CN1972675A - 用于递送活性剂的粒子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了粒度小于100微米的粒子，在所述粒子中活性剂用阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质涂布，所述粒子是用于将活性剂递送到组织如皮肤和粘膜的有效介质。这种粒子能够以很少的相关刺激将化合物递送到皮肤。现有技术的局部用制剂通常具有引起显著的皮肤刺激的缺点。

Description

用于递送活性剂的粒子

发明背景

局部用维甲酸类如视黄酸已经被用于治疗皮肤状况如粉刺、光化性角化病、银屑病、皮肤癌和光致损伤和用于黑素瘤的化学预防[Griffiths等人，N Eng J Med，329：530-534(1993)；Halpern等人，在Advances in the biology and treatment of cutaneous melanoma，Boston，MA，November 6-7^th(1998)中；Kligman，J Am Acad Dermatol，39：S2-S7(1998)；Stam-Postuma，Melanoma Research，8：539-48(1998)；Varani等人，J Inv Dermatol，114：480-486(2000)]。

局部用视黄酸用于治疗皮肤疾病的一个副作用为刺激性增加。局部用维A酸(全反式-视黄酸，ATRA，视黄酸)在90％的患者中引起刺激(Gilchrest，J Am Acad Dermatol，36：S27-S36(1997)]，其它副作用包括斑状红疹、局部肿胀、干燥病和脱皮。刺激已部分地归因于皮肤中维A酸依赖型通道被非生理学量的外源性维A酸过载(Siegenthaler等人，在Retinoids：From Basic Science To Clinical Applications，M.A.Livrea和G.Vidali(eds)，Birkhauser Verlag，Basel，Switzerland，pp.329-335，(1994)中)。例如，与经口给药相比，视黄酸的局部递送使真皮区域中的视黄酸浓度增加10到100倍(Lehman等人，J Invest Dermatol，91：56-61(1988))。这种刺激可能是约50％患者中止治疗的原因(Stam-Postuma等人，Melanoma Research，8：539-48(1998))。导致顺从性差的这种高发性刺激可以妨碍其应用。因此，减少刺激的任何方法都被看作是对任何局部用制剂的非常合乎需要的贡献。在现有技术中，将视黄酸截留在多孔性微球体(Microsponge^)中以延缓其释放到皮肤层中，通过控制活性剂释放进入皮肤中而降低刺激(Won等人，美国专利5,955,109(1999))。然而，包含这种递送系统的制剂趋向于在皮肤表面上沉淀细干残余物，其是美学上不能被接受的。

除了相当的刺激性之外，还有由于维甲酸类和如维生素D3的化合物的水不溶性和光不稳定性引起的与其局部给药有关的问题。低的溶解性限制了将这些药物结合到可接受的介质中，而光不稳定性可使局部施用的药物无效。不溶性问题意味着这些药物不能在没有通常带有刺激性的添加剂和增溶剂的存在下进行局部给药。在对人局部施用这些药物时，它们必须穿过角质层，然后到达作为表皮层和真皮层的靶组织。应该避免活性剂向系统循环中的任何进一步渗透，因为这将触发某些细胞因子如IL-1α的释放并且引起继发性的刺激反应。

因为由这些活性剂引起的刺激，多年来一直需要取代常规局部用制剂(如，凝胶剂、霜剂和洗液)。问题在于如何将不溶性药物混合在载体溶液中而不使用可能带有刺激性的添加剂和/或增溶剂。另外，存在如何用在能够稳定药物并且更容易为患者所忍受的试剂中“掩蔽”药物的问题。

虽然已经考虑将脱乙酰壳多糖作为局部用制剂的成分，但是以前的制剂没有解决上述的所有问题。

在Grandmontagne等人(美国专利6,242,099(2001))中，使用阴离子表面活性剂和脱乙酰壳多糖生产了由壳多糖或壳多糖衍生物包封疏水物质而成的微胶囊。阴离子表面活性剂起到使疏水物质乳化以及使脱乙酰壳多糖聚合物沉淀的双重作用。脱乙酰壳多糖通过交联进行进一步加工或通过乙酰化形成壳多糖。在该发明中，微胶囊的形成要求使用阴离子表面活性剂，其可能引起不利的皮肤反应，如红疹和浮肿。使用表面活性剂沉淀脱乙酰壳多糖的应用还在德国专利申请DE19712978 A1和DE 19756452 A1中有所公开，其描述了通过将脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物与油状体(oil bodies)混合并将这些混合物在碱性表面活性剂溶液中沉淀生产的微球体。

Garces等人描述了通过将活性成分的乳液用阴离子聚合物包封随后用脱乙酰壳多糖包封生产的直径为0.1mm到5mm的微胶囊(美国专利公开2003/0064106)。这些微胶囊通过包含乳化剂以形成初始乳液并使活性成分增溶的方法得到。

因此，现有技术的包封方法依靠表面活性剂和/或乳化剂作为生产脱乙酰壳多糖基微粒的关键步骤。这些表面活性剂，特别是离子表面活性剂，可以促进增加的皮肤刺激和其它不利的皮肤反应。另外，这些微粒中的一些在局部施用后留下美学上不能接受的残余物。因此，需要克服这些问题的制剂。

发明内容

本发明的发现是基于水不溶性活性剂可以适合于给药(如，局部给药、透皮给药、经粘膜给药)的微米粒子或纳米粒子(统称为粒子)的形式进行递送的发现。也就是说，具有改善的到达或通过皮肤或粘膜表面的转运性质和/或减少的对给药位置的刺激。主题组合物避免了对在乳液中给药不溶性活性剂(如，视黄酸)的需要，所述乳液包含引起刺激的溶剂或表面活性剂，如在聚(丙烯酸)凝胶剂中稀释的乙醇和聚乙氧基化蓖麻油(参见例如Technical Bulletin ME 142e，Tretinoin for thePharmaceutical Industry，October 1998，BASF Corporation)。相对于单独的或在这些其它制剂中的活性剂，本发明的系统减少或消除了不利的皮肤反应如红疹和肿胀。因此，本发明的组合物可以递送以其它方式递送时可引起反应的活性剂，如视黄酸、视黄醇和钙泊三醇。

在某些实施方案中，本发明提供用于给药水不溶性或水微溶性活性剂的组合物，其包括平均直径最大为100微米的粒子。在某些实施方案中，粒子为纳米粒子，其平均直径小于1微米，如10nm到500nm或20nm到300nm。粒子包括含活性剂的内核(如，主要是实心粒子)和由包括阳离子聚合物(如，高粘度脱乙酰壳多糖)和阴离子聚合物的基质形成的外壳。外壳的基质由离子性或其它非共价相互作用形成，而不是通过这些聚合物的化学交联形成。

在某些实施方案中，本发明提供用于递送刺激性活性剂的组合物。这种组合物包括的粒子具有含活性剂的内核和由包括阳离子聚合物(如，高粘度脱乙酰壳多糖生物聚合物)和阴离子聚合物的基质形成的外壳。在某些实施方案中，活性剂既是刺激性的又是水不溶性或水微溶性的。

在示例性的实施方案中，本发明的组合物由活性剂(如，在适当的分散剂中)和阳离子聚合物的水溶液的乳液形成，所述阳离子聚合物在剧烈搅拌条件下在阴离子聚合物的存在下、通常在大于6.0的pH值下沉淀，形成微米粒子和/或纳米粒子。可以通过例如使用高压均化器(如，微流化器(microfluidizer))减小粒子大小。可两次或多次通过高压均化器以得到所需大小的粒子。

在另一个示例性的实施方案中，本发明的组合物的制备通过将阳离子聚合物溶解在水溶液中并将其与在适当的分散剂中的活性剂(如，视黄酸)混合，以形成包含活性剂粒子的乳液，然后直接使其通过高压均化器，直到得到所需大小的粒子。可将其它试剂加入到乳液中(如，阴离子聚合物)以促进粒子的形成，优选加入对皮肤没有刺激的试剂。

