CN1973041A - 治疗性分子与产生和/或选择所述治疗性分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及可用于诱导例如但不限于癌细胞这样的特定细胞凋亡的治疗性分子，以及产生和/或选择治疗性分子的方法。本发明还提供诱导例如癌细胞这样的细胞发生凋亡的方法以及可用于此的药物组合物。本发明还提供通过选择性抑制促生存蛋白质来产生或选择能够诱导特定细胞凋亡的治疗剂的方法。本发明还提供基于结构结合特征进行治疗性分子设计的计算方法。

Description

治疗性分子与产生和/或选择所述治疗性分子的方法
发明背景
发明领域
本发明总体涉及可用于诱导例如但不限于癌细胞这样的特定细胞凋亡的治疗性分子，以及产生和/或选择治疗性分子的方法。本发明还提供诱导例如癌细胞这样的细胞发生凋亡的方法以及可用于此的药物组合物。本发明还提供通过选择性抑制促生存(pro-survival)蛋白质来产生或选择能够诱导特定细胞凋亡的治疗剂的方法。本发明还提供基于结构结合特征设计治疗性分子的计算机方法。
现有技术描述
本说明书中的任何现有技术参考文献均不是，也不应被视作，对该现有技术构成了任何国家的公知常识的承认或任何形式的暗示。
本文中所引用参考文献的著录项目列于本说明书末尾。
癌症是发展中国家的第二大死亡原因。除了使患者及其家属遭受痛苦之外，癌症也是在治疗上最为昂贵的疾病之一(Zhang，Nat RevDrug Discov 1：101-102，2002)。因此，尽管已经付出了人类生命的代价，如果同时考虑治疗费用以及由于使经济生产力降低而造成的损失，到2010年对社会的年度经济负担预计约为20～50亿美元。
程序性细胞死亡(凋亡)的扰乱是包括癌症在内的许多重要疾病发展过程中的一个中心步骤。Bcl-2蛋白家族是一个凋亡关键调控因子家族。研究表明，人滤泡淋巴细胞瘤中发生的Bcl-2过表达会抑制凋亡并促使肿瘤形成(Vaux等人，Nature 335：440-442，1988；Strasser等人，Nature 348：331-333，1990)。在高达90％的乳腺癌、结肠癌和前列腺癌中也注意到了Bcl-2过表达(Zhang，2002，出处同前)，这些癌症代表了一些最为普通的癌症。Bcl-2的促生存家族成员也在许多肿瘤中过表达。毫无疑问，凋亡受损目前已被视为大多数恶性肿瘤发生过程中的中心步骤(Cory等人，Nat Rev Cancer 2：647-656，2002)。
凋亡受损也是细胞毒性癌症疗法效力的一个主要障碍(Cory等人，2002，出处同前；Johnstone等人，Cell 108：153-164，2002)。大多数细胞毒性试剂，包括许多化疗药物和放射，通过比如肿瘤抑制因子p53来间接启动凋亡(Cory等人，2002，出处同前)。然而，在多数肿瘤中p53途径是失活的，阻止了该信号引发凋亡。因此，p53功能的丧失或者Bcl-2的过表达均能激发化学抗性，这是治疗失败的一个常见原因。
Bcl-2蛋白家族中促进细胞存活的那些成员，包括哺乳动物Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1，含有三或四个具有序列相似性的BH( Bcl-2  homology，Bcl-2同源物)区，并发挥功能直至被它们的BH3-only家族成员中和。这些促凋亡拮抗剂，包括哺乳动物Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa，彼此间以及与更大的家族之间仅通过短BH3结构域相关(Huang和Strasser，Cell 103：839-842，2000)。相反，Bax和Bak，促凋亡家族成员的一个亚组，却与Bcl-2共有三个BH结构域，且可能在细胞内膜透化中具有关键的下游作用(Wei等人，Science 292：727-730，2001)。
BH3-only蛋白质控制细胞稳定，损伤信号启动它们与促生存类Bcl-2蛋白质的结合，由此引发细胞死亡(Cory等人，Oncogene 22：8590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，出处同前)。它们的由转录信号(例如Bim、Puma、Noxa)或多种不同的翻译后机制(例如Bim、Bmf、Bad、Bid)所诱导的差异活化，赋予了它们某些信号特异性(Putha lakath等人，Cell Death Differ 9：505-512，2002)。然而通常认为，各种不同的BH3-only一旦被激活则通过靶向所有的促生存类Bcl-2蛋白质来发挥类似的功能(Adams等人，Genes Dev 17：2481-2495，2003；Cory等人，Oncogene 22：8590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，出处同前)。然而，它们的相互作用未得到系统的特征描述，少量的定量研究也限于Bcl-xL或Bcl-2(Letai等人，Cancer Cell 2：183-192，2002；Petros等人，2000，出处同前；Sattler等人，1997，出处同前)。确定多样变化的BH3-only蛋白质与促生存家族成员是否选择性地或混杂地相互作用，对于澄清细胞死亡是如何引发的是非常重要的(Adams，2003，出处同前；Cory等人，2003，出处同前；Danial和Korsmeyer，Cell 116：205-219，2004)且对于目前开发模拟BH3-only蛋白质起作用的化合物作为新抗癌剂的努力是非常相关的。
根据降低毒性和更好的靶向治疗这一要求，显然需要鉴定能够与类Bcl-2蛋白质相互作用并抑制其促生存功能的分子。
发明概述
在本说明书中，除非另有要求，词语“包括”及其变体如“包含”或“含有”应理解为意指包含所述整数或步骤或所述的多个整数或步骤的组，但却不排除任何其它整数或步骤或所述多个其它的整数或步骤的组。
本文中所使用的缩略语如表1所定义。
本发明提供促生存分子的小分子拮抗剂，尤其是促生存分子或其它相关促生存分子的Bcl-2家族中的一个或多个成员的小分子拮抗剂。拮抗剂的产生和/或选择以Bcl-2家族蛋白质(BH3-only蛋白质)的天然拮抗剂的模拟物和/或具有仅被小范围BH3-only蛋白质抑制的Bcl-2分子之间的结构相似性的模拟物为基础。
结构研究揭示，由促凋亡蛋白质BH3结构域形成的两性α-螺旋的疏水表面插入到由促生存蛋白质的BH1、BH2和BH3结构域形成的疏水沟中，并抑制它们的促生存功能。促凋亡蛋白质中的α-螺旋在其螺旋外部含有名称为H1、H2、H3和H4的疏水区。氨基酸序列形成七个重复。H1至H4外表面与Bcl-2蛋白质上的口袋(沟)相互作用。
根据本发明，BH3-only蛋白质可以依据与之相互作用的Bcl-2靶分子谱在功能上相区分。根据本发明将这些组分作混杂型和限制型。通过鉴定混杂型和限制型BH3-only蛋白质(尤其是围绕BH3结构域的α-螺旋与Bcl-2蛋白质疏水沟间的相互作用)的氨基酸电荷、大小、构象、溶解度、极性、疏水性、亲水性以及氨基酸对三级结构差异的贡献，可以产生或选择出模拟这些组中的一个组或其它组的模拟物。Bcl-2蛋白质还带有促进BH3-only蛋白质的混杂型或限制型活性的结构特征。
例如，可以对促凋亡分子上的七联体重复中的氨基酸进行修饰，以减弱该氨基酸或在三级结构上与之最接近的氨基酸适配插入Bcl-2蛋白质上由三级结构形成的口袋中的能力。
限制型BH3-only蛋白质由此提供具有赋予其选择性拮抗特定Bcl-2蛋白质能力的构象的支架(scaffold)。根据本发明，该支架可用作设计模拟物或模仿包括混杂型BH3-only蛋白质在内的化合物的模板，从而产生具有限制型结合谱型的拮抗剂。
相应地，在本发明的一种实施方案中，制备了能够在所选定的例如但不限于癌细胞这样的细胞类型中诱导凋亡的限制型BH3-only蛋白质的模拟物。
在本发明的另一种实施方案中，混杂型和限制型BH3-only蛋白质在与存在于促生存Bcl-2蛋白质上的结合沟之间的相互作用水平上有所不同。
本发明还提供用于预测模拟限制型BH3-only蛋白质支架的分子构象从而产生和/或选择和/或筛选候选化合物的计算方法，之后制备候选化合物并对其诱导凋亡的能力进行实验评估。
在另一种实施方案中，本发明提供一种产生或选择促生存Bcl-2蛋白质家族的拮抗剂的方法，所述方法包括：选择带有定义由BH3结构域形成的两性α-螺旋的残基位置的支架BH3-only蛋白质结构；选择一或多个与BH3-only蛋白质的混杂型结合表型相关的残基位置；将赋予其混杂型表型的氨基酸残基替换为赋予其与Bcl-2蛋白质的限制型结合模式的氨基酸或其化学类似物；分析各次替换后的相互作用其诱导更为限制的Bcl-2蛋白质结合谱的能力。
本发明还提供产生或选择促生存Bcl-2蛋白质家族的拮抗剂的方法，所述方法包括：选择限制型BH3-only蛋白质作为支架蛋白质，确定赋予该支架限制型表型的构象，产生或筛选模拟所述支架和/或赋予其限制型Bcl-2蛋白质结合谱的构象部分的化合物。
因此，本发明提供一种根据带有赋予其限制型表型的残基位置的支架BH3-only蛋白质设计促生存Bcl-2蛋白质家族的拮抗剂的计算机方法，该方法包括：选择一些混杂型BH3-only蛋白质；对这些蛋白质进行序列比对，和将这些蛋白质与限制型BH3-only蛋白质作同样的比较；根据所述比对得到各氨基酸在一或多个带来与Bcl-2蛋白质结合的混杂特性或限制特性的位置上的出现频率；利用所述频率产生一个选自电荷、大小、构象、溶解度、极性、疏水性、亲水性和对三级结构的贡献的计分函数；用所述计分函数和/或至少一种另外的计分函数来产生一套优选蛋白质序列或其构象等价物，产生或选择出一种具有与Bcl-2蛋白质的限制型结合表型的化合物或蛋白质。
在又一种实施方案中，本发明提供混杂型BH3-only蛋白质在产生或选择赋予所述BH3-only蛋白质或其化学或构象等价物以限制型结合表型的氨基酸替换变体中的用途。
另一方面，本发明构思了一种产生或选择Bcl-2蛋白质拮抗剂的方法，所述方法包括确定选自以下的一系列参数：
(1)鉴定混杂型和限制型Bcl-2蛋白质间的结构差异；
(2)鉴定混杂型和限制型BH3-only蛋白质间的结构差异；和
(3)鉴定Bcl-2-BH3-only蛋白质复合物的结构特征，然后设计与有限范围内的Bcl-2蛋白质结合的BH3-only蛋白质模拟物。
BH3-only蛋白质的模拟物也可以通过例如但不限于在芯片上(insilico)筛选、高通量化学筛选、基于功能的检测方法或结构活性关系这样的方法来产生或选择。
在另一种实施方案中，本发明的BH3-only模拟物易于以比如药物组合物这样的药物形式提供。
本发明的组合物尤其适用于治疗患有癌症或有患癌症倾向的受试者。
附图简述
图1是显示竞争结合实验的图形。(A)将Mcl-1注射进固定有突变体4EBimBH3(蓝色)或wtBimBH3(红色)的传感器芯片。为获得绝对结合(黑色)，从与wtBimBH3的反应中扣除了与4EBimBH3的基线反应。(B)促生存蛋白质等同地与Bim结合。传感图，其显示：将促生存蛋白质注射到固定化的wtBimBH3上时发生类似的反应。(C)溶液竞争实验。提高竞争肽浓度(2)使Bcl-xL与固定化配体的结合减弱(1)。(D)与竞争剂BH3肽的预温育使生物传感器反应减弱。在将Bcl-xL与BikBH3的混合物注射到wtBimBH3传感器芯片上之前，先将Bcl-xL与浓度逐渐升高的BikBH3进行了预温育。线条(430秒处)表示用于计算IC50的反应。(E)BikBH3有效地与固定化的BimBH3竞争与Bcl-xL的结合。相对反应(％)显示，在给定浓度的BikBH3存在下仍然与固定化肽结合的Bcl-xL与无BikBH3存在下的Bcl-xL(100％)的比率。(500秒后的不规律反应是由分析物解离后洗涤芯片引起的)。向专利权人提出请求可以获得彩色复印件。
图2是显示促凋亡BH3-only和促生存类Bcl-2蛋白质具有显著相互作用的图形。(A)利用竞争性结合实验，测定了所示相互作用的IC50(nM)。所示结果得自代表性实验；多次实验间观察到的差异小于两倍(用不同的芯片或不同批次的蛋白质)。(B)对相互作用的相对结合亲和力(列表于A)反向作图。显示了促生存蛋白质的BH3结合图。(C)中比较了形成其BH3结合沟的(α-螺旋2～8；Hinds等人，EMBO J 22：1497-1507，2003)人Bcl-2(残基93-202)、人Bcl-xL(86-195)、人Bcl-w(42-151)、小鼠Mcl-1(190-300)和小鼠A1(33-148)的序列，并示为系统发生树。向专利权人提出请求可以获得彩色复印件。
图3是显示Bad、Bik和Noxa在哺乳动物细胞中具有选择性促生存靶的照片。借助共免疫沉淀测试了FLAG(FL)-标记的促生存蛋白质(人Bcl-2、人Bcl-xL和小鼠Mcl-1)和HA-标记的BH3-only蛋白质(A，人Bim；B，人Puma；C，人Bik；D和E，小鼠Bad；F和G，小鼠Noxa)间的相互作用。将收获自293T细胞的等量35S-标记裂解物与HA、FLAG(FL)或对照(C)标记的抗体进行共免疫沉淀。Bim(A)或Puma(B)与Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1结合良好。在A的顶部图版中，为从大小上使Bim与Bcl-2相区分，用BimL代替了BimEL。(C)Bik偏好与Bcl-xL结合。(D)Bad结合Bcl-2和Bcl-xL，但不与Mcl-1结合，正如用同一滤膜与所示抗体做的免疫印迹(E)证实的。**内源14-3-3，与Bad结合，如免疫印迹(E)所证实的。(F)Noxa只结合Mcl-1，如免疫印迹(G)所证实。*Mcl-1的降解产物不能发生结合。
