CN1991353A - 检测农药的方法、生物微传感器及降低电流噪声的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种农药检测方法、生物微传感器及降低电流噪声的方法。本发明提供一种检测农药的方法及生物微传感器，是利用表面固定酶、金纳米颗粒及无机催化剂的电极检测样本的电流变化，并利用温度补偿调整所检测的数据。本发明的生物微传感器可降低生物传感器的检测极限与环境中自然物质的干扰，同时缩短检测时间，达到现地即时检测的目的。

Description

检测农药的方法、生物微传感器及降低电流噪声的方法

技术领域

本发明涉及一种农药检测方法、生物微传感器及降低电流噪声的方法。

背景技术

为了增加产量及保持农作物的美观，通常施用大量的农药，其中有机磷农药(organophosphorous compounds；OPCs)由于具有低生物累积性及高生物可分解性的优点，目前已取代有机氯农药成为最普遍使用的农药种类。有机磷农药虽具有上述优点，但在大量使用的情况下，可能导致在土壤、作物、表面水及工业废水中残留，对人体健康与自然环境造成相当大的威胁。世界各国已对有机磷农药的管制详加注意，针对饮用水、食品及工业废水中颁布制定相当严格的管制标准。

一旦有机磷进入生物体内后，它会跟胆碱酯酶(cholineesterase；ChE)的活性位置形成不可逆的结合，进而抑制该酶活性，延缓生物体内乙酰胆碱(acetyl choline；ACh)的水解速率，干扰神经传输。根据农药本身的毒性、剂量与接触时间的差异，所导致的症状包括：疲倦、恶心、嗜睡、视觉模糊，严重时甚至会死亡。

传统上，农药的分析主要采用化学方法(包括：高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC、气相色谱-质谱法GC-Mass、电感耦合等离子体-质谱法ICP-Mass等)。传统的实验室化学仪器分析方法虽可对环境样本提供精确的检测，但前处理及分析步骤极为冗长，加以仪器本身价格昂贵、体积庞大，且需要经过专业训练的人员才能操作，导致检测成本过高，基本上并不符合污染现地即时监测的要求。对即将上市的农产品而言，这些传统的化学分析方法对于农药的即时检测与筛选并无法提供任何的帮助。

有鉴于此，开发一个能够快速筛检污染物浓度，同时兼具可携带、操作简便与廉价特性的微传感器(Micro-sensor)，成为当前检测监测技术的研发重点。

生物传感器(biosensor)由于具有下列诸多的优点，可克服传统分析方法的缺失，深具发展潜力：(1)经由固定化技术的应用，生物元件可重复使用，降低成本；(2)生物辨认元件专一性高，可避免非目标物干扰；(3)操作简易；(4)灵敏度高，所需样品量低；(5)应答快速，降低分析时间；(6)数字信号输出，达到微小化，易携带，可用于现场检测。

由于信号传输元件本身传输能力的差异，各生物传感器的可检测范围有所不同。传统的电化学生物传感器的检测极限只能达到ppm级，是所有信号传输元件中最差的。然而电化学生物传感器由于操作简便、设备成本与检测成本低廉，同时针对有颜色及高浊度的样品仍可做准确的检测，因此仍是发展最早且最完善的，无论国内外均有相当多的研究结果提出。目前电化学生物微传感器之所以无法达到普遍使用的程度，主要的困难点包括：(1)操作时氧化电位过高，易同时氧化环境中的干扰物质，导致噪声产生；(2)检测时间相较其他形式的生物传感器为长；(3)检测极限太高，无法针对低浓度的污染物做检测，应用面过于狭窄。若能克服这些缺点，将可加速此类生物传感器商业化的速度，同时扩大其在环境污染检测的应用面。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测农药的方法，包括提供一样本；使该样本与至少一电极接触；以及检测产生的电流信号，其中该电极表面有酶、金纳米颗粒及无机催化剂固定其上。

本发明的检测农药的方法中，该酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶。

本发明的检测农药的方法中，该无机催化剂为普鲁士蓝。

本发明的检测农药的方法中，该电极表面是以电聚合方法固定。

本发明的检测农药的方法中，该电聚合固定方法是在电极表面聚合一层聚吡咯，固定酶、金纳米颗粒及无机催化剂于聚吡咯层上。

本发明的检测农药的方法中，该金纳米颗粒的浓度为0.5-2.0ppm。

本发明的检测农药的方法中，该金纳米颗粒粒径为16.5-20nm。

本发明的检测农药的方法中，该电极为白金电极。

本发明的检测农药的方法中，其还包括使该样品与一温度感应器接触，检测该样品温度。

本发明的检测农药的方法中，该电流信号以样品温度进行温度补偿处理。

本发明的检测农药的方法中，该农药为有机磷或氨基甲酸盐。

本发明的检测农药的方法中，该电极与温度感应器设置在一平板上。

本发明的另一目的在于提供一种生物微传感器，包括：至少一电极，用以检测电流信号；一处理单元，用以接收处理该电流信号，且转换该电流信号成为一浓度数据；以及一显示单元，用以显示该浓度数据；其中该电极表面以酶、金纳米颗粒以及无机催化剂固定。