在某些实施方案中，本发明的制剂包括直径小于1微米的粒子，优选小于500nm，优选大于20nm。这种粒子通常足够小以穿过角质层，但是足够大以保留在皮肤组织中。

本发明还包括本文所述组合物在生产药物中的应用，所述药物用于治疗本文中公开的疾病或状况。

水不溶性活性剂以微粒型悬浮液形式进行局部递送使得活性成分有更大的稳定性和粒子向作为皮肤外层的角质层中的渗透的增加。

附图说明

图1表示当视黄酸被包含在纳米粒子中时其在40℃是稳定的。

图2表示对于游离视黄酸或用脱乙酰壳多糖截留的视黄酸，通过使用Franz扩散池的皮肤外植体模型，视黄酸渗透性作为高分子量脱乙酰壳多糖(HMW)浓度的函数。

图3表示视黄酸(ATRA)在200小时之后的皮肤分布。

发明描述

已经出人意料地发现如果首先将阳离子聚合物如高粘度脱乙酰壳多糖在分散在适当的分散剂中的水不溶性活性成分的存在下混合形成基质，则这种基质可以随后在阴离子聚合物的存在下在剧烈搅拌条件下沉淀以形成可穿透角质层或皮肤外层的微米或亚微米大小的粒子。脱乙酰壳多糖基微米粒子或纳米粒子的这种制剂避免了使用可以引起皮肤刺激或其它不良反应的表面活性剂或乳化剂。

本发明提供其中将水不溶性或水微溶性的活性剂(例如药物如维甲酸类)结合在聚合物载体中的组合物，用于提供以下优点，如药物的有利的组织分布、延长的半衰期、受控的药物释放和降低的药物毒性。另外，本发明的局部用组合物提供活性剂的持续释放。虽然申请人不希望束缚于任何特定理论，但是据信持续释放是通过将活性剂沉淀在阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质中实现的。此外，本发明的局部用组合物起到局部递送介质的作用，其不在皮肤上留下聚合物残余物。没有残余物可能是由于某些阳离子聚合物对皮肤表面的生物粘附性，认为生物粘附性允许到角质层或皮肤外层中的更大渗透。与递送介质减少皮肤刺激的能力一致，本发明的示例性组合物在动物研究中表现出统计学上更低水平的红疹和浮肿(参见实施例)。

作为阳离子聚合物的例子的脱乙酰壳多糖用在局部用药物或化妆品制剂中的能力是出乎意料的。在先前的实验中，申请人发现脱乙酰壳多糖与阴离子聚合物和/或大于6的pH不相容。在这些情况下，脱乙酰壳多糖在最终的局部用制剂中以通常包括美学上不接受的较大微粒的凝胶复合物的形式沉淀。这与指出脱乙酰壳多糖在阴离子聚合物的存在下和在pH大于6时形成不溶性沉淀物的文献记载一致(参见Cognis Company Literature on HydagenCMF和Amerchol Companyliterature on Kytamer^TM PC)。

上述优点可以通过使用比微米粒子更小的纳米粒子得到进一步的增强。微米粒子的平均直径为1微米到100微米，例如1微米到50微米、1微米到20微米、或1微米到10微米。通常，纳米粒子的平均直径为小于1或小于500nm，例如20nm到500nm、20nm到300nm、50nm到200nm、或50nm到150nm。优选地，大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、或大于99％的粒子落入这些范围的一个范围中。优选地，粒子均匀性为使得在具有特定平均直径的组中的粒子具有在平均直径的50％范围内，例如在25％内或甚至在10％内的个体直径。

如本文中使用的，术语“活性剂”是指在被引入到身体中时对被施用组织的外观有影响、或改变身体器官等活动方式的任何物质。

术语“水不溶性的”是指不溶于水或微溶于水的任何活性剂。水微溶性的化合物具有在25℃的水中小于0.1mg/ml的溶解度，优选小于0.05mg/ml。水不溶性的化合物具有在25℃的水中小于0.01mg/ml的溶解度。

术语“刺激性”是指在施用于皮肤时引起浮肿和/或红疹的活性剂。通常，刺激性活性剂具有大于1.0的累积刺激指数(如下所述)，更通常为大于2.0。

术语“药学活性剂”是指药物，即，在施用于身体或被引入到身体中时以某种方式改变身体器官等活动的物质，如改变细胞过程。水不溶性或水微溶性的药学活性剂的例子包括但不限于抗炎药(如，NSAIDS、激素和自体有效物质例如皮质类固醇)、抗痤疮药(如，维甲酸类)、抗皱药、抗疤痕药、抗银屑病药、抗增殖药(如，抗湿疹药)、抗真菌药、抗病毒药、抗菌剂(如，抗菌药)、局部麻醉剂、抗偏头痛药、角质溶解剂、毛发生长刺激药、毛发生长抑制剂和用于治疗皮肤疾病或状况的其它药物。某些活性剂属于不止一个类别。

维甲酸类的例子包括但不限于化合物，如视黄酸(顺式和反式)、视黄醇、阿达帕林、维生素A和他扎罗汀。维甲酸类可用于治疗痤疮、银屑病、红斑痤疮、皱纹和皮肤癌和癌前体如黑素瘤和光化性角化病。

非甾体抗炎药包括水杨酸、水杨酸酯、乙酰水杨酸、二氟尼柳、保泰松、羟布宗、布洛芬、酮洛芬、萘普生、甲芬那酸、夫洛非宁、托美丁、佐美酸、双氯芬酸、吡罗昔康等。

自体有效物质和激素(不限于抗炎药)包括甾体化合物、前列腺素、前列环素、凝血恶烷、白细胞三烯、血管紧张素(卡托普利)、以及药学活性肽如5-羟色胺、内啡肽、加压素、催产素等。水微溶性的甾体化合物包括雌激素和皮质类固醇。抗炎的皮质类固醇包括黄体酮、氢化可的松、泼尼松、氟氢可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、肤轻松等。

局部麻醉剂包括可卡因、氨苯乙酯、丁卡因、利多卡因、布比卡因、它们的盐酸盐等。

一般的防腐剂包括吖啶类染料、溴硝丙二醇、氯己定、酚类、六氯酚、有机汞制剂、有机过氧化物(过氧苯甲酰)、季铵化合物等。

抗生素药包括青霉素、头孢菌素、环孢子菌素、万古霉素、杆菌肽、环丝氨酸、多粘菌素、粘菌素、制霉菌素、两性霉素B、mupirocim、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、壮观霉素、克林霉素、利福平、萘啶酸、氟胞嘧啶、灰黄霉素等。磺胺类抗菌剂包括磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲唑、甲氧苄氨嘧啶、胺嘧啶等。

抗病毒药包括阿糖腺苷、阿昔洛韦、利巴韦林、盐酸金刚烷胺、金刚乙胺、idoxyuridine、干扰素等。

抗真菌药包括咪康唑、酮康唑、特比萘芬、托萘酯、十一烷酸，和包括吗啉、咪唑的其它杂环化合物及其衍生物。

角质溶解剂包括过氧苯甲酰、α醇酸、水果酸(fruit acid)、羟基乙酸、水杨酸、壬二酸、三氯乙酸、乳酸和吡罗克酮。

抗偏头痛药包括曲坦类例如舒马普坦。

抗脱发(毛发生长)药包括烟酸、烟酸的酯和盐和米诺地尔。

对治疗痤疮特别有用的化合物包括壬二酸(具有抗痤疮性质的脂肪族二酸)、地蒽酚(具有抗真菌和抗银屑病性质的二苯酚化合物)和马索罗酚(去甲二氢愈创木酸，具有抗氧化性质的四苯酚化合物，还可用于治疗光化性角化病)及其类似物(例如austrobailignan 6，氧代austrobailignan 6、4′-O-甲基-7，7′-二氧代austrobailignan 6、macelignan、去甲基二氢愈创木酸、3，3′，4-三羟基-4′-甲氧基木酚素、Saururenin、4-羟基-3，3′，4′-三甲氧基木酚素和isoanwulignan)。

对抗增殖疾病(如，癌症、银屑病)特别有效的活性剂包括alitretinoin的残基(9-顺式视黄酸)；氨磷汀；蓓萨罗丁(4-[1-(5，6，7，8-四氢-3，5，5，8，8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸)；博来霉素；卡培他滨(5′-脱氧-5-氟-胞苷)；苯丁酸氮芥；博来霉素；BCNU；克拉屈滨；阿糖胞苷；柔红霉素；多西他赛；多柔比星；表柔比星；雌莫司汀；依托泊苷；依西美坦(6-亚甲基雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮)；氟达拉滨；5-氟尿嘧啶；吉西他滨；羟基脲；伊达比星；伊立替康；美法仑；甲氨蝶呤；米托蒽醌；紫杉醇；喷司他丁；链脲霉素；替莫唑胺；替尼泊苷；雷替曲塞；拓扑替康；戊柔比星(N-三氟乙酰基阿霉素-14-戊酸酯)；和长春瑞滨。适合作为本发明中的一种或多种构成化合物的抗代谢活性剂包括：5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、5-氟-2′-脱氧尿苷(FUDR)、Ara-C(阿糖胞苷)、吉西他滨、巯嘌呤和其它经过修饰的核苷酸和核苷。抗代谢化合物通过例如与对负责所述代谢的酶结合而干扰细胞内正常的代谢过程，并且通常可用于治疗增殖疾病。

