CN1978634A - 一种禽流感病毒h5亚型乳胶凝集检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种禽流感病毒h5亚型乳胶凝集检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测H5亚型禽流感病毒的乳胶凝集试剂盒。利用水溶性碳化二亚胺将抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体偶联到羧化聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，建立了H5亚型禽流感病毒乳胶凝集检测方法，再辅以其它配套试剂制备了禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒。禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒由盒体和设在盒体内的乳胶诊断试剂、样本处理液A，样本处理液B，阳性对照样品和阴性对照样品组成。本发明制备的试剂盒能够直接对H5亚型禽流感病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、操作简便和诊断快速等显著优点。

Description

一种禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于禽类免疫学技术领域，具体地，本发明涉及适用于一种禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒的研制及其在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。
背景技术
众所周知，H5N1亚型高致病性禽流感是一种严重危害养禽业和危及人类健康的烈性传染病。1997年“香港禽流感”事件是第一次禽流感直接跨种传播给人，2004年的东南亚禽流感，更加引起全世界对禽流感跨种传播的极大关注。我国2004年也有16个省市50个疫点也大面积暴发了禽流感疫情，引起了我国养禽业的重大损失。2005年7月份以来，东南亚的越南、泰国、柬埔寨、印尼、菲律宾和中国，欧洲的希腊、罗马尼亚、克罗地亚、英国、瑞典和俄罗斯相继报道了H5N1亚型高致病性禽流感的发生。H5N1亚型高致病性禽流感随着候鸟的迁移已成世界分布。据世界卫生组织(WHO)2005年10月24日公布的人类感染H5N1禽流感病例，自2003年底以来，共有121件病例，62人死亡。
目前，检测禽流感的病原学方法主要有病毒的分离鉴定、中和试验(SN)、琼脂扩散试验(AGP)、RT-PCR、免疫荧光试验(IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。病毒的分离鉴定是检测AIV的最根本、最经典的方法，但该方法存在着固有的一些不足之处，比如操作相对繁琐、需要的时间长，容易受到污染以及生物安全性等问题。中和试验比较烦琐，而且需要很有经验的人员来操作。琼脂扩散和免疫荧光试验在敏感性和特异性方面都不尽人意，且田间样本复杂多变，干扰大，样本处理难，使得这些方法在临床检测中的应用受到一定限制。酶联免疫吸附试验虽然相对容易一些，但仍然需要一定的仪器设备和操作技能。乳胶凝集试验(Latex Aagglutination Test，简称LAT)由于其迅速、简单和无须专门的技能和任何特殊仪器设备而具有巨大的优势。
从上个世纪中叶聚苯乙烯乳胶颗粒开始用做凝集试验的材料以来，由于其所具有的独特优点，如：操作简便，不需要特殊的仪器，肉眼判断，也不需要对操作过程进行培训；时间短，一般在2分钟之内可以出结果；价格低廉，检测单份样品比其它血清学、病原学方法便宜得多；适合于现场检测等，在临床检验中得到了广泛的应用。其意义有：①传染性疾病的诊断：细菌、真菌、寄生虫、立克次体、病毒的感染检测；②自身免疫病诊断：如抗核抗体、类风湿因子等检测；传统的乳胶凝集试验(LAT)是以惰性聚苯乙烯胶乳颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到相应的抗体和抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。在应用乳胶凝集技术建立病原学检测方法时，一般是将特异性抗体致敏到乳胶颗粒表面，普通聚苯乙烯胶乳和抗体的结合为无选择性的物理静电吸附，由于抗体的分子量小，很难结合到乳胶表面，即使致敏上的抗体也容易从乳胶颗粒上脱落或者变性失活，导致致敏好的乳胶试剂保存期短，难以适合产品开发的需要。为此，本申请人以带有羧基基团(-COOH)的羧化聚苯乙烯胶乳为载体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺(EDAC)为介质，经化学反应将抗体(IgG)分子偶联到乳胶表面。本发明的方法克服了普通乳胶致敏抗体时，致敏量少，不稳定，抗体容易脱落等缺点，提高了抗体的结合效率，而且致敏上的抗体不容易从乳胶颗粒上脱落，进而提高乳胶的敏感性和保质期，适合了产品开发和大规模生产的要求。
发明内容
本发明的第一个目的是得到一种特异性强的可用于组装检测试剂盒的核心试剂的抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。
本发明的第二个目的是组装一种用于适用于检测H5亚型禽流感病毒的乳胶凝集试剂盒。
本发明的第三个目的是试剂盒在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。
本发明的总体技术路线图见图1所示。
本发明是这样实现的：
本申请人制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJLXB-1已于2005年11月28日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-C200518。申请人利用所述的单克隆抗体制敏羧化聚苯乙烯胶乳得到乳胶诊断试剂，并以该乳胶诊断试剂为核心试剂组装了一种用于快速检测H5亚型禽流感病毒的乳胶凝集试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的乳胶诊断试剂、样品处理液A，样品处理液B，阳性对照样品和阴性对照样品组成。
所述的样品处理液A和B的组分及含量按重量/体积为：
样品处理液A
