阻止。

有效剂量

适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中含有治疗有效量的活性成分，也就是有效实现其预期目的的量。对特定应用有效的真实量将尤其取决于所治疗的疾病。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其根据本文详细公开的内容。

对于本文所述的任意化合物，治疗有效量可以最初是从细胞培养测定法确定的。靶血浆浓度将是这样的活性化合物浓度，它能够抑制细胞的生长或分化。在优选的实施方案中，细胞活性被抑制了至少25％。能够诱导至少约50％、75％或者甚至90％或者更高的细胞活性抑制作用的活性化合物的靶血浆浓度是目前优选的。可以对患者细胞活性的抑制百分率进行监测，以评估所达到的血浆药物浓度的适当性，并且可以向上或向下调整剂量，以达到所需的抑制百分率。

正如本领域所公知的，用于人类的治疗有效量也可以从动物模型确定。例如，可以制定人用剂量，以达到已经发现对动物有效的循环浓度。如上所述，监测细胞抑制作用，并向上或向下调整剂量，可以调整人用剂量。

治疗有效量还可以从关于已知表现相似药理活性的化合物的人类数据加以确定。所用剂量可以基于所给药的化合物与已知化合物相比的相对生物利用度和效力加以调整。

基于上述方法和本领域公知的其它方法调整剂量以实现对人的最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。

在局部给药的情况下，所给药的化合物的全身循环浓度将不是特别重要的。在这类情形下，将化合物给药的目的是在局部区域达到有效实现预期效果的浓度。

对于在涉及异常细胞增殖的疾病的预防和/或治疗中的用途来说，所给药的化合物的循环浓度优选为约0.001μM至20μM，而约0.01μM至5μM是优选的。

本文所述化合物对患者口服给药的剂量通常从约1mg/天至约10,000mg/天，更通常从约10mg/天至约1,000mg/天，最通常从约50mg/天至约500mg/天。根据患者的体重，典型的剂量从约0.01至约150mg/kg/天，更通常从约0.1至约15mg/kg/天，最通常从约1至约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。

对于其它给药方式来说，剂量和间隔的调整可以因人而异，以提供所给药的化合物对所治疗的特定临床适应症有效的血浆水平。例如，在一种实施方案中，根据本发明的化合物可以按相对高的浓度给药，每天多次。择一地，可能更可取的是按最小有效浓度给以本发明化合物，并且使用不太频繁的给药方案。这将提供与个体疾病严重性相称的治疗方案。

利用本文提供的教导，可以规划有效的治疗性处理方案，既不会导致实质性毒性，又完全有效地治疗由特定患者所表现的临床症状。这种规划应当牵涉考虑下列因素谨慎地选择活性化合物：化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的存在与严重性、优选的给药方式和所选择的药物的毒性曲线。

下列实施例进一步阐述本发明的化合物、组合物和方法。这些实施例仅供举例说明，不限制所要求保护的发明。

实施例

材料和方法

在下列实施例中，除非有相反的规定，温度是以摄氏度(℃)给出的；操作是在室温或环境温度(通常为约18-25℃)下进行的；溶剂的蒸发是利用旋转蒸发器、在减压(通常4.5-30mmHg)下进行的，浴温至多60℃；反应的过程通常继之以TLC，反应时间仅供举例说明；熔点是未经校正的；产物表现令人满意的¹H-NMR和/或微量分析数据；收率仅供举例说明；还使用下列常规缩写：mp(熔点)，L(升)，mL(毫升)，mmol(毫摩尔)，g(克)，mg(毫克)，min(分钟)，LC-MS(液相色谱-气相光谱)和h(小时)。

¹H-NMR光谱是在Varian Mercury 300MHz光谱计上测量的，与指定的结构一致。化学漂移是以偏离四甲基硅烷的百万分之份数(ppm)报告的。电子喷雾质谱是在Perkin Elmer Sciex API 365质谱计上记录的。元素分析是由Robertson Microlit Laboratories，Madison，NJ进行的。快速色谱法用硅胶是E.Me rck级(230-400目)。反相分析型HPLC是在HP 1100或Varian Pro Star 210仪器上进行的，带有Phenomenex Luna 5μm C-18(2)150mm×4.6mm柱或VarianMicrosorb-MV 0.1μm C-18 150mm×4.6mm柱。流速为1mL/min，它是0％至50％缓冲液B历经15分钟的梯度或10％至100％缓冲液B历经10分钟的梯度，在254nm下UV检测。缓冲液A是20mM甲酸铵+20％乙腈或含0.1％三氟乙酸的乙腈，缓冲液B是20mM甲酸铵+80％乙腈或0.1％三氟乙酸水溶液。反相制备型HPLC是在Varian ProStar 215仪器上进行的，带有Waters Delta Pak 15μm C-18300mm×7.8mm柱。

实施例1：肽连接基团缀合物的合成

1.1a合成方法

路线图1

路线图2

路线图3

路线图4

路线图5

路线图6

1.1b化合物1：N-[2′-(N′-叔丁氧羰基-氨基)-乙基]-缬氨酸叔丁 酯的合成。

向2-(N-叔丁氧羰基-氨基)-乙基溴化物(1g，4.5mmole)和缬氨酸叔丁酯(0.936g，4.5mmole)的DMF(10mL)溶液中加入碳酸钾(1.85g，13.5mmole)。将如此获得的混合物在100℃下搅拌过夜。浓缩反应混合物，并在硅胶上用乙酸乙酯/己烷(3/7)作为洗提液将剩余物用快速色谱纯化，得到油状的标题化合物(0.16g，12％)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.94(ft，6H)，1.44(s，9H)，1.473和1.475(2s，9H)，1.88(m，1H)，2.51(m，1H)，2.78(m，2H)，3.11(m，1H)，3.22(m，1H)，3.39和4.13(2bt，1H)，5.00(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)205(M+H⁺-112)，261(M+H⁺-Bu)，317(M+H⁺)。

1.1c化合物2：N-(2-氨乙基)-缬氨酸的合成。

将化合物1(137mg，0.43mmole)在室温下溶于TFA/二氯甲烷溶液(2mL，1/1)。将如此获得的混合物在室温下搅拌30min。浓缩反应混合物至干燥，得到油状的标题化合物(0.18g，95％)。¹H NMR(CD₃OD)δ1.07和1.16(2d，6H)，2.35(m，1H)，3.2(m，1H)，3.38(m，4H)ppm；LC-MS(ESI)217(M+H⁺)。

1.1d化合物3的合成。

向马来酰胺-dPEG₄-NHS酯(61mg，0.16mmole)的二氯甲烷(2mL)溶液中逐滴加入化合物2(80.7mg，0.16mmole)和二异丙基乙胺(55.5μL，0.32mmole)的二氯甲烷(1mL)溶液。将如此获得的混合物搅拌过夜。在旋转蒸发仪上除去溶剂，并在硅胶上用二氯甲烷，接着用5％甲醇的二氯甲烷溶液，最后用100％甲醇作为洗提液将剩余物用快速色谱纯化，得到无色油状的标题化合物(87mg，97％)。¹H NMR(CDCl₃)δ1.08(dd，6H)， 2.25(m，1H)，2.49(t，2H)，2.52(t，2H)，3.10-3.79(m，25H)，6.82(s，2H)ppm；LC-MS(ESI)559(M+H⁺)。

1.1e化合物4：Fmoc-Cit-PABOH的合成。

向Fmoc-Cit-OH(1.0g，2.52mmole)和4-氨基苄醇(341mg，2.77mmole)的二氯甲烷(10mL)和甲醇(5mL)溶液中一次性加入2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉[EEDQ](1.24g，5.04mmole)。在暗处搅拌混合物16小时。在旋转蒸发仪上除去溶剂，并用乙醚(100mL)研磨白色固体。将所得的混悬液超声处理5min，然后放置30min。过滤收集白色固体，用乙醚洗涤，并真空干燥(1.23g，97％)。¹H-NMR(DMSO)δ1.32到1.52(m，2H)，1.52到1.74(dm，2H)，2.86到3.06(dm，2H)，4.1(M，1H)，4.42(d，2H)，5.07(t，1H)，5.40(bs，2H)，5.97(t，1H)，7.19到7.95(m，12H)，8.10(d，1H)，9.97(s，1H)ppm；LC-MS(ESI)503.1(M+H⁺)。

1.1f化合物5：Fmoc-Cit-PABC-PNP的合成。

向化合物4(309mg，0.62mmole)和氯甲酸对硝基苯酯(372mg，1.85mmole)的四氢呋喃(30mL)和1-甲基-2-吡咯烷(1mL)溶液中一次性加入吡啶(100μL，1.23mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。在旋转蒸发仪上除去溶剂，并在硅胶上用二氯甲烷，接着用3％甲醇的二氯甲烷溶液，最后用10％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液将剩余物在硅胶上用快速色谱纯化，得到标题化合物白色固体(97.9mg，70％)。LC-MS(ESI)668(M+H⁺)。