抗湿疹药包括吡美莫司和他克莫司。

适合用于本发明的抗银屑病活性剂包括维甲酸类(包括视黄酸的异构体和衍生物，以及结合视黄酸受体的其它化合物，例如视黄酸、阿曲汀、13-顺式-视黄酸(异维A酸)、9-顺式-视黄酸、维生素E视黄酸酯(视黄酸(反式或顺式的)的维生素E酯、阿维A酯、莫维A胺、1-(13-顺式-视黄酰氧基)-2-丙酮、1-(13-顺式视黄酰氧基)-3-癸酰基氧基-2-丙酮、1，3-双(13-顺式-视黄酰氧基)-2-丙酮、2-(13-顺式-视黄酰氧基)-苯乙酮、13-顺式-视黄酰氧基甲基-2，2-二甲基丙酸酯、2-(13-顺式-视黄酰氧基)-n-甲基-乙酰胺、1-(13-顺式-视黄酰氧基)-3-羟基-2-丙酮、1-(13-顺式-视黄酰氧基)-2，3-二油酰基丙酮、13-顺式-视黄酸琥珀酰亚胺基酯、阿达帕林和他扎罗汀)、水杨酸(单铵盐)、地蒽酚、6-氮尿苷、维生素D衍生物(包括但不限于罗钙全(Roche Laboratories)、EB1089(24α，26α，27α-三同型-22，24-二烯-lα，25-(OH)₂-D₃)、KH1060(20-表-22-氧杂-24α，26α，27α-三同型-1α，25-(OH)₂-D₃)、MC1288、GS1558、CB1093、1，25-(OH)₂-16-烯-D₃、1，25-(OH)₂-16-烯-23-炔-D₃和25-(OH)₂-16-烯-23-炔-D₃、22-氧杂骨化三醇；1α-(OH)D₅(University ofIllinois)、ZK 161422和ZK 157202(Institute of MedicalChemistry-Schering AG)、α骨化醇、骨化二醇、卡泊三醇(钙泊三醇)、maxacalcitriol、维生素D3、doxercalciferol、维生素D2、氟骨三醇、来沙骨化醇、马沙骨化醇、帕立骨化醇、司骨化醇、seocalcitol、他卡西醇、钙泊三醇、骨化三醇和在美国专利5,994,332中公开的其它类似物、焦棓酚和他卡西醇。

用于皮肤病的另外的药学活性剂包括抗组胺药、辣椒素、resiquimod和咪喹莫特。另外的药学活性剂包括抗原如蛋白质(包括糖蛋白和脂蛋白)如破伤风类毒素和白喉类毒素、碳水化合物、病毒粒子和完全减弱或失活的病毒(如，流感病毒)。

如本文中使用的，术语“治疗学活性剂”是指改变体内过程、或改变感兴趣的组织如皮肤的美学外观但是在技术上不认为是药物(药学活性剂)的水不溶性或水微溶性物质。治疗学活性剂的例子包括但不限于维生素和维生素衍生物、皮肤着色剂和漂白剂(如，二羟基丙酮)、皮肤保护药、补湿剂、脱毛剂、皂类和其它清洁剂、润肤剂、补湿剂和去皮剂。

维生素及其衍生物包括维生素A、抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、7-去氢胆甾醇(维生素D)、维生素K、α-硫辛酸、脂溶性抗氧化剂等。

适合在本发明中作为活性剂的示例性的皮肤保护药包括尿囊素和七叶甙。

脱色剂包括氢醌和曲酸。

其它治疗学活性剂包括沙棘油和芳香油如橙油。

如本文中使用的，术语“生色活性剂”是指水不溶性的或水微溶性的遮光剂。遮光剂的例子为辛基甲氧基肉桂酸和相关酯、辛基水杨酸和酯、对氨基苯甲酸和酯、二苯甲酮如2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、苄基二苯基丙烯酸酯、氨基苯甲酸酯、三嗪、亚苄基樟脑和衍生物。适合在本发明中用作活性剂的另外的示例性遮光剂包括阿克汀喹和对-和4-二甲氨基苯甲酸

在某些实施方案中，组合物包含超过一种的活性剂，即，包括至少一种另外的活性剂，其可为药学活性剂、生色活性剂或治疗学活性剂。例如，组合物包括维甲酸类作为药学活性剂，包括维生素E作为治疗学活性剂。

本发明主要对维甲酸类进行讨论。然而，应该理解，可用于递送系统中的任何活性剂都可用于本发明的组合物和方法。优选地，活性剂为水不溶性的物质。示例性的药物包括维甲酸类如视黄酸和视黄醇(维生素A)、钙泊三醇和已知刺激皮肤的其它活性剂。

如本文中使用的，术语“局部用”为本领域中已知的，并且包括本发明的化合物对上皮表面的施用，包括皮肤、鼻和上呼吸道系统、消化道和胃肠道的粘膜。

如本文中使用的，术语“阳离子聚合物”包括帮助被递送的活性剂的释放的递送系统的组分。优选的阳离子聚合物为分子量为至少约100,000道尔顿的高粘度脱乙酰壳多糖，更优选分子量为至少约250,000道尔顿，最优选为至少约300,000道尔顿。在一个实施例中，适用于本发明的阳离子聚合物每100amu到2000amu具有一个正电荷(或能够在施用于皮肤时带正电荷的部分)。这种聚合物的例子包括白蛋白、明胶、淀粉、DEAE-纤维素、阳离子性瓜尔胶和DEAE-葡多糖。DEAE-葡多糖和阳离子性瓜尔胶具有叔氨基。阳离子性瓜尔胶的INCI名称是Guar羟丙基三氯化monium，DEAE-葡多糖为二乙氨乙基-葡多糖。这种阳离子聚合物另外的例子为在美国专利6,264,937、6,299,868和6,726,906中公开的具有一个或多个疏水性区域的那些，所述专利的内容被并入本文作为参考。

适当的阳离子聚合物，如脱乙酰壳多糖和在引用的专利中公开的适当的聚合物，经常具有用于结合脂类的高容量。例如，在口服脂肪摄取体内试验(Watanabe等人，1992)中试验时，与其它可生物降解的多糖如甲基纤维素(脂类容量128)相比，脱乙酰壳多糖的脂类容量为5380个相对单位。

优选阳离子聚合物没有使用例如戊二醛或二价交联剂进行共价交联。另外，优选用于本发明的阳离子聚合物是可生物降解的。

脱乙酰壳多糖是通过使壳多糖脱乙酰基得到的天然的可生物降解的阳离子性多糖，壳多糖为从真菌、贝类的外壳和从藻类提取的天然物质，并且以前据称是伤口愈合的促进剂(Balassa，美国专利3,632,754(1972)；Balassa，美国专利3,911,116(1975))。脱乙酰壳多糖包括具有高百分比的氨基葡萄糖(通常为70-99％)和N-乙酰化氨基葡萄糖(通常为1-30％)，形成分子量为10,000直到约1,000,000道尔顿的直链糖链的聚合物家族。通常，用于本发明的脱乙酰壳多糖为70-100％氨基葡萄糖，例如70-90％氨基葡萄糖或80-100％氨基葡萄糖，更通常为85-95％氨基葡萄糖。脱乙酰壳多糖通过其阳离子氨基葡萄糖基团与皮肤中的阴离子蛋白质如角蛋白相互作用，产生一些生物粘附特征。另外，在没有脱乙酰化时，脱乙酰壳多糖的乙酰氨基是疏水性相互作用的靶标并且在一定程度上有助于其生物粘附特征(Muzzarelli等人，在Chitin and Chitinases Jolles P and Muzzarelli RAA(eds)中，BirkhauserVerlag Publ.，Basel，Switzerland，pp.251-264(1999))。

术语“高粘度”脱乙酰壳多糖是指使用Brookfield LVT粘度计在25℃、使用适当的轴在30rpm下测量在1％乙酸中的1％溶液中具有至少约100cps表观粘度的脱乙酰壳多糖生物聚合物。脱乙酰壳多糖溶液的粘度可由本领域技术人员容易地测定，例如通过Li等人，RheologicalProperties of aqueous suspensions of chitin crystallites，J Colloid InterfaceSc，183：365-373，1996中描述的方法。另外，可以根据Philipof方程V＝(1+KC)⁸估算粘度，其中V为表示以cps表示的粘度，K为常数，C为表示为分数的浓度(Form No.198-1029-997GW，Dow ChemicalCompany)。在某些实施方案中，优选高粘度脱乙酰壳多糖具有大于至少100cps的粘度，更优选大于至少500cps的粘度。通常，通过增加阳离子聚合物的粘度延缓活性剂从本发明组合物中的释放，通过增加浓度或增加分子量增加阳离子聚合物的粘度。