Na2B4O7·10H2O    13.3g/L
H3BO3             16.08g/L
NaCl               8.5g/L
补充蒸馏水至1L。
样品处理液B
Na2B4O7·10H2O       13.3g/L
H3BO3                16.08g/L
NaCl                 8.5g/L
N-乙酰-L-半胱氨酸    5g/L
Nonidet P-40(NP-40)  5ml/L
补充蒸馏水至1L。
所述的阳性对照样品是禽流感H5亚型血凝素蛋白    0.5ml/管；
所所述的阴性对照样品是鸡胚尿囊液              0.5ml/管。
本发明制备了1株分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJLXB-1，该杂交瘤细胞株保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-C200518。
显而易见，本发明制备的试剂盒适用于在检测禽流感病毒上的应用，特别是在检测H5亚型高致病性禽流感病毒上的应用，其中的应用包括制备一种适用于禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒的应用。
本发明的检测试剂盒能直接对样本中的H5亚型禽流感病毒进行检测。若样本中含有H5亚型禽流感病毒，则乳胶试剂在30秒内出现明显均匀一致的凝集，即可判为阳性结果；若样本中不含有H5亚型禽流感病毒，则乳胶试剂在30秒内液滴仍然呈原有的均匀乳状，即可判为阴性结果。
与现有技术相比本发明具有如下优点：
1、本发明的试剂盒能直接对H5亚型禽流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(30秒之内出结果)，检测样品范围宽(鸡胚尿囊液、喉头拭子和各种内脏组织)的特点；
2、本发明的试剂盒适用于对H5亚型禽流感病毒进行检测，而对其它亚型的禽流感病毒(H1-H4，H6-H15)具有特异性。
3、本发明的检测方法不需要任何特殊仪器、设备，具有检测成本低的特点。试剂盒操作简便，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒保存期长，在4℃条件下放置半年不会影响其敏感性。
附图说明
图1：是本发明总体技术路线图；
图2：表达蛋白的Westem-blotting检测
图3：是未转染的SF9细胞形态
图4：是转染了重组Bacmid发生病变的细胞
具体实施方式
实施例1抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
1、单克隆抗体的制备
参照薛庆善，《体外培养的原理与技术》，科学出版社，2001年版中的方法：以禽流感H5亚型油乳剂灭活苗(购自中国哈尔滨维科生物技术开发公司生产)为抗原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)，免疫程序是选4只BALB/c小鼠进行免疫，剂量为200ul/只，每只小鼠颈背部皮下多点注射。二周后用相同剂量加强免疫一次，二周后再加强免疫一次，剂量为400ul/只，间隔四周后于小鼠腹腔注射400ul抗原。三天后取其脾细胞按实验室常规方法进行融合。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞购自卫生部武汉生物制品所)按1～2×107个SP2/0与108个免疫细胞(1∶10～1∶15)的比例于50mL离心管中混匀，1500r/m，离心10min。倒净上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL(购自sigma公司产品)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌1min。然后慢慢加入37℃预温的1640(购自sigma公司商业培养基)基础液10mL。具体步骤为：第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3～4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL 1640液，也需慢慢加入。800r/m离心5min，去上清，于37℃放置5～8min。用HAT(购自Sigma公司商品培养基)培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μL/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察有无污染，于第4天补加1滴HAT培养基，第8～10天吸去100μL培养基换HT(购自sigma公司)培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体效价检测。采用购自哈尔滨维科生物技术开发公司的禽流感H5 HI抗原作为筛选抗原，利用HI(血凝抑制)方法筛选出分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(参照薛庆善，《体外培养的原理与技术》，科学出版社，2001年版)进行克隆、筛选。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆杂交瘤细胞株。
2、单克隆抗体的鉴定
(1)HI效价的鉴定
采用购自哈尔滨维科生物技术开发公司的禽流感H5 HI抗原作为抗原用血凝抑制的方法测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价，其中杂交瘤细胞系96孔细胞培养板细胞培养上清HI效价为27，Balb/C小鼠腹水HI效价为218。
(2)Ig亚类(型)的鉴定
用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行鉴定，所得的单克隆抗体抗体经鉴定为IgG 2a亚类。
(3)特异性鉴定
用血凝抑制试验分别测定单克隆抗体与禽流感H9 HI抗原、禽流感H7 HI抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)，NDV、IBV、及阴性尿液的交叉反应，结果均为阴性，说明获得的单克隆抗体具有很好的特异性。
(4)染色体计数