图4是显示促生存类Bcl-2蛋白质通过BH3-only蛋白质发生不同靶向的图形。BH3-only蛋白质对促生存蛋白质的亲和力(列于图2)反向作图以便能够比较BH3结构域。向专利权人提出请求可以获得彩色复印件。
图5是显示BH3肽具有成为α-螺旋倾向的图形。(A)BH3肽和马心脏肌球蛋白在30mM磷酸钠(pH7)中的CD谱，其显示所使用的BH3肽大部分是无结构的(一些具有低％的螺旋性)，而对照蛋白质马心脏肌球蛋白在缓冲条件下形成了所预期的α-螺旋。208nM和222nM处所指的最小值(箭头)对于α-螺旋多肽是典型的。(B)BH3肽和肌球蛋白在添加了30％(v/v)TFE的20mM磷酸钠(pH7)中的CD谱，其显示所有的BH3肽都具有与马心脏肌球蛋白在螺旋稳定溶剂TFE存在下的构象相似的α-螺旋构象(Nelson和Kallenbach，Biochemistry 28：5256-5261，1989)。向专利权人提出请求可以获得彩色复印件。
图6是显示促凋亡Bad和Noxa靶选择性的促生存类Bcl-2肽的图形。注射重组促生存类-Bcl-2蛋白质(Bcl-2ΔC22、Bcl-xLΔC24、Bcl-wΔC29、Mcl-1ΔN151ΔC23、A1ΔC20)或无关蛋白质(GST和LIF-受体)时，对(A)BadBH3或(B)固定有NoxaBH3的芯片的生物传感器反应。Mcl-1和A1对BadBH3无亲和力，而Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w积极结合BadBH3(A)。用NoxaBH3观察到了互补模式(B)。向专利权人提出请求可以获得彩色复印件。
图7是显示结合选择性靶的BH3-only蛋白质具有弱杀伤活性的图形。(A)对BH3-only肽对促生存蛋白质的亲和力(列于图3A)反向作图以利于比较BH3的结合模式。(B)Bim和Puma(而非Bmf、Bad、Bik、Hrk或Noxa)对MEFs的有效杀死。用只表达GFP(对照)、或表达BH3-only蛋白质之一和GFP的反转录病毒感染永生化3T9 MEF。感染后24小时利用PI排斥测定了被感染(GFp+ve)细胞的活力。柱状图表示至少三次实验的平均值±1SD。(C)用共免疫沉淀测试了FLAG(FL)-标记的促生存蛋白质(Bcl-xL和Mcl-1)与Bims(或其变体)间的相互作用。将等量来自被感染293T细胞的裂解物与Bim、FLAG(FL)标记或对照无关抗原的抗体进行共免疫沉淀(C)。用大鼠单克隆抗-FLAG抗体探测滤膜。*Mcl-1的降解产物。(D)与促生存蛋白质的结合受到限制的Bims变体是弱杀伤剂。感染后24小时分析了被编码所示蛋白质(GFP+ve)的反转录病毒感染的MEFs的活力。柱状图表示至少三次实验的平均值±1SD。(E)被表达BH3的反转录病毒感染的MEF的长期存活。用一百个被反转录感染的细胞铺板，六天后计数所形成的GFP+ve克隆的绝对数量。用Bims(+)感染后未得到集落，而Bims4E未影响长期活力。Bik、Noxa、Bims BadBH3或Bims NoxaBH3有中度影响。数据表示来自至少3次实验所形成的GFp+ve集落的平均数量±1SD。
图8是显示不同类别的BH3-only蛋白质间的合作的图形。(A)基于结合数据给出的一个模型，用于解释具有选择性靶的特定BH3-only蛋白质的弱杀伤活性。(B)促凋亡BH3-only蛋白质间的合作。用共表达BH3-only蛋白质(Bims、Bik、Noxa或Noxa3E)和GFP、或共表达BH3-only蛋白质和GFP-标记-Bims、-Bims BadBH3或-BimsNoxaBH3的反转录病毒感染MEFs。感染后24小时对细胞活力计数；数据表示至少三次实验的平均值±1SD。
图9是显示选择性较低的Noxa突变体是有效的杀伤剂的图形。(A)α-螺旋化的BimBH3区(编号指小鼠BimL)与Bcl-xL的靶沟(关键残基以黑体标记)之间的相互作用。(B)人Bim(BimL)和人Noxa的核心BH3区的比对。突变的Noxa残基框出。(C)Noxa突变体与Bcl-xL和Bcl-w的增强结合。在溶液竞争实验中测试了野生型或突变Noxa肽结合Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w或Mcl-1的能力。柱形图显示各相互作用的IC50(nM)。+：IC50＞100μM。(D)Noxa m3与Bcl-xL和Mcl-1都结合。通过共免疫沉淀测试了Bcl-xL或Mcl-1，与BimsNoxaBH3m3之间的相互作用。*Mcl-1降解产物。(E)NoxaBH3 m3是一种有效的杀伤剂。用所示反转录病毒感染后24小时MEFs的存活。(F)NoxaBH3m3的剂量依赖型杀伤。用NoxaBH3或NoxaBH3 m3感染的MEFs的活力分作低、中或高GFP表达；(E，F)中的数据表示至少三次实验的平均值±1SD。
发明详述
本发明设想用于产生BH3-only蛋白质模拟物的方法，所述模拟物计划可用于诱导选择性细胞尤其是在癌细胞中诱导凋亡。提出了利用氨基酸电荷、大小、构象、溶解度、极性、疏水性、亲水性以及对限制型BH3-only蛋白质和它们各自的靶Bcl-2蛋白质之间的三级结构相似性的贡献，以产生诱导凋亡的BH3-only蛋白质的模拟物。
在详细描述标题发明之前，应当注意，本发明不限于特定的治疗成分、生产方法、剂量方案等，可以做许多的变化。还应当理解，本发明中所使用的术语是为仅为描述特定的实施方案而不意指对其进行限制。
必须注意，如在本说明书中所使用的，单数形式的“一个”和“该”包括复数的方面，除非上下文中另外指明。因此，例如，“治疗剂”的含义包括单一试剂，以及两种或多种治疗剂；“方法”的含义包括一种单一的方法，以及两种或多种方法；“残基”包括单个残基，以及两个或多个残基，等等。
本文中的“凋亡”的含义意指细胞死亡的形式，其中发生一系列程序化的事件导致细胞的消除。
相应地，在本发明的一种实施方案中，制备了能够在所选定的例如但不限于癌细胞这样的细胞类型中诱导凋亡的限制型 BH3-only蛋白质的模拟物。
本文中的“癌细胞”的含义指，任何表现出不正常的生长、且倾向于以失控的方式增殖、并且在某些情况下发生转移的细胞。本文中所考虑的癌症包括但不限于ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、起因不明的骨髓化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星细胞瘤、共济失调-毛血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、中枢神经系统肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童期脑肿瘤、儿童期癌、儿童期白血病、儿童期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、皮肤纤维肉瘤-隆凸、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管细胞癌、内分泌腺癌、子宫内膜癌、室鼓膜瘤、食道癌、恶性骨髓瘤、肝外胆小管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、先天性骨髓发育不全、纤维肉瘤、胆汁膀胱癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养层疾病、神经胶质瘤、妇科癌、血液恶性肿瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金氏病、人视神经乳头水肿病毒、水泡状胎块、血钙过多、咽喉癌、眼内黑素瘤、岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、Langerhan′s-Cell-组织细胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni综合症、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳腺癌、恶性棒状肾肿瘤(Malignant-Rhabdoid-Tumor-of-Kidney)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、迁移癌、口癌、多发性内分泌腺瘤、蕈样霉菌病、骨髓异常增生综合征、骨髓瘤、骨髓及外骨髓增殖失调、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病遗传性疾病、Nijmegen Breakage综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘘术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、副甲状腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、红血球增多症、前列腺癌、罕见癌及其相关病症(Rare-cancers-and-associated-disorders)、肾细胞肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白内障-毛细血管扩张-色素沉着综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、恶性皮肤网状细胞增多综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊索肿瘤、鳞片细胞肉瘤(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、迁移性细胞癌(膀胱)、迁移性细胞癌(肾-骨盆-/-输尿管)、胚胎滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、Uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、阴户癌、瓦尔登斯特伦病(股骨小头的骨软骨病)巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。
作为本发明特定靶的癌症是那些产生过量Bcl-2蛋白质或促生存家族成员和/或减少量的抑制Bcl-2蛋白质的促凋亡分子的癌症。
在本发明的又一种实施方案中，BH3-only蛋白质可以是混杂型或限制型。本文中的“混杂型”的含义是指，该蛋白质结合许多种靶(即，结合全部或多种Bcl-2蛋白质)。本文中的“限制型”是指，该蛋白质仅结合特定靶(即，仅结合一种或几种Bcl-2蛋白质)。混杂型和限制型BH3-only蛋白质在存在于促生存Bcl-2蛋白质上的结合沟的相互作用的水平方面可以不同。
根据本发明，术语“靶”用于指比如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl和A1这样的Bcl-2蛋白质或任何其它含有三或四个Bcl-2同源(BH)区的促生存分子。
“靶结合物”用于描述分子和或模拟BH3-only蛋白质，其抑制促生存蛋白质。天然存在的靶结合物包括Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa。
本发明的目的是产生或选择高度限制型或特异性的模拟物，其作为特定细胞(比如癌细胞)的凋亡抑制剂的靶结合物。
本发明在另一种实施方案中，提供一种产生或选择促生存Bcl-2蛋白质家族的拮抗剂的方法，所述方法包括：选择带有定义由BH3结构域形成的两性α-螺旋之残基位置的支架BH3-only蛋白质结构；选择一或多个与BH3-only蛋白质的混杂型结合表型相关的残基位置；将赋予其混杂型表型的氨基酸残基替换为赋予其与Bcl-2蛋白质的限制型结合模式的氨基酸或其化学类似物；和分析各次替换后的相互作用其诱导更为限制的Bcl-2蛋白质结合谱的能力。
本文中的“支架蛋白”的含义是指期望其变体文库的蛋白质(也即BH3-only蛋白质)。该支架蛋白质用作蛋白质设计计算方法中的输入，且常用于促进实验文库的形成。支架蛋白可以是具有已知结构的或者可以对其结构进行计算、估计、模型化或实验测定的任何蛋白质。
本发明还提供一种产生或选择促生存Bcl-2蛋白质家族的拮抗剂的方法，所述方法包括：选择一种限制型BH3-only蛋白质作为支架蛋白质，确定赋予该支架限制型表型的构象，产生或筛选模拟所述支架和/或赋予其限制型Bcl-2蛋白质结合谱的构象部分的化合物。
在又一种实施方案中，本发明提供混杂型BH3-only蛋白质作为氨基酸残基替换基质在产生或选择替换变体中的用途，所述变体赋予所述BH3-only蛋白质或其化学或构象等价物以限制型结合表型。
在一个实施例中，描述了Noxa BH3-only蛋白质选择性的分子基础。
Noxa BH3选择性地结合Mcl-1和A1，且不结合Bcl-2、Bcl-w或Bcl-xL。