1.1g化合物6：Fmoc-Lys (Boc)-PABOH的合成。

按照上述化合物4的制备方法制备化合物6，产率98％。¹H-NMR(DMSO)δ1.40(s，9H)，1.38(m，2H)，1.50到1.74(dm，2H)，3.04(t，2H)，3.30(q，3H)，4.19到4.31(m，2H)，4.41(d，2H)，4.55(s，2H)，7.28到7.68(m，12H)，8.00(d，1H)ppm；LC-MS(ESI)574(M+H⁺)。

1.1h化合物7：Fmoc-Lys(Boc)-PABC-PNP的合成。

按照上述化合物5的制备方法制备化合物7，产率70％。¹H NMR(CDCl₃)δ1.44(s，9H)，-1.49-1.60(m，6H)，1.73(m，1H)，2.00(m，1H)，3.11(m，1H)，3.20(bs，1H)，4.23(m，2H)，4.46(bs，2H)，4.67(bs，1H)，5.56(bs，1H)，7.28(m，2H)，7.36-7.41(m，6H)，7.59(m，4H)，7.76(d，2H)，8.26(dd，2H)，8.45(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)639(M+H⁺-Boc)，684(M+H⁺-Bu)，739(M+H⁺)，778(M+K⁺)。

1.1i化合物8：Boc-Val-Cit-OH的合成。

向瓜氨酸(2.54g，14.50mmole)和碳酸氢钠(1.28g)的水(40mL)溶液中加入溶于二甲氧基乙烷(DME)中的Boc-Val-OSu(4.34g，13.81mmole)。为了帮助混合物溶解，加入四氢呋喃(10mL)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。加入柠檬酸水溶液(15％，75mL)，并用10％2-丙醇/乙酸乙酯(2×100mL)萃取混合物。用盐水(2×150mL)洗涤有机层，并在旋转蒸发仪上除去溶剂。真空干燥所得的白色固体5小时，然后用乙醚(100mL)处理。简单的超声处理和研磨以后，过滤收集白色固体产物(1.39g，27％)。¹H NMR(CD₃OD)δ0.91(dd，3H)，0.98(dd，3H)，1.44(s，9H)，1.70(m，2H)，1.87(m，2H)，2.02(m，2H)，3.11(t，2H)，3.89(t，1H)，4.39(q，1H)，8.22(d，1H)ppm；LC-MS(ESI)375(M+H⁺)。

1.1j化合物9：Boc-Val-Cit-PABOH的合成。

按照上述化合物4的制备方法制备化合物9，产率71％。¹H NMR(CD₃OD)δ0.93和0.97(2d，6H)，1.44(s，9H)，1.58(m，2H)，1.75(m，1H)，1.90(m，1H)，2.05(m，1H)，3.10(m，1H)，3.19(m，1H)，3.91(d，1H)，4.52(m，1H)，5.25(s，2H)，7.40(d，2H)，7.45(dd，2H)，7.64(d，4H)，8.29(dd，2H)ppm；LC-MS(ESI)480(M+H⁺)。

1.1k化合物10：Boc-Val-Cit-PABC-PNP的合成。

将Boc-Val-Cit-PABOH(178mg，0.370mmole)的THF(8mL)和CH₂Cl₂(4mL)溶液在室温下与PNP氯甲酸酯(160mg，0.80mmole)和吡啶(65μL，0.80mmole)搅拌3h。将乙酸乙酯(100mL)和10％柠檬酸水溶液(50mL)加入反应混合物，并用盐水洗涤有机层，干燥和浓缩，并用5％甲醇作为洗提液将剩余物在硅胶上用快速色谱纯化，得到标题化合物的白色固体(165mg，70％)。¹H NMR(CD₃OD)δ0.93(dd，3H)，0.97(dd，3H)，1.44(s，9H)，1.58(m，2H)，1.75(m，1H)，1.89(m，1H)，2.05(m，1H)，3.10(m，1H)，3.20(m，1H)，3.90(d，1H)，4.51(m，1H)，4.55(s，2H)，7.29(d，2H)，7.55(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)545(M+H⁺-Boc)，645(M+H⁺)，667(M+Na⁺)，683(M+K⁺)。

1.1l化合物12a的合成。

向化合物11(20mg，0.078mmole)的乙酸乙酯(5mL)混悬液中吹入HCl气体20min(这时，混悬液变成澄明溶液)。再搅拌反应混合物5min，然后浓缩混合物至干燥，得到标题化合物的黄色固体(26mg，100％)，它不经进一步纯化就用于下个步骤。LC-MS(ESI)260(M+H⁺-Cl)，295(M+H⁺)。

1.1m化合物12b的合成。

向化合物11(20mg，0.078mmole)的乙酸乙酯(5mL)混悬液中吹入HBr气体20min(这时，混悬液变成澄明溶液)。再搅拌反应混合物5min，然后浓缩混合物至干燥，得到标题化合物的黄色固体(33mg，100％)，它不经进一步纯化就用于下个步骤。LC-MS(ESI)260(M+H⁺-Br)，339(M+H⁺)，341(M+H⁺+2)。

1.1n化合物13b的合成。

向化合物12a(26mg，0.078mmole)的DMF(2mL)溶液中加入5-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯并呋喃-2-羧酸(44mg，0.155mmole)和EDC(30mg，0.155mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌2h。浓缩混合物，并将剩余物溶于H₂O/CH₃CN/TFA(4/1.5/0.5，6mL)，并将它放入制冷器3h。过滤收集黄色固体(35mg，85％)。¹H NMR(CD₃OD)δ2.67(s，3H)，3.01(s，6H)，3.34(m，2H)，3.63(ft，1H)，3.89(s，3H)，3.91(m，1H)，4.41(m，3H)，4.54(m，1H)，4.65(m，1H)，7.20(dd，1H)，7.36(d，1H)，7.54(s，1H)，7.59(d，1H)，7.73(bs，1H)，11.75(s，1H)ppm；LC-MS(ESI)490(M+H⁺-Cl)，526(M+H⁺)。

1.1o化合物13c的合成。

向化合物12b(19mg，0.0387)的DMF(2mL)溶液中加入5-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯并呋喃-2-羧酸HBr盐(25mg，0.0775mmole)和PS-碳二亚胺(82mg，mmole/g：0.94，0.0775mmole)。室温搅拌反应混合物24h。过滤以后，浓缩滤液，并将剩余物溶于H₂O/CH₃CN/TFA(2/0.75/0.25，3mL)，并将它放入制冷器3h。过滤收集黄色固体并干燥，得到标题化合物(18mg，82％)。LC-MS(ESI)490(M+H⁺-Br)，570(M+H⁺)，572(M+H⁺+2)。

1.1p化合物14a的合成。

在-78℃下，向化合物13a(48mg，0.10mmole)的二氯甲烷(4mL)混悬液中加入氯甲酸对硝基苯酯(80mg，0.40mmole)和三乙胺(56μL，0.40mmole)。将混合物缓慢升温至室温，并继续再搅拌30min。向反应混合物中加入化合物N-Boc-N，N′-二甲基乙二胺(166mg，0.80mmole)，并搅拌过夜。浓缩混合物，并用1.25％甲醇的二氯甲烷作为洗提液将剩余物在硅胶上用快速色谱纯化，得到标题化合物的白色固体(71mg，100％)。¹H NMRδ1.45-1.47(m，9H)，2.69(s，3H)，2.97(s，3H)，3.14-3.34(m，4H)，3.81-3.92(m，8H)，4.38-4.47(m，3H)，4.70(d，1H)，7.05(dd，1H)，7.11(d，1H)，7.45(s，1H)，7.48(d，1H)，7.99(s，1H)，10.43(s，1H)ppm。LC-MS(ESI)710(M-H⁺)。

1.1q化合物14b的合成。

在0℃下，向化合物13b(48mg，0.075mmole)的二氯甲烷(2mL)混悬液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(80mg，0.4mmole)和三乙胺(40mg，0.4mmole，56μL)。将混合物升温至室温，并继续再搅拌6h。蒸发溶剂，并用乙醚洗涤剩余物，得到中间体。将中间体溶于二氯甲烷(2mL)，并向反应溶液中加入N-Boc-N，N′-二甲基乙二胺(44mg，0.2mmole)和三乙胺(20mg，0.2mmole，28μL)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。浓缩混合物，并用甲酸铵(20mM，pH7.0)和乙腈作为洗提液在C-18柱上用HPLC纯化剩余物得到标题化合物的白色固体(31mg，54％)。LC-MS(ESI)755(M+H⁺)。

1.1r化合物14c的合成。

在0℃下，向化合物13c(24mg，0.04mmole)的CH₂Cl₂(2mL)溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯(64mg，0.32mmole)和三乙胺(22μL，0.16mmole)。将如此获得的反应混合物在室温下搅拌18h。向反应混合物中加入N-Boc-N，N′-二甲基乙二胺(94mg，0.50mmole)，并继续再搅拌50min。浓缩反应混合物，并用5％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液在硅胶上用快速色谱纯化剩余物得到标题化合物的白色固体(28mg，83％)。LC-MS(ESI)490，570，684(M+H⁺-Boc)，784(M+H⁺)，805(M+Na⁺)，722(M+K⁺)。