按常规方法进行杂交瘤染色体计数，所有获得的杂交瘤细胞染色体众数位于85-97之间(SP2/0骨髓瘤细胞染色体众数为70，Balb/c鼠脾细胞染色体数为40)，均高于两亲本细胞的染色体数目，证明所有获得的杂交瘤细胞确为SP2/0细胞与免疫脾细胞的杂合体。
经过对单克隆抗体的鉴定，确定筛选出的该单克隆杂交瘤细胞系所分泌的抗体为抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，申请人将其命名为ZJLXB-1，并于2005年11月17日送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC-C200501。
3、单克隆抗体的纯化
参照朱立平等，《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社2000版中的方法：取所得的小鼠腹水5ml与等体积的二氧化硅混合，加入等体积的巴比妥缓冲液，室温振荡1h后，室温静置30min，取上清于洁净离心管中，4℃，3000r/m离心10min；取上清液8ml，加入16ml 0.06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4.5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132μl后，室温搅拌30min，然后转入4℃冰箱充分沉淀2h，4℃，15000r/m离心30min，得上清液22ml，加入2.2ml 0.1M的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/ml，4℃冰箱充分沉淀2h后，4℃，12000r/m离心30min，弃上清，沉淀用5ml 0.1M的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000ml 0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析后，再对2000ml蒸馏水透析，最后对3000ml三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)浓缩至3ml，然后4℃，12000r/m离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为1.6mg/ml。经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为98％。
实施例2禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测方法的建立
取125μL 10％羧化乳胶放入EP管中，pH9.6，0.1M碳酸缓冲液洗3遍，再用pH4.5，0.01M磷酸缓冲液选3遍，然后加入0.5％的水溶性碳化二亚胺在磷酸缓冲液中室温(25℃)作用4h，后用pH8.5，0.01M硼酸缓冲液洗3遍，将乳胶用1ml硼酸缓冲液悬浮后加入适量的IgG致敏一定时间后加入终止剂终止反应。
其具体步骤如下：
1、最佳偶联IgG量的确定
在1mL硼酸缓冲液悬浮的羧化乳胶中，分别加入不同量的IgG，从200μg、400μg、600μg递增至1800μg，收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，计算IgG的偶联效率，公式如下：
IgG的偶联效率(％)＝(IgG的初始加入量-剩余的IgG量)/IgG的初始加入量×100％
经试验验证，在1mL浓度为1％的羧化乳胶中，当加入的IgG量为800-1000μg时，偶联效率达到最大，此时乳胶检测的灵敏度最高，稳定性最好。具体结果见表1：
表1不同IgG加入量时的偶联效率
    IgG的初始加入量(μg)    偶联到乳胶上的IgG量(μg)     偶联效率(％)
    200400600800     62148276520     31374665
    10001200140016001800     690648700672684     6954504238
2、最佳偶联时间的选择
在1mL硼酸缓冲液悬浮的羧化乳胶中，加入1000μgIgG，在室温作用不同的时间(0.5、1、2、4、，6、8、10、12、14h)，作用完后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，计算IgG的偶联效率，公式如下：
IgG的偶联效率(％)＝(IgG的初始加入量-剩余的IgG量)/IgG的初始加入量×100％
经试验验证，当偶联时间达到8h时，偶联到乳胶微球上的IgG量基本上不再变化，此时偶联效率达到最大，所以选用8h作为最佳偶联时间。具体结果见表2：
表2不同致敏时间时的偶联效率
  偶联时间     IgG的初始加入量(μg) 偶联到乳胶上的IgG量(μg) 偶联效率(％)
  0.5h1h2h4h6h8h10h12h14h     100010001000100010001000100010001000     325283410520640690690700695     32.528.341526469697069.5
3、偶联反应终止剂的选择
抗体与乳胶微球过度偶联会导致抗体失活，从而降低抗体-微球基质与抗原结合的能力。所以需要在反应体系中引入其它氨基基团以终止偶联反应。在本发明中所述的终止剂为乙醇胺或甘氨酸。经大量试验验证用乙醇胺作终止剂的效果要好于甘氨酸，因此本发明优选用乙醇胺作为终止剂，所用的浓度为0.1M，使用的剂量为1mL浓度为1％的羧化乳胶中加入50μL 0.1M乙醇胺，反应时间为15min。
实施例3禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒阳性对照的制备
选用在昆虫细胞SF9中的表达的H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白作为试剂盒的阳性对照样品。将H5亚型禽流感病毒的血凝素基因克隆到杆状病毒BAC TO BAC表达系统中的Pfastbac质粒中，构建了Pfastbac-HA中间转移质粒。在大肠杆菌DH10BAC中，使Pfastbac-HA与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(ACNPY)基因组(BACMID)发生细菌内同源重组，从而获得包含有完整HA基因的重组穿梭载体，并转染SF9细胞获得重组杆状病毒ACNPY-HA.，经SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析可见70kd左右大小的带，表明血凝素基因在昆虫细胞中获得了表达。红细胞凝集试验和间接免疫荧光试验进一步证明表达产物具有良好的血凝活性和免疫原性，可以作为试剂盒的阳性对照样品。其具体制备步骤如下：