本发明的生物微传感器中，该酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶。

本发明的生物微传感器中，该无机催化剂为普鲁士蓝。

本发明的生物微传感器中，该电极表面是以电聚合方法固定。

本发明的生物微传感器中，该电聚合固定方法是在电极表面聚合一层聚吡咯，固定酶、金纳米颗粒及无机催化剂于聚吡咯层上。

本发明的生物微传感器中，该金纳米颗粒浓度为0.5-2.0ppm。

本发明的生物微传感器中，该金纳米颗粒粒径为16.5-20nm。

本发明的生物微传感器中，该电极为白金电极。

本发明的生物微传感器，还包含一温度感应器，用以检测温度并传送至该处理单元。

本发明的生物微传感器中，该电流信号以该检测温度进行温度补偿处理。

本发明的生物微传感器用于检测农药。

本发明的生物微传感器中，该农药为有机磷或氨基甲酸盐。

本发明的生物微传感器中，该电极与温度感应器同时在一平板上。

本发明的生物微传感器，还可包括至少一电极，一温度感应器，以及一数据处理显示仪，其中该电极表面有酶、金纳米颗粒及无机催化剂固定其上，用以检测农药。

本发明的另一目的进一步提供一种降低电流噪声的方法，包括将金纳米颗粒及无机催化剂固定在一酶固定的电极表面。

本发明的降低电流噪声的方法中，该无机催化剂为普鲁士蓝。

本发明的降低电流噪声的方法中，该金纳米颗粒粒径为16.5-20nm。

本发明的降低电流噪声的方法中，该金纳米颗粒浓度为0.5-2.0ppm。

本发明的降低电流噪声的方法中，该电极表面是以电聚合方法固定金纳米颗粒及无机催化剂。

本发明的降低电流噪声的方法中，该电聚合固定方法是在电极表面聚合一层聚吡咯，使金纳米颗粒及无机催化剂固定于聚吡咯层上。

本发明的降低电流噪声的方法中，该酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶。

本发明在生物微传感器的开发上，除了需保有传统生物传感器的优点之外，还要能克服环境因子干扰，保持生物辨认元件活性，缩短检测时间，同时还要能降低检测极限，才能扩大应用范围。欲达到这些目标，整个微传感器开发需建立包括：电极制备、生物辨认元件固定、电流信号放大、噪声消除与信号数字化、传感器微小化等平台技术。

在电极的制备方面，材质的选择包括：玻璃、金、白金、钯、石墨及碳黑，电极结构无论是平板电极、针状电极(实心或镂空)均可使用。电极表面处理可以酸、碱、物理研磨或超音波处理，得到干净的电极表面。在生物辨认元件固定方面，可使用物理包埋或化学共价键结达到固定的目的，但在固定的过程中，需考量生物辨认元件流失与失活的问题。

此外，要缩短检测时间，同时改善检测极限，需通过降低环境因子所产生的噪声及放大输出信号加以达成。除了电子媒介物的使用之外，在固定的过程中采用导电聚合物(例如聚吡咯及丙二胺)进行生物辨认元件固定亦可适当降低检测时所需的氧化电位值，避免环境样本中的杂质同时被氧化，减低环境因子的干扰的程度。

另外，纳米材料的研究成果显示物质一旦进入纳米规格，不论在强度、导电度与导热能力等材料性质均会大幅提升。在生物辨认元件的固定过程中使用纳米材料，将有助于传感器输出信号的放大，进而提升微传感器的检测速度、准确性与灵敏度。

欲使使用者便于上手，同时可用于现场监测，除了仪器本身需轻薄短小之外，检测的结果最好能直接显示在传感器的面板上，此部分则有赖信号数字化与传感器微小化来达成。

本发明尝试将酶生物传感器与纳米科技的概念结合，开发一种生物微传感器检测水中的农药，利用金纳米粒子所具有的高比表面积与高导电度的特殊性质并组合无机催化剂，用以降低氧化电位电子转移，同时达到放大电流的输出信号与避免噪声产生，提升本发明的生物微传感器的S/N值。因此，本发明的生物微传感器可降低生物传感器的检测极限与环境中自然物质的干扰，同时缩短检测时间，达到现地即时检测的目的。

附图说明

图1为本发明的生物微传感器的一具体实施形态。

图2说明本发明的电极系统的背景电流(未添加H₂O₂)的变化。

图3说明系统中批次添加2μM的H₂O₂溶液的电流信号输出变化。

图4说明H₂O₂添加前后输出电流值变化与H₂O₂浓度的变化。

图5A～图5E说明直接添加酶(未固定酶)前，有机磷农药对酶活性的抑制情形。图5A为未固定酶以及无农药添加的空白试验；图5B为未固定酶前，添加对氧磷浓度0.47ppm的电流变化；图5C为未固定酶前，添加对氧磷浓度4.7ppm的电流变化；图5D为未固定酶前，添加对氧磷浓度47ppm的电流变化；以及图5E为未固定酶前，添加对氧磷浓度470ppm的电流变化。

图6说明当乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱酯酶(ChE)与胆碱氧化酶(ChO)添加量(酶未固定)为1mM、0.004Unit(酶活力单位)及0.2Unit时，对于不同对氧磷浓度(47ppm、4.7ppm、0.47ppm)及作用时间灵敏度的变化。

图7显示在固定对氧磷浓度(4.7ppm)下，悬浮酶(未固定酶)在不同抑制时间与电流抑制率的关系。

图8显示以溶胶-凝胶(sol gel)法将酶固定于白金电极表面前后的电极灵敏度。栏(a)使用以溶胶-凝胶法固定酶的白金电极表面；栏(b)为使用酶未固定、悬浮于样本中的标准白金电极；栏(c)为使用酶未固定、悬浮于样本中的1公分白金电极；及栏(d)为使用以溶胶-凝胶包埋酶后，直接置于水中，不将其固定于电极表面的电极。

