CN1977043B - 天然IgM抗体及其抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供天然IgM抗体的抑制剂，可用于治疗各种炎性疾病或病症。

Description

天然IgM抗体及其抑制剂

1、政府资助  本发明得到国家卫生研究院资金No.GM52585、GM24891和GM07560的政府资助。政府具有本发明的一定权利。 

2、相关申请的相互参照  本申请要求美国临时申请No.60/588648(申请时间为2004年7月16日)及美国临时申请No.60/549123(申请时间为2004年3月1日)的权益；每个临时申请均通过引用明确的结合至文中。 

3、发明背景 

有核细胞对低氧高度敏感，即使是多细胞组织内短时间的局部缺血也能显著影响细胞形态、基因转录及酶促过程。线粒体，作为氧代谢的主要部位，对氧浓度的变化尤其敏感，并且在缺氧期间释放活性氧中间体，对胞内组分如脂质和蛋白进行化学修饰。临床上这些效应表现为病人体内炎症应答。尽管对低氧的细胞应答进行了深入研究，但关于急性炎症的起始所知甚少。 

急性炎症应答可因多种疾病和自然出现事件如中风和心肌梗塞等引起。普通的医疗操作也可能导致局部和全身炎症。留下未处理的炎症可导致显著的组织损伤，还可能最终导致多系统衰竭并死亡。在损伤后干涉炎症应答可能是减少组织损伤的一种方法。 

炎性疾病及因组织损伤引起的急性炎症应答，却不能仅由细胞活动来解释。种种证据表明血清先天应答或补体系统在炎症中起主要作用。迄今的研究已经注意到因局部缺血以及再灌注而引起的组织损伤作为一类炎性病症是依赖补体的。例如，在再灌注损伤的鼠心肌模型中，用补体I型受体的可溶形式预处理的鼠，其损伤显著降低。了解补体激活如何促成炎症应答是有效的研究领域。 

炎性疾病或病症可能威胁生命、昂贵且每年影响许多人。因此，炎性疾病或病症的有效治疗是必需的。 

4、发明简述 

一方面，本发明的特征是分离的天然免疫球蛋白(IgM)。在一个实施方案中，抗体由ATCC检索号PTA-3507所产生。在另一个实施方案中，抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。还有一个实施方案中，抗体的重链可变区含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。 

另一方面，本发明的特征是IgM抑制剂及其药物制剂。在一个实施方案中，IgM抑制剂为特异结合天然IgM的肽，并因此阻碍其与抗原的结合及/或补体激活。在一个实施方案中，肽包括以下共有序列：xNNNxNNxNNNN(SEQ ID NO：14)。提供了特定的抑制肽为SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、34、36和38。可对抑制肽进行修饰，以提高如体内半衰期或生物利用度。也可对抑制肽进行标记以便于检测。 

还一方面，本发明鉴定的核酸编码特异结合天然IgM抗体的肽，以及表达该肽的载体和宿主细胞。提供了特定的核酸，为SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。 

再一方面，本发明的特征是受试者的炎性疾病的治疗方法为通过给予受试者含有这里公开的IgM抑制剂的药物组合物。 

还有一个方面，本发明的特征为检测、诊断或监测受试者的炎性疾病的方法是用标记的抑制抗体。 

基于以下发明详述和权利要求，本发明的其他特征和优点将会显现出来。 

5、附图简述 

图1显示了B-1杂交瘤22A5的IgM重链序列。(A)显示IgM^CM-22(或22A5 IgM)重链核酸序列(SEQ ID NO：1)，(B)显示重链序列SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：2)相应的氨基酸序列。框架区和  互补决定区(CDR)在核苷酸上标明。 

图2显示了B-1杂交瘤22A5的IgM轻链序列。(A)显示IgM^CM-22(或22A5 IgM)轻链核酸序列(SEQ ID NO：7)，(B)显示轻链序列SEQ ID NO：7(SEQ ID NO：8)相应的氨基酸序列。框架区和互补决定区(CDR)在核苷酸上标明。 

图3的条线图描述了近交系小鼠在肠内局部缺血和再灌注损伤后或无损伤(阴性)肠道通透性的改变。WT(野生型)代表亲系Cr2-/-小鼠。用混合的IgG或IgM或者对照盐溶液重新构建Cr2-/-。混合的IgM或IgG(0.5mg)在处理前约一小时静脉给予。数值为均值+标准差；n等于实验组中小鼠的数量。 

图4证明在抗体不足的小鼠(RAG-1)中，通过混合来自单个B-1细胞杂交瘤无性系的IgM进行I/R损伤的重建。在剖腹手术开始前静脉注射IgM或盐溶液30分钟。再灌注结束时，取血液并计算干燥肠与血液的¹²⁵I数量的比率作为通透性指数。数值表示为均值±标准差；n等于实验组所用小鼠数量。1＝WT加生理盐水；2＝RAG加生理盐水；3＝RAG加IgM杂交瘤CM-22；4＝WT阴性对照。 

图5是补体和补体受体在正向选择腹膜B-1淋巴细胞时计划作用的示意图。 

图6A是显示IgM^CM-22特异肽的M13噬菌体展示库的ELISA筛选图。标记：□-P1克隆；×-P2克隆；○-P7克隆；◇-P8克隆。在加入不同浓度的噬菌体克隆前平板上覆盖一层IgM^CM-22的溶液。所示结果为至少三次独立实验的代表性结果。 

图6B的条线图显示了合成肽P8抑制IgM^CM-22与噬菌体克隆P8的结合。加不同浓度的合成肽P8到IgM^CM-22覆盖的平板进行ELISA后，再加入5×10¹¹PFU的噬菌体。所示结果为至少三次独立实验的代表性结果。 

图6C的条线图显示了P8肽与IgM^CM-22的特异性结合。ELISA  平板包被了50μg/ml的P8肽溶液，随后加入IgM^CM-22或IgM^CM-75至1或10μg/ml。用生物素化的大鼠抗小鼠IgM，通过抗生物素蛋白链菌素-磷酸酶和颜色反应检测IgM的结合。所示结果为至少三次独立实验的代表性结果。 

图7A为一系列显微照片，显示P8肽阻断IgM^CM-22介导的体内损伤。上面两格(i和ii)所示为在分别单独使用IgM或IgM与P8肽混合物对RAG-1^-/-小鼠RI处理后而制备的切片(苏木精和伊红染色)。下面两格(iii和iv)所示切片制备于处理为肠再灌注损伤的野生型小鼠，再灌注前5分钟，给予小鼠盐溶液或P8肽。箭头指示损伤的病理特征。放大倍数为200× 

图7B的散布图指示每组处理动物的病理学评分均值。每个标记代表一个动物的评分。对照组为对照肽(ACGMPYVRIPTA；SEQ IDNO：61)预处理的WT小鼠，处理剂量与P8肽相似。^*指示对P8处理组与未处理组通过Student t检验确定的统计学显著性(p＜0.05)。 

图7C是一系列显微图片，显示P8处理动物的微绒毛内缺乏IgM和补体C3或C4。肠组织代表性的冷冻切片(cryosection)在肠RI后被获得。i-viii格为未经P8预处理(i-iv格)或P8预处理(v-viii格)的IgM^CM-22重建的RAG-1^-/-小鼠。各组代表的冷冻切片来自未经P8预处理的WT肠(ix-xii)或经P8预处理的肠(xiii-xvi格)。切片(i，iii，v，vii，ix，xiii，xv)用抗IgM生物素及随后的抗生物素蛋白链菌素-阿糖胞苷-568(红色)(Streptavidin-Alexa-568)染色并用DAPI(紫色)复染。各格(ii，x，xiv)用抗C4-阿糖胞苷-488/FITC(绿色)染色，各格(iv，viii，xii，xvi)用抗C3-FITC(绿色)染色。放大倍数为400×。 

图8A的免疫印迹显示再灌注损伤(RI)特异抗原的免疫沉淀。SDS-PAGE(10％)上检测到约250Kda的单带(箭头)。分子量标准示于左侧。肠裂解物制备自用IgM^CM-22重建的RAG-1^-/-小鼠，阴性对照(无局部缺血)或有局部缺血的小鼠随后都被再灌注0或15分  钟。 

图8B的一系列图片显示了IgM^CM-22与非肌球蛋白重链II(NMHC-II)同种型(isoform)的体外结合分析结果。ELISA板用针对三种不同的NMHC-II同种型的单克隆抗体包被(左上：同种型A，右上：同种型B，左下：同种型C，右下：抗泛肌球蛋白抗体(anti-panmyosin antibody))。肠裂解物中结合的肌球蛋白重链由IgM^CM-22或IgM^CM-31检测。结果显示为OD405nm的均值+标准差并代表三份样品。 

图8C是一副显微照片和一个散布图，显示在RAG-1^-/-小鼠中由抗泛肌球蛋白修复RI损伤。RAG-1^-/-小鼠用亲和纯化的抗泛肌球蛋白重建再施RI手术。左格显示用盐溶液对照和用抗泛肌球蛋白处理的RAG-1^-/-形态。右格是肠损伤的病理学评分。散布图(右格)显示病理学评分，其中每个标记代表一个动物。 

图9A的图显示自身肽N2的表面等离子体振子共振。自身肽N2样品的结合等温线，样品浓度从10.5μM至120μM，注射到IgM^CM-22 偶联的表面。 

图9B的图显示了对照肽的表面等离子体振子共振。同样大小、序列随机的对照肽(AGCMPYVRIPTA：SEQ ID NO：62)的结合等温线，对照肽以117μM浓度注射到IgM^CM-22偶联的表面。 

图9C的图显示与1∶1兰米尔(langmuir)结合等温线拟合至图9A所示注射用稳态响应水平的非线性曲线(χ²＝10)。 

图9D的图显示了注射120μM自身肽N2到偶联有对照IgM^CM-31 的表面的结合等温线。 

图10A是一系列显微图片，显示N2自身肽阻断RAG-1^-/-小鼠中的RI。上面两格显示用IgM^CM-22或与N2自身肽的混合物对RAG-1^-/- 小鼠RI处理后制备的代表性切片。下面两格的代表性切片是制备自处理为肠RI的WT小鼠，每只在再灌注前给予盐溶液或N2肽5分  钟。 

图10B的散布图显示每组处理动物的病理学评分的均值。每个标记代表一只小鼠。^*指示基于Student t检验的统计学显著性。 

图10C的一系列显微照片显示，通过自身肽N2防止了肠RI中补体经典途径的激活。肠组织的代表性的冷冻切片在肠RI后获得并用特异针对小鼠IgM、C4或C3的抗体处理(400×放大倍数)。IgM ^CM-22重建的RAG小鼠，i-iv格中是未经自身肽N2预处理，v-viii格中是经自身肽N2处理。野生型小鼠未经自身肽N2预处理的见ix-xii格，经自身肽N2预处理的见xiii-xvi格。i、iii、v、vii、ix、xiii、xi、xv格中的组织用抗IgM生物素染色后，用抗生物素蛋白链菌素-阿糖胞苷-568(红色)染色并用DAPI(紫色)复染。ii、vi、x和xiv格用抗C4-FITC(绿色)染色。格Iv、viii、xii、xvi用抗C3-FITC(绿色)染色。 

图11显示的是小鼠非肌肉肌球蛋白重链II-A(mNMHC-IIA)的核酸序列(A)(SEQ ID NO：47；Genbank检索号no：NM002410)和氨基酸序列(B)(SEQ ID NO：48；Genebank检索号no：NP071855)。 

图12显示的是人非肌肉肌球蛋白重链II-A(Hnmhc-IIA)的核酸序列(A)(SEQ ID NO：49；Genbank检索号no：NM002473)和氨基酸序列(B)(SEQ ID NO：50；Genebank检索号no：NP002464)。 

图13显示的是小鼠非肌肉肌球蛋白重链II-B(mNMHC-IIB)的核酸序列(A)(SEQ ID NO：51；Genebank检索号no：NM175260)和氨基酸序列(B)(SEQ ID NO：52；Genebank检索号no：NM780469)。 

图14显示的是人非肌肉肌球蛋白重链II-B(hNMHC-IIB)的核酸序列(A)(SEQ ID NO：53；Genebank检索号no：NM005964)和氨基酸序列(B)(SEQ ID NO：54；Genebank检索号no：NM005955)。 

图15显示的是小鼠非肌肉肌球蛋白重链II-C(mNMHC-IIC)的核酸序列(A)(SEQ ID NO：55；Genebank检索号no：AY363100)和氨基酸序列(B)(SEQ ID NO：56；Genebank检索号no：AAQ24173)。(C)显示的核酸序列(SEQ ID NO：57；Genebank检索号no：NM028021)和(D)显示的氨基酸序列(SEQ ID NO：59；Genebank检索号no：NM024729)属于另一种非肌肉肌球蛋白重链II-C。 

图16显示的是人非肌肉肌球蛋白重链II-C(hNMHC-IIC)的核酸序列(A)(SEQ ID NO：59；Genebank检索号no：NM024729)和氨基酸序列(B)(SEQ ID NO：60；Genebank检索号no：NM079005)。 

6、发明详述 

6.1、定义： 

为方便起见，在详述、实施例和所附的权利要求书中使用的某些术语提供如下。除非另外定义，这里使用的所有技术和科学上的术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有同样意义。 

这里用的“一”指的是一个或多于一个(即至少一个)的文章语法对象。举例说明，“一个要素”是指一个要素或多余一个要素。 

这里使用的“氨基酸”是指天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L型旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽(peptidomimetics)。 

这里用的“抗体”是指结合于分子包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的一段免疫活性部分，即含有一个抗原结合位点的分子。用于本发明的免疫球蛋白分子可是任一类(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类。天然抗体和免疫球蛋白通常为异四聚体糖蛋白，约150,000道尔顿，由两个相同的轻链和两个相同的重链组成。每个重链在一端具有一个可变区，随后是许多恒定区。每个轻链在一端具有一个可变区，另一端为恒定区。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、双特异性(bispecific)、嵌合、部分或完全人化的抗体、完  全人的抗体(表达人免疫球蛋白基因的转基因鼠中所产生的抗体)、骆驼抗体和抗独特型抗体。一种抗体，或一般而言任一分子，如果该抗体优先结合抗原，并且例如与其他分子的交叉反应少于30％，优选20％、10％或1％，则其与该抗原(或其他分子)“特异性结合”。术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。 

这里用的“抗体片段”或“部分抗体”是指抗体的任何衍生物，小于全长。在示例性的实施方案中，抗体片段至少保留全长抗体特异结合能力的重要的一段。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv双特异抗体、微抗体(minibody)、Fd片段和单链抗体。抗体片段可以通过任何方法产生。例如，抗体片段可通过酶促或化学方法分裂完整抗体而产生，可从编码部分抗体序列的基因重组产生，或可以全部或部分合成产生。抗体片段可以任选是单链抗体片段。或者，片段可包含连接在一起(例如通过二硫键)的多个链。片段也可以任选是多分子复合物。典型的功能性抗体片段包含至少约50个氨基酸，更典型的包含至少约200个氨基酸。 

这里所用的“抗体结合位点”是指重链的可变区以及轻链的可变区。 

这里用的“结合”或“结合的”是指可检测的分子间的关系或联系(如生化反应)。 

“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是可交换使用的术语。这些术语不仅是指特定实验细胞也指该细胞的子代或潜在子代。因为某种修饰由于突变或环境影响可能出现于连续的传代，事实上这种子代可能不会与亲代细胞完全相同，但是仍然包含于这里所用术语的范围内。 

“包含”或“组成”用于综合的、广泛的含义，意思是可包括添加的元素。 

这里用的“共有序列”是指一族相关序列中最常见的氨基酸(或  核苷酸)组成的序列(参见Winnaker，从基因到克隆，1987)。在一族蛋白中，共有序列的每个位置都被该族在该位置出现频率最高的氨基酸占据。如果两个氨基酸出现的频率相等，每个都可能包含于共有序列中。“共有框架”是指免疫球蛋白共有序列的框架区。 

“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基族已在本领域被确定。这些族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在天然免疫球蛋白中预测的非必需氨基酸残基可优选被另一来自相同侧链族的氨基酸残基取代。或者，在另一个实施方案中，突变可随着全部或部分天然免疫球蛋白编码序列被随机引入，例如通过饱和诱变，用生物活性筛选生成的突变体。 

这里用的“可检测标记”是指能检测到的分子，包括但不限于放射性同位素标记、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如生物素或半抗原)等。“荧光团”指能在可检测范围内呈现荧光的物质或其部分。可能用于本发明标签的特定实例包括荧光素、若丹明、丹酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、NADPH、β半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。 

“抑制剂”或“IgM抑制剂”或“拮抗剂”用来指减少或阻碍(完全或部分)天然抗体和涉及炎症级联的其他分子的相互作用的物质。一种抑制剂可以拮抗一种或多种天然IgM的以下活性：(i)抑制或减少IgM和局部缺血特异性抗原之间的相互作用(如结合)；(ii)抑制或减少天然IgM和补体途径中的一种成分如Clq的相互作用；(iii)通过如螯合免疫球蛋白和/或靶向其降解以中和天然  IgM；或(iv)抑制或减少天然IgM的产生，如阻断IgM的合成、装配和/或翻译后修饰。抑制剂可以是蛋白或肽、抗体或其片段(如抗独特型抗体)、经修饰抗体、糖类、糖蛋白或有机小分子。 