一项对Noxa BH3结构域序列的研究揭示，在人Noxa和两个鼠NoxaBH3结构域中紧邻在H4前方的氨基酸非常独特地是一个碱性氨基酸(表3)。有人提出，如果将该位置恢复为在其它BH3结构域序列中更常见的酸性残基，则会恢复其与Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL的结合。一项对突变人Noxa BH3结构域的实验(其中将相关赖氨酸替换为谷氨酸)显示，突变肽的IC50为5.8μM，也即比野生型肽紧密至少17倍。
人Noxa BH3结构域的另一个独特特性是在H3位置存在有芳香氨基酸苯丙氨酸。这是带有支链γ碳原子的唯一一次出现(表3)，提示在靶Bcl-2家族蛋白中该位置需要更多的空间来接收较大的氨基酸。若将Bcl-2家族蛋白质的氨基酸序列进行比对，很明显，Mcl-1和A1在BH3结构域H3氨基酸的受体位点包含较小的氨基酸。通过在已经发表的与Bim BH3结构域的复合Bcl-xL的三维结构(Liu，X.等人，Immunity 19：341-352，2003)上绘图以及利用上述序列比对，这一结论是有可能的。人Noxa BH3在H3位置从F突变为I导致突变肽的IC50为1.1uM，也即比野生型紧密至少90倍。K突变为E加上F突变为I的双突变显示该变化产生协同作用，其IC50为0.1μM。
这解释了本发明如何能够将选择性的BH3结构域转变为混杂型的BH3结构域。
本文中的“试剂”应理解为，源自天然、重组或合成途径的任何蛋白性或非蛋白性分子这一含义。可利用的来源包括：筛选天然产生的文库、化学分子文库以及组合文库、噬菌体展示文库以及基于体外翻译的文库。尤其有用的来源是对混杂型BH3-only蛋白质支架进行修饰从而产生限制型分子。
在一种实施方案中，本发明可用于完全抑制或部分降低Bcl-2或促生存家族成员的促生存功能的活性的试剂可以是蛋白质性的或化学分子。所有这样的对Bcl-2家族蛋白的促生存活性的降低、抑制、减弱或下调均包括在术语“拮抗剂”或“拮抗”内。
对于蛋白质性分子试剂，这样的分子包括肽、多肽和蛋白质。此外，术语突变体、部分、衍生物、同源物、类似物或模拟物意指包括各种不同形式的完全抑制或基本上降低Bcl-2家族蛋白质的促生存功能的试剂。
试剂可以是天然存在的或人工产生的分子。试剂可以是包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的BH-3 only蛋白质。试剂可以是通过突变或其它化学方法产生的，或重组或合成产生的。丙氨酸扫描是一种鉴定重要的氨基酸的有效技术(Wells，Methods Enzymol 202：2699-2705，1991)。该技术中，用丙氨酸替换氨基酸残基，并测定其对肽活性的影响。通过这种方法对试剂中的每个氨基酸残基进行分析以确定重要的结构和/或电荷和/或构象和/或疏水/亲水区域。测试试剂与Bcl-2结合的能力以及其它性质，比如寿命、结合亲和力、解离速率、跨膜能力或诱导凋亡的能力。
本发明的试剂还可以包括全长BH3-only蛋白质的Bcl-2结合部分。这些部分是至少1个、至少10个、至少20个和至少30个连续的氨基酸，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个氨基酸，其定义一个比如两性α-螺旋结构的Bcl-2结合片段。建议该结构与Bcl-2蛋白质的疏水沟相互作用。该类型的肽可以通过应用标准重组核酸技术获得或用常规液相或固相合成技术合成。例如，对于液相合成或固定合成，可以参考由Blackwell科技出版社出版、Nicholson编辑、名称为“合成疫苗”中的Atherton和Shephard描述的第九章“肽合成”。或者，可以通过用比如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶这样的蛋白酶消化本发明的氨基酸序列来制备肽。消化片段可以通过，例如，高效液相色谱(HPLC)技术纯化。任何这样的片段，无论其产生的途径如何，均应理解为包含在本文所使用的术语“拮抗剂”中。
因此拮抗剂可能包含混杂型BH3-only蛋白质的衍生物。这样的一种衍生物包括部分、突变体、同源物、片段、类似物以及杂交体或融合分子以及混杂型BH3-only蛋白质的糖基化变体。衍生还包括在进行优化比对后在比较框中具有百分比氨基酸序列同一性的分子。优选地，特定序列和对照序列间的相似性百分数至少约为60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至少约95％或更高，比如至少约96％、97％、98％、99％或更高。优选地，本试剂的种间、功能或结构同源物间的相似性百分数为至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至少约95％或更高，比如至少约96％、97％、98％、99％或更高。介于60％和100％之间的相似性或同一性百分数也是预期的，比如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
本文中所构思的蛋白质拮抗剂(比如BH3-only蛋白质的衍生物)中的残基类似物包括但不限于对侧链的修饰，在肽、多肽或蛋白质合成过程中掺入非天然氨基酸和/或它们的衍生物，以及使用交联剂和其它的对蛋白质性分子或其类似物施加构象约束的方法。该术语也不排除对多肽进行修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。该定义中包括，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，比如表1中所列的那些非天然氨基酸)的多肽，或具有替换的连键的多肽。这样的多肽可能需要能够进入细胞。
本发明所构思的侧链修饰的例子包括氨基基团修饰，比如通过与醛反应之后用NaBH4还原进行的还原性烷基化；用甲基亚氨逐乙酸酯进行脒化；用乙酸酐进行酰基化；用氰酸盐使氨基基团甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基基团三硝基苯基化；用琥珀酸酐和四羟基邻苯二甲酸酐使氨基基团酰基化和；和用吡哆醛-5-磷酸使赖氨酸吡啶化，之后再用NaBH4还原。
精氨酸残基的胍基可以通过用比如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛这样的试剂形成杂环缩合产物进行修饰。
羧基可以通过碳二亚胺活化、形成O-酰基异脲、之后衍生为例如对应的氨基化合物来进行修饰。
巯基可以通过，比如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代马来酰亚胺反应；用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯汞氯化物、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞剂形成含汞衍生物；用氰酸盐在碱性pH下甲氨酰化来进行修饰。
色氨酸残基可以通过例如用N-溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-溴化硝基苯或硫苯基卤化物使吲哚环烷基化进行修饰。另一方面，酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物进行改变。
对组氨酸的咪唑环的修饰可以这样实现：用碘乙酸衍生物使其烷基化或用二乙基焦碳酸使其N-乙酯基化。
肽合成中掺入的非天然氨基酸及其衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文所考虑的非天然氨基酸的清单示于表1。这样的非天然氨基酸可用于形成类似于限制型BH3-only支架的三级结构。
表1：非常规氨基酸代码
非常规氨基酸 代码  非常规氨基酸 代码
α-氨基丁酸 Abu  L-N-甲基丙氨酸 Nmala
α-氨基-α-甲基丁酸盐 Mgabu  L-N-甲基精氨酸 Nmarg
氨基环丙烷羧酸盐 Cpro  L-N-甲基天冬酰胺 Nmasn
 L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp
氨基异丁酸 Aib  L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys
氨基降冰片基-羧酸盐 Norb  L-N-甲基谷氨酰胺 Nmgln
 L-N-甲基谷氨酸 Nmglu
环己烷丙氨酸 Chexa  L-N甲基组氨酸 Nmhis
环戊烷丙氨酸 Cpen  L-N-甲基异亮氨酸 Nmile
D-丙氨酸 Dal  L-N-甲基亮氨酸 Nmleu
D-精氨酸 Darg  L-N-甲基赖氨酸 Nmlys
D-天冬氨酸 Dasp  L-N-甲基甲硫氨酸 Nmmet
D-半胱氨酸 Dcys  L-N-甲基正亮氨酸 Nmnle
D-谷氨酰胺 Dgln  L-N-甲基正缬氨酸 Nmnva
D-谷氨酸 Dglu  L-N-甲基鸟氨酸 Nmorn
D-组氨酸 Dhis  L-N-甲基苯丙氨酸 Nmphe
D-异亮氨酸 Dile  L-N-甲基脯氨酸 Nmpro
D-亮氨酸 Dleu  L-N-甲基丝氨酸 Nmser
D-赖氨酸 Dlys  L-N-甲基苏氨酸 Nmthr
D-甲硫氨酸 Dmet  L-N-甲基色氨酸 Nmtrp
D-鸟氨酸 Dorn  L-N-甲基酪氨酸 Nmtyr
D-苯丙氨酸 Dphe  L-N-甲基缬氨酸 Nmval
D-脯氨酸 Dpro  L-N-甲基乙基甘氨酸 Nmetg
D-丝氨酸 Dser  L-N-甲基-叔丁基甘氨酸 Nmtbug
D-苏氨酸 Dthr  L-正亮氨酸 Nle
D-色氨酸 Dtrp  L-正缬氨酸 Nva
表1(续)
非常规氨基酸 代码  非常规氨基酸 代码
D-酪氨酸 Dtyr  α-甲基-氨基异丁酸盐 Maib
D-缬氨酸 Dval  α-甲基-γ-氨基丁酸盐 Mgabu
D-α-甲基丙氨酸 Dmala  α-甲基环己烷丙氨酸 Mchexa
D-α-甲基精氨酸 Dmarg  α-甲基环戊基丙氨酸 Mcpen
D-α-甲基天冬酰胺 Dmasn  α-甲基-α-萘基丙氨酸 Manap
D-α-甲基天冬氨酸 Dmasp  α-甲基青霉胺 Mpen
D-α-甲基半胱氨酸 Dmcys  N-(4-氨基丁基)甘氨酸 Nglu
D-α-甲基谷氨酰胺 Dmgln  N-(2-氨基乙基)甘氨酸 Naeg
D-α-甲基组氨酸 Dmhis  N-(3-氨基丙基)甘氨酸 Norn
D-α-甲基异亮氨酸 Dmile  N-氨基-α-甲基丁酸 Nmaabu
D-α-甲基亮氨酸 Dmleu  α-萘基丙氨酸 Anap
D-α-甲基赖氨酸 Dmlys  N-苯基甘氨酸 Nphe
D-α-甲基甲硫氨酸 Dmmet  N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸 Ngln
D-α-甲基鸟氨酸 Dmorn  N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸 Nasn
D-α-甲基苯丙氨酸 Dmphe  N-(2-羧乙基)甘氨酸 Nglu
D-α-甲基脯氨酸 Dmpro  N-(羧甲基)甘氨酸 Nasp
D-α-甲基丝氨酸 Dmser  N-环丁基甘氨酸 Ncbut
D-α-甲基苏氨酸 Dmthr  N-环庚基甘氨酸 Nchep
D-α-甲基色氨酸 Dmtrp  N-环己烷甘氨酸 Nchex
D-α-甲基酪氨酸 Dmty  N-环癸基甘氨酸 Ncdec
D-α-甲基缬氨酸 Dmval  N-环十二烷甘氨酸 Ncdod
D-N-甲基丙氨酸 Dnmala  N-环辛基甘氨酸 Ncoct
D-N-甲基精氨酸 Dnmarg  N-环丙基甘氨酸 Ncpro
D-N-甲基天冬酰胺 Dnmasn  N-环十一基甘氨酸 Ncund
D-N-甲基天冬氨酸 Dnmasp  N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸 Nbhm
D-N-甲基半胱氨酸 Dnmcys  N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸 Nbhe
表1(续)
非常规氨基酸 代码  非常规氨基酸 代码
D-N-甲基谷氨酰胺 Dnmgln  N-(3-胍基丙基)甘氨酸 Narg
D-N-甲基谷氨酸 Dnmglu  N-(L-羟乙基)甘氨酸 Nthr
D-N-甲基组氨酸 Dnmhis  N-(羟乙基))甘氨酸 Nser
D-N-甲基异亮氨酸 Dnmile  N-(咪唑基乙基))甘氨酸 Nhis
D-N-甲基亮氨酸 Dnmleu  N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸 Nhtrp
D-N-甲基赖氨酸 Dnmlys  N-甲基-y-氨基丁酸盐 Nmgabu
N-甲基环己基丙氨酸 Nmchexa  D-N-甲基甲硫氨酸 Dnmmet
D-N-甲基鸟氨酸 Dnmorn  N-甲基环戊基丙氨酸 Nmcpen
N-甲基甘氨酸 Nala  D-N-甲基苯丙氨酸 Dnmphe
N-甲基氨基异丁酸盐 Nmaib  D-N-甲基脯氨酸 Dnmpro
N-(1-甲基丙基)甘氨酸 Nile  D-N-甲基丝氨酸 Dnmser