图9显示酶经电聚合固定前后的电流输出信号的关系。栏(a)使用未固定酶的电极；栏(b)使用固定吡咯(pyrrole)单体/酶乙酰胆碱酯酶(AChE)与过氧化酶(HRP)为20μl/1000U的电极；栏(c)使用固定吡咯单体/酶AChE与二茂铁(ferrocene)为20μl/1000U的电极；栏(d)使用固定吡咯单体/酶AChE为0.013mg/1000U的电极；及栏(e)使用固定吡咯单体/酶AChE为20μl/1000U的电极。

图10显示在无机催化剂(普鲁士蓝Fe(CN)₆ ^3-)有无存在下的氧化电位下降效应；实线表示无Fe(CN)₆ ^3-；虚线表示Fe(CN)₆ ^3-存在。

图11显示不同外加电压下抗坏血酸的氧化电流值。

图12为本发明使用的金纳米颗粒的电子扫描显微照片。

图13A显示固定或未固定酶与纳米金颗粒的电极与电极灵敏度的关系；正方形标记代表使用未固定酶与纳米金颗粒的电极；三角形标记代表使用固定酶与金纳米颗粒的电极。图13B显示使用固定酶与纳米金颗粒的电极时，纳米金颗粒添加浓度与电极灵敏度的关系。

图14显示纳米金颗粒的体积与电极敏感度的关系。

图15说明本发明生物微传感器使用的酶活性回复性。

图16说明本发明生物微传感器在不同检测温度下电极灵敏度的变化。

图17显示本发明生物微传感器在不同pH值下检测，电流输出信号的变化情形。

图18A显示甲醇与本发明生物微传感器的酶活性的关系；图18B显示乙醇与本发明生物微传感器的酶活性的关系；图18C显示丙酮与本发明生物微传感器的酶活性的关系。

图19A显示镉离子与本发明生物微传感器的酶活性的关系；图19B显示铁离子与本发明生物微传感器的酶活性的关系；图19C显示铜离子与本发明生物微传感器的酶活性的关系；图19D显示铅离子与本发明生物微传感器的酶活性的关系。

图20显示硫酸根SO₄ ^2-与本发明生物微传感器的酶活性的关系。

图21说明检测时间10分钟25℃下对氧磷浓度与本发明生物微传感器的电流抑制率的关系。

图22说明本发明的生物微传感器电流抑制率与对氧磷的线性范围。

图23显示本发明的生物微传感器检测番茄汁原液及添加对氧磷农药的番茄汁的数据及比较。栏(a)使用番茄汁原液；栏(b)使用添加30ppb对氧磷农药的番茄汁液；栏(c)使用稀释10倍的番茄汁原液；及栏(d)使用稀释10倍的添加30ppb对氧磷农药的番茄汁原液。

具体实施方式

为让本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下：

生物微传感器的构成

如图1所示，本发明的一具体实施形态包括三个电极101、103及105，分别为对电极、工作电极以及参考电极，各工作电极固定有酶、金纳米颗粒以及普鲁士蓝(Fe(CN)₆ ^3-)，用以测量样本中产生的电流信号S1，将所检测的电流信号输出至一处理单元120。

如图1所示，本发明的生物微传感器还包括一温度感应器110，用以检测样本温度，并将检测的温度信号S2输入一处理单元120。该处理单元120内依下列式(4)将检测的电流信号经过下述的温度补偿处理后转成为一浓度数值，并输入一显示单元122，在该显示单元122上显示样本中所含的农药浓度，即检测出样本中农药含量。

电流输出信号检测机制

本发明的生物微传感器的整个电化学检测机制可分为三个步骤，首先利用乙酰胆碱酯酶(AChE)(1000Unit/mg固体；Sigma)对乙酰胆碱(ACh)(99％，Sigma)行水解作用，所产生的胆碱再通过胆碱氧化酶(ChO)(100Unit/mg固体，Sigma)作用，产生过氧化氢，最后再以外加电压对过氧化氢进行氧化作用，使反应放出电子，如此通过电位计可测量到酶反应过程电流输出信号的变化。整个酶反应与电流信号检测机制可以下列的方程式来加以表示：

由于有机磷与氨基甲酸盐农药均会与乙酰胆碱酯酶上的活性位置相结合，造成酶的活性抑制，进而降低上列式(1)、(2)及(3)的连续反应的反应速率，而使电流输出信号变小。

将电流输出信号与抑制剂(待测农药)的浓度相对关系，定义如下式的电流抑制率(RI)，则可通过电流输出信号，依式(4)确认分析水样中有机磷的浓度。

$\mathrm{RI}(\%)=\frac{{\mathrm{dI}}_t/\mathrm{dt}-{\mathrm{dI}}_1/\mathrm{dt}}{{\mathrm{dI}}_1/\mathrm{dt}}\×100\%---\left(4\right)$

其中dI₁/dt为酶未受抑制前的输出电流变化速率(或灵敏度)；dI_t/dt为酶经过一定时间t抑制后的电流变化速率(或灵敏度)。

金纳米颗粒的生产方法

取247.5ml的去离子水煮沸后，加入1％的柠檬酸钠溶液15ml，煮沸5分钟，加入HAuCl₄溶液2.5ml，溶液逐渐由淡黄色转变为灰色、深褐色后，持续90℃加热搅拌15分钟，将溶液置于室温中冷却，溶液相会还原出暗红色的金纳米粒子，储存于4℃冰箱。以柠檬酸钠作为还原剂，其羧基(COO-)会将三价金离子还原至一价金离子，同时生成丙酮二羧酸(acetonedicarboxylate)，再由一价金离子还原成金原子。整个反应式如下所示：