“相互作用”是指两个或多个分子间的物理联系，如结合。相互作用可以是直接的或者间接的。 

这里所用的“炎性疾病”是指由一组复杂的功能性和细胞性调整引起或导致的疾病或病症，所述调整包括微循环内急性或慢性改变、液体的移动、和炎症细胞(如粒细胞)以及补体的流入和激活，并包括自身免疫性疾病。每种疾病和病症的实例包括但不限于：再灌注损伤、局部缺血损伤、中风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、乳糜泻、高IgM免疫缺陷症、动脉硬化、冠心病、败血病、心肌炎、脑炎、移植排斥、肝炎、甲状腺炎(例如淋巴瘤性甲状腺肿、毒性弥漫性甲状腺肿)、骨质疏松症、多肌炎、皮肌炎。I型糖尿病、痛风、皮炎、斑秃、全身性红斑狼疮、藓硬化症、溃疡性结肠炎、糖尿病性视网膜病、盆腔炎、牙周病、关节炎、青少年慢性关节炎(如慢性虹膜睫状体炎)、银屑病、骨质疏松症、糖尿病的肾病、哮喘、盆腔炎、慢性肝炎、慢性肺炎、肺纤维化、肝纤维化、类风湿性关节炎、慢性肝炎、慢性肺炎、肺纤维化、肝纤维化，克罗恩病、溃疡性结肠炎、烧伤，以及中枢神经系统(CNS：如多发性硬化症)、胃肠系统、皮肤和相关结构、免疫系统、肝胆管系统或可与炎症成分一起出现的病变的身体的任何位置的其他急性和慢性炎症性疾病。 

“分离”分子，如分离的IgM，是指被分离的状态或从自然环境中存在的其他分子纯化而来。 

“天然IgM”用来指在哺乳动物中(如人)天然产生的IgM抗体。抗体具有五聚环结构，其中个别单体类似IgG因此具有两个轻链(κ或λ)和两个重链(μ)。另外，重链含有附加的C_H4区域。单体通过邻近重链的二硫键形成五聚体。五聚环通过J链和两个重  链之间的二硫键闭合。因为抗原结合位点的数目大，天然IgM抗体是有效的抗原凝集物。在受试者体内产生的天然IgM抗体对B细胞、巨噬细胞和补体系统的最初激活是至关重要的。在抗体应答中IgM是第一个合成的免疫球蛋白。 

“核酸”用来指多核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)及适当位置的核糖核酸(RNA)。该术语也应被理解为包括由核苷酸类似物得来的RNA或DNA类似物形式的等价物，和适用于所描述的实施方案形式的单(有义或反义)和双链多核苷酸。 

“操作性连接”用来指一种并列关系，其中描述的成分所处的联系使其以预期方式发挥功能。例如，当RNA聚合酶将两个编码序列转录为单个mRNA，其随后被翻译为含有得自两个编码序列的氨基酸的单个多肽时，则一种编码序列“操作性连接”于另一种编码序列。编码序列不必一个紧接另一个，只要表达的序列最终加工产生目的蛋白。一种表达控制序列操作性连接于一种编码序列，从而使编码序列在与表达控制序列相容的条件下完成表达。这里所用的术语“表达控制序列”是指调节与其操作性连接的核酸序列表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调节核酸序列的转录和恰当的翻译时，表达控制序列被操作性连接于核酸序列。因此，表达控制序列可包括合适的启动子、增强子、转录终止子、位于蛋白编码基因前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号，维持该基因的正确读码框使mRNA正确翻译和终止密码子。术语“控制序列”最低限度要包含其存在可影响表达的成分，还可包含其存在是有利的额外的成分，例如引导序列和融合伴侣序列(fusion partner sequence)。表达控制序列可包括一个启动子。 

“患者”、“受试者”或“宿主”用来指人或非人的哺乳动物。 

“肽”用来指长度相对短的氨基酸聚合物(如少于50个氨基酸)。聚合物可以是线性或分支的，可由经修饰的氨基酸组成，并可插入非氨基酸。该术语也包括被修饰过的氨基酸聚合物；所述修饰  例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或其他处理，例如与标记成分偶联。 

“启动子”用来指足以引导转录的最小序列。也包括本发明中那些启动子元件，其足以使依赖启动子的基因表达，表达可控制于特异的细胞型、特异的组织，或者可通过外部信号或物质诱导；这种元件可位于多核苷酸序列的5’或3’区域。组成型和诱导型的启动子都被包括于本发明中(参见Bitter等，酶学方法153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中纯培养时，可使用诱导型启动子例如噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。当在哺乳动物细胞系统中纯培养时，可使用的启动子得自哺乳动物细胞的基因组(如金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒(如逆转录病毒长末端重复、腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)。重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供本发明的核酸序列的转录。可使用组织特异性调控元件。包括，例如在不同组织中差异表达的基因或病毒的调控元件。 

“特异性结合”用来指两个分子间的相互作用，以形成在生理学条件下相对稳定的复合物。这里使用的术语与不同分子有关，包括例如抗体和抗原(如肽)的相互作用。特异性结合可通过解离常数来表征，至少约1×10^-6M，一般至少约1×10^-7M，通常至少约1×10^-8M，尤其至少约1×10^-9M或1×10^-10M或更高。确定两个分子是否特异性结合的方法是众所周知的，包括如平衡透析法、表面等离子体振子共振等。 

“严格杂交”或“在低严紧度、中度严紧度、高严紧度或极高严紧度条件下杂交”用来描述杂交和洗涤的条件。可在分子生物学通用实验方案(Current Protoclos in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y(1989)，6.3.1-6：3.6)中找到进行杂交反应的规程，并通过引用结合到本文。参考文献中描述了水和非水方法并可使用任一个。这里的特异性杂交条件所指如下：1)低严紧杂交条件是在约45℃  6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在0.2×SSC、0.1％SDS至少50℃下洗两遍(对低严紧条件，洗涤温度可以升高到55℃)；2)中度严紧杂交条件是在约45℃ 6×SSC，随后在0.2×SSC、0.1％SDS 60℃下洗一遍或更多遍；3)高度严紧杂交条件是在约45℃ 6×SSC，随后在0.2×SSC、0.1％SDS 65℃下洗一遍或更多遍；优选4)极高度严紧杂交条件为65℃ 0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在0.2×SSC、0.1％SDS 65℃下洗一遍或更多遍。极高度严紧杂交条件(4)是首选条件并且是应该使用的条件，除非另外说明。序列间的同源性或序列一致性(这里所用术语可交换)的计算如下进行。 

为确定两个氨基酸序列或核酸序列的一致性百分数，以最佳比对目的对序列进行比对(如为了最适比对，可在第一和第二个氨基酸或核酸的序列中引入缺口，或均引入缺口)。在优选的实施方案中，为对比目的而对齐的参考序列的长度至少为30％，优选至少为40％，更优选至少为50％、60％，并且最优选至少为参考序列长度的70％、80％、90％、100％。相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸随后被比较。当第一个序列的一个位置被与第二个序列相应位置同样的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。 

考虑到缺口的数量、每个缺口的长度(为使两个序列进行最佳比对而必需引入的缺口)，两个序列间的一致性百分数是各序列共有的同样位置的数量函数，两个序列间的同源性百分数是各序列共有的保守位置的数量函数。序列的比对和两个序列间一致性和/或同源性百分数的确定可用数学算法来完成。在优选的实施方案中，两个氨基酸序列间的一致性百分数用Needleman和Wunsch算法((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)确定，该算法已经被整合到GCG软件包的GAP程序中(可从www.gcg.com上获得)，使用Blossum 62或PAM250矩阵及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一个优选的实施方案中，用GCG软件包中的GAP  程序(可从www.gcg.com上获得)确定两个核苷酸序列的一致性百分数，使用NWSgapdna CMP矩阵及40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。尤其优选的一组参数(应该使用的参数除非另外说明)是Blossum 62评分矩阵，具有缺口罚分12、缺口扩展罚分4和移码缺口罚分5。 

两个氨基酸或核苷酸序列间的一致性和/或同源性百分数可用E.Meyers和W.Miller算法((1989)CABIOS，4：11-17)进行确定，该算法已经被整合到ALIGN程序中(2.0版)，使用PAM120权重剩余表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。 

“治疗”用来指任何治疗或预防或抑制受试者的病症或疾病并且包括例如：(a)预防可被诱发为但还未被诊断为具有疾病或病症的受试者出现疾病或病症；(b)抑制疾病或病症，即终止其进展；或(c)减缓或改善疾病或病症即引起缓解。因此，这里用的治疗包括例如在损伤部位修复或再生被损坏或损伤的组织或细胞，或阻止损害如手术前的预防疗法。 

“载体”用来指一种核酸分子，能运送其他的已被操作性连接于该分子上的核酸，可包括质粒、粘粒或病毒载体。一类优选的载体是游离基因，即能在染色体外复制的核酸。优选载体是能自主复制和/或表达其连接的核酸的载体。载体可引导操作性连接于其上基因的表达。载体也可整合到宿主DNA。在本说明书中，由于质粒(双链DNA的环形排列)是最常使用的载体形式，“质粒”或“载体”可交换使用。但是本发明预期包括这种其他形式的载体，其具有等同的功能，以及此后在本领域已知的载体。病毒载体包括如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。 

6.2、天然IgM抗体 

本发明至少部分基于天然免疫球蛋白(Ig)的鉴定，尤其是天然IgM。可从保藏于美国标准培养收藏所的杂交瘤中(检索号为PTA-3507)获得特定的IgM。 

由杂交瘤PTA-3507产生的IgM重链可变区核苷酸序列，IgM^CM-22(也指22A5IgM)示于图1A(SEQ ID NO：1)，氨基酸序列示于图1B(SEQ ID NO：2)。重链可变区的CDR1区域与SEQ ID NO：2的31至35位氨基酸(SEQ ID NO：4)相应，由SEQ ID NO：1的91-105位核苷酸(SEQ ID NO：3)编码，重链可变区的CDR2区域与SEQ ID NO：2的50至66位氨基酸(SEQ ID NO：6)相应，由SEQ ID NO：1的148-198位核苷酸编码(SEQ ID NO：5)。 

IgM^CM-22的轻链可变区的核苷酸序列示于图2A(SEQ ID NO：7)，氨基酸序列示于图2B(SEQ ID NO：8)。轻链可变区的CDR1区域与SEQ ID NO：8的23至37位氨基酸(SEQ ID NO：10)相应，由SEQ ID NO：7的67-111位核苷酸(SEQ ID NO：9)编码，轻链可变区的CDR2区域与SEQ ID NO：8的53至59位氨基酸(SEQ ID NO：12)相应，由SEQ ID NO：7的157-177位核苷酸编码(SEQ ID NO：11)。由于遗传密码的简并性，其他核酸序列可编码这里列出的氨基酸序列。 

来自任一cDNA、基因组或混合物的本发明的核酸组合物虽然常常为天然序列形式(除了修饰的限制性酶切位点等)，但可依照标准技术被突变。对于编码序列，这些突变可按需要影响氨基酸序列。尤其是，与天然V、D、J、恒定区、铰链区(switch)和其他这里描述的序列实质上相同的核苷酸序列都被考虑到。 

例如，分离的核酸可包含IgM^CM-22(或22A5 IgM)重链可变区核苷酸序列，其具有的核苷酸序列示于图1A(SEQ ID NO：1)，或包含与SEQ ID NO：1有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。核酸分子可包含SEQ ID NO：3的重链CDR1核苷酸序列，或其部分。另外，核酸分子可包含SEQ ID NO：5的重链CDR2核苷酸序列，或其部分。在示例性的实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO：3的重链CDR1核苷酸序列或其部分，以及SEQ ID NO：5的重链CDR2核苷酸序列或其部分。本发明的核酸分子可包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5的重链序列或其组合物，或包含具有与SEQ ID NO：1、3、5至少80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列一致性的核苷酸。此外，本发明的核酸分子可包含重链序列，该序列与SEQ ID NO：1、3或5在严紧条件下如低度、中度、高度或极高度严紧条件下杂交。 

在另一个实施方案中，本发明特征性的核苷酸序列与编码多肽重链的核酸分子(如SEQ ID NO：2、4或6的多肽重链)具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列一致性。本发明特征性的核酸分子还与编码天然抗体重链可变区或其部分的核苷酸序列杂交，如SEQ ID NO：2、4或6的重链可变区。 

再一个实施方案中，分离的核酸编码IgM^CM-22(22A5)轻链可变区，其具有图2A(SEQ ID NO：7)所示的核苷酸序列，或与SEQ IDNO：7有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％一致性的序列。核酸分子可包含SEQ ID NO：9的轻链CDR1核苷酸序列，或其部分。在另一个优选的实施方案中，核酸分子可包含SEQ IDNO：11的轻链CDR2核苷酸序列，或其部分。在一个示例性的实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO：9的轻链CDR1核苷酸序列或其部分，和SEQ ID NO：11的轻链CDR2核苷酸序列或其部分。本发明的核酸分子可包含如SEQ ID NO：7、9或11的轻链序列或其组合物，或包含与SEQ ID NO：7、9或11具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列一致性的核苷酸。更多的核酸分子可包含在严紧条件下，如低度、中度、高度或极高度严紧条件下与SEQ IDNO：7、9或11杂交的轻链序列。 

核酸分子可含有与编码多肽轻链(如SEQ ID NO：8、10或12的多肽轻链)的核酸分子至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。本发明特征性的核酸分子还与编码天然抗体轻链可变区(如SEQ ID NO：8、10或12的轻链可变区)或其部分的核苷酸序列杂交。 

在另一实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，编码包含SEQ  ID NO：4氨基酸序列的重链CDR1区域或其部分，或其经修饰形式。该核酸仅可编码CDR1区，或编码完整的抗体重链可变区域或其片段。例如，核酸可编码的重链可变区具有含SEQ ID NO：6氨基酸序列的CDR2区域。再一个实施方案中，本发明提供分离的核酸，编码具有SEQ ID NO：6氨基酸序列或其片段或其经修饰形式组成的重链CDR2区域。该核酸仅可编码CDR2区域或编码完整的抗体重链可变区或其片段。例如，核酸可编码的轻链可变区具有含SEQ IDNO：4氨基酸序列的CDR1区域。 

在又一个实施方案中，本发明提供分离的核酸，编码具有SEQ IDNO：10氨基酸序列或其片段或其经修饰形式的轻链CDR1区域。该核酸仅可编码CDR1区或编码完整的抗体轻链可变区。例如，核酸可编码的轻链可变区具有含SEQ ID NO：12氨基酸序列CDR2区域。分离的核酸也可编码含SEQ ID NO：12氨基酸序列或其片段或其修饰形式的轻链CDR2区。该核酸仅可编码CDR2区域或可编码完整的抗体轻链可变区。例如，核酸可编码的轻链可变区具有含SEQ IDNO：10氨基酸序列的CDR1区域。 

编码重链或轻链可变区的核酸可以是鼠源或人源，或者可以包含鼠和人氨基酸序列的组合物。例如，核酸序列可编码的重链可变区具有SEQ ID NO：2的CDR13SEQ ID NO：4)和/或SEQ ID NO：2的CDR2(SEQ ID NO：6)，以及人的框架序列。此外，核酸可编码的轻链可变区具有SEQ ID NO：8的CDR1(SEQ ID NO：10)和/或SEQID NO：8的CDR2(SEQ ID NO：12)，以及人的框架序列。本发明进一步包含的载体具有以上描述的核酸和含有表达载体的宿主细胞。 

本发明的特征还有IgM^CM-22重链可变区和/或轻链可变区的多肽及片段。在示例性的实施方案中，分离的多肽包含如SEQ ID NO：8、10或12的氨基酸序列或其片段或其组合物；或者SEQ ID NO：2、4或6的氨基酸序列或其片段或其组合物。本发明的多肽包括与SEQ IDNO：8、10、12、2、4或6有至少但不多于20、10、5、4、3、2或  1个氨基酸的不同。示例性的多肽是保留生物活性的多肽，如能结合局部缺血特异性抗原和/或能结合补体。在另一个实施方案中，多肽包含与轻链可变区或其部分有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列一致性的多肽，如SEQ ID NO：8、10或12的多肽轻链可变区。在又一个实施方案中，多肽包含与重链可变区或其部分有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列一致性的多肽，如SEQ ID NO：2、4或6的多肽轻链可变区。再一个实施方案中，本发明特征性的多肽包含SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：2的氨基酸序列，进一步包含IRES序列。 

6.3、天然IgM抗体的抑制剂 

6.3.1天然IgM抗体的肽抑制剂 

本发明另外的特征是IgM抑制剂。在一个实施方案中，IgM抑制剂为特异性结合于天然IgM并因此而阻碍IgM与抗原结合的肽。这种肽可包括但不限于，下表1所述的天冬酰胺-富集肽。 

表1天然IgM抗体结合肽的氨基酸序列 

序列编号	序列	名称
			14	xNNNXNNXNNNN	天冬酰胺-富集共有序列
16	YNNNNGNYTYRN	P1
			18	ANTRNGATNNNM	P2
20	CDSSCDSVGNCN	P3
			22	WNNNGRNACNAN	P4
24	HNSTSNGCNDNV	P5
			26	NSNSRYNSNSNN	P6
28	KRNNHNNHNRSN	P7
			30	NGNNVNGNRNNN	P8
32	NVANHNNSNHGN	P9
			34	SYNNNNHVSNRN	P10

该肽也可包括下表2所述的特定的“自身肽”。 

表2自身肽的氨基酸序列 

序列编号	序列	名称
			36	LMKNMDPLNDNI	自体-1
38	LMKNMDPLNDNV	自体-2(“N-2”)

正如实施例中更详细描述的，自身肽与天然IgM抗体IgM^CM-22 结合。 

除了上述肽之外，本发明包含经修饰的肽，其活性可由熟练的技术人员用已知的不同方法鉴定和/或分析。例如，肽与IgM结合的检测可用生物鉴定法、蛋白质印迹、免疫沉淀或免疫细胞化学技术，例如以下所述的方法。特别是，经修饰肽的生物活性(如，与天然IgM抗体的结合能力)可相对于P8(SEQ ID NO：30)或N2(SEQ IDNO：38)被表征。 

这种经修饰的肽，当被设计为至少保留蛋白天然存在形式的一种活性时，被认为是该肽的“功能等价物”，这里有更详细的描述。例如可通过氨基酸置换、缺失或添加来产生这种经修饰肽，其置换可存在于全部或部分保守氨基酸的置换中。 