可以通过控制脱乙酰壳多糖的浓度，即百分比和/或分子量实现所需的脱乙酰壳多糖粘度，如以下表中所示，其中LMW为分子量小于50kDa的脱乙酰壳多糖，MMW为分子量为50-250kDa的脱乙酰壳多糖，HMW为分子量大于250kDa的脱乙酰壳多糖：

LMW            MMW            HMW

粘度            粘度           粘度

(cps)    ％    (cps)      ％  (cps)      ％

7        1     66         1   552        1

21,263   9     151,403    5   15,862     2

116,882  12    3.27E+06   8   171,163    3

在优选实施方案中，脱乙酰壳多糖具有至少300,000道尔顿(如，300kDa到1,000kDa、500kDa到1,000kDa)的分子量。在其它优选实施方案中，脱乙酰壳多糖的浓度为至少1重量％，通常为至少约2重量％。在特别优选的实施方案中，生物聚合物包括分子量为至少约300,000道尔顿(如，300kDa到1,000kDa、500kDa到1,000kDa)和浓度为至少2重量％的高粘度脱乙酰壳多糖。

如本文中使用的，术语“分散剂”包括使水不溶性或水微溶性的活性剂悬浮但不与脱乙酰壳多糖或活性物质发生化学反应的任何适当的试剂。优选地，活性剂与分散剂相容，但是不易溶于分散剂中，使得最好是粒子的至少70％部分(例如至少80％或90％)不溶解。例如，在用于生产微米粒子或纳米粒子的条件下，活性剂通常以约1％到约10％溶解于分散剂中。适当的分散剂通常具有比其中活性剂易溶的溶剂小0.5到5个单位的极性指数值(其中水的极性指数为9)。分散剂(特别是用于视黄酸和具有类似溶解特征的其它活性剂的分散剂)的例子包括大豆油、己二酸二丁酯、椰油甘油酯(cocoglycerides)、具有2-30个碳原子的脂肪族或芳香族酯(如，椰油辛酸酯/癸酸酯(cococaprylate/caprate))、椰子油、橄榄油、红花油、棉子油、具有2-30个碳原子的烷基醚、芳基醚或环醚、具有4-30个碳原子的脂环族或芳香族烃、具有1-30个碳原子的烷基或芳基的卤化物。通常，活性剂粒子以比在水溶液中更大的比例在适当的分散剂中分配(如，大于50％、60％、70％、80％乃至90％)。

在高压均化作用之后，这些阳离子生物聚合物可与阴离子聚合物如聚丙烯酸酯(卡波姆)凝胶剂或其它类型的阴离子凝胶剂络合，以进一步稳定涂覆生物聚合物的药物粒子。然而，优选阴离子聚合物含量不产生带有中性或负电荷的纳米粒子，使得在纳米粒子中正电荷比负电荷数量更大。通常，正电荷与负电荷分的比为1∶1到5∶1，例如1.5∶1到4∶1或1.5∶1到2.5∶1。

或者，所需的阳离子聚合物与阴离子聚合物的比可以通过测量纳米粒子组合物的粘度测量。通常，纳米粒子组合物的粘度在加入阴离子聚合物之后增大至少10倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍。

术语“阴离子聚合物”是指可与阳离子聚合物如脱乙酰壳多糖形成复合物的带负电荷的聚合物。阴离子聚合物通常具有直接或间接地连接于骨架或骨架的一部分(如多糖、聚丙烯酸酯或聚乙烯)的例如羧酸根、膦酸根、磷酸根和磺酸根的基团。阴离子聚合物的例子包括聚(丙烯酸)和衍生物、黄原胶、海藻酸盐(如，海藻酸钠)、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、乙基纤维素、角叉菜胶、聚乙烯醇、硫酸化粘多糖如硫酸软骨素和硫酸皮肤素。阴离子聚合物的分子量可由本领域技术人员选择，但是通常为50,000-1,000,000道尔顿。通常，阴离子聚合物的1％溶液的粘度为50,000-100,000cps。用于本发明的阴离子聚合物可以在阳离子聚合物之间产生非共价的交联。

为了生产本发明的微米粒子，一个实施方案包括在第一步骤中通过剧烈搅拌(如，搅拌产生充分的剪切以产生平均直径最大为100微米的粒子，例如通过均质器如Y形均质器产生的)形成阳离子聚合物(如，脱乙酰壳多糖)和水不溶性活性剂或包含水不溶性活性剂的油组分的粘性水溶液基质。对于脱乙酰壳多糖，优选分子量大于100,000道尔顿并且浓度大于2重量％。然后通过在大于6的pH例如pH6-8下在剧烈搅拌下加入阴离子聚合物溶液使基质沉淀，其引起微米粒子的形成。沉淀粒子的粘度通常为至少50,000cps，例如为至少100,000cps。可以使用高压均质器减小粒子的大小。

在另一个实施方案中，使用高压均质器例如Microfluidizer(ModelM-110Y；Microfludics Corporation，Newton，MA)制备粒子，所述均质器达到最高20,000psi的压力。能够在高压(如，至少3000psi的压力，例如至少5000psi或至少10000psi的压力)下推动悬浮液通过细的通道、网孔或筛网从而产生能够减小粒子大小的剪切力的其它均质器如法氏压滤机(French Press)也是适当的。使用高压均质器，有可能产生悬浮在脂类混合物中的固体活性成分在阳离子聚合物水溶液中的乳液。为了实现所需的粒子大小，可能需要两次或多次通过均质器。聚合物/脂类乳液形成包围细微药物粒子的单层，从而形成稳定的悬浮液。将阴离子聚合物加入到悬浮液中以使基质沉淀。在加入阴离子聚合物后减小粒子的大小可以通过使沉淀的基质通过均质器(如，Z型均质器)实现。

微米粒子或纳米粒子制备的所有或部分过程有利地在惰性气氛下进行，特别是在用阴离子聚合物沉淀之前的步骤中。通常，惰性气氛包括一种或多种的氮气、氦气、氩气和其它惰性气体。在活性成分对氧化敏感但是对还原气氛不敏感时，也可存在氢气。例如，微流化器可以保持在氮气氛下。

单独地或与上述惰性气氛组合，微米粒子或纳米粒子制备的全部或一部分过程任选地在没有光的存在下进行。如果不能除去所有的光，优选存在较长波长的光(如，红光)以对化合物造成的光损害危险减到最小。对于光敏化合物特别是维甲酸类来说排除光是合乎需要的。

在某些实施方案中，组合物包括防腐剂。通常，防腐剂为抗氧化剂。示例性的抗氧化剂包括BHT、BHA、维生素E和其它生育酚和维生素C(抗坏血酸)。在具体实施方案中，抗氧化剂与活性剂(如维甲酸类如视黄酸))的重量比为约1∶3到3∶1，例如约1∶2到2∶1，例如约1.5∶1到1∶1.5。

在形成由阴离子聚合物稳定的微米粒子和/或纳米粒子之后，通常将包含微米粒子和/或纳米粒子的组合物加入到适当的介质中，以制备药用制剂(如，凝胶剂、霜剂或洗液)。优选地，介质不破坏微米粒子或纳米粒子而是稳定该粒子。介质的优选组分的例子为聚合物粘度增强剂如羟乙基纤维素和/或螯合剂例如EDTA。介质还有利地包括防腐剂例如抗氧化剂和/或抗微生物剂。另外，优选介质不刺激或者破坏其被给用的组织。例如，用于局部用制剂的介质通常不包括乙醇、异丙醇、乳化剂和表面活性剂。

本发明的药用制剂通常具有至少100,000cps的粘度，例如至少200,000cps的粘度。例如，药用制剂可以具有100,000到500,000cps的粘度，例如200,000到300,000cps的粘度。