若欲制备不同粒径大小的金纳米粒子，可通过改变四氯金酸与柠檬酸钠的比例来达成。调整柠檬酸钠与四氯金酸的比例为7、1.75、3.75或14，分别制备出平均粒径为25nm、36.3nm、16.5nm或19.4nm的金纳米颗粒。

酶固定方法

在酶固定之前，电极表面分别以超音波震荡及浓硝酸清洁白金电极表面。以下分别以溶胶-凝胶固定方法(sol-gel)及电聚合方法将酶固定于白金电极表面。

(a)溶胶-凝胶固定方法(sol-gelimmobilization)

取10μL TEOS(原硅酸四乙酯，tetraethyl orthosilicate；Aldrich Chemicals)、200μL去离子水、30μL乙醇以及1μL 0.1M的HCl于塑胶小试管中，以超音波震荡一小时，在室温放置2-3小时，溶胶-凝胶(sol gel)溶液的p H值维持在6。取0.1mg的AChE与ChO及金纳米粒子溶液1μL(对照组则不添加)溶解于100μL pH值7的PBS溶液(磷酸缓冲液，phosphate buffersolution)中。取25μL溶胶-凝胶(sol gel)溶液加入前述的酶溶液中，充分混合。取出50μL，与白金电极一起置入另一小塑胶试管中，在4℃风干24小时，以PBS溶液充分洗净再储存于4℃干燥的环境。

(b)电聚合固定方法(electropolymerization)-使用聚吡咯(polypyrrole)

利用循环伏安法(cyclic voltammetry；CV)在0-1V间，以10mV/sec的速度扫描，将酶电聚合于白金电极表面。先于白金电极表面聚合上一层聚吡咯(如下式(7))作为预备层，以避免酶直接附着于电极表面。再以表1的条件进行酶电聚合。在电极的保存方面，需先以去离子水冲洗后，在将其保存于4℃的0.1M PBS中。

表1：聚吡咯电聚合所采用的物质与条件

参数值	电聚合条件
		电极材料	铂(Pt)
扫描速度	10mV/sec
		电解液条件	0.1M LiClO4
单体浓度	0.1M吡咯
		酶浓度膜厚：预备层(Prelayer)	0.8g/L
0-1.0V两次扫描周期vs.Ag/AgCl
	聚吡咯-酶层		0-1.0V两次扫描周期vs.Ag/AgCl：膜B
温度		22℃

电位计电流输出信号初步测试

在实验进行之初先以白金电极作为工作电极，经由外加电压+700mV(亦即H₂O₂的氧化电位)，测试电位计电流输出信号对H₂O₂浓度变化的反应结果如图2所示。图2为系统的背景电流值变化，由图可看出当测试样本中未添加H₂O₂时系统的背景电流值约在300秒的后达到稳定值0。

图3为批次添加2μM的H₂O₂溶液于测试瓶中，系统的电流信号输出变化图。由图3可明显看出随着H₂O₂溶液的添加，电流值呈批次下降，显示电位计可对样本中H₂O₂的浓度作准确的检测。

将每一区间H₂O₂添加前后输出电流值变化与H₂O₂的浓度作图结果如图4所示。由图4可看出本系统的电流输出信号与所添加的H₂O₂的浓度成一正比关系，尤其在H₂O₂浓度在0.002-0.006mM之间时，因此可用于本实验设计所产生的H₂O₂的检测，进而经由酶活性抑制，确认样本中有机磷农药的浓度。

有机磷农药对悬浮态酶活性的抑制情况

先添加0.1ml 500mM的乙酰胆碱(acetylcholine；ACh)于含0.1M PBS与0.1M KCl的测试瓶中，而后在测试电流变化期间添加乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase；AChE)3.75Unit与胆碱氧化酶(choline oxidase；CHO)2Unit，同时外加电压+700mV，再添加不同浓度(0、0.47、4.7、47及470ppm)的对氧磷(paraoxon，属于有机磷农药的一种)，观察电流输出信号的变化，结果如图5A-图5E所示。由图5A-图5E可明显看出一直到对氧磷浓度提升至470ppm时，电流输出信号才有较明显的变化，推测其可能原因为实验中乙酰胆碱酯酶(AChE)添加量太多，以致于加入抑制剂对氧磷后，残余的酶活性仍然可使乙酰胆碱(ACh)反应，故电位变化并没有减弱的现象。

修改酶作用底物与酶的添加量，AChE、ChE与ChO添加量各为1mM、0.004Unit及0.2Unit，可将检测极限下降至4.7ppm(如图6所示)。依此结果进行在固定对氧磷浓度4.7ppm下，不同对氧磷抑制时间对电流输出信号(抑制率)影响的实验，结果如图7所示。由图7可明显看出，随着抑制时间延长，酶受对氧磷抑制的程度越高，因此电流输出信号的抑制率越大，亦即电流输出信号除了受抑制剂(对氧磷)浓度的影响之外，亦与抑制时间密切相关。

酶固定后的活性表现

根据上述酶固定方法，分别以溶胶-凝胶固定法及电聚合法将酶固定于电极表面上。结果发现以溶胶-凝胶法固定酶具有胶化缩合过程不易掌控，脱水干燥时间过长，胶体易脆酶易流失，屏蔽效应阻碍分子扩散与电子传递等缺点，导致酶固定后，电流输出信号较未固定前小甚多，感测灵敏度亦随的下降。如图8所示，以溶胶-凝胶法将酶固定于白金电极表面(图8(a))，相较于直接将酶悬浮于样本(图8(b)、(c))中，电极灵敏度下降约4-10倍。同时若将酶以溶胶-凝胶包埋后，直接置于水样中，而不将其固定于电极表面(图8(d))，则由于质传阻力的存在，导致灵敏度较酶直接固定于电极表面者更差，几乎没有电流信号发生。