N-(2-甲基丙基)甘氨酸 Nleu  D-N-甲基苏氨酸 Dnmthr
D-N-甲基色氨酸 Dnmtrp  N-(1-甲基乙基)甘氨酸 Nval
D-N-甲基酪氨酸 Dnmtyr  N-甲基-萘基丙氨酸 Nmanap
D-N-甲基缬氨酸 Dnmval  N-甲基青霉胺 Nmpen
γ-氨基丁酸 Gabu  N-(对羟基苯基)甘氨酸 Nhtyr
L-叔丁基甘氨酸 Tbug  N-(硫甲基)甘氨酸 Ncys
L-乙基甘氨酸 Etg  青霉胺 Pen
L-高苯丙氨酸 Hphe  L-α-甲基丙氨酸 Mala
L-α-甲基精氨酸 Marg  L-α-甲基天冬酰胺 Masn
L-α-甲基天冬氨酸 Masp  L-α-甲基叔丁基甘氨酸 Mtbug
L-α-甲基半胱氨酸 Mcys  L-α-甲基乙基甘氨酸 Metg
L-α-甲基谷氨酰胺 Mgln  L-α-甲基谷氨酸 Mglu
L-α-甲基组氨酸 Mhis  L-α-甲基高苯丙氨酸 Mhphe
L-α-甲基异亮氨酸 Mile  N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸 Nmet
L-α-甲基亮氨酸 Mleu  L-α-甲基赖氨酸 Mlys
L-α-甲基甲硫氨酸 Mmet  L-α-甲基正亮氨酸 Mnle
表1(续)
 非常规氨基酸 代码  非常规氨基酸 代码
 L-α-甲基正缬氨酸 Mnva  L-α-甲基鸟氨酸 Morn
 L-α-甲基苯丙氨酸 Mphe  L-α-甲基脯氨酸 Mpro
 L-α-甲基丝氨酸 Mser  L-α-甲基苏氨酸 Mthr
 L-α-甲基色氨酸 Mtrp  L-α-甲基酪氨酸 Mtyr
 L-α-甲基缬氨酸 Mval  L-N-甲基高苯丙氨酸 Nmhphe
 N-(N-(2，2-二苯基乙基)氨基甲酰甲基)甘氨酸 Nnbhm  N-(N-(3，3-二苯基乙基丙基)氨基甲酰甲基)甘氨酸 Nnbhe
 1-羧基-1-(2，2-二苯基-乙基氨基)环丙烷 Nmbc
例如，可以使用交联剂来稳定3D构象，用比如带有n＝1至n＝6的(CH2)n间隔基团的双功能酰亚胺酯、戊二醛、N-羟琥珀酰亚胺酯这样的同-双功能交联剂，和通常含有比如N-羟琥珀酰亚胺这样的氨基-反应性部分以及另一个比如马来酰亚胺或巯基(SH)或碳二亚胺(COOH)这样的基团特异性反应部分的杂-双功能试剂。此外，可以通过，例如，掺入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸Cα和Cβ原予之间引入双键，和通过比如在N和C末端之间、两条侧链之间或侧链和N或C末端之间形成氨基化合物这样在导入共价键来形成环肽或类似物，来限制肽的构象。
BH3-only蛋白质的模拟物的含义包括结构和/或功能水平上的靶结合物(也即BH3-only蛋白质)且抑制促生存Bcl-2-蛋白质。根据本发明的一种实施方案，提出产生经过选择的BH3-only蛋白质模拟物。根据靶间的结构差异以及靶结合物间的结构差异设计了一种BH3-only蛋白质。根据本发明以及如上文所定义的，后一种可以分为混杂型(也即结合所有或多种Bcl-2蛋白质)或限制型(也即只结合一种或几种Bcl-2蛋白质)。
肽模拟物可以是模拟蛋白质二级结构组件的含肽分子(Johnson等人，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993)。使用肽模拟物的基本原理是，蛋白质肽骨架的存在主要是为了以有利于比如抗体和抗原、酶和底物这样的分子相互作用的方式确定氨基酸侧链的方向或支撑蛋白质。设计了一种能够发生与天然分子类似的分子互作的肽模拟物。BH3-only蛋白质的肽或非肽模拟物在本发明中可用作降低Bcl-2促生存功能的试剂。
将模拟物设计成药学活性化合物是本领域已知的一种根据“先导”化合物开发药物的方法。当活性化合物难以合成或合成花费昂贵或者它不适于特定的给药方式时，这种方法则比较令人满意，例如肽不是口服组合物的活性试剂，因为倾向于在食道中被蛋白酶快速降解。模拟物设计、合成和测试通常用于避免为寻找靶特性而随机筛选大量的分子。
从具有给定靶特性的化合物设计模拟物通常采取几个步骤。首先，确定该化合物中对于确定该靶特性来说是关键和/或重要的特定部位。就肽而言，这可以通过系统地改变该肽中的氨基酸残基来完成，例如依次替换各残基。如上文所述，肽的丙氨酸扫描常用于提炼这样的肽基序。这些构成该化合物的活性区域的部位或残基已知为其“药效团”。
一旦发现了药效团，则利用多种来源的数据，例如分光镜技术、x-射线衍射数据和NMR，根据其物理特性，例如立体化学、键、大小和/或电荷，将其结构建立模型。模型建立过程中可以利用计算机分析、相似性作图(其模拟药效团的电荷和/或体积而非各原子间的键)和其它技术。
在该方法的一种变化中，建立了配体及其结合伴侣的三维结构。这在配体和/或结合伴侣在结合后构象发生改变的情况尤其有用，它使得该模型在设计模拟物中能够考虑到这一点。模型可用于产生与线性序列或三维构型相互作用的抑制剂。
之后选择一种在其上可以移植模拟药效团的化学基团之模板分子。可以方便地选择该模板分子和移植到它上面的化学基团，从而使得该模拟物易于合成、可能是药学可接受的、且在体内不会降解而同时保持先导化合物的生物学活性。或者，如果该模拟物是以肽为基础的，则可以通过使肽环化从而提高其刚性来使其更加稳定。之后可以对用这种方法找到的模拟物进行筛选以观察它们是否具有靶特性，或它们表现到什么程度。之后可以进行进一步的优化或修饰得到一个或多个最终的模拟物用于体内或临床实验。
根据本发明合理的药物设计的目标是为制备药物而利用计算机方法产生和/或选择限制型BH3-only蛋白质的结构类似物，例如，所述类似物是多肽的更具活性或稳定的形式，且具有限制性结合谱。在一种方法中，首先借助X射线晶体照相术、计算机模型或最典型地通过组合方法确定目的蛋白质的三维结构。关于多肽的有用信息也可以通过以同源蛋白质结构为基础的模型来获得。一个合理的药物设计的例子是开发HIV蛋白酶抑制剂(Erickson等人，Science 249：527-533，1990)。
一种药物筛选方法，优选在竞争性结合实验中，利用了用表达多肽或片段的重组多核苷酸稳定转化的真核或原核细胞。这样的细胞，无论是存活的或固定的，均可用于标准结合实验。可以测定，例如，靶或片段与被测试剂间的复合物形成，或检查靶或片段与已知配体的复合物的形成受被测试剂的辅助或干扰到何种程度。
筛选程序包括：检测(i)药物和靶之间复合物的存在，或(ii)编码靶的核酸分子的表达水平的变化。一种检测形式涉及竞争性结合实验。在这样的竞争结合实验中，典型地对靶进行标记。从任何推定的复合物中分离出游离靶，游离(也即未复合的)标记的量是被测试剂与靶分子的结合度量。也可以测定结合靶的量，而不是游离靶的量。也可能对化合物而非靶进行标记，以及测定在被测试药物存在或不存在的情况下与靶结合的化合物的量。
药物筛选的另一种技术提供为对具有适宜亲和力的化合物提供高通量筛选，该技术详细描述于Geysen(国际专利公布号WO 84/03564)。简言之，在固相基质，比如塑料插脚或一些其它表面，上合成了大量不同的小肽测试化合物。使肽测试化合物与靶反应，并洗涤之。之后用本领域已知的方法检测结合的靶分子。该方法可适于筛选非肽、化学基团。因此，这一方面延展到了筛选靶拮抗剂或激动剂的组合方法。
可将纯化的靶物直接包被到平板上用于上述药物筛选技术中。然而，也可以使用靶的非中和抗体来将靶固定到固相上。为利于结合和鉴定，也可以将靶与容易选择的标签表达为融合蛋白。
在另一种实施方案中，可以对Bcl-2和Bcl-w抑制剂实施高通量化学筛选(HTCS)。如果BH3-only蛋白质，比如Bim，与促生存分子(Bcl-2或Bcl-w)的相互作用促成凋亡，则可以在文库中筛选以预防BH3结合的方式与促生存蛋白质结合的小有机分子。为鉴定靶向一种或同时靶向两种抗凋亡分子的化合物，可以实施多次筛选活动。
可以在细菌中产生高容量实验所需的蛋白质，用光学生物传感器(BiaCore)所作的一项初期研究显示，生物素化的BimBH3肽以高亲和力与His6-标记的Bcl-wΔC10(Kd～11nM)结合(Hinds等人，EMBOJ22：1497-1507，2003)。利用AlphaScreenTM( Amplified  LuminescentProximity  Homogeneous  Assay)技术(Glickman等人，J Biomol Screen7：3-10，2002)已经开发出了一种HTCS所需的高容量结合实验。通过揭示两个伴侣蛋白质相互作用时发生的荧光输出量变化，可以高灵敏度地监控蛋白质的相互作用。AlphaScreenTM非常适于HTCS，因为它非常有效且易于在很宽的动态范围内作为同源实验以小体积实施。
在一种实施方案中，将His6 Bcl-wΔC10结合到镍包被的受体珠上，将生物素化的BimBH3肽结合到链霉抗生物素包被的供体珠。之后将这些珠与测试化合物在384-孔微量滴定板的板孔中孵育(每孔一种化合物)，并用Fusion alpha平板阅读器读取实验结果。结合实验可以根据蛋白质配体和珠的浓度、孵育时间和实验体积进行优化，以使得实验主要产生信号与背景的比率大于30∶1。该检测已经被证实有效，因为得自一系列肽的IC50值与用光学传感器得到的数值相当。尽管肽亲和力跨越三个数量级(8nM-35μM)，在两组结果中观察到的强相关性(R2＝0.9983)表明这些实验测定出相同的相互作用。也可以对His6 Bcl-2ΔC22/Bim BH3的结合实验进行优化。一旦该实验得到优化，即可对其进行严格的质量控制从而评估板-板或天-天的重复性。之后可用各次实验筛选一个独特的探索文库。为消除假阳性，可在二次竞争实验中对满足靶效力(IC50＜25μM)的所有抑制化合物进行确认(AlphaScreenTM，荧光极化和BiaCore光学生物传感器)。光学生物传感器可以使得对Bcl-2家族成员间的相互作用的定量更为便利，可以容易地在强候选物的亲和力和BH3-only蛋白质的生理结合间作比较。
可以通过尤其是液相色谱-质谱来鉴定已通过这些初期测试的化合物的同一性和纯度，之后测试它们的靶特异性，也即对Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w的亲和力。活性化合物还要在设计用于预测肠道吸收(Wohnsland等人，J Med chem 44：923-930，2001)和肝中毒进行测试。此外，可以用在芯片上(in silico)的方法来预测它们的生物分布特性，以及排除可能存在代谢或毒性问题的药效团(DrugMetabolism Databases and High-Throughput Testing During DrugDesign and Development，Ed Erhardt，Blackwell Science，Malden，MA，USA，1999)。可以根据结合实验中的效力、靶选择性、令人满意的预测ADMET(吸收、分布、代谢、分泌和毒性)特性(van de Waterbeemd和Gifford，Nat Rev Drug Disc 2：192-204，2003)和化学易处理性，将所有活性化合物的数据分级。然后，可以得到顶级化合物的所有可获得的相近结构类似物，并测试它们在结合和杀伤实验中的抑制活性从而确定各结构系列的初步结构-活性关系。
关于先导化合物的生物活性的实验，若寻找到了有前景的先导物，则可以评估它们对培养物中的细胞活力的活性。可以在一板培养的肿瘤发生和非肿瘤发生细胞系，以及原发级小鼠和人细胞群体，例如淋巴细胞，上测试多达50种根据上述标准优化的先导化合物。与1nM-100μM的化合物孵育3～7天可以监控细胞活力。当然最大的注意力将放在比它们的正常细胞对应物更为有效地杀死肿瘤细胞的化合物上。可以评估在＜10μM水平上杀死的化合物对其靶物的特异性以及作用方式。验证它们的作用模式是重要的，因为测试化合物也可能间接地杀死细胞。例如，如果先导化合物以高度的选择性与Bcl-2结合，它不应当杀死缺乏Bcl-2的细胞。因此，可以通过比较化合物在野生型细胞和缺少Bcl-2的细胞中的活性来验证作用特异性。
可以对最有前景的候选物彻底分析其在小鼠模型中的抗肿瘤效力。在两种已经被充分描述过的模型中，用源自myc转基因小鼠(Adams等人，Nature 318：533-538，1985)或myc/bcl-2双重转基因动物(Strasser等人，出处同前)的B淋巴细胞瘤注射过的免疫竞争小鼠，均快速、可重复地死于白血病/淋巴瘤综合征。尽管两种肿瘤都对标准化疗(环磷酰胺)有反应，用myc/bcl-2肿瘤细胞注射的小鼠总是会复发。这两种移植的肿瘤使得能够在治疗这些非常模拟人淋巴瘤的恶性增生过程中，单独或与环磷酰胺结合，测试任何化合物。
关于先导化合物的结构-活性关系(SAR)及其优化，从初筛中选择出的先导物进行相当多的修饰以增强它们的生物化学、生物学和药学特性(Bleicher等人，Nat Rev Drug Discov 2：369-378，2003)。为辅助这些化合物的优化，可以在生物化学或结构研究中验证它们的作用模式。此外，可以通过NMR分光术分析试剂与促生存分子间形成的复合物。因为NMR能够探测低亲和力的配体，并揭示它们结合在靶蛋白质上的什么地方，它能够极大地辅助对结合的优化并加速药物探索过程(Hajduk等人，J Med Chem 42：2315-2317，1999；Pellecchia等人，Nat Rev Drug Discov 1：211-219，2002)。利用比如化学位移作图这样的技术可以监控测试化合物与Bcl-2蛋白质的结合，并且可以选择那些模拟BH3结构域的测试化合物进行优化。