例如，可合理预计的是分离的保守氨基酸置换不会对所得分子的生物活性有较大的影响，例如用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸或丝氨酸置换苏氨酸。肽氨基酸序列上的改变是否导致功能性同源物，通过评价变异体肽产生与野生型肽相似反应的能力(如结合天然IgM抗体的能力)，可容易的确定。发生多于一个置换的肽可容易的用同样方法检测到。 

肽的诱变作用可产生同源物，其在体内的半衰期相对于相应的野生型肽有提高。例如，改变后的肽更稳定，可抵御蛋白水解的降解作用或导致蛋白被破坏或失活的其他细胞进程。 

可比对一群肽同源物的氨基酸序列，优选可能的最高同源性。该群变异体可包括如来自一个或多个物种的同源物，或来自同一物种但由于突变而不同的同源物。出现在比对序列各个位置的氨基酸都被选择以产生一组简并的组合序列(a degenerate set ofcombinatorial sequences)。在某些实施方案中，组合文库经由编码多肽文库的基因简并库产生，每个多肽至少包括一部分可能的肽序列。例如，合成寡核苷酸的混合物可酶联到基因序列，这样可能的核苷酸序列简并组可作为单个多肽表达，或者，作为一组大的融合蛋白表达(如噬菌体展示)。 

有许多方法可从简并的寡核苷酸序列产生可能的同源物文库。化学合成的简并基因序列可在DNA自动合成仪中完成，合成基因可随后被连接于合适的载体以表达。基因简并组合的一个目的是在一个混合物中提供所有可能需要的肽序列的编码序列。简并寡核苷酸的合成为本领域所熟知(参见Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1981)Rcombinant DNA，Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton，Amsterdam：Elsevier pp.273-289；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Sce等(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。这种技术已经被用于其他蛋白的定向进化(参见Scott等(1990)Science 249：386-390；Roberts等(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等(1990)Science 249：404-406；Cwirla等(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及美国专利Nos：5,223,409，5,198,346和5,096,815)。 

或者，可利用突变的其他形式产生组合文库。例如，可通过使用如丙氨酸扫描诱变(alanine scanning mutagenesis)(Ruf等(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等(1993)Gene 137：109-118；Grodberg等(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等(1991)Biochemistry 30：10832-10838；及Cunningham等(1989)Science 244：1081-1085)、接头分区诱变((Gustin等(1993)Virology 193：653-660；Brown等(1992)Mol.CellBiol.12：2644-2652；McKnight等(1982)Science 232：316))、饱和诱变(Meyers等(1986)Science 232：613)、PCR诱变(Leung等(1989)MethodCell Mol.Biol.1：11-19)或随机诱变(Miller等(1992)细菌遗传学的简明教程(A Short Course in Bacterial Genetics)，CSHL Press，Cold SpringHarbor，NY；及Greener等(1994)Strategies in Mol.Biol.7：32-34)等筛选，从文库中产生并分离肽同源物。 

已知在本领域有许多技术来筛选由点突变和截短(truncation)  得到的组合文库的基因产物，以及筛选cDNA文库的具有一定特性(如结合天然IgM抗体的能力)的基因产物。这种技术将被广泛用于快速筛选由肽同源物的组合突变产生的基因文库。最广泛用于筛选大基因文库的典型技术包括将基因文库克隆到复制表达载体、用所得载体文库转化适当的细胞和在所需活性相对易于从编码检测产物的载体基因中分离检测的条件下表达组合基因。当必需对由组合突变技术制造的大量简并序列进行筛选时，以下描述的每个例证实验都可用于高通量分析。 

在筛选实验的例证实施方案中，候选的组合基因产物过柱，柱中含有附着了结合蛋白(如IgM或其部分)的微珠。那些候选的组合基因产物被固定在柱上，可用与IgM的结合(以对天然IgM抗体结合的阻断以及炎性疾病的治疗的方式)进一步鉴定。 

在另一个实施例中，基因文库可作为融合蛋白表达于病毒颗粒的表面。例如，在丝状噬菌体系统中，外源肽序列可被表达在感染性噬菌体的表面，因此获得了两个优点。首先，因为这些噬菌体在高浓度下可被用于亲和基质，所以可以一次筛选大量的噬菌体。其次，因为每个感染性噬菌体都在其表面展示组合基因产物，如果从亲和基质中回收的特定噬菌体的产量低，该噬菌体可通过下一轮感染而被扩增。几乎相同的大肠杆菌丝状噬菌体M13、fd和fl群是在噬菌体展示文库中最常用，因为外壳蛋白gIII或gVIII均可用于产生融合蛋白而不使最终包装的病毒颗粒破裂(Ladner等，PCT公布说明书WO 90/02909；Garrard等PCT公布说明书WO 92/09690；Marks等(1992) J.Biol.Chem.267：16007-16010；Griffitbs等(1993)EMBO J.12：725-734；Clackson等(1991)Nature 352：624-628；及Barbas等(1992)PNAS USA 89：4457-4461)。其他的噬菌体外壳蛋白可适当的使用。 

本发明也提供模拟物(如非肽物质)，它能模拟真正的肽与天然IgM抗体的结合。例如，肽分子中有关天然IgM抗体识别的关键残基可被确定并用于产生结合于天然IgM抗体的拟肽  (peptidomimetics)。通过与天然IgM抗体的结合以及包裹与野生型蛋白相互作用所需的关键残基，拟肽可以被用作野生型蛋白的抑制剂，因此阻止蛋白和天然IgM抗体的相互作用。可产生模拟那些与天然IgM抗体结合的残基的拟肽化合物。例如，可用苯二氮 

类(参见Freidinger等，肽：化学与生物学G.R.Marshall ed.，EsCOMPublisher：Leiden，Netherlands，l988)、氮杂 

(参见Huffman等，肽：化学与生物学，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)、取代的γ内酰胺环(Garvey等，肽：化学与生物学，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，l988)、亚甲基酮假肽(keto-methylene pseudopeptides)(Ewenson等(1986)J.Med.Chem.29：295；及Ewenson等，肽：结构与功能(第九届美国肽专题讨论会年报Pierce Chemical Co.Rockland，IL，l985)，β-折叠二肽核心(dipeptide cores)(Nagai等(1985)Tetrahedron Lett 26：647；及Sato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1：1231)和氨基醇(Gordon等，(1985)Biochem Biophys Res Commun 126：419；及Dann等(1986)Bjochem Biophys Res Commun 134：71)产生有这种残基的非水解产物的肽类似物。 

6.3.2编码肽抑制剂的核酸 

本发明特征性的核酸，编码上述肽。表3提供了示例性的核酸。 

表3编码天然IgM抗体结合肽的核酸 

序列编号	序列	名称
			13	NNN AAY AAY AAY NNN AAY AAY NNN AAY AAY AAY AAY	天冬酰胺-富集共 有序列
15	TAY AAY AAY AAY AAY GGN AAY TAY CAN TAY MGN AAY	P1
			17	GCN AAY CAN MGN AAY GGN GCN CAN AAY AAY AAY ATG	P2
19	TGY GAY WSN WSN TGY GAY WSN GTN GGN AAY TGY AAY	P3
			21	TGG AAY AAY AAY GGN MGN AAY GCN TGY AAY GCN AAY	P4
23	CAY AAY WSN ACN WSN AAY GGN TGY AAY GAY AAY GTN	P5
			25	AAY WSN AAY WSN MGN TAN AAN WSN AAY WSN AAY AAY	P6
27	AAR MGN AAY AAY CAY AAY AAY CAY AAY MGN WSN AAY	P7
			29	AAY GGN AAY AAY GTN AAY GGN AAY MGN AAY AAY AAY	P8
31	AAY GTN GCN AAY CAY AAY AAY WSN AAY CAY GGN AAY	P9
			33	WSN TAY AAY AAY AAY AAY CAY GTN WSN AAY MGN AAY	P10
35	YTN ATG AAR AAY ATG GAY CCN YTN AAY GAY AAY ATH	自体-1
			37	YTN ATG AAR AAY ATG GAY CCN YTN AAY GAY AAY GTN	自体-2

表3中分离的核酸反应了遗传密码的简并性。尤其是，“R”对应的碱基可以是A或G；“S”对应的碱基可以是G或C；“V”对应的碱基可以是A、C或G；“Y”对应的碱基可以是C或T；“W”对应的碱基可以是A或T；“D”对应的碱基可以是A、G或T；“M”对应的碱基可以是A或C；“H”对应的碱基可以是A、C或T；“N”对应的碱基可以是A、C、G或T；“K”对应的碱基可以是G或T；“B”对应的碱基可以是C、G或T。 

预期导致题述蛋白氨基酸序列变化的DNA序列多态性会存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员会理解，由于天然等位基因变异，编码本发明特定肽的核酸中一个或多个核苷酸的变异(从至少约1％到约3％或5％或者可能更多的核苷酸)可存在于所给物种的个体中。任一和所有这种核苷酸变异及所得氨基酸多态现象都在本发明范围内。首选的核酸编码的肽，与氨基酸序列SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或本发明的其他肽至少具约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同源性。核酸编码具有本发明肽活性的肽，与本发明的SEQ IDNO：14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或其他肽有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同源性，这也在本发明范围内。 

单一物种的基因密码子选择偏好性似乎与该基因编码的蛋白的表达水平有关。相应的，本发明包括已被优化以提高在宿主细胞中表达的核酸序列，优化方法为改变核酸序列中的密码子使用频率以接近宿主细胞中首选的密码子使用频率。由于密码子简并性，优化核苷酸序列而不影响编码多肽的氨基酸序列是可能的。相应的，本发明涉及编码SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38所示肽或本发明其他肽的任一核苷酸序列。 

本发明范围内的核酸还可包含接头序列、修饰的限制性内切酶位点及其他对这种重组多肽的分子克隆、表达或纯化有用的序列。 

编码本发明肽的核酸可含有根据所述实验计划得自任何生物体的mRNA或基因组DNA，以及本领域技术人员所普遍了解的那些。例如，可通过从生物体(如细菌、病毒、哺乳动物等)分离总mRNA而获得编码本发明肽的cDNA。可再从总mRNA制备双链cDNA，并随后用已知许多技术的任一种将cDNA插入到适当的质粒或噬菌体载体中。也可根据本发明提供的核苷酸序列信息，用建立的聚合酶链式反应技术克隆编码本发明肽的基因。 

在本发明的另一方面，题述核酸(the subject nucleic acid)提供在表达载体中，含有编码本发明肽和操作性连接于至少一种调控序列的核酸序列。应该理解的是，表达载体的设计取决于要转化的宿主细胞和/或需表达的蛋白类型等因素的选择。而且，还应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数和载体编码的其他任一蛋白(例如抗生素标记)表达的能力，。 

很明显的，题述基因构建体可用于使本发明肽在培养基中传代细胞内进行表达，例如产生要纯化的蛋白或多肽，包括融合蛋白或多肽。 

本发明还涉及重组基因转染的宿主细胞，以表达本发明的肽。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明的多肽可在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母或哺乳动物细  胞中表达。本领域技术人员了解其他合适的宿主细胞。另外，宿主中发现的非典型的tRNA分子可被添加至宿主细胞以优化肽的表达。其他适于最大量表达肽的方法将被本领域技术人员所了解。 

6.3.3产生肽抑制剂的方法 

例如，肽抑制剂可被化学合成、被无细胞系统的核糖体合成或在细胞的核糖体中被合成。化学合成本发明的肽可用许多种本领域公认的方法来实现，包括分步固相合成(stepwise solid phasesynthesis)、通过肽片段构象辅助再连接的半合成、克隆或合成肽片段酶促连接以及化学连接(Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.，85卷，2149页(1964)，Houghten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82卷，5132页(1985)，及Stewart和Young固相肽合成法Pierce Chem.Co，Rockford，III.(1984))。天然的化学连接用两个未保护的肽片段的选择性化学(chemoselective)反应产生暂时的硫酯连接中间体。暂时的硫酯连接中间体随后自发的经过重排以提供在连接位点具有天然肽键的全长连接产物。全长连接产物在化学上与无细胞合成产生的蛋白是相同的。全长连接产物可以随后被再折叠和/或被氧化，以形成天然的含有二硫化物的蛋白分子(参见美国专利No：6,184,344和6,174,530；及T.W.Muir等，Curr.Opin.Biotech.(1993)：vol.4，p420；M.Miller，等，Science(1989)：vol.246，p 1149；A.Wlodawer，等，Science(1989)：vol.245，p616；L.H.Huang，等，Biochemistry(1991)：vol.30，p 7402；M.Schnolzer，等，Int.J.Pept.Prot.Res.(1992)：vol.40，p180-193；K.Rajarathnam，等，Science(1994)：vol.264，p 90；R.E.Offord，在蛋白设计和新的治疗方法和疫苗中的蛋白质工程之化学方法.J.B.Hook，G.Poste，Eds.，(Plenum Press，New York，1990)pp.253-282；C.J.A.Wallace等J.Biol.Chem.(1 992)：vol.267，p 3852；LAbrahmsen等Biochemistry(1991)：vol.30，p 4151；T.K.Chang，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：12544-12548；M.Schnlzer等，Science(1992)：vol.，3256，p221；及K.Akaji等Chem.Pharm.Bull.  (Iokyo)(1985)33：184))。 

在另一备择方案中，肽的产生可以用体外翻译系统来完成。体外翻译系统通常是一种无细胞抽提液的翻译系统，其中至少含有将RNA分子翻译为蛋白所必需的最少元件。典型的体外翻译系统至少包含核糖体、tRNA、起始因子甲硫氨酰-tRNA Met、翻译相关的蛋白或复合物(例如eIF2、Eif3)、含帽结合蛋白和真核起始因子4F(eIF4)的帽结合复合物。许多种体外翻译系统在本领域是众所周知的，包括市售试剂盒。体外翻译系统的例子包括真核细胞裂解物(如兔网织红细胞裂解物)、兔卵母细胞裂解物、人细胞裂解物、昆虫细胞列裂解物及麦胚抽提物。裂解物可从制造厂家买到例如Promega公司(Madison，威斯康辛州)、Stratagene公司(La Jolla，加利福利亚州)、Amersham公司(Arlington Heights，伊利诺依州)、GIBCO/BRL公司(Grand Island，纽约)。典型的体外翻译系统含大分子如酶、翻译起始和延伸因子、化学试剂和核糖体。此外，可用体外转录系统。这种典型的系统至少包括RNA聚合酶全酶、核糖核酸及任何必需的转录起始、延伸和终止因子。体外转录和翻译可以在同一的反应中完成，从一个或多个分离的DNA产生肽。 

编码肽抑制剂的核酸可由DNA传递到合适宿主细胞在体外被表达。肽的表达可通过将编码肽的核酸插入到载体上来促进，例如质粒、病毒或其他本领域所知的载体，其中载体通过插入或合并天然抗体-结合肽的遗传序列进行操纵。这种载体包含启动子序列，其促进插入宿主的遗传序列的有效转录。典型的载体包含复制起点、启动子以及可对转化的细胞进行表型选择的特异基因。适用于本发明的载体包括但不限于用于细菌中表达的基于T7表达载体(Rosenberg等Gene，56：125，1987)、用于哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.，263：3521，1988)和用于昆虫细胞中表达的杆状病毒衍生载体。DNA片段可出现在载体中，载体操作连接于调控元件如启动子(例如T7、金属硫蛋白I  或多角体蛋白启动子)。 

编码肽抑制剂的核酸可在原核生物或真核生物中被表达。宿主可包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物。在原核生物中表达DNA序列(具有真核或病毒序列)的方法是本领域众所周知的。生物学功能的病毒和质粒DNA载体能在宿主中表达和复制，这是本领域已知的。这种载体能整合本发明的DNA序列。可用本领域技术人员所熟知的方法来构建载体，载体中包含天然抗体-结合肽编码序列和合适的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术及体内重组/遗传技术(参见Maniais等描述的技术，1989分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y)。 

许多宿主表达载体系统可被利用。包括但不限于微生物例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌、用重组酵母表达载体转化的酵母、用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞系统、用重组病毒表达载体(如逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统或为稳定表达设计的转化的动物细胞系统。 

依赖所用的宿主/载体系统，大量适合转录和翻译元件的任一个，包括组成型和诱导型启动子、增强子元件、转录终止子等，都可用于表达载体(参见Bitter等，1987，酶学方法153：516-544)。例如，当在细菌系统中克隆时，可用诱导型启动子例如噬菌体γ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可用得自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒的启动子(如逆转录病毒长末端重复、腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)。也可用重组DNA或合成技术产生的启动子。 

在酵母中，可使用包含组成型或诱导型启动子的许多载体。综合来看，分子生物学的当前实验设计Vol.2，1988，Ed.Ausubel等，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，Ch.13；Grant等，1987，  酵母的表达和分泌载体，酶学方法，Eds.Wu & Grossman，319 87，Acad.Press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544；Glover，1986，DNA克隆，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3；and Bitter，1987，酵母中的异源基因表达，酶学方法，Eds.Berger&Kimmel，Acad.Press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684；及酵母菌的分子生物学，1982，Eds.Strathern et al.，ColdSping Harbor Press，Vols.I and II.酵母组成型启动子如ADH或LEU2或诱导型启动子如GAL可被使用(酵母中的克隆，Ch.3，R.Rothstein，DNA克隆，Vol.11，实用方法，Ed.D M Glover，1986，IRLPress，Wash.，D.C.)。或者，可用促进外源DNA序列整合到酵母染色体的载体。 

真核系统，优选哺乳动物表达系统可使表达的哺乳动物蛋白进行正确的翻译后修饰。真核细胞可被用作宿主细胞，其具有正确加工原始转录物、糖基化、磷酸化及有利的血浆膜基因产物的插入的细胞机制。 