1.1s化合物15a的合成。

将化合物14a(70mg，0.10mmole)溶于三氟乙酸(5mL)，并将混合物在室温下搅拌30min，并浓缩至干燥，产物(72mg，100％)不经进一步纯化就用于下个步骤。HPLC显示它＞95％纯度。¹H NMRδ2.64(s，3H)，2.93(s，3H)，3.19(s，3H)，3.30(t，1H)，3.79(s，3H)，3.85(s，3H)，3.81-3.85(m，1H)，4.27-4.49(m，3H)，4.59(d，1H)，4.68(d，1H)，6.97(dd，1H)，7.03(d，1H)，7.38(s，1H)，7.41(d，1H)，8.00(brs，1H)，10.61(br s，1H)ppm。LC-MS(ESI)612(M+H⁺)，634(M+Na⁺)。

1.1t化合物15b的合成。

按照上述化合物15a的制备方法制备化合物15b，产率100％。¹H NMR(CD₃OD)δ2.69(s，3H)，2.76(s，3H)，2.83(bs，1H)，3.01(s，6H)，3.08(bs，1H)，3.24(bs，2H)，3.42(m，2H)，3.63(bs，3H)，3.74(bs，1H)，3.91(s，3H)，3.92(m，1H)，4.40(bs，2H)，4.57(bs，2H)，4.71(bs，1H)，7.22(bd，1H)，7.36(s，1H)，7.56(s，1H)，7.59(d，1H)，8.04(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)490，526，640(M+H⁺)，678(M+K⁺)。

1.1u化合物15c的合成。

按照上述化合物15a的制备方法制备化合物15c，产率100％。LC-MS(ESI)490，570，684(M+H⁺)，722(M+K⁺)。

1.1v化合物16a的合成。

向化合物5(12.5mg，0.019mmole)和化合物15a(10mg，0.014)的二甲基甲酰胺(200μL)溶液中加入三乙胺(6μL，0.044mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。向混合物中加入乙醚(5mL)，白色固体从溶液中沉淀出来。过滤固体，并用二氯甲烷，接着用1％甲醇的二氯甲烷溶液、2％甲醇的二氯甲烷溶液、3％甲醇的二氯甲烷溶液和最后4％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化该固体，得到标题化合物的白色固体(8.7mg，56％)。LC-MS(ESI)470，1112(M+H⁺)，1134(M+Na⁺)，1150(M+K⁺)。

1.1w化合物16b的合成。

向化合物15b(5mg，0.0056mmole)的DMF(0.35mL)溶液中加入化合物5(3.8mg，0.0056mmole)和DIEA(2μL，0.011mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌5h。浓缩混合物，并用10％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的固体(3mg，45％)。LC-MS(ESI)490，526，1169(M+H⁺)，1208(M+K⁺)。

1.1x化合物16c的合成。

按照上述化合物16b的制备方法制备化合物16c，产率50％。LC-MS(ESI)490，570，1212(M+H⁺)，1250(M+K⁺)。

1.1y化合物17a的合成。

向化合物16a(8.7mg，0.008mmole)的二甲基甲酰胺(500μL)溶液中一次性加入哌啶(100μL)。将如此获得的混合物在室温下搅拌20分钟。在旋转蒸发仪上除去溶剂，并置于高真空中1.5h。将剩余物溶于最少量的二氯甲烷(100μL)中，并向溶液中加入己烷(3mL)，白色固体从溶液中析出，滤除该固体，并干燥(6.7mg，96.7％)。MS(ES)470，890.1(M+H⁺)，912(M+Na⁺)，928(M+K⁺)。

1.1z化合物17b的合成。

按照上述化合物17a的制备方法制备化合物17b，产率95％。LC-MS(ESI)947(M+H⁺)。

1.1aa化合物17c的合成。

按照上述化合物17a的制备方法制备化合物17c，产率95％。LC-MS(ESI)1015(M+H⁺)。

1.1bb化合物18a的合成。

向化合物17a(4.2mg，0.005mmole)和化合物3(2.64mg，0.005mmole)的二氯甲烷(1mL)溶液中一次性加入PyBOP(3.7mg，0.007mmole)，接着加入二异丙基乙胺(1μL)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。在旋转蒸发仪上除去溶剂。用制备HPLC纯化剩余物，得到浅褐色固体(2.6mg，38.7％)。MS(ES)470，1431(M+H⁺)，1453(M+Na⁺)，1469(M+K⁺)。

1.1cc化合物18b的合成。

向化合物17b(2.2mg，0.0025mmole)和化合物3在5％甲醇的二氯甲烷(400μL)溶液中加入HBTU(9mg，0.0046mmole)和DIEA(1.4μL，0.0046mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用10mM甲酸铵和乙腈作为洗提液，在半制备HPLC上纯化剩余物，得到油状的标题化合物(1.1mg，30％)。LC-MS(ESI)490，526，1488(M+H⁺)，1527(M+K⁺)。

1.1dd化合物18c的合成。

向化合物17c(6.5mg，0.0065mmole)和化合物3(5.5mg，0.0097mmole)在5％甲醇的二氯甲烷(0.5mL)溶液中加入HBTU(3.7mg，0.0097mmole)和DIEA(3.4μL，0.0194mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用30％甲醇的二氯甲烷作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到油状的标题化合物(4mg，30％)。LC-MS(ESI)1532(M+H⁺)，1554(M+Na⁺)，1570(M+K⁺)。

1.2不含自我牺牲型间隔基团的含双联霉素的肽连接基团的合成 方法

1.2a反应A：

向烷化核7mg在2mL乙酸乙酯中的混悬液中缓慢通过HBr的干燥气流，直至形成澄明溶液，这需要大约15分钟。浓缩反应混合物，并高真空干燥过夜。

1.2b反应B：

向在步骤A中制备的溴甲基开环化合物(bromo methyl secocompound)的DMF混悬液中加入EDC(10mg，0.054mMoles)和5-硝基苯并呋喃羧酸(12mg，0.054mMoles)，并搅拌6小时。然后向该反应混合物中加入乙酸乙酯和盐水。用乙酸乙酯萃取3次以后，浓缩合并的有机层，并用MeOH/DCM(MeOH的量渐增)经硅胶过滤。用质谱确认产物，M+1＝530。

1.2c反应C：

用甲基哌嗪碳酰氯(11mg，0.054mMoles)的2mL DCM、200μL烯丙醇和吡啶(21μL)溶液保护4′-OH 2小时。用硅胶柱色谱纯化产物，并用质谱鉴定，MS+1＝654。

1.2d反应D：

在40PSI下，通过Pd/C在DCM/MeOH(2∶1)中氢解45分钟，进行硝基的还原。过滤产物，浓缩滤液，并在高真空下干燥。用质谱分析确认产物MS+1＝，并且不经进一步纯化就进行下个步骤。

1.2e反应E：

向以上化合物(18mg，0.024mMoles)的MeOH/DCM(2∶1，3mL)溶液中加入Fmoc-Val-Citruline(29mg，0.06mMoles)，将所得的混合物搅拌10分钟，直至所有酸都溶解。加入15mg、0.06moles的EEDQ，在暗处搅拌反应混合物过夜。然后浓缩反应混合物，用二乙醚冲洗，并用反相制备HPLC纯化剩余物，得到产物，该产物用质谱来鉴定，M+1＝1103。

1.2f反应F：

使用5％哌啶的1mL DMF溶液进行Fmoc保护基的去保护10分钟。浓缩反应混合物，接着用二乙醚冲洗固体剩余物。用质谱确认产物，MS+1＝880，和M+K＝919。

1.2g反应G：

向步骤F中制备的游离胺的DMF(1.5mL)溶液中加入Mal-(PEG)₄-NHS-酯(20mg)，并搅拌反应混合物1hr。浓缩，接着用反相制备HPLC纯化，得到2.8mg(从烷化核开始，总产率为11％)，它用质谱来确认，MS+1＝2178，M+Na＝1300，和M+K＝1316。

1.3与Tubulysine A缀合的肽连接基团的合成

配体可以与PEG和肽连接基团通过所示的合成而键合。

中间体以及含肽连接基团的配体-药物缀合物(其中药物是Tubulysine A)的合成在上文中显示。该基本方法可用于其它药物。

1.4a肽-连接基团缀合物111的合成

1.4b肽-连接基团缀合物112的合成

1.4c肽-连接基团缀合物113的合成

实施例2：6-元肼连接基团缀合物的合成

2.1与双联霉素衍生的细胞毒素缀合的6-元双二甲基肼连接基团 的合成

2.1a化合物109的合成路线图

2.1b化合物110的合成

在冰浴温度下，向Cbz-二甲基丙氨酸(1g，3.98mMoles)在30mLDCM的溶液中加入HOAT(催化量，0.25当量)、DIPEA(2.8mL，16mmoles)，接着加入2-氯-1，3-二甲基咪唑烷六氟磷酸盐(CIP)(1.2g，4.4mmoles)。然后向该反应混合物中加入Boc-NN(Me)(643moles，4.4mmoles)。室温搅拌该反应混合物过夜。向该反应混合物中加入10％柠檬酸溶液(100mL)，并用DCM萃取。用水，然后用饱和碳酸氢钠溶液，接着再用水洗涤有机相。然后浓缩有机相，并用极性不断增大的乙酸乙酯的己烷溶液，通过硅胶柱纯化，得到860mg，57％产率的107，它用质谱鉴定，M+1＝380，和M+NH₄ ⁺＝397。