在一种相关方法中，可以建立先导试剂的分子模型以利用改编的DOCK程序评估它们在芯片上的结合(Kuntz，Science 257：1078-1082，1992)。将先导化合物的模型建立到靶Bcl-2沟上，并用计分函数预测最可能的结合模式。这将指导对能够提供附加的相互作用从而增强结合的衍生物的设计。源自NMR的实验数据的可获得性也使得为预测改良配体而锚定配体和靶物灵活性成为可能(Lugovskoy等人，J AmChem Soc 124：1234-1240，2002)。
该信息以及那些来自生物实验的信息可用于合成用于进一步测试的衍生化合物。对于各类先导化合物，合成衍生物的策略。例如，典型的成功化合物由两个或单个连接环系统组成，各系统各自可用大量官能团取代。通过系统地取代各官能团，可以制备和测试具有广泛化学特性的化合物。
本发明还提供用于预测分子构象从而产生和/或选择和/或筛选候选试剂的的计算方法，所述分子模拟限制型BH3-only蛋白质支架，所述候选试剂随后被制备并进行实验室评估其诱导凋亡的能力。
本发明由此提供一种根据带有赋予其限制型表型的残基位置的支架BH3-only蛋白质设计促生存Bcl-2蛋白质家族的拮抗剂的计算方法，该方法包括：选择一些混杂型BH3-only蛋白质；对这些蛋白质进行序列比对，和将这些蛋白质与限制型BH3-only蛋白质作比较；根据所述比对得到各氨基酸在一或多个带来与Bcl-2蛋白质结合的混杂特性或限制特性的位置上的出现频率；利用所述频率产生一个选自电荷、大小、构象、溶解度、极性、疏水性、亲水性和对三级结构的贡献的计分函数；用所述计分函数和至少一种另外的计分函数来产生一套优化蛋白质序列或其构象等价物，产生或选择出一种具有与Bcl-2蛋白质的限制型结合表型的化合物或蛋白质。
对限制型BH3-only蛋白质拮抗Bcl-2蛋白质和诱导凋亡的能力作评估对于选择适宜的治疗方案是重要的。这种的一种评估可以适当地借助软件编程的计算机来简化，所述软件尤其增加了一个关于至少一种与限制型BH3-only蛋白质有关的特征之计分函数(SF)，从而提供对应于所诱导的Bcl-2拮抗程度的效力值(PA)。SF尤其选自：(a)酸性残基的数量和位置；或(b)碱性残基的数量和位置；或(c)极性残基的数量和位置；或(d)非极性残基的数量和位置；或(e)带电荷残基的数量和位置；或(f)不带电荷的残基的数量和位置；或(g)亲水残基的数量和位置；或(h)疏水残基的数量和位置；或(i)残基的水平；或(j)残基的溶解度水平；或(k)残基的大小；或(l)该残基在BH3-only蛋白质中对三级结构的贡献。因此，根据本发明，这样的特征的SF存储于一中机器可读存储介质中，该介质能够处理数据从而提供特定限制型BH3-only蛋白质或化学等价物的PA。
因此，另一方面，本发明构思了一种用于确定在细胞中诱导凋亡的试剂的结构的计算机程序产品，所述产品包括：
(1)被接收为输入计分函数(SF)的至少两种与所述BH3-only或Bcl-2蛋白质相关的特征的代码，其中所述特征尤其选自：
(a)酸性残基的数量和位置；
(b)碱性残基的数量和位置；
(c)极性残基的数量和位置；
(d)非极性残基的数量和位置；
(e)带电荷残基的数量和位置；
(f)不带电荷残基的数量和位置；
(g)亲水残基的数量和位置；
(h)疏水残基的数量和位置；
(i)残基的水平；
(j)残基溶解度水平；
(k)残基的大小；
(l)该残基在BH3-only蛋白质中对三级结构的贡献
(2)为提供一个对应于BH3-only蛋白质的PV的总数而叠加所述SF的代码；和
(3)储存所述代码的计算机可读介质。
在一个相关的方面，本发明延展至一种用于评估BH3-only蛋白质或化学等价物在细胞中诱导凋亡的可能用途的计算机，其中所述计算机包括：
(1)机器可读数据存储介质，该介质包括编码有机器可读数据的数据存储材料，其中所述机器可读数据包含至少两种与所述BH3-only或Bcl-2蛋白质相关的特征IV，其中所述特征尤其选自：
(a)酸性残基的数量和位置；
(b)碱性残基的数量和位置；
(c)极性残基的数量和位置；
(d)非极性残基的数量和位置；
(e)带电荷残基的数量和位置；
(f)不带电荷残基的数量和位置；
(g)亲水残基的数量和位置；
(h)疏水残基的数量和位置；
(i)残基的水平；
(j)残基溶解度水平；
(k)残基的大小；
(l)该残基在BH3-only蛋白质中对三级结构的贡献
(2)用于存储处理所述机器可读数据的指令的工作存储器；
(3)与所述工作存储器以及所述机器可读数据存储介质相耦连的中央处理单元，用于处理所述机器可读数据以提供对应于所述化合物PV的所述SF的总和；和
(4)与所述中央处理单元相耦连的输出硬件，用于接收所述PV。
本发明构思了任何一般或特定用途的计算机系统，包括与存储器和至少一个输入\输出设备，比如终端，电子联通的处理器。这样的系统可以包括，但不限于，个人计算机、工作站或大型机。处理器可以是执行位于RAM存储器中的程序的一般目的的处理器或者微处理器或者特定处理器。程序可位于比如硬盘或预程序化的ROM存储器这样的存储装置的RAM中。在一种实施方案中，RAM存储器同时用作数据存储和程序执行。计算机系统也包括处理器和存储器位于不同的物理实体中但通过网络进行电子联通的系统。
根据本发明鉴定的试剂可用于治疗癌症。
本文中的“治疗”的含义是指减轻已有状态的严重程度。术语“治疗”也包括为预防某种状况发作的“预防性治疗”。术语“治疗”不必意味着接复试者被治疗至完全康复。类似地，“预防性治疗”不必意味着复试者最终不会发生某种状况。
本文中所使用的复试者指，人和非人灵长类(例如大猩猩、短尾猿、狨猴)、家畜动物(例如绵羊、奶牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、被俘野生动物(例如狐狸、鹿)、爬行动物或两栖动物(例如cane蟾蜍)、鱼(例如斑马鱼)和任何其它能够受益于本发明试剂的生物(例如c.elegans)。对于能够受益于目前描述的试剂的动物类型没有限制。最优选的本发明的复试者是人。受试者，无论其是人或非人生物，可以指患者、个体、动物、宿主或受体。
相应地，本发明的另一方面提供一种预防或减轻受试者的癌症的方法，所述方法包括：在足以预防或减轻癌症的状况下向所述受试者施用有效量的Bcl-2蛋白质拮抗剂一定时间。
对能够拮抗Bcl-2并诱导凋亡的试剂的鉴定提供了用于治疗性治疗癌症的药物组合物。
本发明的试剂可以与一种或多种药学可接受载体和/或稀释剂结合形成一种药物组合物。药学可接受载体可包括一种其作用为稳定、或增强或降低本发明的药物组合物的吸收或廓清速率的生理可接受的化合物。生理接受的化合物可包括，例如，比如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷这样的碳水化合物，比如抗坏血酸、谷胱甘肽这样的抗氧化剂，鳌合剂，低分子量蛋白质，减少肽或多肽的廓清或水解的组合物，赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲液。也可以用去污剂来稳定或提高或降低药物组合物的吸收，包括脂质体载体。肽或多肽的药学可接受载体或剂型是本领域技术人员已知的，并详细描述于科技和专利文献中，参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，MackPublishing Company，Easton，PA，1990(“Remington′s”)。
其它的生理学可接受化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或对于预防微生物生长和起作用尤其有用的防腐剂。各种防腐剂是本领域熟知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员将理解，对药学可接受载体包括药学可接受化合物的选择依赖于，例如，本发明的调节试剂的常规给药途径及其独特的生理-化学特征。
药物组合物形式的试剂的施用，可以通过本领域已知的任何便利的方法来完成。给药途径包括但不限于呼吸道、气管内、鼻咽、静脉内、腹膜内、颅内、皮内、肌内、眼内、鞘内、小脑内、鼻内、灌注、口服、直肠、贴片和植入给药。
对于口服给药，可将化合物配制成固态或液态制剂，比如胶囊、药丸、片剂、锭剂、粉末、悬浮液或乳剂。在制备口服剂量形式的组合物时，可以使用任何有用的药学介质，比如，对于液态口服制剂(比如悬浮液、酏剂或溶液)使用水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、色素、悬浮剂等；或者对于固态口服制剂(比如粉末、胶囊和片剂)使用比如淀粉、糖、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、粘合剂、裂解剂等这样的载体。由于片剂和胶囊易于施用，因此它们代表最有力的口服剂量单位形式，此时显然采用了固体药学可接受载体。如果需要的话，片剂可以是用标准技术糖包衣的或肠包衣的。可以将活性试剂胶囊化从而使它稳定地穿过胃肠道而同时也允许穿过血脑屏障，参见，例如国际专利公布号WO 96/11698。
若口服给药，可以将本发明的试剂保护起来以防止其被消化。这可以通过将核酸、肽或多肽与一种组合物混合从而使其能够抗酸和酶解或者将核酸、肽或多肽包装在比如脂质体这样的适宜抗性载体中来实现。保护化合物使其免遭消化的方法是本领域熟知的，参见，例如Fix，Pharm Res 13：1760-1764，1996；Samanen等人，J PharmPharmacol 48：119-135，1996；美国专利号5 391 377，其中描述了用于口服运送治疗剂的脂质组合物(下文中详细描述了脂质体运送)。
适于注射用途的药物形式包括无菌水溶液(若为水可溶的)或分散剂和用于与无菌注射液或分散剂临时配制的无菌粉末或者可以是乳膏或其它适于局部使用的形式。它必须在制备和储存条件下是稳定的，且必须能够抵御比如细节和真菌这样的微生物的污染作用进行保存。载体可以是含有，例如水、乙二醇、多元醇(例如丙三醇、丙烯乙二醇和液态聚乙二醇等)、或其适宜的混合物、以及植物油的溶剂或分散介质。可以通过，例如，使用比如卵磷脂这样的包衣，对于分散剂维持所需颗粒的大小，以及使用超微油膏来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌抗真菌剂，比如氯丁醇、对羟苯甲酸酯、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，来预防微生物的作用。在许多情况中，其优选包括等渗剂，例如，蔗糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和凝胶，来延长对可注射组合物的吸收。
将所需量的试剂和各种其它以上列举的成分掺入到适宜的溶剂中，如果需要的话，之后再进行无菌过滤，可以制备出无菌注射溶液。通常，分散剂是通过将各种无菌活性成分掺入到包含基本分散介质和所需的以上列举的其它成分的无菌载体中来制备的。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，通过这种方法可以从其无菌过滤溶液得到活性成分与任何其它所需成分的粉末。
对于非胃肠道给药，可将试剂溶解于药学载体中，并以溶液或悬液的形式给药。适宜载体的例子是水、盐、葡萄糖液、果糖溶液、乙二醇或动物油、植物油或合成油。载体可以包含其它成分，比如防腐剂、悬浮剂、溶解剂、缓冲液等。若要经鞘施用试剂，还可以将它们溶解在脑脊液中。
对于经黏膜或经皮给药，可以用适于载体渗透的渗透剂来运送试剂。这样的渗透剂是本领域已知的，例如用于经黏膜给药的胆汁盐和褐霉酸衍生物。此外，渗透剂可用于促进渗透。经黏膜给药方式可以通过鼻喷雾或使用栓剂例如Sayani和Chien，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst 13：85-184，1996。对于局部、经皮给药，可以将试剂配制成药膏、乳膏、油膏、粉末和凝胶。经皮运送系统还可以包括贴片。
对于吸入，本发明的试剂可以用本领域已知的任何系统来运送，包括干粉气雾剂、液体运送系统、空气喷射喷雾剂、推进系统等，参见例如Patton，Nat Bioteeh 16：141-143，1998；用于多肽分子的产品和吸入系统，例如Dura Pharmaceuticals(San Diego，CA)、Aradigm(Hayward，CA)、Aerogen(Santa Clara，CA)、InhaleTherapeutic Systems(San Carlos，CA)等。例如，药物剂型可以以气体或薄雾形式施用。对于气体给药，剂型可以与表明活性剂极细的形式提供，并配以推进器。另一方面，用于将制剂运送至呼吸组织的装置是一种制剂在其中蒸发的吸入器。其它的液体运送系统包括，例如，极度分散的形式空气喷射喷雾剂。
本发明的试剂可以以持续运送或持续释放机制施用，其能够在体内运送制剂。例如，本发明的剂型中可包括可生物降解的微球体或胶囊或其它能够持续运送多肽的可生物降解的聚合物结构(例如Putney和Burke，Nat Biotech 16：153-157，1998)。