药用制剂可以在惰性气氛下进行制备和/或包装。

本发明的药用制剂可以通过不同的途径给药，例如局部给药、透皮给药或经粘膜给药(如，鼻内给药、经颊给药)。通常，本发明的药用制剂可施用于表面，例如皮肤或粘膜。

使用的水不溶性活性剂的量为递送药学或治疗有效量以在施用位置实现所需结果而需要的量。在实践中，这取决于具体的药物、状况的严重程度和其它因素的不同而变化。通常，最终制剂中活性剂的浓度可以从仅0.0001直到20％或更高的量变化，以最终制剂的重量计。对于维甲酸类，优选剂量为：视黄醇0.01％-1％，全反式视黄酸0.01％-0.1％通常，水不溶性活性剂的量对应于最终制剂中微米粒子或纳米粒子组合物的至多10重量％。

可使用本发明的组合物治疗的疾病和状况包括痤疮、银屑病、脂溢性皮炎、皮肤的老化和光老化(光致损伤)、皱纹、光化性角化病、黑素瘤、毛发生长障碍(如，脱发症、多毛症)、疣、皮肤干燥和/或鳞状皮肤和红斑痤疮。

由组合物引起的相对刺激可以通过测量“刺激指数”进行评价，所述的刺激指数类似于治疗指数。刺激指数是刺激与效力的比值。测量刺激指数的方法为本领域中已知的并且在以下的实施例7中描述，即对新西兰白兔进行的Draize试验。

刺激可以测量为在以对数刻度对化合物浓度绘图的5-点等级上的红疹。5-点等级如下：

水平	刺激
		0	没有红疹
1	非常轻微的红疹
		2	有明显边界的红疹
3	中等到严重的红疹
		4	严重的红疹

效力，例如对痤疮的效力，通过在对数-浓度图上测量痤疮病灶尺寸的见效进行评价。

现有技术制剂通常具有约1到4的刺激指数。使用纳米粒子的本发明的制剂通常具有大于10的刺激指数，例如从10到20或10到15。

刺激也可通过皮肤接触试验测定(参见Cattaneo和Demierre，DrugDel.Technol.，1：45(2001)；和Queille-Roussel等人，Clin Ther.，23(2)：205-12(2003))，其内容被并入本文作为参考)。这种皮肤接触试验可用于测定累积刺激指数，其中凡士林起到阴性对照的作用，常规的维A酸制剂具有约2.0-2.5的指数。本发明的组合物通常具有小于1.5的指数，并且指数有利地小于1.0，甚至0.5或0.25。刺激也可通过Fluhr等人的Br.J.Dermatol.，145：696-703(2001)中所述的方法评价，其内容被并入本文作为参考。这些方法包括激光-多普勒灌流成像(LDI)、激光-多普勒血流仪(flowmetry)(LDF)、经表皮的水分损失、视觉评分(VS)、比色测量法、Mexameter血红蛋白评分(Mexa Hb)和电容法。LDI、LDF、Mexa Hb和VS对于测定由视黄酸引起的刺激程度特别有用。

组合物的毒性可以通过例如MTT试验测量。本发明的组合物在MTT试验中具有至少90％，例如至少95％、98％或99％的存活率。

包含粒子的制剂通常容易被皮肤吸收，使得活性剂的吸收增加并且残留(ghosting)减到最小。在一个例子中，在应用制剂之后的24小时内，有0.5-5重量％，例如0.5-2重量％或2-5重量％的活性剂被递送到皮肤。残留的测量可以通过用胶带除去保留在皮肤上的制剂并测量制剂的活性剂或另一种部分的量。通常，本发明的包含粒子的制剂在皮肤上具有与常规制剂少至少25％、至少50％或至少75％的残留物。优选地，在粒子被给药之后的一小时，通过眼睛检查和/或使用上述方法测量本发明的粒子没有残留物。

如以下实施例中所示，粒子中的活性剂可以对抗例如氧化和光的破坏而稳定存在。例如，用于给药的粒子和/或制剂中的活性剂优选具有在40℃下为至少2周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年的半衰期。这样的半衰期比在相同储存条件下的没有包含在粒子中的活性剂的半衰期长至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％或至少50％。

本发明的粒子通常在物理上是稳定的，使得粒子分离的发生缓慢，即使在与配制粒子和将它们在组合物中给药时有关的剪切力的存在下时也是如此。例如，粒子在6个月内可具有小于50％、小于75％、小于80％或小于90％的分离。

通过参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明：

实施例1

视黄酸粒子的制备

在大豆油(17重量％)的存在下，通过剧烈搅拌将固体粒子形式的水不溶性的全反式视黄酸(ATRA)(2重量％)结合在高粘度脱乙酰壳多糖溶液[Protasan UP B 80/500(FMC Biopolymers Inc.；755cps表观粘度)在2.1重量％羟基乙酸和0.03重量％氢氧化钠中的3重量％溶液]中以形成基质。在Brookfield LVT粘度计上在25℃下用适当的轴以1.5rpm测量基质的粘度，最初粘度是215,000cps。然后将乳液与聚(丙烯酸)溶液(0.5重量％)在pH6.3混合并均化，以生产包含视黄酸的大小低于10微米的微米粒子的凝胶剂。

实施例2

视黄酸粒子的稳定性

通过HPLC测量最终凝胶剂中视黄酸的浓度。在5毫升乙腈的存在下将50微升的包含视黄酸的局部用制剂摇动20分钟，然后以4000rpm离心5分钟。然后将20微升的上清液小份注射到装备有ZorbaxSB-C18Guard筒(4.6×12.5mm)的Zorbax SB-C18柱(4.6mm×75mm，3.5微米)上，用包含5％乙酸和0.02％三乙醇胺的70％乙腈水溶液作为流动相洗脱(1ml/min)并在340nm检测。校准从50到5,000ng/ml为线性的。

在3个月的时间内测定视黄酸的稳定性。视黄酸在脱乙酰壳多糖微米粒子中是高度稳定的。测定最初的视黄酸浓度为0.052％，在3个月为0.05％。

实施例3

包含视黄酸粒子的凝胶剂的临床前研究

在小鼠和兔中进行3个月的临床前研究，使用Draize试验确定应用如上所述的视黄酸凝胶剂之后皮肤反应的严重程度。将动物(40只新西兰白兔和140只CD-1小鼠)分成如表1、2和3只所示的5组。

将试验化合物配制为如实施例1中所述的在微米粒子形式中包括0.05重量％浓度的视黄酸并以100倍和500倍人用剂量应用(第3和4组)。介质凝胶和包含无视黄酸的脱乙酰壳多糖微米粒子的介质凝胶(第1和2组)作为阴性对照，而500倍人用剂量的标准乳剂形式的市售的0.05％霜剂(Renova 0.05％视黄酸)(第5组)作为阳性对照。如表1中对兔的研究所示，不久发现阳性对照对动物来说刺激太大，采取了三个步骤控制阳性对照组的毒性：(1)在施用10天之后，将阳性对照剂量从500倍人用剂量减小为100倍人用剂量；(2)在等待第一位置愈合时(约2周以后)在第二位置施用阳性对照；和(3)表现出最大不适的动物肌肉注射给予丁丙诺啡(8只动物中的2只)。如表1所示，单独的微米粒子递送系统没有引起红疹或浮肿，并且试验组3和4比第组5表现出在统计学上显著更低的刺激和浮肿水平。

表1.对兔的研究—处理后10天的平均红疹和浮肿得分

组号	平均红疹(n＝8)	平均浮肿(n＝8)	说明
				1.介质	0.125	0	没有红疹/浮肿
2.介质+微米粒子(没有ATRA)	0	0	没有红疹/浮肿
				3.介质+ATRA微米粒子(100倍人用剂量)	0.125	0	没有红疹/浮肿
4.介质+ATRA微米粒子(500倍人用剂量)	0.875	0.25	非常轻微的红疹；没有浮肿
				5.Renova(500倍人用剂量)	2.125	1.875	有明显边界的红疹；轻微的浮肿

在以更低剂量(100倍人用剂量)用Renova处理第二施用位置另外14天之后，红疹和浮肿的水平显著超过100和500倍人用剂量的试验化合物(表2)。

表2.对兔的研究—处理后24天的平均红疹和浮肿得分

组号	平均红疹(n＝8)	平均浮肿(n＝8)	说明
				1.介质	0.125	0	没有红疹/浮肿
2.介质+微米粒子(没有ATRA)	0	0	没有红疹/浮肿
				3.介质+ATRA微米粒子(100倍人用剂量)	0	0	没有红疹/浮肿
4.介质+ATRA微米粒子(500倍人用剂量)	1.75	0.75	轻微的红疹；非常轻微的浮肿
				5.Renova(100倍人用剂量)*	2.125	1.5	有明显边界的红疹；轻微的浮肿