1、Pfastbac-HA中间转移质粒的构建
根据Genebank收录的H5N1亚型禽流感病毒(在Genebank网站中点击：A/chicken/Hubei/489/2004)分离株血凝素基因序列设计并合成一对引物，该引物的序列如下：P1：TT ACT AGT ATG GAG AAA ATA GTGC；P2：GC AAG CTT TTA AAT GCA AAT TCT G，进行PCR反应(具体操作步骤参考：Sambrook J，Fritsch EF等Molecular Cloning：A Laboratry Manual.，New York，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)。用speI+HindIII分别双酶切PCR产物和pfast bac I载体(购自Invitrogen公司)，分别得到大小为1.7kb与0.4kb大小的片断，经连接反应后，转化大肠杆菌DH5a即获得命名为Pfastbac-HA质粒。
2、HA基因的转座和蓝白斑筛选
按常规方法(具体步骤参考Sambrook J，Fritsch EF等Molecular Cloning：A LaboratryManual.，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Ptess，2001)制备DH10BAC感受态细胞(购自Invitrogen公司)，将Pfastbac-HA质粒转化DH10BAC感受态细胞，并将转化产物以10-1，10-2，10-3不同稀释度涂布三抗平皿，该平皿提前30min涂布25mg/ml x-gal(英文名称是：B-casomorphin fragment1-5*hydrochloride bovine B-casomorphin fragment 1-5*hydrochloride bovine)40ul和200ug/ml的IPTG(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)5ul，由于携带有HA基因的表达盒插入LacZ基因使其失活而呈现白色菌落。挑选白色菌落并经过三轮蓝白斑纯化后，依据bac-to-bac手册(由Invitrogen公司提供，一种在公共生物技术实验室广泛散发的宣传手册)提取bacmid(一种杆状病毒基因组)，并进行PCR鉴定。转化产物以10-2稀释度涂布平皿可见均匀的蓝白斑，挑取菌落形态较大的白色菌落，划线纯化三次，进行PCR鉴定。
3、重组病毒的获得以及蛋白的表达
SF9细胞(购自中国典型培养物保藏中心)使用前一天传代，待细胞融合率达60％-70％时，小量制各重组Bacmid-HA DNA，经过脂质体介导直接转染SF9细胞，并以正常细胞作为对照。每日观察细胞形态，如果细胞4-5天后长满单层后仍不发生明显细胞病变，收取培养上清液并继续传代，至细胞发生病变。收取病变三天后的细胞培养上清液和病变细胞。由于AcNPY多角体基因被破坏，因此转座后得到的重组Bacmid不能表达多角体蛋白。细胞培养至第五天在显微镜下出现明显的病变(Cytopathic effect，CPE)，参见图3、图4所示，细胞变大，特别是细胞核膨大，在细胞内可见许多折光性强的不规则颗粒。收取培养上清液并离心除去细胞碎片，保存至-80℃即为重组杆状病毒ACNPY-HA(该病毒是本领域技术人员按照本发明的制备方法都可以实现)。
4、表达蛋白的鉴定
将收集的ACNPY-HA病毒感染SF9细胞，并同时设立野毒对照。收集感染后的72h的病变细胞，经SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色出现一条约70KD左右的带，与血凝素基因所表达蛋白分子量一致。按常规方法(参见：Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratry Manual，NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)进行Western-blotting检测，以抗H5亚型血凝素基因单克隆抗体作为一抗，羊抗鼠IgG酶标抗体作为二抗进行检测，在70KD处出现特异型条带，对照野毒感染细胞后没有此带(如附图2所示)。结果表明：血凝素基因获得了表达，并且可与抗禽流感血凝素基因单克隆抗体发生反应。
5、试剂盒阳性对照样品的制备
将重组病毒AcNPY-HA感染SF9细胞2000ml，感染后72h收集病变细胞，pH7.4；用0.01M PBS洗涤两次后用40ml PBS悬浮，于-20℃反复冻融2次，4℃，12,000r/min离心30min后收取上清作为阳性对照样品，分装到1.5mlEP管中，分装量为0.5ml/每管，于-80℃下保存。注意避免反复冻融和污染。
6、阳性对照的效价测定
取阳性对照样品用禽流感病毒H5 HI抗原进行血凝试验，在本发明中，血凝价达到1∶128定为合格。实施例4禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒的敏感性试验和特异性试验
1、敏感性试验
将禽流感各亚型(H1～15)尿囊液病毒倍比稀释，分别用致敏好的乳胶诊断试剂检测，发现可与1∶64稀释的H5亚型禽流感病毒尿囊液反应(+++)，达到了较好的敏感性(该试验结果由中国国家禽流感参考实验室验证)。结果见表3
表3敏感性试验(n＝5)
稀释度 AIV 尿囊液原毒(HA效价28) 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128
检测结果   H1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15     ----++++----------   ----++++----------   ----++++----------    ----++++----------   ----++++----------   ----++++----------   ----+++----------   -------------