哺乳动物细胞系统可被设计为利用重组病毒或病毒元件引导表达。例如，当用腺病毒表达载体时，天然抗体-结合肽编码序列可被连接于腺病毒转录/翻译控制复合物如后期启动子和三联前导序列。或者，可用痘苗病毒7.5K启动子(参见Maclcett等1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7415-7419；Mackett等1984，J.Virol.49：857-864；Panicali等1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927-4931)。尤其感兴趣的是基于牛乳头状瘤病毒的载体，其具有作为染色体外遗传因子复制的能力(Sarver等1981，Mol.Cell.Biol.1：486)。该DNA进入小鼠细胞后不久，质粒复制达到约每个细胞100至200个拷贝。插入cDNA的转录不需要质粒整合到宿主染色体上，因此产生高水平的表达。这些载体可通过质粒上包括的可选标记如neo基因，用于稳定的表达。或者，逆转录病毒基因组可经修饰以用作载体，该载体能引入并引导天然抗体-结合肽基因在宿主细胞的表达(Cone &Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349-6353)。高水平  表达也可以用诱导型启动子完成，包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子及热激启动子。 

要长期高产量的产生重组蛋白，首选是稳定的表达。可用合适的表达控制元件(如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选标记控制的cDNA转化宿主细胞，而不是用含有病毒复制起点的表达载体。重组质粒中的可选标记赋予细胞对选择的抗性并使细胞将质粒稳定的整合到其染色体上，生长至形成细胞灶(foci)进而能被克隆并扩展为细胞系。例如，随着外源DNA的引入，改造后的细胞可在丰富培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。可使用许多选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，Cell 22：817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。并且，抗代谢物抗性可被用作选择以下基因的基础：dhfr，赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad Sci.USA 78：2072)；neo，赋予对氨基葡糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1)；以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene 30：147)。另外可选择的基因包括：trpB，使细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，使细胞利用组胺醇(histidmol)代替组氨酸(Hartman & Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047)；ODC(鸟氨酸脱羧酶)，赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(2-(difluoromethyl)-DL-omithine，DFMO)的抗性((McConlogue L.，1987，分子生物学最新简讯，ColdSpring Harbor Laboratory ed.)。 

对于稳定的重组细胞系，合适的细胞类型包括但不限于以下类型的细胞：NIH 3T3(鼠科)、C2C12、L6和P19。C2C12和L6成肌  细胞在培养时自然分化并形成依赖特定生长条件的肌管(Yaffe andSaxel，1977；Yaffe，1968)。P19是胚胎癌细胞系。这种细胞在如美国标准培养物保藏中心(ATCC)细胞系目录中有描述。这些细胞可被熟练的技术人员用所知的方法稳定的转化。参见Ausubel等，DNA引入哺乳动物细胞，分子生物学通用实验设计，9.5.1-9.5.6节(JohnWiley & Sons，Inc.1995)。“稳定”转化在本发明的上下文中是指细胞经至少50次分裂仍在某种程度上不死。 

当宿主为真核生物时，可用于转化DNA的方法有，钙磷酸盐共沉淀、常规机械操作如显微注射、电穿孔法、脂质体包装质粒的插入或病毒载体。真核细胞也可用编码天然抗体-结合肽的DNA序列，以及编码可选表型的第二个外源DNA分子，如单纯疱疹-胸腺激酶基因转化。另外一个方式是用真核病毒载体，例如猴病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒，瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白(参见真核病毒载体，冷泉港实验室，Gluzman ed.，1982)。 

与天然抗体相互作用或为了分离和纯化天然抗体，天然抗体-结合蛋白可能需从宿主细胞分泌。因此信号序列可被用来引导在宿主细胞中合成的肽离开细胞。典型的信号序列位于核酸编码序列内，或正好在编码区域的5’末端。许多信号序列已经被鉴定，任一可在所选宿主细胞中发挥功能的信号序列可被使用。因而信号序列可与多肽同源或异源。另外，信号序列可以是用本领域熟知的DNA重组技术化学合成。 

宿主细胞中产生的肽的数量可用本领域所知的标准方法评估。这种方法包括但不限于蛋白质印迹技术、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、HPLC分离、免疫沉淀作用和/或活性分析例如DNA结合凝胶移位分析。 

当天然抗体-结合肽从宿主细胞中分泌时，大部分肽可能会在细胞培养基中被找到。可如果肽不分泌就会出现在细胞质(对于真核、革兰氏阳性细菌和昆虫宿主细胞)中或周质中(对于革兰氏阴  性细菌宿主细胞)。 

如果天然抗体-结合肽存在于胞内空间，宿主细胞通常会首先被机械性或渗透压破裂以释放细胞质内容物到缓冲溶液中。随后从溶液中分离肽。溶液中的肽的纯化因而可用许多技术完成。如果肽已被合成使其在羧基或氨基端具有标签如六组氨酸或其他小肽，肽可在一步过程中被纯化，方法为将溶液流过亲和柱，其中柱材料对标签或直接对肽(即单克隆抗体)有高亲和力。例如，多组氨酸对镍有高度特异亲和力，因此镍亲和层析柱(如Qiagen镍柱)可用来纯化(参见Ausubel等，eds.，分子生物学通用实验设计，John Wiley &Sons，New York，1994)。 

另一方面，对于没有标签并且实际上不能用抗体纯化的肽来说，可用其他熟知的纯化方法。这种方法包括但不限于离子交换层析、分子筛色谱法、HPLC、联用凝胶洗脱的非变性凝胶电泳和制备型等电聚焦(preparative isoelectric focusing)(″Isoprime″仪/技术，HoeferScientific)。在某些情况下，可以联合两个或多个方法以提高纯度。预计肽主要出现在细菌的周质空间或真核细胞的细胞质中，周质或胞质的内容物包括包涵体(如革兰氏阴性细菌)如果处理的肽已经形成了这类复合物，可用任何熟练的技术人员已知的标准技术从宿主细胞抽提。例如，通过使用弗氏细胞压碎器、匀浆器和/或声裂法，宿主细胞可被裂解以释放周质内容物。匀浆随后被离心。 

6.3.4天然IgM抗体的抗体抑制剂 

抗体IgM的抑制剂也可以是抗体，与天然IgM竞争同抗原的结合。产生抗体的方法在本领域是众所周知的。例如，抗靶标物质(如致病免疫球蛋白或细胞上的局部缺血特异性抗原)的单克隆抗体可由多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，如标准的体细胞杂交技术(Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975))。虽然原则上，体细胞杂交过程是首选，但其他产生单克隆抗体的技术可被使用，如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。制备杂交瘤的首选动物系统是鼠  系统。小鼠中杂交瘤产生的程序已建立地很完备。免疫的实验计划和融合用免疫后脾细胞的分离技术在本领域是已知的。融合配偶体(如鼠骨髓瘤细胞)和融合过程也是已知的。 

人单克隆抗体的产生可用带有人免疫球蛋白基因而不是小鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行。脾细胞来自用所需抗原免疫的转基因小鼠，并用于产生杂交瘤，杂交瘤分泌针对来自人蛋白的表位具有特异性亲和力的人mAb(参见Wood等，国际申请WO91/00906，Kucherlapati等，PCT公布说明书WO 91/10741；Lonberg等，国际申请WO 92/03918；Kay等，国际申请92/03917；Lonberg，N.等，1994 Nature 3 68：856-859；Green，L.L.等，1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等，1994 Proc.～Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等，1993 Year Immuno.17：33-40；Tuaillon等，1993 PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等，1991 Eur.J.Immunol 21：1323-1326)。在一个实施方案中，杂交瘤可产生自人CD5+、B-1细胞。或者，“人化的”鼠杂交瘤可用来识别交叉反应的“局部缺血抗原”。 

单克隆抗体也可由重组DNA技术领域的技术人员已知的其他方法产生。一个备择方法，称为“组合抗体展示”方法，已经被发展来鉴定和分离具有特定的抗原特异性的抗体片段，并且可用来产生单克隆抗体(组合抗体展示的描述参见Sastry等，1989 PNAS 86：5，728；Huse等，1989 Science 246：1275；和Orlandi等，1989 PNAS 86：3833)。如上所述用抗原免疫动物后，所得B细胞集合体的抗体库中所有抗体(repertoire)都被克隆。通过使用混合的低聚物引物和PCR，用众所周知的方法获得不同群的免疫球蛋白分子的可变区DNA序列。例如，与5’引导序列(信号肽)和/或框架序列1(FR1)相应的混合的寡核苷酸引物，以及保守3’恒定区域的引物可被用于PCR从大量鼠抗体中扩增重链和轻链可变区(Larrick等，1991，BiotecXlniq7es11：152-156)。相似的策略也可用来从人抗体中扩增人重链和轻链可  变区(Larrick等，1991，方法学：酶学方法手册2：106-110)。 

在一个示例性的实施方案中，用标准的实验方案从B淋巴细胞如外周血细胞、骨髓或脾制剂分离RNA(如，美国专利No.4,683,202；Orlandi等，PNAS(1989)86：3833-3837；Sastry等，PNAS(1989)86：5728-5732；和Huse等，(1989)Science 246：1275-1281)。第一链cDNA的合成，除信号序列的引物外，还用特异性针对重链恒定区及每个κ和χ轻链的引物。用可变区PCR引物，重链和轻链的可变区都被扩增，各自独立或组合，并被连接于适当载体以进一步操作产生展示的包装。用于扩增方案的寡核苷酸引物可以是单一的或简并的或者在简并位置掺入次黄嘌呤核苷。限制性内切酶识别序列也可整合到引物中，使扩增的片段克隆到载体中预设的阅读框内以表达。 

从免疫得来的抗体库中所有成员克隆出V基因库，通过许多展示包装进行表达，优选自丝状噬菌体形成抗体展示库。理想中，展示包装包含一个允许从非常大的多样抗体展示库中抽样、每轮亲和分离后的快速分选以及易于从纯化的展示包装中分离抗体基因的系统。除了可购买到的产生噬菌体展示库的试剂盒外(如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录编号27-9400-01；StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录编号240612)，特别用于产生多种抗体展示库的方法和试剂的例子可在下文中找到，如Ladner等美国专利5,223,409、Kang等国际公布说明书WO 92/18619、Dower等国际公布说明书WO 91/17271、Winter等国际公布说明书WO92/20791、Markland等国际公布说明书WO 92/15679、Breitling等国际公布说明书WO 93/01288、McCafferty等国际公布说明书WO92/01047、Garrard等国际公布说明书WO92/09690、Ladner等国际公布说明书WO90/02809、Fuchs等(1991)Bio/Tech7Z010gy 9：1370-1372、Hay等(1992)Huma A7ltibody Hybrido771as 3：81-85、Huse等(1989)Science 246：1275-1281、Griffths等(1993)EMBO J 12：725-734、Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226：889-896、Clackson等(1991)  Nature 352：624-628、Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580、Garrad等(1991)Bio/Tech71010gy 9：1373-1377、Hoogenboom等(1991)Nuc.Acid Res.19：4133-4137以及Barbas等(1991)PNAS 88：7978-7982。 

在特定的实施方案中，V区结构域的重链和轻链可被表达在同一多肽上，通过结合一段柔软的接头连接以形成一个单链Fv片段，scFv基因随后被克隆到所需表达载体或噬菌体基因组上。通常如McCafferty等在文献(Nature(1990)348：552-554)中所描述的，抗体完整的V_H和V_L区域通过柔软的(甘氨酸₄-丝氨酸)₃接头(SEQ ID NO：65)连接，可用于产生单链抗体，使展示包装可基于抗原亲和力进行分离。分离出来与抗原免疫反应的scFv抗体，可随后配制成用于题述方法的药物制剂。 

一旦显示在展示包装(如丝状噬菌体)表面后，抗体库用目标抗原或其肽片段筛选以鉴定并分离表达具有抗原特异性的抗体的包装。编码所选抗体的核酸可从展示包装(如从噬菌体基因组)中获得，并通过标准的重组DNA技术亚克隆到其他表达载体中。 

获得对表面蛋白具有高亲和力的特异的抗体分子可依照本领域所知的其他方法，如包括筛选库的方法(Ladner，R.C.等，美国专利5,233,409；Ladner，R.C.等，美国专利5,403,484)。另外，这些库可用于筛选以获得模拟抗体结构决定簇的结合决定域。 

尤其是，依照蛋白质相互作用原理，特定抗体分子的Fv结合表面与其目标配体相互作用，因此V_H和V_L的序列数据(后者可以是κ或χ链类型)可用于本领域技术人员已知的蛋白质工程技术。用以前确定的得自NMR研究或晶体学数据的其他抗体三维结构，通过建模程序，可从抗体序列信息中获得包含结合决定域的蛋白质表面详细资料。参见Bajorath，J.和S.Sheriff，1996，蛋白质：结构、功能和遗传学.24(2)，152-157；Webster，D.M.和A.R.Rees，1995，在S.Paul，Ed.，分子生物学方法51，抗体工程实验方案中的″抗体结合位点的分子建模″.，Humana出版社，Totowa，NJ，pp 17-49；以及Johnson，G.、Wu，T.T.和E.A.Kabat，1995，″Seqhunt：A program toscreen aligned nucleotide and amino acid sequences，″in Methods i71MolecularBiol.51，op.cit.，pp 1-15。 

在一个实施方案中，多样的多肽库通过展示包装群被表达以形成肽展示库。理想的展示包装包含一个允许从非常大的多样肽展示库中抽样、每轮亲和分离后的快速分选以及易于从纯化的展示包装中分离肽编码基因的系统。肽展示库可以在如原核生物和病毒上，它们可被快速扩增，相对易于操作，可得到大量的无性系。首选的展示包装包括，如营养型的菌细胞、细菌芽孢，最优选细菌病毒(尤其是DNA病毒)。不过，本发明也考虑到使用真核细胞，包括酵母及其芽孢作为可能的展示包装。噬菌体展示库如上所述。 

其他技术包括用适当的“受体”，如目标抗原，进行亲和层析，随后用常规技术(如质谱分析法和NMR)鉴定分离的结合剂或配体。优选缀合了标签(如荧光团、比色检测用酶、放射性同位素或发光化合物)的可溶受体，通过检测标签来指示配体结合。或者，固定化的化合物可被有选择性的释放，并穿膜弥散与受体相互作用。 

组合文库的化合物也可与“标签”一起合成以编码文库每个成员的标识(identity)(参见W.C.Still等国际公布说明书WO 94/08051)。一般而言，该方法的特点在于使用无活性但易于检测到的可附加到固相载体或化合物上的标签。当检测到活性物质时，通过鉴定唯一的伴随标签来确定化合物的标识。这种标记方法允许合成大文库的化合物，在文库中的全套所有化合物可在很低的水平被鉴定。 

本发明的抗体可以产生自非人类生物体如大鼠或小鼠的可变区或其部分，如互补决定区(CDR或CDRs)。嵌合抗体、CDR移植抗体和人化抗体都在本发明之内。产生自非人类生物体如大鼠或小鼠的抗体，以及经修饰(如在可变框架或恒定区进行修饰以减少在人体中的抗原性)的抗体都在本发明之内。只要抗体具有至少一个抗原结合部分则任何修饰都在本发明范围之内。 

嵌合抗体(如小鼠-人单克隆抗体)可通过本领域已知的重组DNA技术来产生。例如，编码鼠类(或其他种类)单克隆抗体分子Fc恒定区的基因被限制性酶消化，以除去编码鼠Fc的区域，并被编码人Fc恒定区的等价的基因部分替换(参见Robinson等国际专利公布说明书PCT/US86/02269；Alcira等，欧洲专利公布说明书184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利公布说明书171,496；Morrison等，欧洲专利公布说明书173,494；Neuberger等，国际公布说明书WO86/01533；Cabilly等，美国专利No.4,816,567；Cabilly等，欧洲专利公布说明书125,023；Better等(1988 Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，Ca71c.Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；以及Shaw等，1988，J.Natl.CancerInst.80：1553-1559)。 

嵌合抗体的进一步人源化可通过用人Fv可变区等同的序列替换与抗原结合不直接相关的Fv可变区的序列。提供的产生人源化抗体的一般方法有Morrison，S.L.1985，Science 229：1202-1207；Oi等，1986，BioTechniques 4：214以及Queen等US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，以上所有内容均通过引用结合至本文。这些方法包括分离、操作和表达编码全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列，该可变区来自至少一个重链或轻链。这种核酸的来源对本领域技术人员是众所周知的，例如可从7E3(一种产生抗GPIIbIIIa抗体的杂交瘤)中获得。编码嵌合抗体的重组DNA或其片段可随后被克隆到合适的表达载体上。可通过CDR取代择一性的产生适合的人化抗体。美国专利5,225,539；Jones等1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等1988 Science 239：1534；及Beidler等1988 J Imnauft.ol.141：4053-4060。 

人源化的或CDR移植的抗体可通过CDR移植技术或CDR取代来产生，其中免疫球蛋白链的一个、两个或全部CDR都可被取代。  参见美国专利5,225,539；Jones等1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等1 988 Science 239：1534；Beidler等1988 J.Immunol.141：4053-4060；Winter US 5,225,539，以上全部内容均通过引用清楚的结合至本文。Winter描述了一种CDR移植方法，可用来制备本发明的人化抗体(申请于1987年3月26日，英国专利申请GB2188638A；Winter US5,225,539)，其内容通过引用清楚的结合至本文。 

人化或CDR移植的抗体会有至少一种或两种但通常是全部受体CDR(免疫球蛋白链的重链和/或轻链)被供体CDR取代。优选的供体可以是啮齿动物抗体如大鼠或小鼠抗体，受体可以是人框架或人共有框架。通常，提供CDR的免疫球蛋白被称作“供体”而提供框架的免疫球蛋白被称作“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白为非人类的(如啮齿动物)。受体框架可以是自然出现的(如人)框架或共有框架，或与之具有约85％或更高、优选90％、95％、99％或更高一致性的序列。 