^*从第10天开始施用于第二位置上

在小鼠研究中，在处理后10天，接受100倍人用剂量的阳性对照组(第5组-Renova)具有比用500倍人用剂量试验化合物处理的第4组显著更多的红疹(表3)：

表3.对小鼠的研究—处理后10天的平均红疹和浮肿得分

组号	平均红疹(n＝28)	平均浮肿(n＝28)	说明
				1.介质	0	0	没有红疹/浮肿
2.介质+微米粒子	0.07	0	没有红疹/浮肿
				3.介质+ATRA微米粒子(100倍人用剂量)	0.57	0.25	非常轻微的红疹；没有浮肿
4.介质+ATRA微米粒子(500倍人用剂量)	1.0	0.46	非常轻微的红疹；没有浮肿
				5.Renova(100倍人用剂量)*	1.67	1.21	有明显边界的红疹；轻微的浮肿

临床前结果表明，试验化合物在兔和小鼠研究中都具有比市售的视黄酸制剂(Renova0.05％)显著更少的刺激。这些结果强烈暗示在经历视黄酸治疗皮肤病如痤疮、光致损伤和预防黑素瘤的患者中增加患者顺从性的可能性。

实施例4

α-硫辛酸粒子的制备

将水微溶性的物质α硫辛酸(1.5重量％)与高粘度脱乙酰壳多糖水溶液(8.3重量％，40,000cps)和大豆油(0.8重量％)在剧烈搅拌下混合。然后在剧烈搅拌条件下用三乙醇胺提高乳液的pH到6.3，以沉淀脱乙酰壳多糖基质(在这个过程中没有使用阴离子聚合物)。微米粒子大小为5微米。然后将乳液通过Microfluidizer，在5次通过Microfluidizer过滤器之后得到直径约为500nm大小的粒子。微流化器以高压(大于1000psi)推动乳液通过极细孔过滤器，减小粒子的大小。

实施例5

甲氧基肉桂酸辛酯遮光剂粒子的制备

首先将水微溶性的遮光剂甲氧基肉桂酸辛酯(7.5重量％，40,000cps)与高粘度脱乙酰壳多糖水溶液(10重量％)混合，以形成水包油型(O/W)乳液。然后将乳液与黄原胶水溶液(40重量％)混合，以进一步增加遮光剂/脱乙酰壳多糖(O/W)乳液的粘度。在单独的容器中，将微细氧化锌(9重量％)与在70℃加热的包含椰油甘油酯(12重量％)、十二烷基葡糖苷(3重量％)、聚甘油基-2-二多羟基硬脂酸酯(dipolyhydroxystereate)(1重量％)和鲸蜡硬脂基硫酸钠(sodium cetearylsulfate)(1重量％)的油性溶液混合。使用高速搅拌器将遮光剂/脱乙酰壳多糖的O/W乳液和包含微细氧化锌的油性溶液混合在一起。遮光剂最终的pH为7.0，其引起脱乙酰壳多糖基质以包含遮光剂的微米粒子的形式沉淀。然后将混合物冷却到40℃以下，然后加入防腐剂。

实施例6

纳米粒子的制备

通过将分子量大于300kDa的3％w/w脱乙酰壳多糖溶解于包含2％w/w羟基乙酸和0.3％w/w氢氧化钠的水溶液中制备脱乙酰壳多糖水凝胶。将6克BHT溶解于50克大豆油中并在没有搅拌下将该溶液加入到250克水凝胶中。将5克粉末形式的视黄酸加入到油层中并在温和的条件下与水凝胶混合以形成第一乳液。将200克盐水(0.9％NaCl)加入到第一乳液中，然后使其通过高压均质器以减小粒子大小。粒子大小的减小随通过高压均质器(110Y Microfluidizer)的次数而变，两次通过足以实现所需的大小，虽然可使用更多次通过。得到的产物由悬浮液(在液体中的粒子)和/或乳液(在液体中的小滴)中的亚微米大小的维A酸化合物组成。使用可以测量直到20 nm粒子大小的Holiba LA 910粒子分析仪测量粒子大小。生物聚合物/脂类形成包围细微药物粒子的单层，使得它们形成稳定的悬浮液。然后将这种纳米粒子组合物进一步混合在标准的阴离子型凝胶中以生产最终的制剂，如以下说明的。

维A酸凝胶剂	％
		维A酸大豆油丁化羟基甲苯脱乙酰壳多糖(80％脱酰化，MW＞500Da羟基乙酸氢氧化钠氯化钠乙二胺四乙酸二钠卡波姆三乙醇胺丙二醇咪唑烷基脲对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸丙酯净化水	0.050.50.060.0760.050.00760.0180.0950.4750.570.560.30.110.03适量

凝胶剂

	成分	重量％
			ABCD	去离子水EDTA二钠卡波姆三乙醇胺维A酸纳米粒子防腐剂	92.80.10.50.65.01.0
总计		100.0

将部分A的各成分称重在装备有搅拌器的适当容器中。将混合物在室温下混合直到均匀。加入部分B以中和凝胶。在剧烈搅拌条件下独立地加入部分C的成分，直到形成均质的混合物。加入部分D得到最终的制剂。

如图1所示，截留在3％高分子量脱乙酰壳多糖(HMW)中的视黄酸在40℃下是高度稳定的。这弥补了维甲酸类的历史性缺点—它们的光化学不稳定性。在光的影响下，特别是在高温下，该物质迅速降解。已经进行了各种尝试，通过多种方法解决稳定性不足的问题。例如，这些尝试包括：将物质在惰性条件下储存、加入抗氧化剂如维生素E或BHT，以及使用遮光包装。然而，已经发现只有将视黄醇截留在基质中被证明是有一定实际意义的。对不同基质材料的比较表明，脱乙酰壳多糖基质明显地优于其它基质。在使用脱乙酰壳多糖基纳米粒子作为维甲酸类的递送系统时，皮肤护理制剂也表现出比包含市售的维甲酸类递送系统的制品显著更大的活性。

还在用包含表面活性剂(0.5％Volpo)的磷酸盐缓冲液平衡之后试验了包含活性剂的最终凝胶剂容纳视黄酸的容量。通过HPLC(HP1090)监控全反式视黄酸(ATRA)释放，发现脱乙酰壳多糖(90％脱乙酰化，360,000道尔顿MW)为533ng/mg、阳离子瓜尔胶为426ng/mg和DEAE-葡多糖为183ng/mg，分别与阿拉伯树胶的19ng/mg相比。

使用如Lehman PA、Slattery JT和Franz TJ.，PercutaneousAbsorption of Retinoids：Influence of Vehicle，Light Exposure，and Dose.，J Invest Dermatol，91：56-61，1988中所述的Franz扩散池考查介质对局部施用的维甲酸类的吸收的作用和维甲酸类在皮肤内的分布。使用这种装置，通过弹簧夹将皮肤固定在受体室和烟囱帽(chimney top)之间。扩散池允许表皮的1.0cm部分暴露于环境的温度、光、热和湿度，而真皮浸在37℃的5ml受体溶液中，所述溶液通过在围绕下室的夹套内循环的水维持温度。受体溶液为含0.5％Volpo(非离子表面活性剂)的等渗磷酸盐缓冲盐水pH7.3-7.4(PBS)。Volpo用于确保活性成分在受体溶液中的溶解性。受体溶液通过安装在马达上的磁铁持续搅拌。使用一次性移液管端部(Wiretrol，Drummond Scientific Company)用带刻度的主动置换型移液管施加100微升剂量溶液。在24小时研究结束时通过HPLC分析受体溶液。

将皮肤表面一直用丙酮洗，以除去在施用24小时之后残留的药物。在24小时研究结束时，将皮肤从室中取出并置于已经用铝箔遮蔽以蔽光的50ml的用聚丙烯螺旋盖盖住的离心管中。加入5mL乙腈，通过反转30分钟进行混合，并将小瓶以4000rpm离心5分钟。通过HPLC分析有机层。在Hewlett Packard HP 1090系统上进行HPLC。然后将20μL的上清液小份注射到装备有ZorbaxSB-C18 Guard筒(4.6×12.5mm)的Zorbax SB-C18柱(4.6×75mm，3.5μm)上，并用包含5％冰醋酸和0.02％三乙胺的70％乙腈水溶液作为流动相洗脱(1ml/min)，在350nm检测。校准在5-1000ng/ml的样品时是线性的。