在制备本发明的药物时，可以作各种剂型变化并对剂型进行操作从而改变药物代谢动力学和生物分布。本领域技术人员已知许多改变药物代谢动力学和生物分布的方法。这样的方法的例子包括在由比如蛋白质、脂质(例如，脂质体，参见下述)、碳水化合物、或合成聚合物(上述)这样的载体中保护本发明的组合物。对药物代谢动力学的讨论参见例如Remington′s。
在一个方面，将含有本发明试剂的药物剂型掺入单层脂质或比如脂质体这样的双层脂质中，参见例如美国专利号6 110 490、6096 716、5 283 185和5 279 833。本发明还提供这样的剂型，该剂型中本发明的水可溶性调节试剂已经被附着到单层或双层表面。例如，可以将肽附着到含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂酰)乙醇胺的脂质体中(例如Zalipsky等人，Biocojug Chem 6：705-708，1995)。可以施用脂质体或任何形式的脂质膜，比如平面脂质膜或完整细胞的细胞膜，例如血红细胞。脂质体剂型可以通过任何途径给药，包括静脉内、经皮(Vutla等人，J Pharm Sci 85：5-8，1996)、经黏膜或口服。本发明还提供这样的药物制剂，其中将本发明的核酸、肽和/或多肽整合进了微囊和/或脂质体(Suntres和Shek，J Pharm Pharmacol 46：23-28，1994；Woodle等人，Pharm Res 9：260-265，1992)。脂质体和脂质体剂型可以根据本领域熟知的标准方法制备，参见例如Remington′s；Akimaru等人，Cytokines Mol Ther 1：197-210，1995；Alving等人，Immunol Rev 145：5-31，1995；Szoka和Papahadjopoulos，AnnRev Biophys Bioeng 9：467-508，1980，美国专利号4 235 871、4 501728和4 837 028。
根据施用方法，可以以各种单位剂量形式施用本发明的药物组合物。药物组合物的典型剂量是本领域技术人员熟知的。通常这样的剂量依性质而定并根据特定的治疗状况、患者的耐受能力等进行调整。适于实现这一目的的试剂量定义为“有效量”。为此目的的剂量进度和有效率，也即“剂量方案”依赖于各种因素，包括疾病的阶段或状况、疾病或状况的严重程度、患者的整体健康状态、患者的物理状态、年龄、药物剂型、活性试剂浓度等。在计算患者的给药方案时，还应当考虑给药模式。剂量方案还必须考虑药物代谢动力学，也即药物组合物的吸收、生物可接近性、代谢、清除等的速率。参见，例如Remington′s；Egleton和Davis，Peptides 18：143-1439，1997；Langer，Science 249：1527-1533，1990。
根据这些方法，根据本发明定义的试剂和/或药物组合物可以与一种或多种其它试剂同时施用。本文中的“共同施用”的含义指，以相同的剂型或两种不同的剂型经相同或不同的途径或给药顺序通过相同或不同的途径同时施用。本文中的“顺序”给药的含义是指，两种类型的试剂和/或药物组合物在给药时间上的秒、分、小时或天差异。试剂和/或药物组合物的共同施用可以以任意顺序进行。
或者，通过使用比如抗体或细胞特异性配体或特异性核酸分子这样的靶向系统可以用靶向疗法更特异地将活性试剂运送至特定类型的细胞。由于许多原因，靶向都是人们所希望的，例如如果试剂具有不能接受的毒性或者它另外需要太高的剂量或者如果它不能进入靶细胞。
不直接施用试剂的话，也可以在靶细胞中产生这些试剂，例如在比如上述的病毒载体中，或者在比如面美国专利号5 550 050和国际专利公布号WO 92/19195、WO 94/25503、WO 95/01203、WO 95/05452、WO 96/02286、WO 96/02646、WO 96/40871、WO 96/40959和WO 97/12635中所描述的基于细胞的运送系统中。可以使载体靶向靶细胞。将基于细胞的运送系统设计成被植入患者体内的目的靶位且其中包含靶试剂的编码序列。或者，试剂也可以以前体的形式施用，该前体被在所靶向或治疗的细胞中产生的激活剂转化为活性形式。参见，例如，欧洲专利公布号0 425 731A和国际专利公布号WO 90/07936。
又一方面，本发明提供含有组合物，例如本发明试剂，的试剂盒。该试剂盒还包含教导如本文中描述的方法和本发明用途的说明材料。
本领域技术人员将理解，本文所描述的发明除了以上特别描述的之外易于进行变化或修改。应理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或总体提及或指明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两种或多种所述步骤或特征的任何和全部组合。
通过以下非限制性实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
实验方法
以下实验方法用于下述实施例中。
表达构建体：
将人Bcl-2(登录号：登录号NP_000624；残基1-217)和人Bcl-w(登录号NP_004041；残基1-164；C29S A128E)克隆进pQE-9(Qiagen)；所表达的蛋白质具有附加的N-末端残基(MRGSHHHHHHGS，SEQ ID NO：1)。将人Bcl-xL(登录号NP_612815；残基1-209)、小鼠Mcl-1(登录号NP_031588；残基152-308)和小鼠A1(登录号NP_033872；残基1-152)克隆进pGEX-6P-3(Amersham Biosciences)，在经过PreScission蛋白酶消化的蛋白质中仅有五个附加的从载体衍生而来的残基(GPLGS)(参见下述)。人Bcl-2、人Bcl-xL和小鼠Mcl-1的FLAG(DYKDDDDK，SEQ ID NO：2)-标记的哺乳动物表达载体描述于Huang等人，EMBO J 16：4628-4638，1997。将N-末端HA(YPYDVPDYA，SEQ ID NO：3)-标记的全长人BimEL、人BimL、人Puma、小鼠Bad、人Bik和小鼠Noxa亚克隆进pEF PGKhygro(Huang等人，出处同前；O′Conner等人，EMBO J 17：384-395，1998)。用校正阅读Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR，并通过自动测序验证构建体。关于所使用的寡核苷酸和构建体的细节可以从发明人处获知。
pQE-9(Qiagen)中的构建体包括人( h)Bcl-2(登录号NP_000624；残基1-217)和带有C29S和A128E突变以提高其稳定性(Hinds等人，2003)的 hBcl-w(NP_612815；残基1-209)。六组氨酸标签(HHHHHH)使其能够在镍柱上纯化。重组 hBcl-xLΔC24、小鼠(m)Mcl-1ΔN151ΔC23和 mA1ΔC20表达为GST融合蛋白，并根据(Day等人，1999；Hinds等人，2003)的描述用PreScission蛋白酶谷胱甘肽-琼脂糖凝胶柱上切割下来及纯化。所使用的pGEX-6P-3(Amersham Biosciences)中的构建体，包括来自Bcl-xL(NP_612815；残基1-209)、Mcl-1(NP_031588；残基152-308)、和A1(NP_033872；残基1-152)的序列。蛋白酶切割后，它们保留了五个N-末端由载体衍生的残基(GPLGS)。
本研究中所使用的具有自由N-和C-末端的肽(附图2A)由Mimotopes(Victoria，澳大利亚)合成。所有肽都经反相HPLC纯化，且除 hBik(87％)、 mBmf(85％)和 mNoxa B(78％)之外，纯度均大于90％。通过电雾化质谱法鉴定了它们的同一性。将这些根据其重量和在分析HPLC柱上214nM处的吸光度定量的肽完全溶解于水中形成1-2mM的储存液；将 hBimBH3溶解于DMSO中。这些肽所依据的登录号是： mBimL(AAC40030)、 hBimL(AAC39594)、 hPuma(AAK39542)、mBmf(AAK38747)、 hBad(NP_004313)、 hBik(NP_001188)、 hHrk(NP_003797)、 hBid(NP_001187)、 hNoxa(NP_066950)、 mNoxa(NP_067426)。
重组蛋白质和肽：
根据Wilson-Annan等人，J cell Biol 162：877-888，2003描述的方法制备表达为N-末端六组氨酸融合蛋白的重组人Bcl-2ΔC22和人Bcl-wΔC29(包含C29S和A128E突变以提高蛋白质稳定性但不影响其结合特性)。根据(Day等人，Cell Death Differ 6：1125-1132，1999；Hinds等人，EMBO J 22：1497-1507，2003)的描述将重组人Bcl-xLΔC24、小鼠Mcl-1ΔN151ΔC23和小鼠A1ΔC20表达为GST融合蛋白，并从谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱上切下。
本研究中所使用的具有自由N-和C-末端的肽由Mimotopes合成。所有肽都经反相HPLC纯化，且除Bik(87％)、 mBmf(85％)和 mNoxa2(78％)之外，纯度均大于90％。通过电雾化质谱分析鉴定了它们的同一性。将这些根据其重量和在分析HPLC柱上214nM处的吸光度定量的肽完全溶解于水中形成1-2mM的储存液。这些肽的登录号是：小鼠BimL(AAC40030)、人BimL(AAC39594)、人Puma(AAK39542)、小鼠Bmf(AAK38747)、人Bad(NP_004313)、人Bik(NP_001188)、人Hrk(NP_003797)、人Bid(NP_001187)、人Noxa(NP_066950)和小鼠Noxa(NP_067426)。
圆二色(CD)谱学：
为进行圆二色(CD)测定，将肽贮存液和马心脏肌球蛋白在添加了30％(v/v)(2，2，2-三氟乙醇)(TFE)的30mM磷酸钠(pH 7)或20mM磷酸钠(pH 7)稀释至终浓度为0.15mg/ml。室温下用0.1cm的小试管在AVIV 62DS型分光偏振计记录CD谱。记录了两次连续扫描，且扣除了缓冲液单独的背景谱。
亲和测定和溶液竞争性检测法：
室温下在Biacore 3000生物传感器(Biacore)上以HBS(10mMHEPES pH 7.2，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20为流动缓冲液完成亲和测定。采用胺-耦联化学法(Wilson-Annan等人，出处同前)将小鼠26-mer wtBimBH3、4EBimBH3突变体、BadBH3、NoxaBH3或无关肽对照固定到CM5传感器芯片上。为评定促生存类Bcl-2蛋白质对BimBH3的直接亲和力，直接将该蛋白质以20μl/min注射到传感器芯片中。用50mM NaOH或6M GuHCl(pH 7.2)将剩余的残留结合蛋白释放出来，之后用流动缓冲液洗涤两次。扣除基线反应后，用BIA评估软件(第三版，Biacore)(Wilson-Annan等人，出处同前)从传感图得到结合动力学。
通过比较它们与固定化的wtBimBH3肽竞争结合类Bcl-2蛋白质的能力来评估BH3肽对促生存Bcl-2蛋白质的相对亲和力(Wilson-Annan等人，出处同前)。将固定亚饱和量(10nM)的促生存Bcl-2蛋白质与不同量的竞争剂BH3肽在HBS中冰浴超过2小时。之后将该混合物注射到一片传感器表面，该传感器包含一个固定有小鼠wtBimBH3的通道和一个固定有小鼠4EBimBH3的对照通道。扣除基线反应(对照通道)后得到绝对结合反应。以对促生存蛋白的反应作为最大反应(100％)，之后在给定注射时间(430s)内提高竞争肽含量的情况下计算相对残余结合(％)。以初始肽浓度对相对残余反应(f)作图，并将其代入方程f＝100/(1+(c/IC50)m)，其中c＝竞争肽的浓度，m＝曲率常数，以及IC50＝将结合降低50％所需的竞争肽浓度。理论上，IC50＝[A]/2+KD，其中[A]是分析物浓度。
所研究的一些重组蛋白质(Bcl-2、Bcl-xL、A1)包含半胱氨酸残基，但Bcl-2或Bcl-xL的表现却不受二硫苏糖醇(DTT)的影响。A1的孵育混合物中包括2.5mM Tris-(羧乙基)膦氯化氢(TCEP)，A1包含两个半胱氨酸且似乎比所研究的其它蛋白质都更加不稳定。
瞬间转染、免疫沉淀和免疫印迹：
人胚肾(HEK)293T细胞的维持、转染和用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(NEN)对人胚肾(HEK)293T细胞的代谢标记以及共免疫沉淀已得到描述(Huang等人，出处同前；Moriishi等人，Proc Natl Acad SciUSA 96：9683-9688，1999；O′Conner等人，出处同前)。简言之，用HA(HA.11；CRP)、FLAG(M2；Sigma)和对照Glu-Glu(CRP)标签的小鼠单克隆抗体对等量的TCA-可沉淀裂解物进行免疫沉淀。用SDS：PAGE裂解蛋白质，将其转移到硝酸纤维素膜上并用荧光照相术(Amplify；Amersham Biosciences)检测。免疫印迹用HA(3F10；Roche)、FLAG(9H1；(Wilson-Annan等人，出处同前)的大鼠单克隆抗体或小鼠单克隆抗-14-3-3β(H-8；Santa Cruz)完成，用HRP-耦联的抗大鼠(Southern Biotechnology)或抗小鼠(Silenus)抗体检测。通过增强的化学发光来显露这些蛋白质(ECL；AmershamBiosciences)。