使用MeOH中的Pd/C，通过催化氢化，除去Cbz保护基，得到化合物108，它用MS来确认。

向PNPC-1918(10mg，0.1mmoles)在2mL DCM的溶液中逐滴加入化合物108(60mg，0.25mmoles)在8mL DCM中的溶液，并搅拌反应混合物2天，直至所有的原料都已消失。通过短硅胶颠过滤反应混合物，然后浓缩，并用反相制备HPLC纯化，得到4.2mg化合物109。它用质谱来鉴定，M+1＝740。用纯TFA进行化合物109的Boc去保护20分钟，得到化合物110。产物用质谱来鉴定，M+1＝640。

2.1c化合物111的合成

将Ma1-PEG4-苯乙酮和化合物110(3mg，.005mmoles)混和浓缩，并在高真空下干燥过夜。向该混合物中加入前一天制备好的1mL 5％乙酸溶液，并通过分子筛干燥。不到1小时就形成了腙。在这之后，浓缩反应混合物，并用反相制备HPLC(甲酸铵Ph＝7)纯化，得到2.8mg化合物111(产率60％)。用质谱鉴定该产物，MS+1＝1129，M+NH₄＝1146，和M+K＝1168

2.2与tubulysin细胞毒素缀合的双-二甲基6-元肼连接基团的 合成

与实施例2.1中所示的类似的方法可以用于合成与药物如tubulysin A复合的双二甲基6-元肼连接基团。

2.3与双联霉素类似物缀合的肼连接基团的合成

向溴甲基开环化合物(0.074mMoles)在3mL DMF中的溶液中加入5-乙酰基吲哚-2-羧酸酯(30mg，0.15mMoles)和EDC(28mg，0.15mMoles)，并将所得的混合物搅拌过夜。浓缩反应混合物，并用5％MeOH的DCM溶液通过硅胶色谱纯化，得到29mg(产率74％)产物，它用质谱确认，M+1＝523。

向步骤C中合成的化合物在5mL DCM和300μL烯丙醇的溶液中加入甲基哌嗪碳酰氯(22mg，0.11mmoles)和吡啶44μL。室温搅拌反应混合物5小时。浓缩，接着用5％MeOH/DCM作为洗提液通过硅胶色谱纯化，得到48mg想要的产物(产率73％)。用质谱确认产物，M+1＝650。

将以上化合物(8.2mg，0.012mmoles)和Ma1-PEG4-肼的5％乙酸的无水DCM溶液在室温下搅拌20分钟，接着蒸发溶剂，并用乙腈和甲酸铵缓冲水相通过反相制备HPLC得到2.5mg想要的最终产物，它用质谱来确认，M+1＝1063。

2.4a二甲基6-元肼连接基团的成环速度

将与二甲基6-元肼连接基团缀合的双联霉素类似物在pH7.4下在缓冲液中培养24小时，经过一段时间，评估从肼连接基团环化生成的环化产物，由此释放出游离双联霉素类似物。

在pH＝7.4下经过24小时，检测环化产物的最小量，表明这种形式的6-元肼连接基团表现出了相对慢的成环速度。

2.4b双-二甲基6-元肼连接基团的成环速度

将与双二甲基6-元肼连接基团缀合的双联霉素类似物在pH7.4下在缓冲液中培养，经过一段时间，评估从肼连接基团环化生成的环化产物，由此释放出游离双联霉素类似物。

与6-元双-二甲基连接基团一起，环化反应相当迅速，在数分钟内就进行完了。因此，双-二甲基6-元肼连接基团的环化速度比不包含双-二甲基部分的6元连接基团要快得多。

实施例3：5-元肼连接基团缀合物的合成

3.1化合物4的合成方法

Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸(1)

在装有搅拌子、温度计和回流冷凝器的25mL烧瓶中，向2，2-二甲基-丙二酸(2.0gm，0.0151moles)、亚硫酰氯(1.35ml，0.0182moles)的THF(15ml)溶液中加入一滴DMF，并将反应混合物加热至回流2小时，然后冷却至室温。在0℃下，将该反应混合物逐滴加入Cbz-DMDA(4gm，0.0182moles)和三乙胺(4ml，0.0287moles)的THF(5ml)溶液中，并在该温度下搅拌30min。真空除去溶剂，将剩余物溶于1N HCl(50ml)，并用DCM(2×25ml)萃取。用1N NaOH(2×25ml)萃取合并的有机层，用浓HCl酸化(pH＜1)合并的水层，用EtOAc(2×25ml)萃取，过MgSO₄干燥，过滤并真空浓缩成灰白色粘稠固体，3.44gm，产率68％。用质谱确认化合物1：m/z 337.0[M+1]⁺，HPLC保留时间：3.77min(质谱)。

Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N′-甲基肼(2)

在装有搅拌子、温度计和回流冷凝器的50mL 3N RBF烧瓶中，向化合物1(3.0gm，0.0089moles)、亚硫酰氯(0.78ml，0.0107moles)的THF(25ml)溶液中加入一滴DMF，并使反应混合物回流2小时，然后冷却至室温。然后在0℃下将该反应混合物逐滴加入Boc-N-甲基肼(1.33gm，0.091moles)和三乙胺(3ml，0.0215moles)在THF(25ml)的溶液中，并搅拌30min。真空除去溶剂，并将剩余物溶于EtOAc(50ml)，过MgSO₄干燥，，过滤并真空浓缩成褐色的油。将该油溶于EtOAc，并用柱色谱(100％EtOAc)纯化，得到3.45gm、83％产率的澄明的油。用质谱确认化合物2：m/z 465.2[M+1]，HPLC保留时间：3.97min(质谱)

DMDA-2，2-二甲基丙二酸-BocN′-甲基肼(3)

向化合物2(0.5gm，0.0011moles)的MeOH(30ml)溶液中加入10％Pd/C(15mg)，并将反应置于Parr氢化器中30分钟。滤除催化剂，真空浓缩滤液至澄明的油，生成化合物3(0.38gm)。用NMR(¹H，CDCl₃)确认产物：δ1.45(s，15H)2.45(s，3H)2.85(s，6H)，3.16(s，3H)4.64(m，1H)10.6(bs，1H)；NMR(¹³C，CDCl₃)δ24.1，28.57，35.15，35.58，36.66，47.01，48.51，81.11，155.17，173.56，176.24。

化合物4的合成

在装有搅拌子的15ml RBF中混和化合物3(50mg，0.1513mmoles)、PNPC-1918(20mg，0.0315mmoles)和DCM(5ml)。搅拌该溶液30分钟，然后加入三乙胺(25μL，0.1794mmoles)，并搅拌鲜黄色溶液1hr。真空浓缩溶液成黄色的油，并用柱色谱纯化(100％DCM到1∶1 EtOAc/DCM)，生成化合物4的灰白色固体，22mg，(84％)。用质谱确认产物：m/z 825.7[M+1]⁺，HPLC保留时间：7.65min(质谱)。

3.2含5-元肼连接基团的抗体-药物缀合物的合成

该路线图证明了抗体与连接基团-药物复合物缀合。这些方法是药学领域公知的。其它反应部位的实例包括马来酰亚胺、与配体上的硫醇反应的卤代乙酰胺、与配体上的二硫化物反应的硫醇、与配体上的醛和酮反应的酰肼、和与配体上的氨基反应的羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯，异硫氰酸酯和酐。

实施例4：含二硫化物部分的连接基团缀合物的合成

路线图1

路线图2

路线图3

4.1a化合物1的合成。

向含PEG4(3.88g，20mmole)的烧瓶中加入triton B(40％甲醇溶液，1.08mL，0.25mmole)，15分钟后接着加入丙烯酸叔丁酯(3.62mL，24mmole)。室温搅拌混合物过夜。真空浓缩混合物，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的无色的油(2.35g，36％)。¹H NMRδ1.45(s，9H)，2.5(t，2H)，3.65(m，18H)。

4.1b化合物2的合成。

向化合物1(1.17g，3.6mmole)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入三乙胺(532μL，4mmole)和甲烷磺酰氯(309μL，4mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(1.3g，89％)。¹H NMRδ1.43(s，9H)，2.48(t，2H)，3.07(s，3H)，3.62-3.70(m，14H)，3.76(m，2H)，4.37(m，2H)。

4.1c化合物3的合成。

向化合物2(1.3g，3.25mmole)的乙醇(10mL)溶液中加入叠氮化钠(423mg，6.5mmole)。将如此获得的混合物回流过夜。蒸发溶剂，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(1.01g，90％)。¹H NMRδ1.45(s，9H)，2.50(t，2H)，3.40(t，2H)，3.62-3.73(m，16H)。

4.1d化合物4的合成。

向化合物3(470mg，1.35mmol)的含H₂O(25μL)的乙醚(5mL)溶液中加入三苯基膦(391mg，1.48mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(325mg，75％)。¹H NMRδ1.45(s，9H)，2.24(bs，2H)，2.51(t，2H)，2.91(t，2H)，3.56(m，2H)，3.63-3.66(m，12H)，3.72(m，2H)。