在最终结果中，当将包含溶解于乙醇和聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)中的视黄酸的常规制剂与纳米粒子制剂进行比较时，在0.05％和0.5％视黄酸负载量的制剂之间皮肤层中视黄酸的量没有显著不同(P＝0.05)。另外，使用Rhino大鼠模型(Kligman AM，The effect on rhinomouse skin of agents which influence keratinization and exfoliation.，JInvest Dermatol，1979，73：354-358)的效力试验表明，纳米粒子制剂在0.05％视黄酸浓度水平具有与常规制剂类似的效力。这些结果是出乎意外的，因为以前认为纳米粒子不穿过角质层。然而，皮肤渗透和效力研究都表明，在用微米粒子和纳米粒子形式递送时，其中的视黄酸是可被生物利用的。

在将包含溶解于乙醇和聚氧乙烯蓖麻油中的视黄酸的常规制剂与使用纳米粒子的制剂进行比较时，在0.05％水平下通过前述Franz池试验得到的渗透皮肤的量没有显著不同。使用Rhino大鼠模型(KligmanAM，The effect on rhino mouse skin of agents which influencekeratinization and exfoliation.，J Invest Dermatol，1979，73：354-358)的效力试验表明，纳米粒子制剂具有与常规制剂类似的效力。

另外，当减小微胶囊的粒子大小时，包含视黄醇或视黄酸的脱乙酰壳多糖纳米粒子已经表现出提供与皮肤更高程度的融合。用于形成纳米粒子的这种可观的尺寸减小通常如上所述通过使用Microfluidizer或高压均质器进行挤出而实现。

实施例7

维A酸制剂间刺激性的比较

用于携带活性化合物的介质对刺激性有深远影响。乙醇的LD50为3％，通常在LD50大于5-10％的值时发现刺激。非离子表面活性剂的LD50小于1％。常规的制剂经常具有超过这些LD50值的表面活性剂浓度。因此预期包含表面活性剂和增溶剂的常规的维A酸制剂如维A酸润肤霜产生实质上的皮肤刺激性是合理的。另一方面，如以下实施例中所示，通过这种方法得到的维A酸的纳米粒子具有显著更低的刺激性。然而，现有技术组合物要求这些试剂溶解，所以它们的使用是不能避免的。

使用微流化器装置减小粒度到小于1微米得到的包含视黄酸纳米粒子的凝胶剂的临床前研究

在小鼠和兔中进行3个月的临床前研究，使用Draize试验确定应用如上所述的视黄酸凝胶剂之后皮肤反应的严重程度。将动物(40只新西兰白兔和140只CD-1小鼠)分成如表1、2和3中所示的5组。

将试验化合物配制为如实施例6中所述的在纳米粒子形式中包括0.05重量％浓度的视黄酸并以100倍和500倍人用剂量应用(第3和4组)。介质凝胶和包含无视黄酸的纳米粒子的介质凝胶(第1和2组)作为阴性对照，而500倍人用剂量的标准乳剂的市售0.05％霜剂(第5组)作为阳性对照。如表1中对兔的研究所示，不久发现阳性对照对动物来说刺激太大，采取了三个步骤控制阳性对照组的毒性：(1)在施用10天之后，将阳性对照剂量从500倍人用剂量减小为100倍人用剂量；(2)在等待第一位置愈合时(约2周以后)在第二个位置施用阳性对照；和(3)对表现出最大不适的动物肌肉注射给予丁丙诺啡(8只动物中的2只)。如表3所示，单独的纳米粒子递送系统没有引起红疹或浮肿，并且试验组3和4表现出比第组5在统计学上显著更低的刺激和浮肿水平。

表3.对兔的研究—处理后10天的平均红疹和浮肿得分

组号	平均红疹(n＝8)	平均浮肿(n＝8)	说明
				1.介质	0.125	0	没有红疹/浮肿
2.介质+纳米粒子(没有ATRA)	0	0	没有红疹/浮肿
				3.介质+ATRA纳米粒子(100倍人用剂量)	0.125	0	没有红疹/浮肿
4.介质+ATRA纳米粒子(500倍人用剂量)	0.875	0.25	非常轻微的红疹；没有浮肿
				5.常规的ATRA霜剂(500倍人用剂量)	2.125	1.875	有明显边界的红疹；轻微的浮肿

在以更低剂量(100倍人用剂量)用霜剂处理第二施用位置另外14天之后，红疹和浮肿的水平显著超过100和500倍人用剂量的试验化合物(表4)。

表4.对兔的研究—处理后24天的平均红疹和浮肿得分

组号	平均红疹(n＝8)	平均浮肿(n＝8)	说明
				1.介质	0.125	0	没有红疹/浮肿
2.介质+纳米粒子(没有ATRA)	0	0	没有红疹/浮肿
				3.介质+ATRA纳米粒子(100倍人用剂量)	0.125	0	没有红疹/浮肿
4.介质+ATRA纳米粒子(500倍人用剂量)	0.875	0.25	轻微的红疹；非常轻微的浮肿
				5.常规的霜剂(100倍人用剂量)*	2.125	1.5	有明显边界的红疹；轻微的浮肿

^*从第10天开始施用于第二位置上

在小鼠研究中，在处理后10天，接受l00倍人用剂量的阳性对照组(第5组—常规的霜剂)具有比用500倍人用剂量试验化合物处理的第4组显著更多的红疹(表5)：

表5.对小鼠的研究—处理后10天的平均红疹和浮肿得分

组号	平均红疹(n＝8)	平均浮肿(n＝8)	说明
				1.介质	0	0	没有红疹/浮肿
2.介质+纳米粒子(没有ATRA)	0.07	0	没有红疹/浮肿
				3.介质+ATRA纳米粒子(100倍人用剂量)	0.57	0.25	非常轻微的红疹，没有浮肿
4.介质+ATRA纳米粒子(500倍人用剂量)	1.0	0.46	非常轻微的红疹，没有浮肿
				5.常规的霜剂(100倍人用剂量)*	1.67	1.21	有明显边界的红疹；轻微的浮肿

临床前结果表明，试验化合物在兔和小鼠研究中都具有比常规的视黄酸霜剂显著更少的刺激。这些结果强烈暗示在经历视黄酸治疗皮肤病如痤疮、光致损伤和预防黑素瘤的患者中增加患者顺从性的可能性。

实施例8

纳米粒子的长期稳定性

在203天内测量在实施例6中制备的在包含0.05％维A酸的纳米粒子中的维A酸的稳定性。在制备之后，将凝胶剂在室温(25℃)下储存在环境条件下。

在凝胶剂制备之后和随后以定期间隔通过HPLC分析凝胶小份，以测定剩余的维A酸的浓度。结果如下：

时间(天数)	维A酸(mg/mL)
		0	0.51
96	0.50
		203	0.50

这些数据证明，在200天内维A酸没有明显的损失。通常，在这个时间内大部分的维A酸已经由于氧化失效了。因此，维A酸的纳米粒子使维A酸稳定。

实施例9

皮肤渗透性研究

使用皮肤外植体进行皮肤渗透性研究，使用的制剂在凝胶剂中包含游离形式的视黄酸或用脱乙酰壳多糖截留的视黄酸形式的0.1％浓度的反式视黄酸。装置包括平行操作并维持在37℃恒温的6个Franz扩散池(PermeGear Inc.)。将包含0.04μCi ³H-ATRA的每种制剂的约200mg/cm²施用于皮肤样品的表皮侧(1cm²)。每个制剂一式三份进行试验。将皮肤的真皮表面用包括含0.05％Volpo(Croda，Inc.)的缓冲盐水的受体溶液灌注。每隔一天，取样500μL的受体溶液用于得到动力学数据。在200小时运行结束时，对皮肤表面施用包括2×500μL的含1％乙酸的绝对乙醇溶液进行表面冲洗。将皮肤样品在4mL的Solvable(Packard Instruments)中消解(digest)过夜。然后将受体体积(5mL)的全部内容物、表面洗液和进行消解的皮肤层与Ultima Gold闪烁流体(Packard Instruments)混合，用于³H计数。

包含游离视黄酸的制剂在前50到120小时内递送大量的药物通过皮肤，而用脱乙酰壳多糖截留的制剂(在初始滞后之后)以慢得多和恒定的速率递送视黄酸。研究了聚合物浓度对经皮转运的效果，发现在超过2％的生物聚合物浓度以上时变为同一水平(图2)。

在皮肤渗透性研究结束时，当评价活性剂在不同的皮肤部分中的分布时，发现从生物聚合物基质制剂经皮渗透的药物量比使用游离药物制剂得到的低40％。然而，在评价皮肤层的药物含量时，没有显著差异(图3)。