注：：“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；
“++”约50％乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“+”有少许凝集，液体呈混浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状。
2、特异性试验
致敏好的乳胶试剂与H5亚型禽流感病毒反应呈强阳性，与鸡主要的呼吸道病毒如：鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(52、120株)、鸡减蛋综合症病毒(EDSV-76)、禽副粘病毒2型(PMV-2)、SPF鸡胚尿囊液均不反应，达到了较好的特异性。结果见表4。
表4特异性试验(n＝5)
  病毒种类   EDSV-76  NDV  IBV-120   IBV-52   IBDV  PMV-2 阴性尿囊液
  检测结果   -  -  -   -   -   -   -
实施例5禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒的重复性试验
1、批内重复性试验
制备3批禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒(试剂盒批号分别为0411、0412、0413)，每批次20个，在每批次试剂盒中随机抽取3个试剂盒对阳性对照样品、阴性对照样品、灭活的H9N2亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒(NDV)进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本LAT方法的批内重复性良好。其检测结果见表5、6、7所示：
表5批内重复试验(试剂盒批号0411)
  试剂盒编号   阳性对照样品   阴性对照样品     H9N2 AIV   NDV
  0411-02   ++++   -     -   -
  0411-11   ++++   -     -   -
  0411-16   ++++ - - -
表6批内重复试验(试剂盒批号0412)
  试剂盒编号   阳性对照样品   阴性对照样品    H9N2 AIV   NDV
  0412-04   ++++       -       -   -
  0412-12   ++++       -       -   -
  0412-19   ++++       -       -   -
表7批内重复试验(试剂盒批号0413)
  试剂盒编号   阳性对照样品   阴性对照样品    H9N2 AIV   NDV
  0413-06     ++++       -       -   -
  0413-07     ++++       -       -   -
  0413-09     ++++       -       -   -
2、批间重复性试验
在不同时间制备3批禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒(试剂盒批号分别为0411、0412、0413)，对同一份对阳性对照样品、阴性对照样品、灭活的H9N2亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒(NDV)进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本LAT方法的批间重复性良好。检测结果如表8所示。
表8批间重复试验
  试剂盒编号   阳性对照样品   阴性对照样品    H9N2 AIV   NDV
  0411     ++++      -       -   -
  0412     ++++      -       -   -
  0413     ++++      -       -   -
实施例6禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒的保存期试验
1、高温对试剂盒的破坏作用(37℃下作用3天)
将3个不同批次的禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒于37℃下作用3天后，与保存在4℃的同批试剂盒同时检测标准阴性、阳性对照，结果(如表9所示)表明高温(37℃作用3天)对试剂盒的破坏作用不足于破坏其稳定性。
表9高温(37℃作用3天)对试剂盒的破坏作用
    批号     0411     0412     0413
37℃   阳性对照阴性对照     ++++-     ++++-     ++++-
4℃   阳性对照阴性对照   ++++-   ++++-   ++++-
2、试剂盒的保存期实验(4℃)
将同一批致敏的乳胶试剂分装成小份，分别在4℃和室温下保存1至9个月，每月定期进行LAT试验，分别与阳性对照样品、阴性对照样品、灭活的H9N2亚型禽流感病毒和新城疫病毒(NDV)反应，观察其敏感性、特异性和稳定性，以确定乳胶试剂的保存期。在本试验中，申请人制备了三个批次的乳胶诊断试剂(批号0411、0412、0413)，同时进行平行试验。通过本试验，乳胶试剂经4℃保存6个月以上其特异性，稳定性、敏感性均不发生改变。结果见表10，11，12：
表10乳胶诊断试剂保存期试验(批号0411)
样品     阳性对照样品     阴性对照样品     H9N2AIV     NDV
时间 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月
结果 # # # +  -  -  -  -  -  -  - -  -  -  -  -
注：“#”表示“++++”的凝集程度
表11乳胶诊断试剂保存期试验(批号0412)
样品     阳性对照样品     阴性对照样品     H9N2AIV     NDV
时间 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月
结果 # # # +  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -   -
注：“#”表示“++++”的凝集程度
表12乳胶诊断试剂保存期试验(批号0413)