4.1e化合物5的合成。

向3-巯基丙酸(1.22g，11.5mmole)的甲醇(10mL)溶液中加入aldrithio1-2(3.78g，17.25mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂，用30％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到油状的标题化合物(2.44g，98％)。¹H NMRδ2.8(t，2H)，3.05(t，2H)，7.14(m，1H)，7.67(m，2H)，8.48(m，1H)。

化合物5b：¹H NMRδ1.43(d，3H)，2.61(m，1H)，2.76(m，1H)，3.40(m，1H)，7.17(m，1H)，7.66(m，2H)，8.45(m，1H)。

4.1f化合物6的合成。

将3-甲基苯并噻唑鎓碘化物(1g，3.6mmole)溶于2N氢氧化钠水溶液(10mL)，在100℃下搅拌混合物6小时，然后用6N盐酸水溶液酸化至pH4，并用二乙醚萃取。过Na₂SO₄干燥有机层，真空旋转蒸发，并将剩余物溶于甲醇(10mL)，和加入化合物5a(776mg，3.6mmole)。室温搅拌混合物1小时。浓缩混合物至干燥，用1％甲醇的二氯甲烷作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(482mg，55％)。¹H NMRδ2.85(m，2H)，2.95(m，5H)，6.64(m，2H)，7.3(m，1H)，7.4(dd，1H)；MS(ES)244(M+H⁺)，487(2M+H⁺)。

化合物6b：¹H NMRδ1.35(d，3H)，2.48(m，1H)，2.92(s，3H)，3.02(m，1H)，3.34(m，1H)，6.62(m，2H)，7.28(m，1H)，7.44(m，1H)；MS(ES)258(M+H⁺)。

化合物6c：¹H NMRδ1.45(s，6H)，2.70(s，2H)，2.93(s，3H)，6.62(m，2H)，7.24(m，1H)，7.51(m，1H)；MS(ES)272(M+H⁺)，294(M+Na⁺)，310(M+K⁺)。

4.1g化合物7的合成。

向化合物6a(28mg，0.115mmole)的无水甲醇(1mL)溶液中加入乙酰氯(13μL，0.173mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用10％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到油状的标题化合物(24mg，83％)。¹H NMRδ2.08(m，2H)，2.93(s，3H)，2.95(m，2H)，3.70(s，3H)，6.63(m，2H)，7.28(m，2H)，7.40(m，2H)；MS(ES)258(M+H⁺)，280(M+Na⁺)，296(M+K⁺)。

化合物7b：¹H NMRδ1.32(d，3H)，2.45(m，1H)，2.92(s，3H)，2.93(m，1H)，3.35(m，1H)，3.67(s，3H)，6.62(m，2H)，7.26(m，1H)，7.44(m，1H)；MS(ES)272(M+H⁺)。

化合物7c：¹H NMRδ1.42(s，6H)，2.66(s，2H)，2.93(s，3H)，3.62(s，3H)，6.62(m，2H)，7.24(m，1H)，7.51(m，1H)；MS(ES)286(M+H⁺)，308(M+Na⁺)，324(M+K⁺)。

4.1h化合物8的合成。

在0℃下，向化合物7a(24mg，0.093mmole)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入三光气(28mg，0.093mmole)和三乙胺(37μL，0.28mmole)。搅拌混合物1小时。浓缩混合物至干燥，剩余物不经进一步纯化就用于下个步骤。

将粗原料溶于二氯甲烷(1mL)，并加入化合物8a(35mg，0.074mmole)和DMAP(23mg，0.190mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(53mg，76％)。¹H NMRδ2.70(s，3H)，2.74(m，2H)，3.06(m，2H)，3.34(m，1H)，3.35和3.36(2s，3H)，3.63和3.64(2s，3H)，3.86(m，1H)，3.88(s，3H)，3.93和3.94(2s，3H)，4.48(m，1H)，4.55(m，1H)，4.79(m，1H)，7.05(m，1H)，7.11(m，1H)，7.26-7.52(m，5H)，7.85(d，1H)，8.1(bs，1H)，8.98和9.08(2s，1H)；MS(ES)753(M+H⁺)。

化合物8b：¹H NMRδ1.38(m，3H)，2.52(m，1H)，2.69(m，3H)，2.79(m，1H)，3.33(m，1H)，3.37(2s，3H)，3.64(m，3H)，3.88(s，3H)，3.84-3.90(m，1H)，3.93(2s，3H)，4.48(m，1H)，4.57(m，1H)，4.78(m，1H)，7.06(m，1H)，7.12(m，1H)，7.26-7.43(m，3H)，7.50(m，2H)，7.86(m，1H)，8.1(bs，1H)，8.99，9.08，9.13和9.22(4s，1H)；MS(ES)767(M+H⁺)。

化合物8c：¹H NMRδ1.44(m，6H)，2.63(d，2H)，2.70(s，3H)，3.35(m，1H)，3.38和3.39(2s，3H)，3.63和3.64(2s，3H)，3.87(m，1H)，3.88(s，3H)，3.93和3.94(2s，3H)，4.48(m，1H)，4.55(m，1H)，4.79(m，1H)，7.05(m，1H)，7.12(m，1H)，7.31-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.89(d，1H)，8.1(bs，1H)，9.12和9.23(2s，1H)；MS(ES)781(M+H⁺)。

4.1i化合物9和10的合成。

向化合物8a(0.1mg)的PBS缓冲溶液(pH7.2)/甲醇(300μL，2/1)溶液中加入20mM DTT溶液(100μL，15当量)，用HPLC监测反应进程。反应进行得太快，以至于无法检测，数秒钟以后，反应完成，已经定量生成了化合物10。未检测到反应中间体化合物9。

4.1j化合物11的合成。

向化合物6a(66mg，0.2mmole)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入DCC(47mg，0.22mmole)、HOBt(31mg，0.22mmole)和化合物4(50mg，0.2mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(70mg，62％)。¹H NMRδ1.44(s，9H)，2.51(t，1H)，2.63(t，2H)，2.93(d，3H)，3.01(t，2H)，3.45(m，2H)，3.55(m，2H)，3.64(m，12H)，3.71(t，2H)，5.01(bs，1H)，6.38(bt，1H)，6.62(m，2H)，7.27(m，1H)，7.43(dd，1H)。MS(ES)491(M-56+H⁺)，513(M-56+Na⁺)，547(M+H⁺)，569(M+Na⁺)。

化合物11b：¹H NMRδ1.34(d，3H)，1.45(s，9H)，2.30(m，1H)，2.5(t，2H)，2.69(m，1H)，2.93(d，3H)，3.37-3.55(m，5H)，3.63(m，12H)，3.71(t，2H)，4.99(bs，1H)，6.13(bt，1H)，6.62(m，2H)，7.25(m，1H)，7.48(dd，1H)。MS(ES)505(M-56+H⁺)，527(M-56+Na⁺)，543(M-56+K⁺)，561(M+H⁺)，583(M+Na⁺)。

化合物11c：1.43(s，3H)，1.45(s，9H)，2.46(s，2H)，2.5(t，2H)，2.92和2.94(2s，3H)，3.33(m，2H)，3.47(t，2H)，3.63(m，12H)，3.70(t，2H)，6.06(bt，1H)，6.63(m，2H)，7.25(m，1H)，7.54(d，1H)；MS(ES)519(M-56+H⁺)，541(M-56+Na⁺)，575(M+H⁺)，597(M+Na⁺)。

4.1k化合物12的合成：

在0℃下，向化合物11a(20mg，0.037mmole)的二氯甲烷(1mL)混悬液中加入三乙胺(15μL，0.11mmole)和2N光气的甲苯(55μL，0.11mmole)溶液。室温搅拌混合物1小时。浓缩混合物，并将剩余物溶于二氯甲烷(1mL)，加入化合物10(14mg，0.030mmole)和DMAP(9mg，0.076mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到标题化合物的黄色的油(23mg，74％)。¹H NMRδ1.44(s，9H)，2.49(t，2H)，2.67(m，2H)，2.65和2.67(2s，3H)，3.07(m，2H)，3.33(s，3H)，3.40(m，3H)，3.51(m，2H)，3.60(m，12H)，3.69(m，2H)，3.87(s，3H)，3.92(s，3H)，3.93(m，1H)，4.52(m，2H)，4.78(m，1H)，6.65，6.74和6.97(3bt，1H)，7.06(d，1H)，7.12(s，1H)，7.29-7.42(m，3H)，7.50(m，2H)，7.87(d，1H)，8.10和8.15(2bs，1H)，9.79和9.58(2s，1H)；MS(ES)986(M+H⁺-56)，1042(M+H⁺)。