特定抗体的全部CDR可被至少一部分非人类CDR取代或仅仅若干CDR被非人类CDR取代。仅在需要结合人化抗体到Fc受体时，CDR的取代才有数量上的要求。 

也在本发明范围内的是嵌合和人化抗体，其中特异性氨基酸已被替换、删除或插入。尤其优选在框架区有氨基酸置换的人化抗体，如此以提高与抗原的结合。例如，人化抗体会具有与供体框架残基或除受体框架残基外其他的氨基酸一致的框架残基。如另外一个例子，在具有小鼠CDR的人化抗体中，位于人框架区的氨基酸可被位于小鼠抗体相应位置的氨基酸替换。已知这种置换在一些实例中提高人化抗体与抗原的结合。 

本发明的抗体片段可用本领域技术人员已知的常规步骤获得。例如，用胃蛋白酶消化抗体，产生F(ab’)2片段及多种小片段。巯基乙醇还原抗体，产生单个的重链和轻链。用木瓜蛋白酶消化抗体产生Fab片段和Fc片段。 

另一方面，本发明的特点还在于经修饰的天然免疫球蛋白，例如其作为激动剂(模拟)或拮抗剂发挥作用。优选经修饰的天然免疫球蛋白，如经修饰的病原性免疫球蛋白，作为补体激活的拮抗剂发挥作用。病原性免疫球蛋白的变异体可通过诱变产生，如不连续点突变、序列的插入或删除或截短的病原性免疫球蛋白。天然免疫球蛋白的激动剂可保留与天然存在型蛋白基本上相同的生物活性或其中部分活性。天然免疫球蛋白的拮抗剂可抑制一种或多种病原性免疫球蛋白的天然出现型的活性，方式为例如能够结合于局部缺血的特异性抗原但不能激活补体途径。因此，特异的生物效应可通过用限定功能的变异体治疗来产生。 

在一个实施方案中，在天然免疫球蛋白(如病原性IgM)中结合Clq的位点可被突变，使其不再能结合Clq。例如，IgG的CH2区域及IgM的CH4区域可被突变(参见WO94/29351)，这两个区域已知含有Clq结合位点。例如，IgG的CH2区域的部分羧基末端(残基231至239，优选234至239)可被突变，该区域表现为介导Clq结合及随后的补体激活。另一个实施例中，Wright等例证了在IgM恒定区的单核苷酸变化使抗体不能引发补体依赖细胞溶解。单核苷酸的改变导致在第三恒定区的436位氨基酸上编码丝氨酸残基而不是正常的脯氨酸残基(Wright等1988，J.Biol.Chem.263：11221)。氨基酸置换可发生于抗体以改变补体结合或活性，这在本领域是众所周知的(参见Wright等1988，J.Biol.Chem.263：11221；Shulman等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：7678-7682；Arya等，(1994)J.Imnaisraol.253：1206-1212；Poon等，(1995)J.Biol.Claem.270：8571-8577，以上全部内容均通过引用结合至本文)。相应的在一个实施方案中，本发明的抗体具有改变补体结合或活性的突变。有氨基酸的添加、删除或取代的抗体在此都被称作经修饰抗体或经改变抗体。可被熟练的技术人员理解的是，用于在核苷酸或氨基酸序列上产生这种改变的方法会依据所需结果而不同。 

天然免疫球蛋白的变异体可通过以激动剂或拮抗剂活性筛选突变体的组合文库来进行鉴定，所述突变体如天然免疫球蛋白截短突变体。 

片段文库如天然免疫球蛋白的N端、C端或内部片段的编码序列可用于产生多样的片段群以筛选及随后选择该蛋白的变异体。尤其优选的变异体为添加或删除半胱氨酸残基，或者为添加或删除其中被糖基化的残基的变异体。 

通过点突变或截短获得的组合文库基因产物的筛选方法，及为具有所选特性的基因产物而筛选cDNA文库的方法。递归的总体诱变作用(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一种提高文库中功能性突变频率的方法，可与筛选实验联合用于变异体的鉴定(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。 

细胞水平的分析可被用来分析多种文库。例如，可用表达载体文库转染细胞系，如通常对蛋白质的应答为底物依赖方式的细胞系。然后质粒DNA可从能通过病原性免疫球蛋白底物抑制或(二选一的)增强信号转导的细胞中回收，并且进一步鉴定单克隆。 

本发明的特点也在于制造天然免疫球蛋白的方法，如具有非野生型活性(如天然存在的免疫球蛋白的拮抗剂或激动剂或超激动剂)的病原性免疫球蛋白。方法包括：改变天然免疫球蛋白的序列如通过替换或删除非保守区域的一个或多个残基、结构域或这里公开的残基，并测试改变后多肽的所需活性。 

另外，本发明的特点是制造天然免疫球蛋白的片段或类似物的方法，如具有生物活性被改变的病原性免疫球蛋白，其活性与自然存在的病原性免疫球蛋白不同。方法包括：序列的改变，如通过置换或删除病原性免疫球蛋白的一个或多个残基，如改变非保守区域的序列或结构域或这里公开的残基，并测试改变后多肽的所需活性。在一个示例性的实施方案中，经修饰的天然免疫球蛋白激活补体的  能力可被降低。例如，与补体结合和/或激活有关的一个或多个氨基酸残基被突变。 

在某个实施方案中，经修饰的天然抗体可至少含有SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：10)的CDR1区或其抗原结合部分，以及/或至少含有SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：12)的CDR2区或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，经修饰的抗体可至少含有SEQ ID NO：2(SEQ IDNO：4)的CDR1区或其抗原结合部分，以及/或至少含有SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：6)的CDR2区或其抗原结合部分。在一个示例性的实施方案中，经修饰的抗体含有SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：10)的CDR1区和SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：12)的CDR2区或其抗原结合部分。在另一个示例性的实施方案中，经修饰的抗体含有SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：4)的CDR1区和SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：6)的CDR2区或其抗原结合部分。经修饰的抗体也可含有SEQ ID NO：8(SEQ IDNO：10)的CDR1区和SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：12)的CDR2区并且经修饰的抗体包含SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：4)的CDR1区和SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：6)的CDR2区或其抗原结合部分。 

经修饰的天然抗体可以是人抗体，对局部缺血特异性抗原有亲和力，相似的，例如大于、小于或等于以ATCC检索号保藏的PTA-3507的杂交瘤产生的抗体亲和力。再一个实施方案中，天然抗体可以是非人类如奶牛、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猪或兔的抗体。在一个示例性的实施方案中，非人类抗体为鼠类抗体。天然抗体也可是重组抗体。在一个示例性的实施方案中，天然抗体为人源化的抗体。经修饰的天然抗体可以是IgG或IgM抗体。在另一个实施方案中，分离的天然免疫球蛋白与以ATCC检索号保藏的PTA-3507的杂交瘤产生的免疫球蛋白具有同样的抗原特异性。 

6.4鉴定添加的抑制剂的筛选实验 

可从一个或多个(如多数)测试化合物中鉴定天然IgM抗体与抗原或补体途径的成分之间相互作用的其他抑制剂，包含(i)在使  天然IgM抗体与抗原或补体途径的成分的结合能够发生的情况下，提供包括天然IgM抗体及抗原或补体途径的成分的反应混合物；(ii)用一个或多个测试化合物(如组合文库的成员)与天然IgM抗体和抗原或补体途径的成分接触；及(iii)检测在所给测试化合物存在时相对于缺少测试化合物时，天然IgM抗体和抗原或补体途径的成分结合的任何改变。在所给测试化合物存在时，相对于缺少测试化合物时所检测到的，天然IgM抗体和抗原或补体途径的成分之间结合水平的改变(如降低)说明测试化合物是天然IgM抗体和抗原或补体途径的成分之间相互作用的抑制剂。 

该方法可进一步包括用一个或多个测试化合物预处理天然IgM抗体。预处理后的天然IgM抗体可随后被注射到天然免疫球蛋白缺乏的小鼠中。 

在某些实施方案中，这些方法在体外完成。在一个示例性的实施方案中，接触步骤在体内实施。在一个示例性的实施方案中，抗原为肌球蛋白。在另一个实施方案中，抗原为从受试者如患有再灌注或局部缺血损伤的病人获得的内皮组织或溶胞产物。再一个示例性的实施方案中，补体途径的成分是经典补体激活途径的成分。此外的实施方案中，补体途径的成分为CI分子或其亚基(如Clq)。 

在示例性的实施方案中，要么天然IgM抗体要么抗原(或两者)被可检测到的信号如荧光团、比色检测用酶、放射性同位素或发光化合物等标记。此外该方法可包括至少一个步骤的重复，如用文库的第二或后继成员或多数成员接触的步骤。 

在一个示例性的实施方案中，多种测试化合物，如文库成员被测试。多种测试化合物如文库成员可包括至少10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或10⁸种化合物。优选的实施方案中，多种测试化合物如文库成员的结构或功能特性相同。测试化合物可以是肽或有机小分子。 

在一个实施方案中，抑制剂是可在组合文库中被鉴定的有机小分子。在一个实施方案中，本发明提供了抑制剂文库。组合文库的  合成在本领域是众所周知的并已有综述(参见E.M.Gordon等，J.Med.Chenu.(1994)37：1385-1401；DeWitt，S.H.；Czamik，A.W Acc.Chem.Res.(1996)29：114；Armstrong，R.W.；Combs，A.P；Tempest，P.A.；Brown，S.D.；Keating，T.A.Acc.Claem.Res.(1996)29：123；Ellman，J.A.Acc.CAlem.Res.(1996)29：132；Gordon，E.M.；Gallop，M.A.；Patel，D.V.Acc.Claem.Res.(1996)29：144；Lowe，G.Chem.Soc.Rev.(1995)309，Blondelle等Trends Anal.Chem..(1995)14：83；Chen等J..Am.Chem.Soc.(1994)116：2661；美国专利5,359,115，5、362,899及5,288,514；PCT公布说明书W092/10092、W093/09668、W091/07087、W093/20242、W094/08051)。 

本发明化合物的文库可依照多种方法制备，有一些是本领域已知的。例如，“分离-混合”(split-pool)策略可被用于以下方法：珠状功能化聚合支持体被放置于多个反应器内；适合固相肽合成的多种聚合支持体是已知的，有一些可购买到(例如，参见M.Bodansky的“肽合成原则”第二版Springer-Verlag，Berlin(1993))。向每份微珠中加入不同活化氨基酸的溶液，使反应进行以产生多个固定化的氨基酸，每个反应器产生一种。各份衍生微珠随后被洗涤、“混合”(即调配)，混合的微珠再被分开，将每份放置到单独的反应器内。另一种活化的氨基酸随后被加入每份微珠。重复合成循环直到获得所需长度的肽。每个合成循环加入的氨基酸残基可以是随机选择的；或者，可选择氨基酸以提供“偏好”文库，例如文库中抑制剂的某些部分是非随机选择的，提供与已知肽(该肽能与抗体相互作用)的已知结构(如抗独特型抗体的抗原结合位点)具有相似性或同源性的抑制剂。可理解的是，用该方法易于产生广泛的多种肽、拟肽或非肽化合物。 

“分离一混合”策略产生的肽(如抑制剂)库如可用于制备本发明测试化合物文库。在另一个例证的合成中，“diversomer文库”由Hobbs Dewitt等人的方法制造(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909  (1993))。其他的合成方法包括Houghten的“茶袋法”(tea-bag)技术(参见Houghten等Nature 354：84-86(1991))也可依照题述发明用于合成化合物文库。化合物文库可被筛选以确定是否文库的任一成员都具有所需活性，如果是则鉴定活性种类。筛选组合文库的方法已有描述(参见上述Gordon等JMed.Chem.)。可溶的化合物文库可用适当的受体通过亲和层析进行筛选以分离受体的配体，随后用常规技术(如质谱测定法、NMR等)鉴定分离的配体。固定的化合物可用可溶受体通过接触化合物进行筛选；优选与标签缀合的(如荧光团、比色检测用酶、放射性同位素或发光化合物等)的可溶受体，通过检测标签来指示配体的结合。或者，固定的化合物可被有选择性的释放，并可穿膜弥散与受体相互作用。用于筛选本发明文库的示例性实验如下所述。 

在一个实施方案中，可筛选本发明的化合物与天然免疫球蛋白相互作用的能力，方法为分析各化合物直接与免疫球蛋白结合的活性或抑制免疫球蛋白与局部缺血抗原之间相互作用的活性，例如通过测试化合物与免疫球蛋白和溶胞产物(如上皮细胞)的温育(如在单孔或多孔板比如标准的96孔微孔板中)。在该实施方案中，各个化合物的活性可被确定。无测试化合物的一个或多个孔可被用作对照。温育后，每个测试化合物的活性可通过各个孔的实验来确定。因此，多个化合物的活性可被平行测定。 

6.5经修饰的抑制剂及药物和诊断制剂 

例如，IgM的抑制剂经修饰可提高溶解性和/或促进纯化、鉴别、检测和/或结构鉴定。示例性的修饰包括如添加：谷胱甘肽S-转移酶、A蛋白、G蛋白、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、HA、myc、多精氨酸、多组氨酸、多组氨酸-天冬氨酸或FLAG融合蛋白与标签。在不同的实施方案中，IgM抑制剂可包含一个或多个异源融合。例如，肽可含有相同融合区域的多重拷贝或可含有两个或多个不同区域的融合。融合可出现在肽的N端、肽的  C端，或既在N端又在C端。本发明范围也包括本发明肽之间的接头序列以及融合区域，该区域是为了易于构建融合蛋白、或者优化蛋白的表达或融合蛋白的结构参数。在另一个实施方案中，为了在蛋白表达后或此后除去标签，肽可被构建为在融合蛋白和本发明肽之间含有蛋白酶切割位点。合适的内切蛋白酶例子如Xa因子和TEV蛋白酶。 

制造融合基因的技术是众所周知的。基本上，按照常规技术，使用用平末端或粘末端连接、限制性核酸内切酶消化以提供合适的末端、适当补平粘末端、碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接、以及酶连接，来完成各种编码不同多肽序列的DNA片段的连接。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术来合成，包括自动DNA合成仪。或者，基因片段的PCR扩增可用锚定引物完成，引物使连续的基因片段之间产生互补突出端，随后可经退火以产生嵌合基因序列(参见分子生物学通用实验方案，Ausubel等编著，John Wiley &Sons：1992)。 

IgM抑制剂可以在连接于聚合物的价键的基础上进行化学修饰。典型的聚合物是水溶性的，以便抑制剂附着其上而不会在水相环境例如生理环境下沉淀。聚合物可具有单个的反应基团，如酰化作用的活性酯或烃化作用的醛，使聚合程度可被控制。优选的活性醛是水溶性的聚乙二醇丙醛，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利5,252,714)。聚合物可以是分支或无分支的。优选的，对于治疗用途的终产物的制备，聚合物应是药学上可接受的。水溶性聚合物或所需的其混合物，可选自如聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于糖类的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚丙烯氧化物/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(如丙三醇)和聚乙烯醇。 

可用如同位素标签标记IgM抑制剂，以易于用核磁共振或其他合适的方法检测。示例性的同位素标签包括放射性同位素标记例如  钾40(⁴⁰K)、碳14(¹⁴C)、氚(³H)、硫35(³⁵S)、磷32(³²p)、锝99m(^99mTc)、铊201(²⁰¹T1)、镓67(⁶⁷Ga)、铟111(¹¹¹In)、碘123(¹²³I)、碘131(¹³¹I)、钇90(⁹⁰Y)、钐153(¹⁵³Sm)、铼186(¹⁸⁶Re)、铼188(¹⁸⁸Re)、镝165(¹⁶⁵Dy)和钬166(¹⁶⁶Ho)。同位素标记也可以是非零核自旋的原子，包括如氢1(¹H)、氢2(²H)、氚3(³H)、磷31(³¹P)、钠23(²³Na)、氮14(¹⁴N)、氮15(¹⁵N)、碳13(¹³C)和氟19(¹⁹F)。在某些实施方案中，用同位素标记对抑制剂进行均匀标记，如其中至少50％、70％、80％、90％、95％或98％的抑制剂被标记。在其他的实施方案中，同位素标记位于抑制剂中一个或多个特有的部位，例如标签可以被特异的整合于肽的一个或多个亮氨酸残基。单个抑制剂可含有两个或多个不同的同位素标记，例如肽可既含有¹⁵N又含有¹³C标记。 

抑制剂可用荧光标签进行标记。在一个示例性的实施方案中，抑制剂与异源的多肽序列融合，该序列产生可检测的荧光信号，包括如绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、海洋肠腔动物(Renilla reniformis)绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、增强的蓝绿荧光蛋白(ECFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、柠檬色和来自圆盘海葵(discosoma)的红色荧光蛋白(dsRED)。 

天然抗体抑制剂(包括天然IgM抗体结合肽或经修饰的天然IgM抗体)的毒性和治疗效果可通过标准的在细胞培养或实验动物中的药学程序来确定，例如确定LD50(总数50％的致死剂量)和ED50(总数50％有治疗效果的剂量)。毒性和疗效的剂量比为治疗指数，可被表达为LD50/ED50的比值。优选显示巨大疗效的天然抗体抑制剂。虽然可使用有毒副作用的天然抗体抑制剂或天然抗体结合肽，但是应小心设计递药系统将这种肽或经修饰的抗体对准作用组织的位点，以使对非发炎细胞的潜在损伤减小到最低并因此降低副作用。 

从细胞培养实验和动物实验得到的数据可被用于计算人体中使  用剂量的范围。天然抗体抑制剂或天然抗体结合肽的剂量优选在包括ED50的循环浓度的范围内，很少或没有毒性。剂量可根据使用的剂型和采取的给药途径在此范围内变动。对于任何本发明方法中用抑制剂或的肽来说，治疗上的有效剂量最初可从细胞培养实验进行评价。在动物模型中剂量可被计算为完成循环的血浆浓度范围，包括在细胞培养中确定的IC50(即测试化合物对症状的抑制达到最大程度的一半时的浓度)。这种信息可用于更准确的确定人体中的有用剂量。例如通过高效液相色谱可测量血浆中的水平。 