样品     阳性对照样品     阴性对照样品     H9N2AIV     NDV
时间 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月 1月 3月 6月 9月
结果 # # # +  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -
实施例7禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒对试验感染H5亚型禽流感病毒动物不同样本的检测
1、动物感染试验方案
动物试验均在生物安全三级实验室(PIII)的小动物房中的鸡高效隔离器中进行，所有的淘汰动物都经焚尸炉焚烧处理。
1)试验材料禽流感病毒H5亚型毒株由华中农业大学提供(GeneBank登录号：AY684708.1)，由于生物安全的原因由华农业大学动物医学院动物病毒室(本申请单位的发明人)专用保藏室在严格的措施下保藏，该材料仅仅限于对本发明的生物试验效果进行平行评价，不涉及本发明的本身的核心技术和材料(产品)的构建，也不涉及环境释放和对外发放。
2)试验方案：实验前测定所有鸡血清抗体对H5亚型禽流感病毒的血凝抑制(HI)效价，根据Ab水平分为3类：Ab水平＞25为I类，Ab水平≤25为II类，Ab水平完全阴性的为III类。攻毒时，同时平行设100EID50、10EID50、1EID50和0.1EID504个攻毒剂量，每个剂量组12只，其中I类、II类、III类各4只。与100EID50攻毒鸡混合饲养但不攻毒的鸡有8只，其中I类、II类各4只。攻毒方式为胸部肌肉注射0.3mL/只。
2、攻毒后鸡的死亡情况
如表13所示：
表13感染鸡死亡情况
攻毒剂量100EID5010EID501EID500.1EID50不攻毒，混群饲养 攻毒前的Ab   样本     攻毒后一定时间内仍存活的鸡的数量(只)
  效价(HI)   数量  24h  36h  48h   60h   72h  96h   6d  30d
  ＞25≤25-＞25≤25-＞25≤25-＞25≤25-＞25≤25     44444444444444   44444444444444   00011234343444 10134243444 1134243324 0132243312 032143010 31O431 31431
从表13中可以看出，攻毒后，最早的鸡在24小时之内死亡，最慢的鸡在30天之后仍然存活。当攻毒鸡的Ab水平大于25时，可以抵抗1EID50和0.1EID50的攻毒剂量：小于25时，只能抵抗0.1EID50的攻毒剂量，Ab水平完全为阴性的鸡不能抵抗H5N1高致病性禽流感病毒的攻击。没有攻毒但和100EID50攻毒鸡混群饲养的鸡在96小时之内的死亡率达到了87.5％。
3喉头拭子的检测结果结果见表14：
表14喉头拭子的检测结果
攻毒剂量   抗体效价  攻毒后取样时间   样本数量   阳性结果 阴性结果     检出率
喉头拭子 100EID5010EID501EID500.1EID50不攻毒，混群饲养   ＞25≤25＞25≤25＞25≤25≤25≤25＞25≤25   12h-36h12h-36h12h-48h12h-36h12h-30d12h-30d12h-30d12h-30d12h-30d12h-96h   121113127251117844525   7598584084623016   564414143322159     58.3％45.5％69.2％66.7％80.5％78.4％71.8％73.8％66.7％64％
从表14中可以看出，申请人制备的乳胶试剂可以从攻毒鸡的喉头拭子中检测出H5N1禽流感病毒。攻毒后12h后即可以检测出禽流感病毒，而且从攻毒30d后仍未死亡的鸡的喉头拭子中也可以检测到禽流感病毒，当攻毒剂量为1EID50时，检出率相对较高，分别达到了80.5％和75.4％。攻毒剂量为100EID50时，检出率最低，仅有45.5％。另外，从自然感染鸡的喉头拭子中也可以检测出H5N1禽流感病毒，平均检出率为65.4％。
4、各组织、脏器的检测结果结果见表15：
表15各组织脏器的检测结果
心脏 肝脏 脾脏 肺脏 肾脏 胰脏 泄殖腔    胸部肌肉
    总样本数LAT阳性结果检出率     562341.1％  565089.3％  565089.3％    565496.4％   565191.1％   564580.4％     561025％     5600％
从表15中可以看出，申请人制备的乳胶试剂可以从攻毒鸡的组织脏器中检测出H5N1禽流感病毒，其中肺脏的检出率最高，可以达到96.4％，其次是肾脏，脾脏、肝脏、胰脏的检出率相当，从胸部肌肉中则检测不出来。
实施例8禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒对试验感染禽流感病毒其它亚型(例如H9，H1，H3，H4型)动物不同样本的检测
1、动物感染试验方案
动物试验均在通过验收许可的具有负压装置的小动物房中的鸡高效隔离器中进行，所有的淘汰动物都经焚尸炉焚烧处理。
1)禽流感病毒毒株类型：H9N2尿囊液原毒(HA效价210)；H1N1尿囊液原毒(HA效价210)；H3N2尿囊液原毒(HA效价211)；H4N6尿囊液原毒(HA效价211)；NDV尿囊液原毒(HA效价28)；。
2)试验方案：实验前测定所有鸡的血凝抑制(HI)效价，选取抗体水平为阴性的鸡120只进行攻毒试验。试验分为H9N2、H1N1、H3N2、H4N6四个人工感染组，每组30只，同时平行设1000EID50、100EID50、10EID50、1EID50和0.1EID505个攻毒剂量，每个剂量组6只。攻毒方式为胸部肌肉注射0.3mL/只。
2、试验样本检测结果结果见表16：
表16试验样本检测结果
禽流感病毒类型     H9N2     H1N1     H3N2     H4N6
  总样本数  阳性结果  阳性率   总样本数   阳性结果   阳性率   总样本数   阳性结果   阳性率   总样本数   阳性结果   阳性率
喉头拭子 106 0 0％ 106 0 0％ 106 0 0％ 106 0 0％
心   30  0  0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
肝   30  0  0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