化合物12b：¹H NMRδ1.32(m，3H)，1.44(s，9H)，2.39(m，1H)，2.48(m，2H)，2.60(m，1H)，2.67和2.69(2s，3H)，3.32和3.35(2s，3H)，3.38-3.72(m，20H)，3.88(s，3H)，3.93(s，3H)，3.94(m，1H)，4.52(m，2H)，4.77(m，1H)，6.53，6.67和6.72(3bt，1H)，7.06(d，1H)，7.12(s，1H)，7.29-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.88(d，1H)，8.12和8.25(2bs，1H)，9.13，9.36，10.08和10.21(4s，1H)；MS(ES)1000(M+H⁺-56)，1056(M+H⁺)，1078(M+Na⁺)，1084(M+K⁺)。

化合物12c：¹H NMR δ1.30-1.42(m，3H)，1.44(s，9H)，2.45-2.52(m，4H)，2.69和2.72(2s，3H)，3.34和3.35(2s，3H)，3.39-3.72(m，19H)，3.88(s，3H)，3.925和3.93(2s，3H)，3.94(m，1H)，4.53(m，2H)，4.80(m，1H)，6.63(m，1H)，7.06(dd，1H)，7.13(d，1H)，7.25-7.39(m，3H)，7.50(m，2H)，7.89(d，1H)，8.10和8.27(2bs，1H)，9.99和10.191(2s，1H)；MS(ES)1014(M+H⁺-56)，1070(M+H⁺)，1108(M+K⁺)。

4.1l化合物13的合成。

将化合物12a(23mg，0.022mmole)溶液三氟乙酸和二氯甲烷的溶液中(1mL，1/1)，室温搅拌混合物30min，浓缩得到产物(21mg，100％)。¹H NMR δ 2.60(t，2H)，2.67和2.68(2s，3H)，2.75(m，2H)，3.07(m，2H)，3.34(s，3H)，3.38-3.64(m，21H)，3.76(t，2H)，3.88(s，3H)，3.92(s，3H)，3.93(m，1H)，4.53(m，2H)，4.78(m，1H)，7.06(d，1H)，7.13(s，1H)，7.31-7.43(m，3H)，7.49(m；2H)，7.87(d，1H)，8.10和8.15(2bs，1H)，9.44和9.65(2s，1H)；MS(ES)986(M+H⁺)，1008(M+Na⁺)，1024(M+K⁺)。

化合物13b：¹H NMRδ1.34(m，3H)，2.56(m，1H)，2.62(m，2H)，2.68(m，3H)，2.8(m，1H)，3.35-3.36(2s，3H)，3.40-3.70(m，18H)，3.77(t，2H)，3.88(s，3H)，3.93和3.95(2s，3H)，3.94(m，1H)，4.54(m，2H)，4.79(m，1H)，7.07(d，2H)，7.13(s，1H)，7.30-7.42(m，3H)，7.49(m，2H)，7.88(d，1H)，8.11和8.25(2bs，1H)，9.22，9.37，9.80和9.92(4s，1H)；MS(ES)1000(M+H⁺)，1022(M+Na⁺)，1038(M+K⁺)。

化合物13c：¹H NMRδ1.30-1.45(m，6H)，2.54(m，2H)，2.61(m，2H)，2.68和2.69(2s，3H)，3.35-3.36(2s，3H)，3.40-3.70(m，17H)，3.77(t，2H)，3.88(s，3H)，3.92和3.93(2s，3H)，3.94(m，1H)，4.50(m，2H)，4.80(m，1H)，7.08(m，2H)，7.12(d，1H)，7.29-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.89(m，1H)，8.10和8.25(2bs，1H)，9.88和10.04(2s，1H)；MS(ES)1014(M+H⁺)，1036(M+Na⁺)，1054(M+K⁺)。

4.1m化合物14a的合成。

向化合物13a(5.4mg，0.0054mmole)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入PS-碳二亚胺(11.5mg，0.94mmole/g，0.0108mmole)和PS-DMAP(7.2mg，1.49mmole/g，0.0108mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜，过滤并浓缩，得到产物。MS(ES)1082(M+H⁺)。

4.2与Tubulysin A缀合的二硫化物连接基团的合成

使用上文显示的机制，药物Tubulysin A可以缀合到本发明的二硫化物连接基团。本发明的其它药物和其它连接基团可以用类似的反应路线图合成。

4.3二硫化物连接基团的环化速度

向化合物8a(0.1mg)的PBS缓冲液(pH7.2)/甲醇(300μL，2/1)溶液中加入20mM DTT溶液(100μL，15当量)，用HPLC监测反应进程。反应进行快速环化，在数秒钟内反应完成，定量生成了产物10。未检测到反应中间体9。

实施例5

化合物32的合成。

向化合物30(120mg，0.28mmole)的乙酸乙酯(10mL)溶液中吹入HCl气体5min。在RT下再搅拌反应混合物30min，然后浓缩混合物。将乙醚加到反应混合物中，在过滤漏斗上收集白色沉淀物。真空干燥该固体过夜，得到100mg想要的产物，它用LC-MS(ESI)确认，324(M+H⁺)，且不经进一步纯化就用于下个步骤。向该化合物(100mg，0.24mmole)的DMF(5mL)溶液中加入化合物31(65mg，0.26mmole)、HATU(100mg，0.26mmole)和TEA(91μL，0.52 mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌3hrs。蒸发溶剂，用0.1％TFA在水和乙腈中的溶液作为洗提液，在半制备HPLC上纯化剩余物，得到油状的化合物32(110mg，80％)。用LC-MS(ESI)确认所得的产物，555(M+H⁺)。

化合物33的合成。

将DCM(10mL)和甲醇(5mL)中的化合物32(110mg，0.2mmole)和吸附于炭的钯(20mg)在氢气压下室温搅拌12hrs。过滤钯，浓缩反应混合物，用0.1％TFA在水和乙腈中的溶液作为洗提液，在半制备HPLC上纯化剩余物，得到想要的油状化合物(80mg，78％)。LC-MS(ESI)465(M+H⁺)。在0℃下，向剩余物(80mg，0.17mmole)的二氯甲烷(10mL)和THF(5mL)溶液中加入PNPCl(氯甲酸4-硝基苯酯)(137mg，0.68mmole)和三乙胺(144μL，1.02mmol)。在0℃下搅拌如此获得的混合物30min，然后在室温下搅拌12hrs。真空浓缩反应混合物，用乙醚(100mL)沉淀出剩余物，得到化合物33的黄色的油(90mg，82％)，它真空干燥，并用LC-MS(ESI)确认，631(M+H⁺)。

化合物46的合成：

在室温下向化合物33(60mg，0.1mmole)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入Boc-N，N-二甲基乙二胺(84mg，0.38mmole)和三乙胺(26μL，0.1mmol)。将如此获得的混合物在室温下搅拌12hrs。真空浓缩反应混合物，用乙醚(100mL)沉淀剩余物，得到Boc保护的化合物34，它不经进一步纯化就用于下个步骤。将Boc保护的化合物34溶于10mLTFA，将反应混合物在室温下搅拌60min。真空浓缩反应混合物，用乙醚(100mL)沉淀剩余物，得到化合物46的黄色固体，它被真空干燥，并用LC-MS(ESI)确认，631(M+H⁺)。

化合物34的合成。

向2-溴乙胺溴化物(5g，24.4mmole)的DMF(50mL)溶液中加入二异丙基乙胺(8.5mL，48.8mmole)和氯甲酸苄酯(3.48mL，24.4mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物，并在硅胶上用乙酸乙酯/己烷(3/7)作为洗提液将剩余物用快速色谱纯化，得到想要的油状的化合物34(4g，64％)。¹H NMR(CDCl₃)δ3.54(bs，2H)，3.61(bs，2H)，5.12(s，2H)，7.36(m，5H)。

化合物35的合成。

向化合物34(3.34g，12.99mmole)和缬氨酸叔丁酯(3.27g，15.59mmole)的DMF(50mL)溶液中加入碳酸钾(5.39g，38.97mmole)和碘化钾(2.59g，15.59mmole)。在100℃下将如此获得的混合物搅拌过夜。浓缩反应混合物，用乙酸乙酯/己烷(2/8)作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到想要的油状的化合物35(3.12g，69％)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.92(m，6H)，1.46(s，9H)，1.86(m，1H)，2.53(m，1H)，2.80(m，2H)，3.18(m，1H)，3.31(m，1H)，5.10(s，2H)，5.25(bs，1H)，7.36(m，5H)；LC-MS(ESI)296(M+H-叔丁基⁺)，352(M+H⁺)。

化合物36的合成。

将甲醇(30mL)中的化合物35(3.4g，9.72mmole)和吸附于炭的钯(200mg)室温放置在氢气压下。将如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。过滤钯，浓缩反应混合物至干燥，得到想要的油状的化合物36(2.1g，98％)。

化合物37的合成。

在0℃下，向化合物36(2.1g，9.72mmole)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入FmocOSu(9-芴甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)(3.28g，9.72mmole)。在0℃下将如此获得的混合物搅拌2小时。在旋转蒸发仪上除去溶剂，并用二氯甲烷，接着用0.5％甲醇的二氯甲烷溶液，最后用1％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到想要的化合物37的无色的油(2.55g，60％)。¹H-NMR(CDCl₃)δ0.95(ft，6H)，1.48(s，9H)，1.90(m，1H)，2.55(m，1H)，2.82(m，2H)，3.18(m，1H)，3.32(m，1H)，4.24(m，1H)，4.37(m，2H)，5.40(bs，1H)，7.30(m，2H)，7.39(m，2H)，7.60(d，2H)，7.75(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)383(M+H-叔丁基⁺)，440(M+H⁺)，462(M+Na⁺)，478(M+K⁺)。