实施例2
BimBH3紧密结合Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1
产生体外比较结合研究所需的可溶、单体、等量重组促生存蛋白质需要除去它们的疏水C-末端结构域(例如Hinds等人，出处同前)和Mcl-1的N-末端PEST区(Kozopas等人，Proc Natl Acad Sci 90：3516-3520，1993)。同样，由于无法可靠地产生全长BH3-only蛋白质，因此我们使用了长肽(24-26残基；表3)，因为较短的肽具有减弱的螺旋倾向这会使结合减弱(Petros等人，2000，出处同前)。由于跨小鼠BimBH3结构域(BimBH3)的26-mer肽与较长的Bim多肽同样易于结合Bcl-w(Wilson-Annan等人，出处同前)，因此我们用它来测定Bim对其他哺乳动物促生存分子的亲和力。例如Mcl-1，它流经固定化的野生型BimBH3肽而非突变BimBH3肽(不结合)时表现强结合反应(图1A)。确实，Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1均显示与wtBimBH3的强1∶1化学计量式结合(图1B)，0.2～4.5nM的解离平衡常数(KD)(表2)。因此，Bim类似地靶向全部五种哺乳动物促生存蛋白质。
表2：BIM对促生存蛋白质的比较结合
分析物     KD(nM)     kd(10-3s-1) ka(103M-1s-1)
Bcl-2ΔC22Bcl-xLΔC24Bcl-wΔC29Mcl-1ΔN151ΔC23A1ΔC20     4.50.81.60.20.5     0.140.442.700.260.14 3057017001300290
如Hinds等人，出处同前；Wilson-Annan等人，出处同前所述，利用生物传感器实验在传感器芯片上测定了促生存分子对wtBimBH3的结合常数。
实施例3
特定的BH3结构域选择性结合促互存靶
为评估其它的BH3肽是否类似地结合促生存蛋白质，我们用竞争结合检测法直接比较了它们在溶液中的结合亲和力。在这样的检测法中，靶蛋白的质量和绝对量不如在直接结合中那么重要，且溶液结合排除了一些固定化肽所遭遇的空间障碍。图1C显示这一过程：Bcl-xL在溶液中和逐渐增加量的BikBH3预培养减弱了其与wtBimBH3的结合(图1D)。从结合的衰减可以计算出BikBH3的IC50(半数结合时的竞争肽浓度)(图1E)。由于IC50值反映相对结合亲和力(参见实验方法)，我们用该检测法来比较八种BH3肽(表3)与五种促生存蛋白质的结合亲和力。
令人吃惊的是，BH3肽对不同的促生存蛋白质的相对亲和力相差10,000倍(图2A和表2)。它们的结合特性分作几类(图2B和图4)。只有BimBH3和PumaBH3对所有的促生存蛋白质具有相当的亲和力。其它的BH3肽对其特定的亚组具有惊人的选择性。例如，相比A1(～15μM)或Mcl-1(＞100μM)，BadBH3强烈偏好Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w(5.3～30nM)(图2A和B)，BmfBH3也表现出类似的偏好。与此截然相反，NoxaBH3对Mcl-1和A1(nM范围)具有高度的选择性，但是与其它的促生存蛋白质却不发生可检测的结合(＞100μM)。最后，目比Bcl-2或Mcl-1，BikBH3、HrkBH3和BidBH3更偏好Bcl-xL、Bcl-w和A1。与主流观点相反，促生存蛋白质还具有独特的BH3结合模式：Bcl-xL与Bcl-w表现类似，Bcl-2较为独特，而Mcl-1和A1构成一个独立的组(附图2B)。
表3：BH3肽
固定化的肽(顶部2行)源自小鼠( m)BimL。4EBimBH3有四个对于与促生存蛋白质(参见文本)相互作用非常关键的疏水残基(H1～H4)突变为谷氨酸(E)。除注明“ m”(小鼠)之外，竞争肽均源自人蛋白质。按照Huang和Strasser，出处同前所述用GCG“PILEUP”程序进行序列比对。
由于全部的BH3肽都易于结合至少两种促生存蛋白质(附图2)，因此它们的完整性和构象不太可能影响我们的结果。尽管如此，由于较短的BadBH3肽与Bcl-xL的结合依赖于它们的螺旋性(Petros等人，2000，出处同前)，我们评估了CD(圆二色)谱学中所使用的肽的构象。在水性环境下，所有的肽似乎大部分都无结构(图5A)。然而，在加入30％TFE(2，2，2-三氟乙醇)后，一种稳定α-螺旋形成的溶剂(Nelson和Kallenbach，Biochemistry 28：5256-5261，1989)，它们很容易α-螺旋化(补充图S2B)，这表明它们的螺旋化潜力。我们观察到，它们在TFE中的螺旋化倾向与结合亲和力无相关性。
对Bad和Noxa观察到的与众不同的互补结合模式尤其惊人(图2)。Noxa的结果与另一溶液竞争检测中的一致(Letai等人，出处同前)，但是有报道称Noxa在免疫沉淀检测法中与Bcl-2和Bcl-xL结合(Oda等人，Science 288：1053-1058，2000)。为解释这一矛盾，我们还做了与固定化BadBH3或NoxaBH3肽的直接结合试验。与溶液竞争结果一致，只有Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w与BadBH3结合(图6A)，且只有Mcl-1和A1与NoxaBH3结合(图6B)。与人Noxa不同，小鼠Noxa包含两个BH3结构域(Oda等人，出处同前)，但两个小鼠NoxaBH3肽(表2)都结合Mcl-1(IC50 87和109nM)，而不结合Bcl-2、Bcl-xL或Bcl-w。因此，推测Noxa特异性拮抗Mcl-1和A1。
实施例4
Bad、Bik和Noxa在哺乳动物细胞中有选择性生理靶
在不同的试验中对选择性相互作用进行了验证。用可以制备的重组BH3-only蛋白质完成(Bim、Bmf、Bad和Bid)的GST下调(pull-down)实验，给出的结果与溶液竞争试验一致。最确切的是，GST Mcl-1紧密结合Bim，弱结合Bmf，而不结合Bad。为验证该体外结果，用共免疫沉淀法在哺乳动物细胞中调查了所选择的成对全长N-末端标记的蛋白质间的相互作用。HA-Bim、Puma、Bad、Bik或Noxa在HEK293T细胞中与作为所描述的三类促生存蛋白质代表的FLAG-Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1共表达(图2B)。细胞被35S-甲硫氨酸/半胱氨酸代谢标记从而可以对共相关放射标记蛋白质间的任何相互作用做半定量评估。对于所测试的任何一对，通过免疫沉淀所检测的相互作用(图3)与之前的亲和力测定同时进行(图2)。尤其是，Bad与Bcl-2和Bcl-xL结合得很好，但却一点儿都不与Mcl-1结合(图3D、3E)(Opferman等人，Na ture 426：671-676，2003)，而Noxa(带有两个BH3的全长小鼠Noxa)仅与Mcl-1互作(图3F、3G)。Bik与Bcl-xL的程度大于Bcl-2或Mcl-1(图3C)，而Bim和Puma如同所预期的，与全部三种促生存蛋白质结合良好(图3A和3B)。
实施例5
特定残基对于确定Noxa对Mcl-1的选择性是重要的
比较BH3结构域的序列时发现，似乎F32和K35对于确定Noxa对Mcl-1的结合是重要的。野生型Noxa不与Bcl-xL结合，但F32或K35突变均增强Bcl-xL结合，双重突变则结合更加增强(表4)。这强烈暗示，Noxa的F32和K35对于确定Noxa对Mcl-1的选择性是重要的。
表4：特定残基对于确定Noxa对Mcl-1的选择性是重要的
实施例6
Bad、Bik和Noxa在哺乳动物细胞中有不同的靶
为验证体外结果，用共免疫沉淀法在哺乳动物细胞中调查了所选择的成对全长N-末端标记的蛋白质。作为所描述的三类促生存蛋白质代表(图4)，Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1在293T细胞中与Bim、Puma、Bik、Bad或Noxa共表达。细胞被35S-甲硫氨酸/半胱氨酸代谢标记从而可以对放射标记蛋白质间的任何相互作用做半定量评估或者通过更为敏感的蛋白质印迹法对相互作用进行测定。
值得注意的是，对于每一受测试对，通过免疫沉淀所检测到的相互作用与从在先的亲和力测定预计的相同(图4)。尤其是，Bad与Bcl-2和Bcl-xL结合良好，但不与Mcl-1结合，而Noxa(带有两个BH3的全长小鼠Noxa)仅与Mcl-1相互作用。此外，Bik与Bcl-xL的结合大于Bcl-2或Mcl-1，而Bim，如同所预期的，同Puma一样易于与全部三种促生存蛋白质结合。
实施例7
具有限制性靶的BH3-only蛋白质是较弱的杀伤物质
为评估选择性结合的生物相关性，采用反转录病毒递送来比较不同的BH3-only蛋白质杀死野生型小鼠胚纤维原细胞(MEFs)的能力。为监控所导入基因的表达，使用了载体(pMIG)，在该载体中所导入基因的表达通过经内部核糖体进入位点(IRES)与绿色荧光蛋白(GFP)的表达耦联(Van Parijs等人，Immunity 11：281-288，1999)。细胞被有效感染(＞90％)且所导入的BH3-only蛋白质被有效表达。感染后24小时(图7A，7B)以及在长期克隆检测中(图7E)对所感染的(GFP+ve)细胞的活力进行记分。
尽管采用亲本病毒所作的感染引起最小程度的凋亡，但大多数用表达Puma或各种Bim异构体(Bims、BimL或BimEL)的病毒感染的细胞以剂量依赖的方式迅速死亡(图7B)，并且未能形成集落(图7E)。重要的是，其它被测试的BH3-only蛋白质(Bmf、Bad、Bik、Hrk、Noxa)，尽管得到了充分的表达，其作为杀伤剂的潜力却低得多(图7B)，这可能是因为这些BH3-only蛋白质中没有一个能够中和在MEFs中基本表达的所有促生存分子(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)。
特定BH3-only蛋白质的较弱的促凋亡活性，通常归因于特定的负调控机制，比如Bad被14-3-3蛋白质结合。为排除这样的影响并允许对不同的BH3结构域作直接比较，对其中用Puma、Bad或Noxa的BH3替换了Bims BH3嵌合分子作了分析。之所以选择Bims作为基本骨架，是因为Bims，最有效的Bim异构体，不是通过与动力蛋白运动复合物的相互作用来调控的。其促凋亡活性仅依赖于BH3区域，因为Bims4E，其BH3已突变，不与任何一种促生存分子结合并缺乏促凋亡功能。与嵌合蛋白的天然对应物不同，嵌合蛋白的另一个优点是均以相当量的水平表达。
值得注意的是，Bims与PumaBH3的嵌合体保留了Puma结合所有受试促生存分子的能力，且其杀伤效力与天然Bim或Puma相同。相反，Bims与BadBH3或NoxaBH3的嵌合体的表现分别与天然Bad或Noxa相似。Bims BadBH3结合Bcl-xL，但不结合Mcl-1，而Bims NoxaBH3相反却结合Mcl-1。相应地，这两种嵌合体在短和长期的试验中均表现出弱的促凋亡活性。因此，由各BH3-only蛋白质诱导的杀伤似乎反映出其紧密结合细胞中存在的所有促生存类-Bcl-2分子的能力。
实施例8Bad和Noxa间的功能互补
由于结果显示，凋亡需要中和所有的相关促生存蛋白质，因此具有互补结合谱的BH3-only蛋白质(图8A)应当合作杀死细胞。因此，Noxa对Mcl-1的中和应当由BadBH3的共表达来补充以中和MEF中的Bcl-2和Bcl-xL(图8A)。同样地，NoxaBH3应当增强由Bik诱导的杀伤，Bik结合Mcl-1比结合Bcl-xL弱40倍。为了能够做互补实验，通过用Bims的GFP融合物、或嵌合Bims BadBH3和Bims NoxaBH3替换GFP，在pMIG载体中共表达几对BH3-only蛋白质。这样的融合体表现类似于它们的亲本BH3-only对应物，因为GFP Bims融合体是强杀伤物(图8B)。
重要的是，Noxa与BadBH3的共表达导致与仅表达Bims同样多的细胞死亡(图8B)。类似地，NoxaBH3被Bik有效地增强杀伤。所观察到的协同作用反映出互补的BH3功能，因为NoxaBH3的共表达不会增强Noxa杀伤，而且当与GFP融合的Bims BadBH3与不结合Mcl-1的惰性形式的Noxa(3EBH3突变体；参见实验方法)共表达时未观察到显著的杀伤(图8B)。因此，当三种BH3-only蛋白质中的任意一种单独在纤维原细胞中表达时，主要与Bcl-2和Bcl-xL结合的Bad和Bik能够有效地与选择性结合Mcl-1的Noxa共同作用从而增强所观察到的弱杀伤。
实施例9
由混杂型Noxa突变体诱导的有效杀伤