而以电聚合法-聚吡咯(polypyrrole)将酶固定于白金电极表面，不仅可通过导电单体与酶比例调控，达到膜状固定(filmimmobilization)，避免因酶固定层太厚，造成质量传输阻力，同时由于电聚合单体本身为可导电的物质，以电聚合固定后电极的灵敏度反而较悬浮态酶为高，而酶活性在固定的过程中虽有些许失活，但活性残余率仍高达90％。图9是不同吡咯单体/酶量值电聚合完成后电流输出信号的变化。由图9可看出当吡咯单体/AChE酶量为0.013mg/1000U时(图9(d))，酶固定完成后的电极电流输出信号约为悬浮态酶(图9(a))的两倍。这种情况发生主要是因为吡咯本身即为导电性物质。以PTC(丙酰硫代胆碱，propionylthiocholine)套组(CACTA service srl.)测定酶固定后的活性，发现酶活性残余率仍高达未固定前(悬浮态)的89％。

噪声排除与电流输出信号放大

生物微传感器的灵敏度若要提升，则信号与噪声的比值(S/N)必须增大。要达到这个目的，可从两个方向着手，(1)避免环境样本中其他物质在检测过程中被氧化，降低噪声；(2)放大电流信号。在开发的过程中，将无机催化剂普鲁士蓝Fe(CN)₆ ^3-连同AChE及CHO酶一起固定于白金电极表面，通过普鲁士蓝(PB)与普鲁士白(PW)的自催化反应，可将原本氧化H₂O₂所需的外加电压由700mV降低至0左右(如图10所示)。能够降低应用电位是由于普鲁士蓝(PB)提供一个很好的催化角色，使H₂O₂原本需较高电位(700mV)的氧化反应转换成低电位的还原反应，此还原反应的驱动者为普鲁士蓝(PB)的还原态普鲁士白(PW)所扮演。

首先普鲁士白(PW)电催化(electrocatalytic)H₂O₂的还原，之后再通过电极提供的还原应用电位(0mV)，促使普鲁士蓝(PB)再度还原成普鲁士白(PW)，因此得到一还原电流信号。如此可使电极检测到的信号为表面修饰的普鲁士蓝(PB)自我氧化还原改变而非溶液中发生的H₂O₂氧化还原反应，进而增进电极对H₂O₂灵敏度。

因此在此几乎不外加电压的情况下，原本在现地检测过程中可能会同时被氧化的物质(如：腐植酸、抗坏血酸、NH⁴⁺-N等)不再被氧化，可大幅降低电流噪声的产生。图11表示抗坏血酸在不同外加电压下被氧化的情况。由图11可知，随着外加电压上升，因抗坏血酸氧化所产生的电流值越大，而当外加电压趋近于0时，氧化电流便消失，换句话说，此电流噪声将不会产生。

另一方面，利用化学合成的金纳米粒子优良的导电及巨大的比表面积特性(如图12的电子扫描显微照相所示)，将其连同酶与无机催化剂以电聚合的方法一起固定于白金电极表面上，发现由于电子传输阻力大幅下降及催化能力大幅上升，电流输出信号相对提升甚多，亦即传感器的灵敏度提升，使得传感器整体检测极限可下降至ppb级。若考量检测时间与检测极限的关系，则可在两者之间作一折衷，使其不仅检测的灵敏度可达到要求，同时检测时间亦可缩短。有一个特别值得注意的地方，如图13A，当酶与金纳米粒子均为悬浮状态时，金纳米粒子添加越多，电极的灵敏度亦越高。然而在固定的状态下，如图13B，传感器的灵敏度会先随着金纳米粒子的添加而升高，而后若金纳米粒子过量添加，电极的灵敏度会随之下降，较佳为电聚合溶液中含0.5-2.0ppm金纳米颗粒，最佳添加量为0.7ppm。这种现象主要在于悬浮状态下，金纳米颗粒添加量相较于测试样本的体积可视为少量，添加越多，导电性理应越好；而当酶与金纳米粒子呈膜固定的状态下，酶、无机催化剂、电聚合单体与金纳米粒子的量存在一最佳的配比，当金纳米粒子添加过量，不仅粒子容易凝集分散不易，且因为排挤效应，导致固定层当中酶与无机催化剂的含量过低，使得电流输出信号下降。图13A中另外可看出，若适当添加金纳米粒子量，则固定态的传感器灵敏度将远高(约5倍)于悬浮状态下的灵敏度(固定状态曲线的波峰)。

本发明中另以不同的四氯金酸/柠檬酸钠配比合成不同体积的金纳米颗粒，将其固定于电极表面上，结果发现当所添加的金纳米粒子直径小于20nm(约16.5-20nm)时，电流信号放大效应才会出现(如图14所示)。