脾   30  0  0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
肺   30  0  0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
肾   30  0  0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
胰脏   30  0  0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
 泄殖腔   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
 肌肉   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％   30   0   0％
四个不同亚型的流感病毒对鸡的致病力相当，当攻毒剂量为1000EID50时，第3天有4只鸡死亡，死亡率为3.3％(4/120)，但其它的鸡都能够耐过并且表现出良好的精神状态，直到20天时鸡只仍然没有出现死亡，20天后申请人将所有存活的鸡处死并收集内脏组织进行LAT检测。从表16中可以看出，申请人制备的乳胶试剂具有很好的特异性，对四个亚型的禽流感病毒检测结果均为阴性。
3、阴性符合率
用于实验的80份阴性喉头拭子和15份内脏组织均采自SPF鸡，病毒分离鉴定的结果均为阴性，结果见表17：
表17阴性符合率检测结果
数量   病毒分离鉴定阴性结果     LAT阴性结果 阴性符合率
    喉头拭子心脏肝脏脾脏肺脏肾脏胰脏泄殖腔胸部肌肉     801515151515151515     801515151515151515     801515151515151515     100％100％100％100％100％100％100％100％100％
从表17中可以看出，对于不带毒的健康鸡的样本，检测结果其阴性符合率分别达到100％，基本上消除了由样本中的杂质所引起的非特异性凝集。
4、新城疫病毒(NDV)感染鸡LAT检测结果
用新城疫尿囊液病毒(HA211)攻毒20只鸡，胸部肌肉注射尿囊液原毒0.5mL。由表18的结果可以看出，其特异性符合率达到了100％。
表18新城疫病毒(NDV)感染鸡LAT检测结果
   数量   病毒分离鉴定阳性结果     LAT阳性结果 特异性符合率
    喉头拭子心脏肝脏脾脏肺脏肾脏胰脏泄殖腔胸部肌肉     202020202020202020     202020202020202020     000000000     100％100％100％100％100％100％100％100％100％
实施例9禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒与病毒鸡胚分离的比较
1、检测样本：将2003-2004年爆发的H5亚型禽流感期间临床收集并由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保存。
2、禽流感H5亚型乳胶凝集试剂盒与病毒分离鉴定的比较结果
将临床收集的组织病料(心、肝、脾、肺、肾、气管、泄殖腔)做乳胶凝集检测和鸡胚分离，结果见表19。各组织样品乳胶凝集的检出率为50-100％。其中泄殖腔的检出率最低为50％，肝、脾、肺、肾的检出率最高为100％。而病毒鸡胚分离检出率均为100％。结果见表19，20
表19临床收集的组织病料的乳胶凝集检测和鸡胚分离结果
   心脏   肝脏   脾脏   肺脏   肾脏  泄殖腔   气管
 总样本数病毒分离鉴定阳性结果乳胶凝集阳性结果乳胶凝集检出率符合率     70161275％75％   712626100％100％   712525100％100％   853131100％100％   853131100％100％   604250％50％   5812758.3％58.3％
表20禽流感H5亚型乳胶凝集试剂盒与病毒分离鉴定的比较结果(符合率为97.8％)
    病毒分离     禽流感H5亚型乳胶凝集试剂盒的检测结果
    鉴定结果阳性阴性总数     阳性1340134     阴性11355366     总数145355500
3、结果分析
将禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒与病毒的鸡胚分离作比较，检测2003-2004年爆发H5亚型禽流感期间收集的各种病料共500份，通过鸡胚分离鉴定，145份为阳性，355份为阴性。禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒检出134份阳性，366份阴性。阳性检出率为93.1％，符合率为93.1％。阴性检出率为100％，符合率为97％。总符合率为97.8％。
实施例10禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒与禽流感H5亚型快速诊断试纸条的比较
1、敏感性比较
将禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒阳性对照样品做倍比稀释后同时用禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒和禽流感快速诊断试纸条检测，结果(表21)表明禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒和禽流感快速诊断试纸条的敏感性相当。
表21敏感性比较结果
  H9N2 AIV     1∶2     1∶4     1∶8     1∶16     1∶32     1∶64     1∶128
  乳胶凝集     +     +     -     -     -     -     -
  试纸条     +     +     -     -     -     -     -
2、特异性比较
使用禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒和禽流感快速诊断试纸条同时检测禽流感病毒H9N2和一些主要致呼吸系统疾病的病原(新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒等)，检测结果均为阴性。说明两种方法均具有较好的特异性。见表22。