在另一个实施方案中，天然抗体抑制剂的单次团注剂(bolus)包括天然IgM抗体结合肽和经修饰的天然IgM抗体，在组织损伤之前、同时或随后给药。典型的单剂量注射可在组织损伤后的数小时、数天或数周。本发明部分基于天然IgM抗体抑制剂阻止再灌注损伤这一发现。单剂量给药可立即在损伤位点附近给予或在如引流或流到损伤位点的脉管附近给予。 

天然IgM抗体抑制剂例如天然IgM抗体结合肽或经修饰天然IgM抗体的最初给药要在靶器官或组织损伤的时间点前。这可能对确定为有患再灌注损伤危险的受试者是有用的，例如有再灌注损伤病史或快要经历手术的那些受试者。 

还一个实施方案中，天然IgM抗体抑制剂的单次团注随后可以进行天然IgM抗体抑制剂的连续输注给药或另外的团注递药。可连续数小时、数天、数周、数月或数年时间给予抑制剂。此外，考虑到在给予天然抗体结合肽或其他天然抗体抑制剂之前或随后，结合给予另外的治疗剂剂。可与天然IgM抗体抑制剂一起给药的其他的治疗剂剂，包括但不限于抗凝剂和补体抑制剂。 

题述抑制剂可以在药学可接受的载体中提供或配制为多种给药方式，包括全身或局部或定位给药。技术和配方通常可在Remmington’s药物科学(Meade Publishing Co.，Easton，PA.)中找到。在某些实施方案中，提供经粘膜或经皮肤递送的抑制剂。对于这种  给药，适于透过屏障的渗透剂与多肽一起用于制剂中。这种渗透剂是在本领域被广为人知，包括如跨粘膜给药的胆汁盐和夫西地酸衍生物。此外，可用去污剂以利于渗透。跨粘膜给药可通过鼻腔喷雾或用拴剂进行。对于局部给药，本发明的抑制剂可如本领域普遍所知的被配制为软膏、药膏、凝胶或乳剂。 

用载体、赋形剂和添加剂或助剂将天然IgM抗体抑制剂制成适合给予受试者的形式，从而制备本发明的药用组合物。经常用到的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖类、滑石粉、乳蛋白质、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇，和溶剂如无菌水、乙醇、丙三醇和多元醇。静脉内载体包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其他药物可接受的载体包括含水溶液，无毒辅料包括盐、防腐剂、缓冲剂等，例如Remington‘s药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.Easton：MackPublishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975))和国家配方手册(TheNational Formulary XIV.，14th ed.Washington：American PharmaceuticalAssociation(1975))中所描述的，因此其内容通过引用结合至本文。依照本领域常规技术调整PH和药用组合物的不同成分的精确浓度。参见Goodman和Gilman的治疗的药理基础(The PharmacologicalBasis for Therapeutics(7th ed.))。 

优选以剂量单位制备和给予药用组合物。固态的剂量单位是片剂、胶囊和栓剂，并包括如基于藻酸盐的pH依赖性释放凝胶胶囊。对于受试者的治疗，依赖化合物的活性、给药方式、病症的性质和严重度、受试者的年龄和体重，每日剂量不同是必要的。不过在特定情况下，较高或较低的日常剂量可能是适当的。每日剂量的给药既可通过以单剂量单位或若干较小剂量的形式进行单次给药也可通过以特定间隔细分剂量的多次给药来完成。 

依照本发明药用组合物可以治疗上的有效剂量被局部或全身给  予。该用途的有效剂量当然依赖于疾病的严重度和受试者的体重及全身状况。如上所述，外用剂量对在原位使用药用组合物给药的量可提供有用的指导，动物模型可用来确定治疗特定病症的有效剂量。例如Langer，Science，249：1527，(1990)和Gilman等(eds.)(1990)描述了不同的见解，每种都通过引用结合至本文。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种药用组合物，用于给予需要这种治疗的受试者以天然抗体结合蛋白。“给予”本发明的药用组合物可通过任何技术人员已知的方式来实现。优选的“受试者”为哺乳动物，最优选为人类。 

通过注射、快速输注、鼻咽吸收、皮肤吸收、直肠和口服，天然IgM抗体抑制剂可以胃肠外、肠道给药。用于肠胃外给药的药物可接受的载体制剂包括无菌或水的或非水溶液、混悬液和乳浊液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯类如油酸乙酯。封闭敷料的载体可用于提高皮肤渗透性及增强抗原的吸收。用于内服的液体剂型一般可由含有液体剂型的脂质体溶液组成。合适的固体或液体药物剂型是如颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬液、膏剂、气雾剂、滴剂或安瓿形式的可注射溶液，也有延长活性物质释放的药剂，其制剂中的辅料和添加剂和/或助剂如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、增甜剂和包含本领域常用的惰性稀释剂如纯水的酏剂。疾病或病症是胃肠道病症时，优选口服制剂或栓剂。 

无菌的注射液的制备可通过将天然抗体结合肽以所需量(如约10μg到约10mg/kg)掺入适当溶剂并随后灭菌，例如过滤除菌。此外，可通过标准技术如冷冻干燥或真空干燥来制备散剂。 

在另一个实施方案中，为持续释放的特征，与生物可降解的载体一起制备天然IgM抗体抑制剂以在胃肠道持续释放，或使植入长效活性剂的靶器官预期位点的活性有持续释放特征。生物可降解聚  合物包括如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、胶原、多正酯类和聚乙酸。也可使用脂质体制剂。 

另外一种递送天然IgM抗体抑制剂(如天然IgM抗体结合肽)的方式是通过递送表达天然抗体结合肽的细胞到需要修复的位点或组织。或者，细胞可与不同载体结合来递送，包括生物相容的、生物降解的或非生物降解的海绵(如胶原或其他细胞外基质材料)、棉花、聚乙醇酸、肠线、纤维素、明胶、葡聚糖、聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸脂、聚乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或形成三维结构的硝酸纤维素化合物(参见Naughton等的美国专利5,858,721，其公开内容通过引用结合至本文)。 

任何与有效成分相容的给药途径均可被使用。优选肠胃外给药，如皮下、肌肉或静脉注射。给予的有效成分的剂量依照年龄、体重和病人的个体反应遵医嘱。 

病人每日的非体重剂量可在约2.5-5.0mg/kg之间，如约2.5-3.0mg/Kg、约3.0-3.5mg/Kg、约3.5-4.0mg/Kg、约4.0-4.5mg/Kg及大约4.5-5.0mg/Kg。 

肠胃外给药的药用组合物可被制备为注射型，包含有效成分和合适的载体。肠胃外投药的载体是本领域众所周知的，包括如水、盐水溶液、林格氏液和或葡萄糖。 

载体可包括小量赋形剂以维持药物制剂的稳定性和等渗性。 

所引用溶液的制备可依照普通方式完成。 

本发明已用参考文献描述了具体的实施方案，但说明书的内容包含所有由本领域技术人员不需超出权利要求书的含义和目的而进行的修改和置换。若需要，组合物可出现于一个包装或分药装置内，其中可包含一个或多个含有有效成分的单位剂型。例如包装可包含金属或塑料薄片，如泡罩包装。包装或分药装置可附有服药说明。 

6.6可用天然IgM抗体抑制剂治疗的疾病与病症 

IgM抑制剂，例如天然IgM抗体结合肽或经修饰的天然IgM抗  体，可用于治疗许多通过结合天然IgM抗体触发的炎性疾病及病症。例如，抑制剂可用来治疗炎性疾病或病症如再灌注损伤、局部缺血损伤、中风、自身免疫溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、乳糜泻、高IgM免疫缺陷症、动脉硬化、冠状动脉疾病、脓毒症、心肌炎、脑炎、移植排斥、肝炎、甲状腺炎(如Hashimoto′s甲状腺炎、格雷夫斯病)、骨质疏松症、多肌炎、皮肌炎、I型糖尿病、痛风、皮炎、斑秃、全身性红斑狼疮、硬化性苔藓、溃疡性结肠炎、糖尿病性视网膜病、盆腔炎、牙周病、关节炎、幼年慢性关节炎(如慢性虹膜睫状体炎)、牛皮癣、骨质疏松症、糖尿病型肾病、哮喘、盆腔炎、慢性肝炎、慢性肺炎、肺纤维化、肝纤维化、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、烧伤(或热损伤)以及其他中枢神经系统(CNS；如多发性硬化症)、肠胃系统、皮肤和关联结构、免疫系统、肝胆管系统、或机体任何可与炎性成分一起出现的病变位点上的急性和慢性疾病。 

炎性病症如再灌注或局部缺血损伤可在自然出现事件后产生，如中风或心肌梗塞。再灌注或局部缺血损伤也可在手术过程期间或其后发生。能引起损伤的示例性的手术操作包括选自血管成形术、支架操作、经皮腔内斑块旋切术和搭桥术的脉管矫正技术。在一个示例性的实施方案中，再灌注或局部缺血损伤出现在心血管组织如心脏。 

此外，通过结合天然IgM抗体触发的受试者的疾病或病症可被治疗或预防，方法为通过从受试者除去或灭活天然或病原性IgM和/或产生病原性免疫球蛋白的B细胞(如这里所描述的B-1细胞)，从而减少受试者体内病原性免疫球蛋白和/或B细胞的量。 

这里描述的方法可包括从受试者体内除去或灭活病原性免疫球蛋白，如这里所述的病原性IgM，和/或产生病原性免疫球蛋白的B细胞(如这里所描述的B-1细胞)，从而减少受试者体内病原性免疫球蛋白和/或B细胞的量。 

在一个实施方案中，去除或灭活步骤先体外后体内进行。病源性免疫球蛋白或B细胞可通过血液过滤疗法被除去。或者，可用B细胞特异性抗体(如抗B-1抗体或抗CD5抗体或抗CD11G/CD18)除去B细胞。病原性免疫球蛋白如IgM的去除可通过用固定化抗原(如局部缺血特异性抗原)或固定的抗独特型抗体接触受试者的血液进行。去除或灭活病原性免疫球蛋白的步骤可通过给予受试者抗独特型抗体来完成。在另一个实施方案中，去除或灭活B细胞的步骤可通过给予受试者与毒素(如蓖麻毒素或白喉毒素)配对的B细胞靶向部分(如抗体或其抗原结合片段，或抗原)来完成。受试者为哺乳动物，如啮齿类(如小鼠)或灵长类(如人类)。在一个示例性的实施方案中，受试者在下述自然出现的事件如中风后有持续的再灌注或局部缺血损伤，并且在自然出现的事件后数分钟、一到五小时、五到十小时、十到二十小时、一到五天内完成去除步骤。在另外一个示例性的实施方案中，再灌注或局部缺血损伤出现在心血管组织如心脏中，再灌注或局部缺血损伤的预防和/或减少是通过在手术操作之前、期间和/或随后从受试者除去病原性免疫球蛋白和/或B细胞。例如，去除步骤可在手术操作前至少一到五小时、五到十小时、十到二十小时或一、二、三天前完成。去除步骤也可在手术操作期间和之后以适当的时间间隔继续。 

6.7诊断分析 

本发明进一步提供检测生物样品中天然IgM抗体存在的方法。检测受试者的天然IgM抗体，尤其是哺乳动物，特别是人类，将提供诊断受试者体内炎性疾病或病症的诊断方法。大体上，该方法包括用化合物或能检测样品中本发明天然IgM抗体或本发明核酸的试剂来接触生物样品。术语“生物样品”当用于诊断分析时意为包括分离自受试者的组织、细胞和生物液，也包括受试者体内存在的组织、细胞和液体。 

本发明的检测方法可用来在体外以及体内检测生物样品中天然  IgM抗体或本发明核酸的存在。例如，体外检测本发明核酸的技术包括Northern杂交和原位杂交。体外检测本发明多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、免疫荧光、放射免疫测定和竞争性结合测定。 

诊断用核酸可从患者的细胞和组织如骨、血、肌肉、软骨和皮肤获得。核酸如DNA和RNA可直接用于检测或可在分析前被扩增如通过用酶的PCR或其他扩增技术。利用扩增，个体内存在的原核生物的种类和菌株特性可通过原核生物基因的基因型的分析得到。缺失和插入可通过对比参考序列的基因型，扩增产物大小的改变而检测到。点突变可通过核酸如扩增的DNA与本发明核酸(该核酸可被标记)的杂交来进行鉴定。完全配对序列通过核糖核酸酶消化或通过解链温度的不同与错配双链相区别。DNA序列差别也可通过DNA片段的凝胶电泳迁移率(有或无变性剂)改变或通过直接的DNA测序而被检测到。参见Myers等，Science，230：1242(1985)。特殊位置的序列改变也可通过核酸酶保护实验来揭示，如核糖核酸酶和S1保护实验或化学裂解方法。参见如Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：4397-4401(1985)。 

检测本发明核酸(如含有题述核酸序列所示的序列)的检测剂，包括能与本发明核酸杂交的被标记的核酸探针。核酸探针可含有如本发明核酸的全长序列，或其等价物，或其部分，例如长度至少为15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严紧条件下与题述核酸序列或其互补序列特异性结合的寡核苷酸。本发明多肽(如含有题述氨基酸序列的氨基酸序列)的检测剂，包括能与本发明天然IgM抗体结合的被标记抗抗体。抗独特型抗体可以是多克隆或单克隆。一个完整的抗独特型抗体或其片段可被使用。对探针或抗体的标记也包括通过偶联(如物理连接)可检测的物质到探针或抗体而直接标记，还包括通过与其他可被直接检测的反应物反应来间接标记探针或抗体。间接标记的例子包括用荧光标记的二抗和用生物素末端  标记的DNA探针来检测一抗，使得它能够被荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测到。 

在特定的实施方案中，生物样品中本发明核酸的检测包括在聚合酶链式反应(参见美国专利No.4,683,195和4,683,202)，如锚定PCR或RACE PCR或者在连接酶链式反应(LCR)中使用探针/引物(参见Landegran等(1988)Science 241：1077-1080；和Nakazawa等(1994)PNAS 91：360-364)，后者可特用于区别本发明多核苷酸的正向同源物(参见Abravaya等(1995)Nucleic Acids Res.23：675-682)。该方法可包括以下步骤：从病人收集细胞样品；从样品细胞中分离核酸(例如基因组核酸和/或mRNA)；在可使多核苷酸发生杂交或扩增(如果存在)的条件下，用一个或多个与本发明核酸特异性杂交的引物接触核酸样品；和检测扩增产物的存在或缺乏，或检测扩增产物的大小并与对照样品的长度进行比较。 

一方面，本发明精心设计(contemplate)出样品中天然IgM抗体存在的检测方法，方法包括：(a)提供待检测天然IgM抗体存在的样品；(b)在允许抗独特型抗体与其配体作用的条件下，用抗独特型抗体接触样品，该抗体反应性对抗来自该物种题述氨基酸序列的8个连续氨基酸残基；及(c)检测抗独特型抗体与其配体的相互作用，从而检测样品中天然IgM抗体的存在。 

另一方面，本发明精心设计了样品中天然IgM抗体的检测方法，方法包括：(a)提供检测存在天然IgM抗体的样品；(b)在允许抗独特型抗体与其配体作用的条件下，用特异性结合来自本发明此类多肽的抗独特型抗体接触样品；及(c)检测抗独特型抗体与其配体的相互作用，从而检测样品中此类多肽的存在。 

在另一个实施例中，本发明精心设计了对患有与天然IgM抗体存在相关的炎性疾病或病症的患者诊断方法，包括：(a)从病人获得生物样品；(b)检测样品中本发明多肽的存在或缺失，如天然IgM抗体或编码本发明多肽的核酸；及(c)基于患者样品中本发明多肽  或编码本发明多肽的核酸的存在，对患有这种炎性疾病的患者进行诊断。 

本发明的诊断实验也可用于监测对患有与天然IgM抗体相关的炎性疾病或病症的个体的治疗有效性。例如，用天然IgM抗体治疗剂治疗之前和之后，本发明核酸或本发明多肽的存在和/或量可在患有与天然IgM抗体相关炎性疾病或病症的个体中可被检测到。用治疗剂对个体治疗后，本发明多核苷酸或多肽水平的任何改变可提供有关治疗过程的有效性的信息。特别是，生物样品中存在的本发明多核苷酸或多肽水平的无变化或降低表明对抗这种疾病或病症的治疗是成功的。 

或者，本发明多肽如天然IgM抗体可在受试者体内被检测到，通过将特异针对本发明多肽的标记抗体引入受试者体内，如检测天然IgM抗体的抗独特型抗体。例如，抗独特型抗体可被放射性核素标记，其在受试者体内的存在和定位可通过标准显像技术被检测到。 

“放射性核素”是指能产生可探测图像的分子，可通过肉眼或适当仪器如正电子发射断层扫描术(PET)和单光子发射断层扫描成像(SPECT)被检测到。用于本公开的放射性核素包括穿透光子发射体，包含γ发射体和x射线发射体。这些射线伴随核转化如电子俘获、β发射和同质异能跃迁。有用的放射性核素包括那些具80和400keV之间的光子及正电子发生器、511keV湮灭光子和可接受的辐射剂量(由于光子被吸收)、颗粒和半衰期的物质。放射性核素包括元素的放射性同位素。放射性核素的例子包括¹²³I、¹²⁵I、^99mTc、¹⁸F、 ⁶⁸Ga、⁶²Cu、¹¹¹In、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、²¹²Bi、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁶⁶Ho、 ¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁴Cu、¹⁰⁰pd、²¹²Pb、¹⁰⁹pd、⁶⁷Ga、⁹⁴Tc、¹⁰⁵Rh、⁹⁵Ru、¹¹C和⁷⁶Br。 

在一个实施方案中，识别本发明天然IgM抗体的抗独特型抗体可用^99mTc进行标记。^99mTc是通常用于核医学的放射性核素，综合了所需的物理性质以及6hr半衰期和140kevγ能量(85％作为γ光  子)，并且因为易于从钼发生器洗脱而具有的广泛的可用性。 