化合物38的合成。

向化合物37(177mg，0.4mmole)的四氢呋喃-水(3/1，8mL)溶液中吹入HCl气体5min。在37℃下搅拌反应混合物过夜，然后浓缩混合物至干燥，得到想要的化合物38的固体(168mg，98％)，它用LC-MS确认(ESI)383(M+H⁺)，405(M+Na⁺)，且不经进一步纯化就用于下个步骤。LC-MS(ESI)383(M+H⁺)，405(M+Na⁺)。

化合物39的合成。

向化合物5(525mg，0.79mmole)的DMF(5mL)溶液中加入N-Boc-N，N′-二甲基乙二胺(177mg，0.94mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌30min。除去溶剂，用二氯甲烷，接着用2％甲醇的二氯甲烷溶液，最后用5％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗提液，在硅胶上用快速色谱纯化剩余物，得到想要的化合物39的无色的油(364mg，65％)。¹H NMR(CD₃OD)δ1.39(s，9H)，1.56(m，2H)，1.70(m，1H)，1.82(m，1H)，2.70和2.82(2s，3H)，2.90(s，3H)，3.09(m，1H)，3.17(m，1H)，3.30到3.37(m，4H)，4.16(t，1H)，4.27(m，1H)，4.33(d，2H)，5.02(bs，2H)，7.24到7.36(m，6H)，7.51到7.65(m，4H)，7.74(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)618(M+H-Boc⁺)，662(M+H-叔丁基⁺)，718(M+H⁺)，740(M+Na⁺)，1435(2M+H⁺)。

化合物40的合成。

按照以上化合物17a的制备方法制备化合物40，产率98％。LC-MS(ESI)396(M+H-Boc⁺)，496(M+H⁺)，517(M+Na⁺)，533(M+K⁺)，992(2M+H⁺)。

化合物41的合成。

向化合物40(138mg，0.28mmole)的DMF(4mL)溶液中加入化合物38(110mg，0.28mmole)、HOBt(36mg，0.28mmole)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(50mg，0.28mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用0.1％TFA的水和乙腈溶液作为洗提液，在半制备HPLC上纯化剩余物，得到想要的化合物41的油(178mg，70％)。¹H NMR(CD₃OD)δ1.04和1.11(2d，6H)，1.40(s，9H)，1.58(m，2H)，1.77(m，1H)，1.88(m，1H)，2.24(m，1H)，2.72和2.84(2s，3H)，2.92(s，3H)，3.10到3.18(m，4H)，3.35到3.46(m，6H)，3.82(d，1H)，4.22(t，1H)，4.41(m，2H)，4.59(m，1H)，5.04(bs，2H)，7.28到7.40(m，6H)，7.55(m，2H)，7.63(m，2H)，7.78(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)760(M+H-Boc⁺)，804(M+H-叔丁基⁺)，860(M+H⁺)，882(M+Na⁺)，899(M+K⁺)。

化合物42的合成。

按照以上化合物17a的制备方法制备化合物42，产率98％。LC-MS(ESI)538(M+H-Boc⁺)，582(M+H-叔丁基⁺)，638(M+H⁺)，660(M+Na⁺)。

化合物43的合成。

在0℃下，向化合物42(23mg，0.036mmole)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入GMBS(N-(马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)(14mg，0.05mmole)和二异丙基乙胺(8.4μL，0.05mmole)。将混合物缓慢升温至室温，并继续搅拌30min。蒸发溶剂，用0.1％TFA水和乙腈溶液作为洗提液，在半制备HPLC上纯化剩余物，得到想要的油状的化合物43(26mg，79％)。¹H NMR(CD₃OD)δ1.06和1.12(2d，6H)，1.41(s，9H)，1.59(m，2H)，1.78(m，1H)，1.86到1.93(m，3H)，2.24(m，3H)，2.74和2.84(2s，3H)，2.93(bs，3H)，3.13到3.22(m，4H)，3.40到3.60(m，8H)，3.82(d，1H)，4.60(m，1H)，5.05(bs，2H)，6.80(s，2H)，7.32(m，2H)，7.57(d，2H)，8.78(d，1H)ppm；LC-MS(ESI)703(M+H-Boc⁺)，747(M+H-叔丁基⁺)，803(M+H⁺)，825(M+Na⁺)，841(M+K⁺)。

化合物44的合成。

按照以上化合物15a的制备方法制备化合物44，产率98％。LC-MS(ESI)703(M+H⁺)，725(M+Na⁺)。

化合物45的合成。

在室温下向化合物44(15mg，0.016mmole)和化合物33(10mg，0.016mmole)的DMF(0.8mL)溶液中加入二异丙基乙胺(5.5μL，0.032mmole)。将如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，用0.1％TFA的水和乙腈溶液作为洗提液，在半制备HPLC上纯化剩余物，得到想要的油状化合物45(10mg，45％)。¹H NMR(CD₃OD)δ1.02到1.13(m，6H)，1.55(m，2H)，1.74(m，1H)，1.84到1.92(m，3H)，2.20到2.27(m，3H)，2.95到3.14(m，16H)，3.47到3.84(m，12H)，3.98(m，1H)，4.2到4.34(m，3H)，4.57(m，1H)，4.69(m，2H)，5.07到5.17(m，2H)，6.78(s，2H)，7.16到7.23(m，3H)，7.30(m，1H)，7.38到7.47(m，3H)，7.52到7.58(m，3H)，7.81到7.92(m，2H)，8.25(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)1194(M+H⁺)，1215(M+Na⁺)，1233(M+K⁺)。

实施例6

化合物(2)的合成。

将MeOH/CH₂Cl₂(1/2，10ml)中的1(100mg，0.24mmol)和10％Pd-C(35mg)真空脱气40s。将所得的混合物放在氢气氛中，并在25℃下搅拌7h。通过Celite(CH₂Cl₂洗过)过滤反应混合物。真空除去溶剂。用EtOAc/己烷(2/8)在硅胶色谱上洗提，得到2(77mg，98％)。¹NMR DMSO-d₆δ10.36(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.2Hz)，7.72(d，1H，J＝8.2Hz)，7.61(brs，1H)，7.45(t，1H，J＝8.4Hz)，7.261(t，1H，J＝8.4Hz)，4.06(m，4H)，3.73(m，1H)，1.52(s，9H)。

化合物(4)的合成。

在25℃下，在Ar中搅拌2(35mg，0.1mmol)的4 M HC1-EtOAc(5ml)溶液30min。真空除去溶剂。向剩余物中加入5-乙酰茚满酮-2-羧酸(24.4mg，0.12mmol)。加入EDC(22.9mg，0.12mmol)的DMF(3ml)溶液，在25℃下搅拌反应混合物5h。除去溶剂。用10％MeOH的CH₂Cl₂溶液洗提在硅胶上层析粗产物，得到4(40.7mg，93％)。¹HNMRDMSO-d₆δ12.13(s，1H)，10.47(s，1H)，8.45(s，1H)，8.10(d，1H，J＝8.4 Hz)，7.96(brs，1H)，7.85(d，2H，J＝8.4 Hz)，7.54(d，1H，J＝8.4 Hz)，7.51(t，1H，J＝8.2Hz)，7.36(t，1H，J＝7.6)，7.35(s，1H)，4.81(t，1H，11.2 Hz)，4.54(dd，1H，8.8 Hz)，4.23(m，1H)，4.01(dd，1H，J＝10.2Hz)，3.86(dd，1H，J＝10.7Hz)，2.61(s，3H)。

化合物(5)的合成。

将4-甲基-1-哌嗪碳酰氯盐酸盐(19.9mg，0.1mmol)加入4(20mg，0.05mmol)和无水吡啶(25μml，0.3mmol)的3％烯丙醇的无水二氯甲烷(4ml)溶液中，并搅拌混合物16h。在硅胶上纯化粗产物，得到5(23.6mg，91％)。¹NMR DMSO-d₆)δ12.03(s，1H)，8.41(s，1H)，8.21(s，1H)，8.01(d，1H，J＝8.4 Hz)，7.88(d，1H，J＝8.4 Hz)，7.82(dd，1H，J＝8.4Hz)，7.58(t，1H，J＝8.1 Hz)，7.51(d，1H，J＝8.4Hz)，7.46(t，1H，J＝7.6Hz)，7.37(s，1H)，4.86(t，1H，J＝10.8Hz)，4.57(dd，1H，J＝10.8Hz)，4.38(m，1H)，4.06(dd，1H，J＝10.8Hz)，3.86(dd，1H，J＝11 Hz)，3.41(br，4H)，3.29(br，4H)，2.82(s，3H)，2.57(s，3H)。

化合物(7)的合成。

在25℃下，将5(13mg，24μmol)和连接基团6(16.9mg，31μmol)的5％乙酸的无水二氯甲烷(1ml)溶液搅拌30min。真空彻底除去溶剂，用HPLC纯化(SymmetryPrep C₁₈，7μm，19×150mm柱)，得到7(18.5mg，81％)。MS：C₄₈H₅₇ClN₈O₁₁的计算值(M+H)m/z 958.38，实测值958.10。