酶再活化

AChE受到有机磷农药抑制后，可以2-PAM(吡啶-2-醛肟氯甲烷，pyridine-2-aldoxime methochloride)将其活性加以恢复。其作用机制是与乙酰胆碱酯酶表面磷酸化的磷酸结合，使乙酰胆碱酯酶恢复活性。氮上的正电荷与谷氨酸(glutamateacid)间有库伦吸引力，使得具很强亲核力的氧原子可攻击与丝氨酸(serine)结合的磷原子，酶活性因而恢复。本发明中以不同浓度的2-PAM作用于受有机磷农药抑制后的电极，测量酶活性的恢复率及电流输出信号变化，结果如图15所示。图15中，A0表示标准值；A1表示0.126ppm对氧磷处理10分钟，A2表示以2-PAM再活化10分钟，A3表示2-PAM再活化后的30分钟后(测试1)；B1表示对氧磷处理10分钟，B2表示以2-PAM再活化15分钟，B3表示从7月8日制备后，于7月12日使用(测试2)；C1表示对氧磷处理10分钟，C2表示以2-PAM再活化10分钟，C3表示2-PAM再活化后的30分钟后，C 4表示从7月12日制备后，于7月16日使用(测试3)；D1表示对氧磷处理10分钟，D2表示不使用2-PAM，D3表示以2-PAM再活化10分钟，D4表示2-PAM再活化后的30分钟后(测试4)。由图15可看出经过0.126ppm对氧磷溶液抑制过后的电极，可在30分钟之内通过2-PAM的作用将其恢复约70％的活性，经过抑制-恢复连续四次的测试发现酶活性并没有明显下降，显示以2-PAM作为酶活性剂是适当的，而电极有极大重复使用的潜力。

环境干扰因子探讨

针对环境中可能存在的干扰因子可能造成酶失活，或存在易被氧化的物质造成电流噪声产生。本发明针对温度、pH、重金属及有机溶剂对酶活性的影响加以探讨。图16表示在不同温度下酶活性的变化，横座标代表测量温度与25℃之差(T-25)，纵座标以电流变化表示抑制率。由图16可看出当测量温度在10-40℃之间(横座标数值-15～15)时，酶活性随着温度上升而提高，显示当传感器在现地使用时，温度补偿是必须的。本研究针对不同温度下的酶活性表现作探讨，选定25℃为基准点，测量不同温度下抑制率的变化情形，在10-40℃的范围之间，发现不同温度下酶活性表现呈一线性关系(如图16所示)。

图17显示不同pH值下电流输出信号的变化情形。由图17可看出在pH8-9间电流输出信号有明显上升的情况发生。之所以有这种情况乃是因为当pH过高时，R-胆碱(R-Choline)会自动被化学水解，导致电流输出信号急速变大，造成误判。由此可知本电极的适用范围只在pH趋近于中性的情况下。

图18及图19分别表示有机溶剂及重金属对酶活性的影响。由图18A-图18C可看出不论哪种有机溶剂对酶活性均或多或少有抑制性。针对在目前的放流水标准下(黑色长条所示的浓度)，各有机溶剂对酶的活性抑制率均高。较幸运的是丙酮(图18C)最常的使用浓度仅约0.2％，而在此情况下丙酮几乎对酶无任何活性抑制，显示丙酮是农药萃取量测较适合的有机溶剂。在图19A-图19C中则可看出各种重金属对酶活性均有影响，其中以铜离子(图19C)对酶活性的抑制最为严重，当水样本中铜离子浓度达1ppm时，酶活性仅剩约一半。至于铅(图19D)、铁(图19B)、及镉(图19A)离子对酶活性的影响则明显较小，影响程度的顺序为铜＞镉＞铁＞铅。当电极在实场运用时，水中所含重金属的情况是必须加以注意的。

至于SO₄ ^2-对酶活性的影响可由图20来表示。由图20可看出在现行放流水标准之下，硫酸根的存在对酶几乎没有任何影响。

固定测量时间下电流抑制率与有机磷浓度的关系式与可应用范围

传统上，电化学生物传感器的检测极限往往落于ppm等级。如此高的检测极限导致此类生物传感器仅能用于高浓度的量测，对于现场污染物的监控无法提供任何的帮助。通过上述诸多平台技术的建立，本研究所开发的生物传感器检测极限可在极短的检测时间上延伸至ppb等级。如此低的检测极限远小于现行法规管制标准，因而可用于现地污染物监控之用。图21为检测时间10分钟25℃下有机磷浓度与电流抑制率的关系图。由图21可发现电流抑制率起初随着有机磷浓度增加而呈线性上升，但当有机磷农药浓度超过130ppb，电流抑制率增至70％附近便不再改变。此现象暗示(1)有机磷农药可抑制的酶(或有机磷农药可接触到的酶活性位置)仅占全部固定酶的70％；其余的30％的固定酶可能由于太深或立体方位的影响导致有机磷农药无法靠近；(2)130ppb的有机磷农药便足以抑制所有可接触的酶活性位置，因而导致电流抑制率在高有机磷浓度下也不再升高。

将图21中的线性范围(画圈处)重新绘图示于图22中。由图22可看出本发明的生物微传感器的有机磷农药可测定的范围为10-130ppb。此可应用范围可通过增加酶固定量来加以扩大。然而此时无机催化剂、金纳米颗粒、吡咯单体与酶的最佳配比需针对不同电极大小(表面积)再次加以确认。