表22特异性检测结果
    病原乳胶凝集     H9N2 AIV-   NDV-   IBV-   ILTV-   IBDV-   EDSV-   APMV-1-
试纸条 - - - - - - -
3、符合率比较
使用禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒和禽流感H5亚型快速诊断试纸条同时检测107份临床组织样品，禽流感快速诊断试纸条共检测出阳性23份，阴性84份。禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒共检测出阳性20份，阴性87份。两者的符合率为97.2％。结果见表23。
表23LAT试剂盒与禽流感H5亚型快速诊断试纸条试剂盒的符合率比较结果(符合率为97.2％)
    免疫层析试纸条结果     LAT试剂盒的检测结果
阳性 阴性 总数
    阳性     20     3     23
    阴性     0     84     84
    总数     20     87     107
实施例11禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒的组装
1、禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测试剂盒包括：
1)乳胶抗原    1管(1ml/管)
2)阳性对照    1管(0.5ml/管)
3)阴性对照    1管(0.5ml/管)
4)样品处理液A 1瓶(100ml/瓶)
5)样品处理液B 1瓶(100ml/瓶)
2、相关溶液的配制
1)样品处理液A的配制：称取Na2B4O7·10H2O 13.3g，H3BO3 16.08g，NaCl 8.5g，ddH2O 800mL，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000mL。高压灭菌(121℃，30分钟高压蒸汽)后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织。
2)样品处理液B的配制：称取Na2B4O7·10H2O 13.3g，H3BO3 16.08g，NaCl 8.5g，ddH2O 800mL，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000mL。高压灭菌(121℃，30分钟高压蒸汽)后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。
3)阳性对照的配制：将重组病毒AcNPY-HA以5pfu感染SF9细胞2000ml，感染后72h收集病变细胞，pH7.4，0.01M PBS洗涤两次后用40ml PBS悬浮，于-20℃反复冻融2次，4℃，12,000r/min离心30min后收取上清后作为阳性对照样品，分装到1.5mlEP管中，分装量为0.5ml，-80℃下保存。注意避免反复冻融和污染。
4)阴性对照的配制：无菌收取SPF鸡胚尿囊液，4℃，12,000r/min离心30min后加入0.02％NaN3防腐。分装成0.5mL/管，置-20℃下贮存。
实施例12本发明试剂盒的使用方法
1、样品制备
1)临床鸡胚分离病毒尿囊液样本的处理方法：尿囊液样本于12000rpm离心5min取上清待检。
2)内脏组织检测样本的处理方法：称取内脏组织块0.5克，置于匀浆器中，加样本处理液A1ml，研磨完全后取出组织浸出液，冻融3遍，然后于4℃，12000rpm离心15min，取上清待检。
3)喉头拭子检测样本的处理方法：用无菌棉拭子于鸡喉头部沾取渗出液，然后浸泡于0.8ml样本处理液B中，在蜗漩仪上剧烈震荡1min后挤出棉拭子中的液体，弃棉拭子，液体部分冻融3次后于37℃温箱中作用15min，后于4℃，12000rpm离心15min，取上清待检。
2、检测
取检测样品、阳性对照、阴性对照各8-10μl，分置于玻璃片上，各加等量的乳胶，搅拌混匀，摇动30秒后观察结果。
3、结果判定
1)对照试验：30秒内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照与乳胶诊断试剂作用出现明显均匀一致的凝集，阴性对照与乳胶诊断试剂不凝集。
2)30秒内出现明显均匀一致的凝集者判为阳性，30秒内液滴呈原有的均匀乳状为阴性。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1、一种杂交瘤细胞株ZJLXB-1，其保藏编号为CCTCC-C200518。
2、一种能够专门识别H5型禽流感病毒的单克隆抗体。
3、包含权利要求2的检测试剂盒。
4、权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所说的试剂盒是检测H5型禽流感病毒的试剂盒。
5、权利要求3或4所述的乳胶凝集试剂盒，它包含盒体和设在盒体内的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂是能与H5型禽流感病毒特异反应的乳胶试剂，其它组分包括样品处理液A、样品处理液B、阳性对照样品和阴性对照样品。
6、权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的乳胶试剂是用杂交瘤细胞株ZJLXB-1制备腹水，从腹水中提取IgG，用该IgG制敏羧化乳胶得到的，所述的样品处理液A和B的组分及含量按重量/体积为：
样品处理液A
Na2B4O7·10H2O       13.3g/L
H3BO3                16.08g/L
NaCl                 8.5g/L
补充蒸馏水至1L；
样品处理液B
Na2B4O7·10H2O       13.3g/L
H3BO3                16.08g/L
NaCl                 8.5g/L
N-乙酰-L-半胱氨酸    5g/L
Nonidet P-40(NP-40)  5ml/L
补充蒸馏水至1L；
所述的阳性对照样品是禽流感H5型血凝素蛋白    0.5ml/管；
所述的阴性对照样品是鸡胚尿囊液              0.5ml/管。
7、权利要求3-6任一项的试剂盒在检测H5亚型禽流感病毒上的应用。
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