实施例7：增殖测定法

本发明的细胞毒性化合物的生物学活性可以用成熟的³H-胸苷增殖测定法来测定。这是一种适宜于量化细胞增殖的方法，因为它通过测量外源性放射性标记的³H-胸苷的结合，评价DNA合成。这种测定法是非常可再现的，能够适应大量的化合物。

在进行该测定时，在含有10％热灭活的胎牛血清(FCs)的RPMI培养基中培养前髓细胞的白血病细胞HL-60。在研究当天，收集细胞，洗涤，按0.5×10⁶细胞/mL的浓度再悬浮在含有10％FCS的RPMI中。将100μL细胞混悬剂加入到96孔平板中。进行多柔比星(作为阳性对照)或供试化合物的系列稀释(3倍增量)，每孔加入100μL化合物。最后，每孔加入10μL的100 μCi/mL³H-胸苷，将平板培育24小时。利用96孔收获器(Packard Instruments)收获平板，在Packard TopCount计数器上计数。根据四参数逻辑曲线测定³H-胸苷的结合，作为药物体积摩尔浓度的函数，使用Prism软件测定IC₅₀值。

本发明化合物在上述测定法中的IC₅₀值一般从约1pM至约100nM，优选从约10pM至约10nM。

实施例8：药物-连接基团分子与抗体的缀合

该实施例描述了将本发明的药物-连接基团分子(任选包括其它基团，例如间隔基团和反应性官能团等)与作为靶向剂的抗体X⁴缀合的反应条件和方法。这些条件和方法仅仅旨在解释，而非限制。将药物-连接基团分子与抗体缀合的其它方法是现有技术已知的。

本文描述的缀合方法是基于通过抗体的赖氨酸与2-iminothiolane反应，接着药物-连接基团分子与活泼马来酰亚胺基团反应，而将游离硫醇基团引入抗体。最初，所缀合的抗体被缓冲液更换到含50mM NaCl、2mM DTPA，pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液pH8.0中，并浓缩至5-10mg/ml。通过向抗体中加入2-iminothiolane而实现硫醇化。在预实验中确定所加入的2-iminothiolane的量，并根据抗体的不同而有所改变。在预实验中，将渐增量的2-iminothiolane滴加入抗体，随后在室温下用抗体培养1小时，使用Sephadex G-25柱将抗体除去盐分，放入pH6.0的50mM HEPES缓冲液中，通过与二硫代二吡啶(DTDP)反应，快速测定所引入的硫醇基团的数量。硫醇基团与DTDP的反应导致在324nm处监测到的硫代吡啶的释放。使用蛋白质浓度为0.5-1.0mg/ml的样品。将280nm处的吸光度用于精确测定样品中的蛋白质浓度，然后在室温下用0.1ml DTDP(5mM储备液的乙醇溶液)培养每份样品(0.9ml)10分钟。单独的缓冲液加上DTDP的空白样品也同时培养。10分钟以后，测定324nm处的吸光度，用19800M^-1的硫代吡啶的吸光系数对存在的硫醇的数量进行定量。

通常，想要每个抗体三个硫醇基团的硫醇化水平。例如，用一种特定的抗体，通过加入15倍过量摩尔的，接着在室温下培养1小时，可以实现该目的。因此，以想要的摩尔比用2-iminothiolane培养要缀合的抗体，然后脱盐分到缀合缓冲液(50mM HEPES缓冲液，pH6.0，含5mM甘氨酸、3％甘油和2mM DTPA)中。保持硫醇化原料在冰上，同时如上所述对引入的硫醇数量进行定量。

鉴定引入了一定量的硫醇以后，以每份硫醇过量3倍摩尔的水平加入含活性马来酰亚胺基团的药物-连接基团分子。在还包含最终浓度为5％的乙二醇二甲醚(或适当的可替代溶剂)的缀合缓冲液中进行缀合反应。通常，溶解药物-连接基团储备液在90％乙二醇二甲醚、10％二甲亚砜中。对于添加到抗体中来说，储备液可以直接加入到硫醇化抗体中，该硫醇化抗体含有足够的乙二醇二甲醚，所加入的乙二醇二甲醚的量使得其最终浓度为5％，或预先稀释在含最终浓度为10％的乙二醇二甲醚的缀合缓冲液中，接着加入相等体积的硫醇化抗体。

在室温下搅拌，培养缀合反应2小时。培养反应以后，以14000RPM使混合物离心15分钟，并将pH调节至7.2，如果不立即纯化的话。使用多种方法通过色谱法实现缀合物的纯化。可以在预先用含5mM甘氨酸、50mM NaCl和3％甘油的pH7.2的50mM HEPES缓冲液平衡过的Sephacryl S200柱上，使用分子排阻色谱纯化缀合物。以28cm/h的线性流速进行色谱层析。收集含缀合物的部分，混和，并浓缩。择一地，可以通过离子交换色谱法进行纯化。条件根据抗体的不同而改变，在每种情况下，条件需要最优化。例如，将抗体-药物缀合物反应混合物应用到在50mM HEPES，5mM甘氨酸，3％甘油，pH6.0中预先平衡过的SP-Sepharose柱上。用平衡缓冲液中的0-1M NaCl梯度洗提抗体缀合物。混和含缀合物的部分，将pH调节至7.2，并按需要浓缩样品。

在本说明书中提到或涉及的每份专利申请、专利、出版物和其它公开的文献都全部引入本文作为参考，相当于每份单独的专利申请、专利、出版物和其它公开的文献都是具体和单独引入本文作为参考的。

尽管已经参照具体实施方案描述了本发明，不过本领域技术人员应当可以理解的是，可以进行各种改变，可以代替等价方式，而不背离本发明和所附权利要求的真正精神和范围。另外，可以进行很多修改，以适应特定的情形、材料、物质组成、方法、方法步骤，适应本发明的目的、精神和范围。所有这类修改都打算属于所附权利要求的范围内。

Claims (12)

1.下式化合物

其中，

D是具有下面结构的药物部分：

其中，环系A选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基；

E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或E和G相连形成环系，该环系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基和取代或未取代的杂环烷基；

X选自O、S和NR²³；

R²³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基；

R³选自(=O)、SR¹¹、NHR¹¹和OR¹¹，

其中，

R¹¹选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²和SiR¹²R¹³R¹⁴，

其中，

R¹²、R¹³和R¹⁴独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和取代或未取代的芳基，其中，R¹²和R¹³与它们所连接的氮原子或碳原子一起任选连接形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选含有两个或多个杂原子；

R⁴、R^4′、R⁵和R^5′独立地选自H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵=NR¹⁶和O(CH₂)_nN(CH₃)₂

其中

n是1到20的整数；

R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的肽基，其中，R¹⁵和R¹⁶与它们连接的氮原子一起任选相连形成4到6元取代或未取代的杂环烷基环系，该环系任选包含两个或多个杂原子；

R⁶是单键，它可以存在也可以不存在，当R⁶存在时，R⁶和R⁷相连形成环丙基环；和

R⁷是CH₂-X¹，或在所述环丙基环中与R⁶相连的-CH₂-，其中，

X¹是离去基团，

其中，R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个连接所述药物部分D到L³，如果存在的话，或者连接到-NH-，

AA¹代表单个氨基酸或通过酰胺键连接在一起的多个氨基酸；所述氨基酸为天然氨基酸和／或非天然α-氨基酸；

c是1到20之间的整数；

L³是包含伯胺或仲胺或者羧基官能团的间隔基团；其中，或者L³的胺与D的悬挂羧基官能团形成酰胺键，或者L³的羧基与D的悬挂胺官能团形成酰胺键；

o是1；

L⁴包含聚乙二醇部分；

其中，L⁴不包含直接与(AA¹)_c的N末端相连的羧酸酰基；

p是1；和

X⁴选自受保护的反应性官能团、未受保护的反应性官能团、可检测的标记和靶向剂。

2.权利要求1的化合物，其中，聚乙二醇部分包含3-12个重复单位。

3.权利要求2的化合物，其中，聚乙二醇部分包含2-6个重复单位。

4.权利要求3的化合物，其中，聚乙二醇部分包含4个重复单位。

5.根据权利要求1到4任一项的化合物，其中，(AA¹)_c是可被肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽序列。

6.权利要求5的化合物，其中，蛋白酶是溶酶体蛋白酶。

7.权利要求1-4任一项的化合物，其中，c是2或3。

8.根据权利要求1到4任一项的化合物，其中，最接近于药物部分的(AA¹)_c中的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Va1。

9.根据权利要求1到4任一项的化合物，其中，(AA¹)_c是选自以下的肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N⁹-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N⁹-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly。

10.根据权利要求9的化合物，其中，(AA¹)_c是Val-Cit或Val-Lys。

11.权利要求1的化合物，它选自：

其中，X¹是Cl或Br，且Ab是抗体，或其片段。

12.一种药物制剂，其包含权利要求1-11任一项的化合物和药学可接受的载体。