电极表现的温度补偿

针对电极于不同温度下的表现进行温度补偿测试。以25℃为基准点，配合图22中所得的电流抑制率与有机磷农药关系，选定已知有机磷浓度的标准溶液进行测量，以测量结果进行两阶段的温度补偿。第一阶段为单一浓度的温度补偿；第二阶段则为全浓度范围(0-100ppb)的温度补偿。测量的有机磷浓度包括：20、40、60、80及100ppb；温度范围则涵盖：10、18、25、32及40℃，结果如表2所示。表2中P1为通过图22关系式换算所得的原始(未经温度补偿)测量结果；P2为经过单一浓度温度补偿后所得的结果；P3则为经过全浓度范围温度补偿所得的结果。以实际测量结果为基准，将针对各有机磷浓度及全范围有机磷农药所得的温度补偿方程式归纳于表3。进行全浓度范围的温度修正时，当低于100ppb时，由式1c得出P3′，再由式1b得出Coeff.，最后由式1a得出P3；当100ppb以上时，由式2c得出P3′，再由式2b得出Coeff.，最后由式2a得出P3。由表2可看出(比较标准溶液浓度与P2)，除了高浓度有机磷(100ppb)之外，通过单一浓度温度补偿方程式修正后的结果，无论环境温度如何，其SD(标准差)均可小于2％；若通过全浓度范围方程式来进行温度补偿(比较标准溶液浓度与P3)，可看出当环境温度越偏离25℃，补偿效果越差。当环境温度介于18-32℃时，全有机磷浓度补偿后的结果，其SD＜7％；当环境温度低至10℃或高至40℃时，其SD有时会高达15％。当进行真实样品真测试，可通过电流抑制率与浓度关系式及全范围温度补偿方程式，得到样品中有机磷的含量。若样品温度过高或过低，超出温度补偿范围，建议应回温后再行测量。

表2：各有机磷(对氧磷)浓度不同温度条件下电极测量的原始数据与温度补偿后的结果

温度(℃)	20ppb对氧磷			40ppb对氧磷			60ppb对氧磷			80ppb对氧磷			100ppb对氧磷
																P1	P2	P3	P1	P2	P3	P1	P2	P3	P1	P2	P3	P1	P2	P3
	10	17.6	20.2	23.8	29.2	40.2	40.9	36.5	59.6	51.8	55.1	80.0	79.5	59.4	87.7																85.9
18																19.1	20.3	21.6	35.2	40.3	40.6	51.1	61.9	59.4	68.7	80.3	80.2	84.1	97.3	98.4
	25	20.0	20.0	20.0	40.2	40.2	40.2	59.5	59.6	59.6	80.8	80.8	80.8	100	100																100
32																21.5	20.3	19.3	45.5	40.3	40.1	69.2	58.5	60.7	91.7	80.0	80.2	105	92.7	92.6
	40	22.7	20.2	18.4	51.2	40.2	39.8	84.2	61.1	64.7	105	80.1	80.4	118	89.9																90.3

表3：单一浓度与全浓度范围的温度补偿方程式

电流输出信号数字化

通过一连串的实验结果，建立固定测量时间下电流抑制率与有机磷浓度的关系式。将此相关式烧入芯片，建立信号撷取系统的连接，完成信号数字化，作为生物微传感器的数字信号传输系统。基本上此数字信号传输系统的开发，主要分为软、硬件两部分进行。硬件部分包括有：掌上型电位计、信号传输线(RS232排线)、信号分析与记录器(微处理器)等。而软件主要是使用LabVIEW(Laboratory Virtual Instrument EngineeringWorkbench)套装程序语言来控制硬件间的信号撷取、传输、分析与记录等工作。LabVIEW是由National Instrument公司于1986年发展出的一种图像式的程序语言，其主要用途是可以完全整合控制的通讯接口，例如GPIB、VXI、PXI、RS232，以及支持数据呈现(data presentation)、数据储存(data storage)、数据分析(data analysis)、数据撷取(data acquisition)、环境控制(serial instrument control)等功能。因为LabVIEW中模块化仪器Express VIs可使原型制作及测试混合信号设计及自动产生测试程序码；可确保Real-Time Desktop PC功能将在任何基于PC(PC-based)测试系统能最佳化系统稳定度及绩效；快速PDA数据撷取效能及DMM支持，建立客制化的可携式数据撷取系统；蓝牙支持-运用无线蓝牙科技与其他设备做沟通；50种全新数学函数功能-运用增大LAPACK/BLAS基础函数库，增加精准度及速度最高可达200％；超线程(Hyper-Threading)科技来增加最高至100％系统执行力。在检测的过程中，除了可得到污染物的浓度之外，亦可针对检测条件，包括：抑制时间、氧化电位、电流纪录频率作改变，可谓相当便利。

真实样品检测

为了确认本研究所开发的生物微传感器的实用性，针对市售蕃茄汁进行初步测试，结果如图23所示。在实验过程中先行对蕃茄汁原液进行有机磷农药的测量，而后在原液中掺入(spike)30ppb的对氧磷农药，观察传感器是否能对此做出准确的测量。在另一个实验中，则先将蕃茄汁原液稀释十倍，进行有机磷农药测量，而后同样地于此稀释液中掺入30ppb的对氧磷农药，观察传感器的测量情况。实验中整体农药抑制时间为10分钟。由图23可清楚看出，蕃茄汁原液的有机磷农药浓度为25.6ppb，当掺入30ppb对氧磷农药后，测量值变为54.9ppb，而在另一实验中，稀释十倍后，稀释液中农药浓度已低于可测量范围，而后再掺入30ppb后，稀释液中的有机磷农药，又变成可测量其值为39.6ppb。由此结果可知本研究所开发的生物微传感器可准确地测量果汁中有机磷农药的残留量，同时果汁中的干扰物质，例如：糖分、色素、悬浮固体与抗氧化剂等，并不会对测量结果有任何的影响。显示此系统可用于真实样品的量测。

产业可利用性

本发明结合生物技术与纳米科技，开发以酶反应为基础的电化学生物微传感器，可针对现地水环境中的污染物作快速且灵敏的检测，相对于传统实验室的化学分析方法，不仅可达到省时省钱的目的，同时在使用的方便性上更大幅提升。