公布的显像剂可以以下方式使用。显像剂的有效量(1至50mci)可与药物可接受的载体结合，用于显像研究。根据本公开，公布的显像剂“有效量”被定义为足以产生临床应用仪器可接受的图像的量。本公开显像剂的有效量可在多次注射中给予。本公开显像剂的有效量依据多种因素而变动，如个体的易感性程度、年龄、性别及个体的体重、个体的特异反应和剂量。本公开显像剂的有效量也依照仪器和胶片相关的因素而变动。这种因素的优化完全在本领域技术人员的技术水平内。 

用于诊断目的的显像剂的量和成像研究的持续时间取决于治疗病症的性质和严重性、患者经历的治疗处置的性质和患者的特异反应。最终，主治医师会决定给予每个患者的显像剂的量和成像研究的持续时间。 

本公开药物可接受的载体可包括任一和全部的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。这种药学活性物质的介质和剂是本领域众所周知的。本公开的显像剂还可以在合适的稀释剂或佐剂中给予个体，与酶抑制剂或在合适的载体如人血清白蛋白或脂质体中共给药。补充的活性化合物也可被加入到本公开的显像剂。药物可接受的稀释剂包括生理盐水及水缓冲液。这里精心设计的佐剂包括间苯二酚、非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯油基醚和聚乙烯十六烷基醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、焦碳酸二乙酯和抑肽酶(trasylol)。脂质体包括水包油包水CGF乳剂及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroiniiizunol.7，27)。 

在一个实施方案中，本公开的显像剂被肠胃外注射给予(静脉、肌肉或皮下注射)。显像剂可配制为无菌、无热源、肠胃外可接受的水溶液。制备这种在pH、等渗性、稳定性等方面有规范(due)肠胃外可接受的溶液，在本领域技术范围内。适合肠胃外投药的本发明的某些药用组合物包含一种或多种显像剂以及药物可接受的无菌粉  末，临用前重建为无菌的可注射溶液或分散体，其可含有抗氧化剂、缓冲液、制菌剂、使制剂与目标受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。除了心血管显像剂，注射液用制剂应该包括等渗载体如氯化钠溶液、林格氏液、葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠溶液、乳酸林格氏溶液、葡聚糖溶液、山梨醇溶液、含有聚乙烯醇的溶液、或包含表面活性剂和粘性增强剂的渗透平衡溶液、或本领域已知的其他载体。用于本公开的制剂也可包括稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其他添加物。 

本发明还包括检测生物样品中天然IgM抗体存在的试剂盒。例如，试剂盒可包含能检测生物样品中本发明多核苷酸或多肽的标记的化合物或剂；确定样品中天然IgM抗体量的工具；及比较样品中天然IgM抗体量与标准量的工具。未标记的化合物也可与化合物标记的说明书一起被提供。化合物或剂可被包装在合适的容器中。试剂盒可进一步包含用试剂盒检测本发明多核苷酸或多肽的说明书。 

实施例 

本发明经总体上描述后，通过参考以下实施例可更易于理解，所举实施例仅仅是用来说明本发明的某些方面和实施方案，而不是为了以任何方式限制本发明。 

实施例1：局部缺血-再灌注损伤的机理 

该实施例显示补体系统缺陷的小鼠对局部缺血-再灌注损伤有抵抗力。 

为了检验局部缺血-再灌注损伤的机理，缺乏补体C3的小鼠被处理为后肢模型。基于渗透指数约50％的减少，C3-/-小鼠部分的免于损伤(参见Weiser等(1996)J.Exp.Med.1857-1864)。因此，在该鼠类模型中，补体C3是诱导完全损伤所必需的。 

Weiser等人的实验没有对补体如何被激活进行鉴定。至少可通过三种不同途径(经典激活途径、凝集素活化途径或旁路激活途径)激活血清补体系统。了解与哪种途径有关，对揭示损伤机理是重要  的。例如，经典激活途径可被IgM和IgG免疫球蛋白同种型或被血清识别蛋白C-反应性蛋白非常有效的激活。而凝集素活化途径的激活在识别特异性糖以后，如甘露聚糖结合凝集素(MBL)对甘露聚糖的识别(Epstein等，(1996)Im77lunol8，29-35)。在这两个途径中，补体C4是与C2形成催化中心组分C3的裂解的酶复合体所必需的。相对而言，旁路激活途径自发激活，导致C3转化成其激活型(C3b)并附着在外源或自身组织上。当通过灭活或置换C3转化酶(Muller-Eberhard，H.J.，(1988)Ann.Rev.Biochem.57，321-347)所有的宿主细胞都表达补体途径放大的抑制剂时，该途径被紧紧控制住。一种确定相关途径的方法是利用C4缺陷小鼠，即不能通过经典或凝集素途径形成C3转化酶。在后肢模型中比较C3或C4缺陷小鼠与野生型对照，揭示C4对完全损伤的诱导也是必需的(上述Weiser等)。这一重要发现说明抗体或MBL可能是有关的。 

实施例2：天然IgM介导局部缺血再灌注(I/R)损伤 

该实施例显示免疫球蛋白缺陷的小鼠对局部缺血-再灌注损伤有抵抗力。 

为了确定I/R损伤的介导是否涉及抗体，完全缺乏免疫球蛋白的小鼠RAG2-/-(重组酶激活基因-2缺陷)与肠模型中补体缺乏动物一起鉴定。明显的是，RAG2-/-小鼠受到保护，其水平与在补体缺乏动物(上述Weiser等)中观察到的类似。由于RAG2-/-动物也缺少成熟淋巴细胞，所以重要的是确定致病效应是抗体依赖性的(Shinkai等(1992)Cell 68，855-867)。为证实损伤的介导是通过血清抗体，缺陷动物用正常小鼠血清(上述Weiser等)或纯化的IgM(Williams等(1999)J.Appl.Physiol 86；938-42)重建。在两种情况下，重建的RAG2-/-小鼠不再受到保护并回复损伤。在后面的实验中，肠损伤模型用于此模型，损伤被认为主要受补体介导。 

这些结果的解释是，在局部缺血期间新生抗原要么被表达要么被暴露于上皮细胞表面。循环的IgM表现出识别新的决定簇，结合  并激活补体的经典激活途径。虽然抗原的性质是未知的，似乎是IgM而不是IgG主要负责激活补体，理由是用混合的IgG重建的缺陷小鼠未显著回复小鼠的损伤。一个备择假说是存在另外一个起始事件如识别改变的内皮表面的MBL途径，诱导低水平的补体激活，从而暴露新的抗原位点并通过IgM的结合放大该途径。 

实施例3：病原性IgM为B-1细胞的产物 

既然大部分循环IgM被认为代表天然抗体，即种系基因的重排产物，有可能淋巴细胞的B-1成分缺乏小鼠也可受到保护。B-1细胞具有与较多的常规B-2细胞不同的表型，因为其表达低水平的IgD和CD23，并且大部分表达细胞表面蛋白CD5(Hardy等，(1994)Inmlunol.Rev.：137，91；Kantor等(1993)Aiiiiu.Rev.I7nmunol.11，501-538，1993)。B-1细胞以小鼠中循环的减少、外围淋巴结和脾脏的有限频率的为特征，主要集中在腹膜腔内。为了检验作为病原性IgM来源的B-1细胞的作用，抗体缺乏小鼠(RAG2-/-)用5×10⁵腹膜B-1细胞重建并在处理前静息约30天。循环IgM水平在过继性转移后的一个月内达到近乎正常的范围。在肠局部缺血模型中对B-1细胞重建小鼠的鉴定证实B-1细胞是病原性IgM的主要来源(参见上述Williams等(1999))。这是重要的观察结果，因为B-1细胞天然抗体的所有组成成分比常规B-2细胞所预期的要有限的多。因此，病原性抗体代表种系产物是可能的。 

实施例4：Cr2-/-小鼠免于局部缺血再灌注损伤 

Cr2-/-敲除小鼠的初步鉴定显示B-la或CD5+B-1细胞的频率大约减少50％(Ahearn等(1996)Isamnaity 4：251-262)。但是对另一品系的Cr2缺乏小鼠的鉴定未鉴别到相似的减少(Molina等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，3357-3361)。CD5+细胞频率的不同是否是由于品系背景的变化或环境的不同还是未知。尽管在Cr2-/-小鼠中B-1细胞频率降低，但IgM循环水平是在正常范围内。这些发现说明在Cr2缺乏动物中IgM的所有组成成分可能是不同的。为检验该假说，  鉴定肠I/R模型小鼠。令人惊讶的是，Cr2-/-小鼠同完全抗体缺乏的小鼠一样受到保护(图3)。比较肠模型处理后5天的存活率，证明WT与Cr2缺乏动物相比死亡率显著增加。与增加的死亡率相一致的是，从处理后WT或Cr2-/-缺乏小鼠收获的组织切片上观察到损伤明显减少。 

肠粘膜层的重度损伤在WT小鼠或用混合的IgM或B-1细胞重建的Cr2-/-小鼠中被观察到。通过对比，分离自处理后Cr2-/-小鼠的组织切片与阴性对照的切片类似。因此，尽管IgM的循环水平正常，Cr2缺乏小鼠免受损伤。这些结果不仅证实了B-1细胞作为病原性抗体的重要性也说明补体系统不明原因的与天然抗体所有组成成分的形成或维持有关。例如，补体可涉及B-1细胞的正向选择。 

实施例5：病原性IgM的鉴定 

该实施例描述了从正常B-1细胞产生特异的杂交瘤克隆及对产生病原性IgM的单克隆的鉴定。病原性IgM被显示出在抗体缺陷小鼠体内回复损伤。 

在患有补体受体CD21/CD35缺乏的小鼠中的研究，显示小鼠缺少病原性抗体。这一发现在意料之外，因为其血液中含有正常水平的IgM。这些发现导致的假说为，特异的B细胞群，称作B-1细胞负责分泌病原性IgM。例如，将正常小鼠的B-1细胞移植入受体缺乏小鼠(Cr2-/-)回复损伤，确定B-1细胞的重要性。为了鉴定负责损伤的特异性的一种或多种抗体，从正常小鼠收获并富集腹膜B-1细胞群，构建一组杂交瘤克隆。从腹膜细胞的富集部分制备杂交瘤的一般方法包括从七天前用IL-10处理的小鼠收获腹膜细胞，再用磁珠进行负选择富集CD23阴性B细胞。富集的B细胞用FACS进行分析，然后用IgM、Mac-1和CD23特异的Mab染色。富集的群进一步通过与LPS培养24小时而被激活。激活的细胞在PEG存在下用融合配偶体骨髓瘤细胞杂交并在HAT-选择性培养基中生长。通过ELISA筛选杂交瘤的IgM分泌克隆，阳性孔被扩展以纯化  IgM。 

通过混合各个克隆的等量的IgM产物，分析22个分泌IgM的杂交瘤克隆。用混合的IgM处理的抗体缺乏小鼠与用来自血清的混合IgM处理小鼠的观察结构相似，回复了损伤。这一发现证实病原性IgM在22个杂交瘤中生成。混合抗体划分为两部分，即1-11和12-22，用两部分处理小鼠，发现病原性抗体被划分到含有22号克隆的群。最后，用克隆17或22重建小鼠。克隆22回复损伤而其他克隆都没有(见图4)。 

实施例6：补体参与B-1细胞选择 

提出两个不同的模型来解释B-1细胞的发育。谱系假说提出B-1细胞在胎儿早期作为特殊群发育(上述Kantor等，1993)。或者，B-1细胞从与常规B细胞同样的祖细胞发育而来，但依赖其环境(即遭遇抗原)，他们发育为B-1或保留B-2细胞表现型(Wortis，H.H.(1992)Int.Rev.Immunol.8，235；Clarke，J.(1998)Exp.Med.187，1325-1334)。不论其起源，已知B-1细胞不与B-2细胞以同样的频率由成人骨髓补足，其表现型更类似于胎儿早期肝B细胞或新生儿骨髓(BM)细胞。与早期起源一致的是，其所有组成成分倾向于偏好表达更多邻近的V_H基因和N核苷酸的加入有限(Gu et al.(1990)EMBO J 9，2133；Feeney，J.(1990)Exp.Med.172，1377)。考虑到由成人BM干细胞补给的减少，这似乎是适当的，即B-1细胞是自我更新的，抗原刺激对其更新、分化甚至起始选择可能是重要的(Hayakawa等(1986)Eur.J.Immunol.16，1313)。的确为常规模型所固有，B-1细胞必需是抗原选择的。 

支持B细胞受体(BCR)信号需要B-1细胞正向选择的证据来自BCR信号改变的突变小鼠。例如，通过CD19、vav或Btk信号的BCR损伤显著影响了B-1细胞的发育。相对的，在诸如CD22或SHIP-1缺乏小鼠中缺失负向选择可导致B-1细胞频率的增加(O′Keefe等(1996)Science 274，798-801；Shultz等(1993)Cell73，1445)。最近  用具有两种不同免疫球蛋白转基因(V_H12(B-1细胞表现型)或V_HB1-8(B-2细胞表现型))的小鼠进行了巧妙的研究，证实B-1细胞通过自体抗原进行正向选择的观点。例如，单独表达V_H12或与B1-8一起表达的B细胞发育为B-1细胞表现型。然而，如果有也只有很少的B细胞被鉴定为仅表达B1-8转基因。因此，这些结果说明遭遇自身PtC的转基因B细胞导致那些表达V_H12的细胞扩展。B-1细胞的选择最近由Hardy等人报道(1994)Immunol.Rev.137，91)。在他们的模型中，选择表达特异针对Thy1.1的免疫球蛋白转基因的B细胞，并在表达同源抗原的小鼠中扩展。相对的，转基因B-1细胞在表达替代的异型Thy1.1的小鼠中未被找到。 

补体在何处配合B-1细胞发育呢？B-1细胞频率的全面减少及表达I/R损伤有关的IgM的B-1细胞更特别缺少，说明CD21/CD35在正向选择或维持B-1细胞中的作用。补体的一个可能作用是在遭遇同源抗原时增强BCR信号。对CD21/CD35缺乏小鼠的生化研究和分析证明共受体信号在常规B细胞的激活和存活方面的重要性(Carroll，M.C.，(1998)Ann.Rev.Innrzunol.16，545-568；Fearon等(1995)Aiiiiu.Rev.lintizunol.13，127-149)。很可能B-1细胞同样利用共受体信号来增强BCR信号。例如，细菌表达典型的B-1细胞抗原例如磷酸胆碱，并且用补体配体C3d包被细菌可增强共受体与BCR的交联及增强总体信号不是不适当的。因此，较低水平表达的抗原可能需要补体增强作用以使得同源B细胞对其识别和扩展或被正向选择。补体受体另外的作用是将抗原定位于淋巴样隔室内的滤泡树突细胞(FDC)上。不过，既然主要的B-1细胞群占据腹膜组织，细胞是否会遇到淋巴样结构内的FDC还不清楚。B-1细胞经历正向选择的真实位点或多位点是未知的。可能在胚胎发育早期或在新生儿BM中这些细胞必须遭遇同源抗原。若情况如此，可预计在这些隔室中的基质细胞上补体受体结合抗原以递呈给B细胞。可能补体受体能参与发育的两个阶段。首先，补体受体可能增强在最初的正  向选择中的抗原信号。其次，作为选择的B-1细胞在外周位点被补足，补体受体可再次参与BCR信号的增强作用。 

图5是提出的补体和补体受体在正向选择腹膜B-1淋巴细胞中作用的示意图。补体-配体包被抗原(自身和非自身)的相互作用导致CD21/CD19共受体与细胞表面的BCR的共连接，导致信号和正向选择增强。 

实施例7：实施例8-11的材料与方法 

噬菌体展示肽库和肽合成 

依据厂家推荐，12-mer的M13展示库(纽英伦生物技术公司，MA)用包被有IgM^CM-22的MBL-微珠进行四轮筛选并用包被有IgMCM-75的微珠进行2轮筛选。从富集库中选出噬菌体克隆，至少确定10个克隆的有关噬菌体基因的核苷酸序列。所选肽在哈佛大学蛋白组学中心或纽英伦肽公司(Gardner，MA)合成，纯度大于95％。 

结合实验 

如前所述(Zhang等(2004)PNAS USA 101：3886-91)完成结合测定ELISA。简短的说，结合噬菌体或噬菌体特异肽的IgM通过用饱和量的抗原包被96孔板来确定。阻断后，加入IgM(1或10μg/ml)37℃作用2hr。洗板并随后用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgM(Sigma，MO)显影。IgM与NMHC-II的结合通过培养预先包被了特异的兔抗(NMHC-11 A & B；Covance Research Products；NMHC-II C为Adelstein(NHLBI，NIH，Bethesda，MD)所赠)或泛肌球蛋白Hc(Sigma，MO)的96孔板确定，而肠溶胞产物制备自IgMCM-22重建的RAG-1-/-小鼠，如所述进行阴性处理或缺血处理(Zhang等(2004)PNAS USA 101：3886-91)。如所述制备溶胞产物用于免疫沉淀(见下)。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgM(Sigma，MO)随后被用于检测结合的IgM。 

肠RI模型 

如以前所述完成RI的手术设计(Zhang等(2004)PNAS USA 101：3886-91)。简短的说，进行剖腹手术，微型夹(压力125g，Roboz，MD)被用于上部肠系膜动脉，用缝合丝线限制空肠区段20cm的两侧的循环。局部缺血40分钟后，移走微型夹，通过恢复脉管弓形组织的搏动并变为粉红色确定肠系膜动脉的再灌注。闭合切口，所有动物保温3小时。重建的RAG-1-/-动物接受与肽或盐液混合的IgM，在剖腹手术开始前30分钟静脉注射0.2ml。WT动物用盐液或肽处理，在再灌注前静脉注射5分钟。再灌注结束时，采集空肠的局部缺血区段，切下中央的4cm用于病理分析。 