这些结果表明，脱乙酰壳多糖基递送系统能够降低系统吸收40％，但是其不妨碍被治疗的施用位置处的皮肤吸收的视黄酸的量。基于这些结果，用脱乙酰壳多糖截留的视黄酸制剂应该表现出与游离的视黄酸相比降低的刺激性。

实施例10

维生素E增湿凝胶剂

ABCD	成分去离子水EDTA二钠海藻酸钠(Protanal LF10/60；FMC Biopolymer)巴巴多芦荟(Activera100-200C；Active Organics)黄原胶(KeltrolT；CP Kelco)0.5三乙醇胺维生素E ChitosphereTM防腐剂	重量％86.80.11.00.50.50.110.01.0
				总计	100.0

将部分A的各成分称重在装备有搅拌器的适当容器中。将混合物在室温下混合直到均匀。加入部分B以调节pH到7.0。在剧烈搅拌条件下单独加入部分C成分，直到形成均质的混合物。加入部分D，形成最终的制剂。

虽然已经参考某些优选实施方案详细描述了本发明，但是应该理解，改进和变化在描述和要求保护的本发明的精神实质和范围内。

Claims (53)

1.用于给药水不溶性或水微溶性活性剂的组合物，其包括平均直径最大为100微米的粒子，所述粒子包括含活性剂的内核和由包括阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质形成的外壳。

2.用于给药刺激性活性剂的组合物，其包括平均直径最大为100微米的粒子，所述粒子包括含活性剂的内核和由包括阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质形成的外壳，其中所述组合物具有比单独的活性剂更小的刺激性。

3.权利要求1或2的组合物，其中活性剂在25℃水中的溶解度小于0.1mg/mL。

4.权利要求1或2的组合物，其中粒子的平均直径小于10微米。

5.权利要求4的组合物，其中粒子的平均直径小于1微米。

6.权利要求5的组合物，其中粒子的平均直径小于500nm。

7.权利要求6的组合物，其中粒子的平均直径为20nm到300nm。

8.权利要求1或2的组合物，其中活性剂悬浮在适当的分散剂中。

9.权利要求8的组合物，其中分散剂选自：大豆油，矿物油，橄榄油，杏仁油，椰子油，红花油，棉子油；己二酸二丁酯，椰油甘油酯，椰油辛酸酯/癸酸酯，具有2-30个碳原子的烷基、芳基和环醚，具有4-30个碳原子的脂环族和芳香族烃，具有1-30个碳原子的烷基或芳基的卤化物，具有3-30个碳原子的酮类和挥发性分散剂。

10.权利要求1或2的组合物，其中阳离子聚合物为脱乙酰壳多糖。

11.权利要求10的组合物，其中脱乙酰壳多糖为高粘度脱乙酰壳多糖。

12.权利要求11的组合物，其中脱乙酰壳多糖的分子量为至少约100,000道尔顿。

13.权利要求11的组合物，其中粒子在剧烈搅拌下通过以下步骤得到：(a)形成乳液，所述乳液包括具有活性剂的高粘度脱乙酰壳多糖聚合物的水溶液，所述活性剂分散在适当的分散剂中，(b)通过与阴离子聚合物络合并且任选地提高pH到大于6.0使所述乳液沉淀。

14.权利要求13的组合物，其中得到粒子进一步包括在使所述乳液沉淀之后减小粒子的大小。

15.权利要求1或2的组合物，其中阴离子聚合物选自阴离子多糖、聚(丙烯酸)及其衍生物、海藻酸钠和聚乙烯醇。

16.权利要求1或2的组合物，其中活性剂为药学活性剂、治疗学活性剂或生色活性剂。

17.权利要求16的组合物，其中活性剂选自抗炎药、抗痤疮药、抗皱药、抗疤痕药、抗银屑病药、抗增殖药、抗真菌药、抗病毒药、抗菌剂、局部麻醉剂、角质溶解剂、抗偏头痛药、毛发生长刺激剂和毛发生长抑制剂。

18.权利要求1或2的组合物，其中活性剂为用于治疗皮肤病的药学活性剂。

19.权利要求18的组合物，其中药学活性剂为维甲酸类。

20.权利要求19的组合物，其中维甲酸类为视黄酸。

21.权利要求20的组合物，其特征在于组合物具有0.001到5重量％的视黄酸含量。

22.权利要求16的组合物，其中活性剂为选自维生素A、D、E和K及其脂溶性衍生物、α硫辛酸、脂溶性抗氧化剂、芳香油和沙棘油的治疗学活性剂。

23.权利要求16的组合物，其中活性剂是作为水不溶性遮光剂的生色剂。

24.权利要求23的组合物，其中生色剂为甲氧基肉桂酸辛酯。

25.权利要求1或2的组合物，其中组合物基本上不含表面活性剂。

26.权利要求1或2的组合物，其中组合物包括0.1到10重量％的粒子。

27.权利要求1或2的组合物，其中组合物为凝胶剂、霜剂或洗液的形式。

28.权利要求1或2的组合物，其用于活性剂的局部给药。

29.权利要求1或2的组合物，其用于活性剂的透皮给药。

30.权利要求1或2的组合物，其用于活性剂的经粘膜给药。

31.权利要求1的组合物，其中组合物在MTT试验中具有至少90％的细胞存活率。

32.权利要求1或2的组合物，其中组合物在新西兰白兔中具有大于10的刺激指数。

33.权利要求2的组合物，其中活性剂具有2.0或更大的累积刺激指数。

34.权利要求2的组合物，其中组合物具有0.5或更小的累积刺激指数。

35.权利要求1的组合物，其中基质在给药之后一小时在人皮肤上不留下可见的残留物。

36.治疗皮肤疾病或状况的方法，包括对患有所述皮肤疾病或状况的主体给药权利要求1的组合物。

37.权利要求36的方法，其中皮肤疾病或状况为痤疮。

38.权利要求36的方法，其中皮肤疾病或状况为癌或癌前体。

39.权利要求38的方法，其中癌或癌前体为黑素瘤或光化性角化病。

40.权利要求36的方法，其中皮肤病症或状况为银屑病、脂溢性皮炎、老化、光老化、毛发生长障碍、疣、皮肤干燥、鳞状皮肤或红斑痤疮。

41.权利要求36的方法，其中组合物包括维甲酸类。

42.权利要求41的方法，其中维甲酸类为视黄酸。

43.制备包括粒子的组合物的方法，其中所述粒子具有小于100微米的平均直径并且包括含水不溶性或水微溶性活性剂的内核和由包括阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质形成的外壳，所述方法包括：

形成乳液，所述乳液包括具有活性剂的阳离子聚合物的水溶液，所述活性剂分散在适当的分散剂中，

通过与阴离子聚合物络合并且任选地提高pH到大于6.0使所述乳液沉淀，和

任选地减小沉淀的乳液的大小。

44.制备包括粒子的组合物的方法，其中所述粒子具有小于100微米的平均直径并且包括含水不溶性或水微溶性活性剂的内核和由包括阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质形成的外壳，所述方法包括：

用高压均质器产生悬浮在脂类混合物中的活性剂在阳离子聚合物水溶液中的乳液，

向所述乳液中加入阴离子聚合物。

45.制备包括粒子的组合物的方法，其中所述粒子具有小于100微米的平均直径并且包括含刺激性活性剂的内核和由包括阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质形成的外壳，所述方法包括：

形成乳液，所述乳液包括具有活性剂的阳离子聚合物的水溶液，所述活性剂分散在适当的分散剂中，

通过与阴离子聚合物络合并且任选地提高pH到大于6.0使所述乳液沉淀，和

任选地减小沉淀的乳液的大小。

46.制备包括粒子的组合物的方法，其中所述粒子具有小于100微米的平均直径并且包括含刺激性活性剂的内核和由包括阳离子聚合物和阴离子聚合物的基质形成的外壳，所述方法包括：

用高压均质器产生悬浮在脂类混合物中的活性剂在阳离子聚合物水溶液中的乳液，

向乳液中加入阴离子聚合物。

47.权利要求43-46中任一项的方法，其中阳离子聚合物为脱乙酰壳多糖。

48.权利要求47的方法，其中脱乙酰壳多糖为高粘度脱乙酰壳多糖。

49.权利要求43-46中任一项的方法，其中阴离子聚合物为聚(丙烯酸酯)。

50.权利要求43-46中任一项的方法，其中一个或多个步骤在惰性气氛中进行。

51.权利要求43-46中任一项的方法，其中一个或多个步骤在没有光存在的条件下进行。

52.权利要求43或45的方法，其中沉淀的乳液的大小用高压均质器减小。

53.权利要求52的方法，其中所述方法包括至少两次通过高压均质器。

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