以电聚合固定方法将酶，连同无机催化剂与金纳米粒子一起固定于电极表面上，由于无机催化剂的存在，可降低检测进行时所需施加的电压值，因而大幅缩小环境样本中其他物质被氧化所产生的噪声。另外，通过金纳米粒子的高比表面积与高导电性的特质，可放大酶反应所产生的电流信号，因此可大幅提升生物微传感器的灵敏度，同时改善检测极限，缩短检测时间。依实验的结果建立电流输出信号及分析物浓度二者之间的关系，配合电流信号输出数字化系统的建立，所开发出流的生物微传感器将兼具灵敏、快速、准确、成本低廉与易上手的特点。

本发明生产的生物微传感器重量小于1公斤，可在10分钟的检测时间内，准确检测水样本中的农药至10ppb以下，与传统的生物传感器相比，本发明的生物传感器不但体积及重量较小，检测极限下降两个数量级，检测时间缩短，且检测成本仅需约10元，在污染检测的应用面上将大幅提升。

以上所述仅为本发明较佳实施例，然其并非用以限定本发明的范围，任何熟悉本项技术的人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可在此基础上做进一步的改进和变化，因此本发明的保护范围当以本申请的权利要求书所界定的范围为准。

附图中符号的简单说明如下：

101：电极

103：电极

105：电极

110：温度感应器

120：处理单元

122：显示单元

S1：电流信号

S2：温度信号

Claims (32)

1.一种检测农药的方法，其特征在于，包括：

提供一液体样品；

使该样品与至少一电极接触，其中该电极表面有酶、金纳米颗粒及无机催化剂固定其上；以及

检测由该电极输出的电流信号。

2.根据权利要求1所述的检测农药的方法，其特征在于，该酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶。

3.根据权利要求1所述的检测农药的方法，其特征在于，该无机催化剂为普鲁士蓝。

4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的检测农药的方法，其特征在于，该电极表面是以电聚合方法固定。

5.根据权利要求4所述的检测农药的方法，其特征在于，该电聚合固定方法是在电极表面聚合一层聚吡咯，固定酶、金纳米颗粒及无机催化剂于聚吡咯层上。

6.根据权利要求5所述的检测农药的方法，其特征在于，该金纳米颗粒的浓度为0.5-2.0ppm。

7.根据权利要求1所述的检测农药的方法，其特征在于，该金纳米颗粒粒径为16.5-20nm。

8.根据权利要求1所述的检测农药的方法，其特征在于，该电极为白金电极。

9.根据权利要求1所述的检测农药的方法，其特征在于，其还包括使该样品与一温度感应器接触，检测该样品温度。

10.根据权利要求9所述的检测农药的方法，其特征在于，该电流信号以样品温度进行温度补偿处理。

11.根据权利要求1所述的检测农药的方法，其特征在于，该农药为有机磷或氨基甲酸盐。

12.根据权利要求9所述的检测农药的方法，其特征在于，该电极与温度感应器设置在一平板上。

13.一种生物微传感器，其特征在于，包括：

至少一电极，用以检测电流信号；

一处理单元，用以接收处理该电流信号，且转换该电流信号成为一浓度数据；以及

一显示单元，用以显示该浓度数据；

其中该电极表面以酶、金纳米颗粒以及无机催化剂固定。

14.根据权利要求13所述的生物微传感器，其特征在于，该酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶。

15.根据权利要求13所述的生物微传感器，其特征在于，该无机催化剂为普鲁士蓝。

16.根据权利要求13、14或15中任一项所述的生物微传感器，其特征在于，该电极表面是以电聚合方法固定。

17.根据权利要求16所述的生物微传感器，其特征在于，该电聚合固定方法是在电极表面聚合一层聚吡咯，固定酶、金纳米颗粒及无机催化剂于聚吡咯层上。

18.根据权利要求17所述的生物微传感器，其特征在于，该金纳米颗粒浓度为0.5-2.0ppm。

19.根据权利要求13所述的生物微传感器，其特征在于，该金纳米颗粒粒径为16.5-20nm。

20.根据权利要求13所述的生物微传感器，其特征在于，该电极为白金电极。

21.根据权利要求13所述的生物微传感器，其特征在于，其还包含一温度感应器，用以检测温度并传送至该处理单元。

22.根据权利要求21所述的生物微传感器，其特征在于，该电流信号以该检测温度进行温度补偿处理。

23.根据权利要求13所述的生物微传感器，其特征在于，该生物微传感器用于检测农药。

24.根据权利要求23所述的生物微传感器，其特征在于，该农药为有机磷或氨基甲酸盐。

25.根据权利要求21所述的生物微传感器，其特征在于，该电极与温度感应器同时在一平板上。

26.一种降低电流噪声的方法，其特征在于，该方法包括将金纳米颗粒及无机催化剂固定在一电极表面，其中该电极表面有酶固定。

27.根据权利要求26所述的降低电流噪声的方法，其特征在于，该无机催化剂为普鲁士蓝。

28.根据权利要求26所述的降低电流噪声的方法，其特征在于，该金纳米颗粒粒径为16.5-20nm。

29.根据权利要求26所述的降低电流噪声的方法，其特征在于，该金纳米颗粒浓度为0.5-2.0ppm。

30.根据权利要求26所述的降低电流噪声的方法，其特征在于，该电极表面是以电聚合方法固定金纳米颗粒及无机催化剂。

31.根据权利要求30所述的降低电流噪声的方法，其特征在于，该电聚合固定方法是在电极表面聚合一层聚吡咯，使金纳米颗粒及无机催化剂固定于聚吡咯层上。

32.根据权利要求26所述的降低电流噪声的方法，其特征在于，该酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶。

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