组织病理学和免疫组织化学分析 

肠组织的冷冻切片用苏木精和伊红(H&E)染色并通过光镜检查粘膜损伤。病理学评分的评价基于Chiu的程序(Chiu等Arch Surg101：484-488，1970；Chiu等Arch Surg 101：478-483，1970)，包括如所述(Zhang等(2004)PNAS USA 101：3886-91)直接检查4cm长空肠的所有微绒毛。对免疫荧光而言，冷冻切片与4％(W/V)多聚甲醛固定，与生物素标记的抗鼠IgM(Becton Dickinson，CA)温育不同时间，随后用抗生物素蛋白链菌素-Alexa-568(1：500稀释，分子探针，OR)温育1小时。通过用FITC标记的兔抗huC4c(DAKO，CO)，然后用抗-兔-Alexa 488(Molecular Probes，OR)对C4沉淀物染色来检测。通过用生物素标记的抗鼠C4对连续切片染色1小时，随后用抗生物素蛋白链菌素-FITC(Becton Dickinson，CA)染色来确定抗C4c染色的特异性。通过用FITC标记的抗C3(DAKO，CO)处理来检测C3沉淀物。切片被包埋在有DAPI(分子探针，OR)的抗退色的封固剂内。 

抗体结合肽的SPR分析 

IgM抗体(IgM^CM-22或IgM^CM-31)通过胺偶联被固定在Biacore SPRCM5芯片的流动池中，密度为33400个响应单位(RU)，如所述的(Vorup-Jensen等PNAS USA 100：1873-1878，2003)约33ng/mm²。  简短的说，参照流动池用偶联氨基乙醇-HCl来制备。稀释于PBS运行缓冲液(running buffer)的肽分别流过偶联IgM的表面和参照，25℃流速为10μl/min，数据收集率为10Hz。注射阶段持续240s(注射阶段的结束用图9A、B和C上部的箭头标识)。通过从IgM偶联表面的应答曲线扣除对照池的应答来得到结合等温线。随后每次运行后，通过注射40μl 0.05％(v/v)的聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酸酯/PBS使表面再生。 

免疫沉淀冷冻组织在溶解缓冲液(含有去垢剂和多种酶抑制剂)中匀浆。溶胞产物的样品被用来分析总蛋白质含量(Biorad试剂盒)以确保分析蛋白的水平相似。溶胞产物与包被了大鼠抗小鼠IgM的琼脂糖微珠4℃混合1hr。随后微珠被小心沉淀收集，在溶解缓冲液中洗涤，然后在还原条件下于SDS样品缓冲液中煮沸以洗脱结合的复合物。样品在6％(W/V)聚丙烯酰胺SDS胶中分离，随后固定并用考马斯蓝或银染剂染色以鉴定蛋白带。 

通过串联质谱法鉴定蛋白 

从SDS凝胶上切下单个的考马斯蓝染色带，脱色并如前所述经酶消化(Borodovsky等Cherra Biol9：1149-1159，2002)。用纳流(nanofloW)液偶联的色谱系统(Waters Cap LC)分离肽，并通过串联质谱仪(Q-TOF micro，Waters，MA)确定氨基酸序列。MS/MS数据被处理并用Mascot(Matrixscience)检索数据库Swissprot、TREMBL/New或NCBY非冗余数据库。 

实施例8：结合天然IgM抗体的富含天冬酰胺肽的鉴定 

我们之前鉴定了在肠RI模型中结合局部缺血组织的天然IgM抗体(IgM^CM-22)的杂交瘤克隆，这支持了我们的假设即局部缺血组织相对于正常组织有变化，并且在局部缺血过程中表达的新的表位是自身先天反应的靶标。为鉴定被病原性IgM^CM-22结合的配体，用包被有特异性IgM的微珠筛选随机12-mer氨基酸序列的M13噬菌体展示库。 

四轮特异性筛选和两轮用对照IgM(克隆IgM^CM-75)筛选后，分离到10个噬菌体克隆并测序了有关的M13基因序列的核苷酸序列。值得注意的是，全部10个克隆都包含天冬酰胺-富集序列。用IgM^CM-22的相对结合测定选出5个克隆，这些克隆中的一个，P8有最高结合效率，被选出做进一步研究(表4和图6A)。 

表4结合IgM^CM-22的噬菌体展示肽 

噬菌体克隆	序列	序列编号
			P1	YNNNNGNYTYRN	16
P2	ANTRNGATNNNM	18
			P3	CDSSCDSVGNCN	20
P4	WNNNGRNACNAN	22
			P5	HNSTSNGCNDNV	24
P6	NSNSRYNSNSNN	26
			P7	KRNNHNNHNRSN	28
P8	NGNNVNGNRNNN	30
			P9	NVANHNNSNHGN	32
P10	SYNNNNHVSNRN	34
			天冬酰胺-富集共有序列	xNNNxNNxNNNN	14

12氨基酸肽(P8)基于噬菌体序列被合成并分析其对噬菌体P8与IgM^CM-22结合的抑制作用(图6B)。产生50％抑制的P8肽增加量的滴定，预计浓度为10μmole。本实验表明，基于噬菌体表面表达的多种结合位点，总体的结合亲和力是适当的。该结果说明结合噬菌体P8的IgM^CM-22对肽区是特异的，合成肽可被用作真实抗原的模拟位。为进一步鉴定P8肽与IgM^CM-22的结合，用肽包被ELISA板并用IgM^CM-22或对照IgM^CM-75测试结合(图6C)。在1μg/ml的较低浓度下，两个IgM都不结合上述背景。不过，在10μg/ml时，IgM^CM-22 明显比IgM^CM-75结合的更多。总的说来，这三个结果说明肽P8特异性结合IgM^CM-22并可被用来鉴定真实抗原。 

实施例9：天冬酰胺-富集肽P8阻断肠RI 

上述研究已经证明在RAG-1^-/-小鼠中的肠RI是IgM依赖的并且仅IgM^CM-22足以回复损伤。意料中的，再灌注前用IgM^CM-22而非生理盐水重建RAG-1^-/-小鼠导致RI(如7A(i)和图7B)。通过对比，  在局部缺血小鼠注射前混合IgM^CM-22与P8显著阻碍了表观的损伤(意味着病理学评分6±3对31±31；p＜0.001)(图7Aii和图7B)。前面用IgM^CM-22的肽滴定说明P8最适浓度为10μM，足以阻断50-100μg的IgM^CM-22(0.1-0.2μM)。 

RI后对再灌注肠组织(空肠)的连续切片进行免疫组织学分析鉴定出IgM和补体C3及C4共定位于用IgM^CM-22重建的RAG-1^-/-小鼠的微绒毛内(图7Ci-vi)。通过对比，制备自接受P8小鼠的切片显示没有IgM或补体结合的证据(图7Cv-viii)。在IgM^CM-22重建的阴性对照中没有观察到IgM或补体的结合，也没有在用对照IgM^CM-31重建的RAG-1^-/-小鼠或仅用盐液重建的RAG-1^-/-小鼠中观察到(Zhang等(2004)PNAS USA 101：3886-91)。因此，P8阻碍IgM^CM-22 的结合并诱导体内损伤。 

可引发RAG-1^-/-小鼠中RI的单一天然IgM抗体的鉴定引出了在局部缺血组织上表达的可能新表位的数目以及在野生型(WT)小鼠的所有组成成分中IgM病原性克隆相应数目的普遍性问题。基于天然IgM的所有组成成分相对较少的当前理解，有限的抗体数目是可被预测的(Herzenberg等branauTaol Today 14：79-83，discussion 88-90，1993；Arnold等J ExpMed 179：1585-1595，1994)。此外，天然IgM抗体的配体被认为是高度保守的结构，在数量上也可能是有限的。为了测试P8是否代表主要自体抗原的模拟位，在肠模型再灌注前，用P8(约10μM)处理WT小鼠5分钟。在再灌注前，对用盐水或对照肽处理的小鼠空肠组织经分析，鉴定出如所预期的对微绒毛造成显著损伤(图7Aiii)。通过对比，再灌注前用P8预处理5分钟的WT小鼠阻断表观损伤(是指病理学评分5±3对24±16及23±19；p分别小于0.005和0.027)(图7A(iv)和图7B)。如所预期的，IgM、C4和C3共定位于RI处理的WT小鼠的微绒毛内(图7Cix-xii)。通过对比，在给予P8小鼠的再灌注组织中没有观察到表观的IgM或补体沉积物(图7Cxiii-xvi)。这些结果表明引发RI所必需的关键表位的数量是有限的，因为单个肽阻断损伤和IgM及补体的沉积。 

实施例10：IgM^CM-22对自身肽的免疫沉淀作用 

用P8的氨基酸序列对基因组数据库进行同源性检索显示没有精确的匹配。因此，免疫沉淀方法用来鉴定用IgM^CM-22重建RAG-1^-/-小鼠的局部缺血抗原/多种抗原。 

用优化量的IgM^CM-22重建RAG-1^-/-小鼠，处理为肠局部缺血并以不同长度的时间再灌注，即在采集组织前0分钟或15分钟。IgM抗原的免疫复合物在不同的时间点从空肠的溶胞产物中分离，在诱导条件下通过SDS-PAGE分离。染色胶的分析表明所有时间点在较低的分子量有共同的带(图8A)。不过，在15分钟时，鉴定出一个高分子量(＞200kD)的带(图8A)。 

从染色胶上切下蛋白带，酶消化并用所述的串连质谱对肽进行分析(Kocks等Mol Cell Proteonzics 2：1188-1197，2003)。被洗脱的肽的分析表明共同带约25、50和75kDa，分别代表免疫球蛋白轻链(Lc)和IgG重链(Hc)及IgM Hc。高分子量带的分析产生的肽序列与非肌肉肌球蛋白重链(NMHC)II型A及C同种型同源(表5)。 

表5：质谱测定结果 

匹配的蛋白	质谱测定的肽序列
		小鼠非肌肉肌球蛋白的重链  II-A(gi/20137006；  GenBankTM检索号：  NP071855)总分＝130；匹配  的肽＝6	VVFQEFR(MS-1；SEQ ID NO：39)  CNGVLEGIR(MS-2；SEQ ID NO：40)  KFDQLLAEEK(MS-3；SEQ ID NO：41)  KFDQLLAEEK(SEQ ID NO：41)  EQADFAIEALAK(MS-4；SEQ ID NO：42)  QLLQANPILEAFGNAK(MS-5；SEQ ID NO：43)
小鼠非肌肉肌球蛋白重链  II-C(gi/33638127；GenBankTM  检索号：AAQ24173)  总分＝133；匹配的肽＝7	CNGVLEGIR(SEQ ID NO：40)  VKPLLQVTR(MS-6；SEQ ID NO：44)  KFDQLLAEEK(SEQ ID NO：41)  KFDQLLAEEK(SEQ ID NO：41)  EQADFALEALAK(SEQ ID NO：66)  LAQAEEQLEQESR(MS-7；SEQ ID NO：45)  QLLQANPILEAFGNAK(MS-8；SEQ ID NO：46)

*分数为-10×Log(P)，其中P为观察到的匹配为随机事件的概率。个别离子分数＞53说明一致性或广泛的同源性(p＜0.05)。 

在相似的实验中用从WT小鼠制备的溶胞产物处理肠RI3小时，相似大小的200kD带也被观察到，并且序列分析鉴定为NMHC-A和C肽。 

在小鼠和人类基因组中已鉴定II型NMHC的三种形式(A、B和C)(Golomb等J Biol Chem 279：2800-2808，2004；Kelley等，JCell Biol134：675-687，1996)。  所有的真核细胞都表达II型NMHC，但三种同种型的分布不同。NMHC-II的A和B大约有85％的同源性；而NMHC-II C约有65％相似性(Golomb等，J Biol Chem 279：2800-280S，2004)。这三个同种型在小鼠和人类中高度保守。 

为证实IgM^CM-22与II型NMHC的结合，使用了ELISA方法。板包被有特异性针对NMHC三种形式的抗体或泛肌球蛋白抗体，以从制备自RAG-1^-/-小鼠空肠的溶胞产物捕获有关抗原。随后，IgM^CM-22 或IgM^CM-31被加入并用标记的抗鼠IgM抗体显像。NMHC-II的全部三种亚型都被观察到与IgM^CM-22而不是IgM^CM-31超过本底结合(图8B)。结合的序列分析及ELISA结果表明IgM^CM-22识别II型NMHC的保守区域。 

为确定肌球蛋白是否被暴露给局部缺血后的循环抗体，用纯化的兔抗泛肌球蛋白重链的IgG流分重建RAG-1^-/-小鼠。在用兔IgG重建RAG-1^-/-小鼠后，假处理小鼠的组织分析显示没有损伤或IgG沉积的证据。通过对比，在再灌注前，用泛肌球蛋白IgG重建的局部缺血的RAG-1^-/-小鼠发展出比盐水对照显著的RI(33±11对11±8，p＜0.028)(图8C)。相应的，局部缺血后肌球蛋白被暴露于循环抗体。 

比较三种NMHC-II同种型的序列与P8肽序列，鉴定出一个表观同源性的区域(表6)。全部三种同种型包括与P8序列相似的基序NxxxxNxNx。为进一步研究制备12个氨基酸的自身肽(N2)序列(NMHC-IIC同种型)。 

表6：NMHC II A-C的保守同源性序列 

用等离子体振子共振分析检测结合IgM^CM-22的表面区域(图9)。N2肽被注射到偶联有IgM^CM-22的表面(图9A)，产生强烈的响应，从稳态响应水平计算的相应的Kd值为12361μM(均值±SD，n＝2)(图9C)。相反，当对照肽被注射到特异IgM偶联的表面时(图9B)或当N2肽被注射到偶联IgM^CM-31对照的表面时(图9D)，没有观察到结合。 

实施例11：自身肽N2阻断肠RI 

为检测N2与致病性IgM的功能性结合，重建RAG-1^-/-小鼠并在RI模型中处理前约100纳摩尔的肽(或盐水对照)与IgM^CM-22混合。制备自IgM^CM-22和盐水处理的小鼠再灌注空肠组织切片的组织学分析如所预期的鉴定出损伤和IgM与补体沉积(图5Ai和5B)。通过对比，再灌注前混合了IgM^CM-22的N2肽防止损伤(平均病理学评分13±8对31±10；p＜0.049)(图10Aii和10B)。此外，当IgM^CM-22与N2肽在注射到RAG-1^-/-小鼠前混合时，再灌注空肠内未观察到IgM和补体的沉积(图10Ci-viii)。因此，如用合成肽P8所观察到的，自身肽N2阻断体内IgM^CM-22的功能性结合。 

为检测自身肽N2是否代表肠RI中主要的自身表位，在肠模型中再灌注损伤前用约40μM的合成肽P8处理WT小鼠。盐水处理WT小鼠的组织切片的组织学分析鉴定出所预期的损伤和IgM及补体的沉积(图10Aiii和10Cix-xii)。通过对比，用自身肽N2处理WT小鼠，阻断两种损伤(平均病理学评分8±5对22±17)并阻断IgM及补体的沉积(图10Aiv，图10B，图10Cxiii-xvi)。这些结果说明II型NMHC蛋白内的保守区域代表肠模型中局部缺血后天然IgM结合的主要的抗原表位。 

通过引用而结合 

这里提到的所有出版物、专利和专利申请书都通过引用整体结合到本文中，如同每个出版物或专利个体都被特异的和个别的表明以通过引用而结合到本文中。在冲突的情况下，本申请包括这里的任何定义会加以调整。 

任何多核苷酸和多肽序列也是通过完整引用来整合的，引用其进入关联的公开数据库的检索号，如在环球网上扩展域名为tigr.org的基因组研究院(TIGR)和或在环球网上扩展域名为ncbi.nlm.nih.Gov的美国国立生物技术信息中心(NCBI)。 

等价物 

本领域技术人员只用常规实验就会认识或能确定本发明这里描述的特定实施方案的许多等价物。通过以下权利要求书，这种等价物被特地包括其中。 

Claims (21)

1.一种分离的核酸，所述核酸编码由SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30或32组成的肽。

2.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸为SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29或31。

3.权利要求1的分离的核酸，其中所述肽为SEQ ID NO：30。

4.权利要求2的分离的核酸，其中所述核酸为SEQ ID NO：29。

5.一种分离的核酸，所述核酸编码为SEQ ID NO：36或38的肽。

6.权利要求5的分离的核酸，其中所述肽为SEQ ID NO：38。

7.权利要求1或5的分离的核酸，所述核酸操作性连接于启动子。

8.一种载体，所述载体含有权利要求7的核酸。

9.一种宿主细胞，所述细胞含有权利要求8的载体。

10.一种组合物，所述组合物由肽组成，所述肽由氨基酸序列SEQID NO：16、18、20、22、24、26、28、30或32组成。

11.一种组合物，所述组合物含有由氨基酸序列SEQ ID NO：36或38组成的肽。

12.权利要求11的组合物，其中所述肽由SEQ ID NO：38组成。

13.权利要求10或11的组合物，其中所述肽被聚乙二醇化。

14.权利要求10或11的组合物，其中所述肽被可检测的标签标记。

15.权利要求10或11的组合物在制备用于治疗受试者的急性炎性疾病或病症的药物中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述急性炎性疾病或病症为再灌注损伤。

17.权利要求15的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

18.权利要求15的用途，其中所述受试者为人。

19.一种由ATCC保藏号为PTA-3507的细胞产生的分离的天然免疫球蛋白，或其抗原结合部分，所述蛋白具有以下一种或多种特性：(i)能与局部缺血特异性抗原相互作用；或(ii)能固定补体。

20.权利要求19的分离的天然免疫球蛋白，所述蛋白为IgM。

21.权利要求19的分离的天然免疫球蛋白，其中的免疫球蛋白为重组抗体。

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