随后探究了Noxa的选择性结合谱和弱杀伤活性的分子基础。功能互补实验结果(图8)提示，结合额外的促生存蛋白质的Noxa形式有可能是一种有效的杀伤剂。Bcl-xL：Bim复合物的高分辨率X-射线晶体学结构指导了寻找该变体的研究(图9A)。BimBH3的疏水残基(包括亮氨酸L94、异亮氨酸I97、苯丙氨酸F101；基于小鼠BimL编号)结合Bcl-xL表面的疏水口袋。Bcl-xL(和Bcl-2)上对应Bim I97(h3)的口袋部分地由苯丙氨酸(F97)和酪氨酸(Y101)残基形成，它们比Mcl-1(缬氨酸、组氨酸)或A1(缬氨酸、缬氨酸)中相应的残基大，这提示，Mcl-1和A1能够容易地容纳在人NoxaBH3中发现的γ-支链苯丙氨酸(F32)(图9B)。此外，在Bim的带负电荷的谷氨酸(E100)和Bcl-xL上的带正电的精氨酸(R100)之间形成了一个共有电荷对，但是这一在Bcl-2和Bcl-w中保守的精氨酸，在Mcl-1中被中性的天冬酰胺所替换、在A1中被谷氨酸所替换。因此，从BimBH3中的谷氨酸(E100)到Noxa中的赖氨酸(K35)的电荷改变(附图9B)可能是削弱NoxaBH3与Bcl-xL结合的一个因素。
基于这些考虑，在溶液竞争试验中测试了带有突变K35E(m1)、F32I(m2)或这二者(m3)的Noxa(图9B)对促生存蛋白质的结合。它们与Bcl-2的结合仍然很弱，但与Bcl-xL和Bcl-w的结合却显著增强(图9C)。对于Bcl-xL，电荷改变突变K35E(m1)使结合增强了20倍以上；F32I替换(m2)使结合增强了超过100倍；双突变(m3)更进一步使结合得到增强(图9C)。而wtNoxaBH3对Bcl-xL和Bcl-w二者的IC50均大于100,000nM，m3突变体表现对Bcl-xL的IC50为110nM、对Bcl-w的是410nM，而Mcl-1结合得到轻微地提高(图9C)。共免疫沉淀实验证实，Noxa m3在细胞中结合Bcl-xL(图9D)，而野生型Noxa不结合(图7C)。因此，两个关键BH3残基的改变足够拓宽Noxa的特异性。
值得注意的是，当在纤维原细胞中表达时，Noxa m3被证实是一种比野生型Noxa更有效的杀伤剂(图9E、9F)。因此，Noxa只与Mcl-1结合不足以杀死MEFs。Noxa对凋亡的有效诱导需要其它的BH3与Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w类蛋白质之间的互作，或者通过Bad-类蛋白质的共表达(图8)或者通过降低Noxa选择性的突变(m3；图9)来提供这种相互作用。
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1               5                   10
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<400>2
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210>3
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<212>PRT
<213>肽
<400>3
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1               5

Claims (18)

1.一种产生促生存Bc1-2家族的拮抗剂的方法，所述方法包括：选择带有定义由BH3结构域形成的两性α-螺旋之残基位置的支架BH3-only蛋白质结构；选择一或多个与BH3-only蛋白质的混杂型结合表型相关的残基位置；将赋予其混杂型表型的氨基酸残基替换为赋予其与Bc1-2蛋白质的限制型结合模式的氨基酸或其化学类似物；和分析各次替换后的相互作用其诱导更为限制的Bc1-2蛋白质结合谱的能力。
2.权利要求1的方法，其中Bc1-2拮抗剂特异于Bc1-2、XBc1-xL、Bc1-w、Mc1或A1中的一种或多种。
3.权利要求1或2的方法，其中Bc1-2拮抗剂基于选自Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid的分子的结构。
4.权利要求1的方法，其中Bc1-2拮抗剂抑制癌细胞上的促生存蛋白质。
5.权利要求4的方法，其中癌细胞选自：ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、起因不明的骨髓化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星细胞瘤、共济失调-毛血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、中枢神经系统肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童期脑肿瘤、儿童期癌、儿童期白血病、儿童期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、皮肤纤维肉瘤-隆凸、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管细胞癌、内分泌腺癌、子宫内膜癌、室鼓膜瘤、食道癌、恶性骨髓瘤、肝外胆小管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、先天性骨髓发育不全、纤维肉瘤、胆汁膀胱癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养层疾病、神经胶质瘤、妇科癌、血液恶性肿瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金氏病、人视神经乳头水肿病毒、水泡状胎块、血钙过多、咽喉癌、眼内黑素瘤、岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕氏细胞-组织细胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni综合症、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳腺癌、恶性棒状肾肿瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、迁移癌、口癌、多发性内分泌腺瘤、蕈样霉菌病、骨髓异常增生综合征、骨髓瘤、骨髓及外骨髓增殖失调、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病遗传性疾病、Nijmegen Breakage综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘘术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、副甲状腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、红血球增多症、前列腺癌、罕见癌及其相关病症、肾细胞肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白内障-毛细血管扩张-色素沉着综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、恶性皮肤网状细胞增多综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊索肿瘤、鳞片细胞肉瘤(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、迁移性细胞癌(膀胱)、迁移性细胞癌(肾-骨盆-/-输尿管)、胚胎滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、Uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、阴户癌、瓦尔登斯特伦病(股骨小头的骨软骨病)巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中Bc1-2拮抗剂抑制哺乳动物中的促生存蛋白质。
7.权利要求6的方法，其中所述哺乳动物是人。
8.一种产生或选择促生存Bc1-2蛋白质家族的拮抗剂的方法，所述方法包括：选择限制型BH3-only蛋白质作为支架蛋白质，确定赋予该支架限制型表型的构象，和产生或筛选模拟所述支架和/或赋予其限制型Bc1-2蛋白质结合谱的构象部分的化合物。
9.混杂型BH3-only蛋白质作为氨基酸残基替换基质在产生或选择替换变体中的用途，所述变体赋予所述BH3-only蛋白质或其化学或构象等价物以限制型结合表型。
10.一种基于带有赋予其限制型表型的残基位置之支架BH3-only蛋白质设计促生存Bc1-2蛋白质家族的拮抗剂的计算方法，该方法包括：选择一些混杂型BH3-only蛋白质；对这些蛋白质进行序列比对，将这些蛋白质与限制型BH3-only蛋白质比较；根据所述比对得到各氨基酸在一或多个带来与Bc1-2蛋白质结合的混杂特性或限制特性的位置上的出现频率；利用所述频率产生选自电荷、大小、构象、溶解度、极性、疏水性、亲水性和对三级结构的贡献的计分函数；用所述计分函数和至少一种另外的计分函数来产生一套优化蛋白质序列或其构象等价物，和产生或选择具有与Bc1-2蛋白质的限制型结合表型的化合物或蛋白质。
11.权利要求10的方法，其中所述计分函数选自(a)酸性残基的数量和位置；或(b)碱性残基的数量和位置；或(c)极性残基的数量和位置；或(d)非极性残基的数量和位置；或(e)带电荷残基的数量和位置；或(f)不带电荷残基的数量和位置；或(g)亲水残基的数量和位置；或(h)疏水残基的数量和位置；或(i)残基的水平；或(j)残基的溶解度水平；或(k)残基的大小；或(1)该残基在BH3-only蛋白质中作出的对三级结构的贡献。
12.一种用于确定在细胞中诱导凋亡的试剂之结构的计算机程序产品，所述产品包括：
(1)被接收为输入计分函数(SF)的至少两种与所述BH3-only或Bc1-2蛋白质相关的特征的代码，其中所述特征尤其选自：
(m)酸性残基的数量和位置；
(n)碱性残基的数量和位置；
(o)极性残基的数量和位置；
(p)非极性残基的数量和位置；
(q)带电荷残基的数量和位置；
(r)不带电荷残基的数量和位置；
(s)亲水残基的数量和位置；
(t)疏水残基的数量和位置；
(u)残基的水平；
(v)残基的溶解度水平；
(w)残基的大小；
(x)该残基在BH3-only蛋白质中作出的对三级结构的贡献
(2)累加所述SF以提供相应于BH3-only蛋白质的PV的总和的代码；和
(3)储存代码的计算机可读介质。
13.一种用于评估BH3-only蛋白质或化学等价物在细胞中诱导凋亡的可能用途的计算机，其中所述计算机包括：
(1)机器可读数据存储介质，该介质包括编码有机器可读数据的数据存储材料，其中所述机器可读数据包含至少两种与所述BH3-only或Bc1-2蛋白质相关的特征的Iv，其中所述特征尤其选自：
(m)酸性残基的数量和位置；
(n)碱性残基的数量和位置；
(o)极性残基的数量和位置；
(p)非极性残基的数量和位置；
(q)带电荷残基的数量和位置；
(r)不带电荷残基的数量和位置；
(s)亲水残基的数量和位置；
(t)疏水残基的数量和位置；
(u)残基的水平；
(v)残基的溶解度水平；
(w)残基的大小；
(x)该残基在BH3-only蛋白质中作出的对三级结构的贡献
(2)用于存储处理所述机器可读数据的指令的工作存储器；
(3)与所述工作存储器以及所述机器可读数据存储介质相耦连的中央处理单元，用于处理所述机器可读数据以提供相应于所述化合物PV的所述SF的总和；和
(4)与所述中央处理单元相耦连的输出硬件，用于接收所述PV。
14.一种预防或减轻受试者的癌症的方法，所述方法包括：在足以预防或减轻癌症的条件下向所述受试者施用有效量的Bc1-2蛋白质拮抗剂一定时间。
15.权利要求14的方法，其中所述拮抗剂与一种或多种药学可接受载体和/或稀释剂相结合形成药物组合物。
16.权利要求14或15的方法，其中拮抗剂的施用经呼吸道、气管内、鼻咽、静脉内、腹膜内、皮下、颅内、皮内、肌内、眼内、鞘内、小脑内、鼻内、灌注、口服、直肠、贴片和植入途径给药。
17.一种包含促生存Bc1-2蛋白质家族拮抗剂的组合物，所述拮抗剂通过以下方法产生：选择带有定义由BH3结构域形成的两性α-螺旋的残基位置的支架BH3-only蛋白质结构；选择一或多个与BH3-only蛋白质的混杂型结合表型相关的残基位置；将赋予其混杂型表型的氨基酸残基替换为赋予其与Bc1-2蛋白质的限制型结合模式的氨基酸或其化学类似物；分析各次替换后的相互作用其诱导更为限制的Bc1-2蛋白质结合谱的能力，所述组合物还包含一种或多种药学可接受载体和/或稀释剂。
18.促生存Bc1-2蛋白质家族的拮抗剂在生产癌症治疗药物中的用途，所述拮抗剂通过以下方法产生：选择带有定义由BH3结构域形成的两性α-螺旋的残基位置的支架BH3-only蛋白质结构；选择一或多个与BH3-only蛋白质的混杂型结合表型相关的残基位置；将赋予其混杂型表型的氨基酸残基替换为赋予其与Bc1-2蛋白质的限制型结合模式的氨基酸或其化学类似物；和分析各次替换后的相互作用其诱导更为限制的Bc1-2蛋白质结合谱的能力。
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