CN1953772A - 对血管紧张素ⅱ受体显像的造影剂 - Google Patents

Abstract

式I的造影剂：V－L－R(I)，其中V是对血管紧张素II受体位点具有结合亲和力的有机基团，L是含氨基酸的直链或支链生物改性部分或连接部分，R是在人或动物体的体内显像术中可检测到的报告部分。

Description

对血管紧张素II受体显像的造影剂

发明领域

本发明涉及适合用于诊断显像技术的靶向造影剂，诊断显像技术可使疾病状态显像。更具体地讲，本发明涉及用于与血管紧张素II型受体AT₁上调有关的疾病显像的造影剂。本发明描述了与现有药物制剂相比，具有更高功效、更好的排泄特征和体内分布特征的配体。

利用靶向AT₁受体的造影剂可检测到的疾病包括充血性心力衰竭(CHF)、动脉粥样硬化和器官(如心脏、肺和肝)纤维化。

发明背景

血管紧张素II(Ang II)(八肽Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)是多效血管活性肽，它结合两种不同的受体：Ang II 1型受体(AT₁)和AngII 2型受体(AT₂)。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活导致血管肥厚、血管收缩、盐和水潴留、以及高血压。这些作用主要通过AT1受体介导。反常的是，其它Ang II介导的作用(包括细胞死亡、血管舒张和尿钠排泄)由AT₂受体活化作用介导。对Ang II的信号转导机制仍然未完全了解。AT₁受体激活作用触发多个胞内系统，包括酪氨酸激酶诱导的蛋白磷酸化作用、花生四烯酸代谢物的产生、活性氧中间体活性的改变、胞内Ca²⁺流出。AT₂受体激活导致缓激肽的刺激作用、一氧化氮的产生和前列腺素代谢，很大程度上，这些作用与AT₁受体的作用相反。(参见：Berry C，Touyz R，Dominiczak AF，Webb RC，Johns DG.：Am J Physiol Heart Circ Physiol.，2001年12月；28 1(6)：H2337-65.Angiotensin receptors：signalling，vascularpathophysiology，and interactions with ceramide(血管紧张素受体：信号传导、血管病理生理学、以及与神经酰胺的相互作用))。

Ang II是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的活性成分。它在调节血压、血浆容量、交感神经活性以及渴觉反应中具有重要生理作用。Ang II还在心脏肥大、心肌梗塞、高血压、慢性阻塞性肺疾病、肝纤维化和动脉粥样硬化中具有病理生理作用。它由经典RAAS系统地产生以及由组织RAAS局部产生。在经典RAAS中，来自肾的循环性肾素切割来自肝的血管紧张素原，形成十肽血管紧张素I(Ang I)，Ang I通过肺的血管紧张素转化酶(ACE)转化为活性Ang II。Ang I还可通过组织内肽酶加工为七肽Ang-(1-7)。RAAS系统通过本文的附图1图解说明，本文附图1根据Foote等(Ann Pharmacother 27：1495-1503(1993))的文章中的附图1绘制。

RAAS除了在正常心血管稳态中具有重要作用外，RAAS过度活性还涉及不同的心血管疾病(例如高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉缺血)和肾功能不全的形成。在心肌梗塞(MI)后，RAAS被激活。具体地讲，AT₁受体似乎在MI后重塑具有突出作用，因为在MI后以及左心室功能障碍中，AT₁受体表达增加。因此，干扰RAAS的药物(例如ACE抑制剂和AT₁受体拮抗剂)已在治疗这类心血管疾病中显示了很好的疗效。

对于心脏、肾、肺和肝相同的是，纤维化是它们衰竭的共同途径。因此，了解涉及器官纤维化的病理生理机制是相当有益的，尤其可能提供保护性药理学策略。组织修复涉及炎症细胞，包括单核细胞谱系/巨噬细胞谱系成员，它们是启动修复过程所必需的；还涉及由间质成纤维细胞表型转化的成肌纤维细胞，它们参与胶原更新和纤维组织形成。在修复微环境中的上述各种细胞事件与导致血管紧张素II(Ang II)从头生成的分子事件有关。在自分泌/旁分泌方式中，这种肽通过血管紧张素(AT₁)受体-配体结合而调节TGF-β1的表达。就是这种细胞因子促进成纤维细胞至成肌纤维细胞(myoFb)的表型转化，调节成肌纤维细胞的胶原更新。抑制血管紧张素转化酶(ACE)或拮抗AT₁受体均可防止在纤维化中发生的分子反应和细胞反应，由此，发现这些作用是保护性介入作用。(参见：Weber KT.Fibrosis，a common pathway to organ failure：angiotensin II and tissue repair(器官衰竭的共同途径：血管紧张素II与组织修复)，Semin Nephrol，1997年9月；17(5)：467-91以及其中的参考文献)。

Ang II可以通过激活间充质细胞而调节组织纤维化。例如，Ang II在体外通过激活AT₁而刺激心脏成纤维细胞的增殖。而且证实，在体外心脏成纤维细胞上存在AT₁受体。Ang II的大部分促纤维化作用(profibrotic effect)似乎是通过该受体介导；但是，已在肥大的人心脏中检测到心脏成纤维细胞上表达的AT₂增高，这两种受体亚型间的表达平衡可能在确定对Ang II的反应中非常关键。(参见Am.J.Respir.Crit.Care Med.，第161卷，第6期，2000年6月，1999-2004，AngiotensinII Is Mitogenic for Human Lung Fibroblasts Via Activation of the Type 1Receptor(血管紧张素II可通过激活1型受体促进人肺成纤维细胞的有丝分裂)，Richard P.Marshall，Robin J.McAnulty和Geoffrey J.Laurent以及其中的参考文献)。

可以根据特异性拮抗剂的抑制作用来区别不同的Ang II受体。AT₁受体被联苯基咪唑(例如氯沙坦)选择性拮抗，而四氢咪唑并吡啶特异性抑制AT₂受体。AT₂受体还可以被CGP-42112A选择性激活。CGP-42112A是Ang II的六肽类似物，它也可抑制AT₂受体，这取决于CGP-42112A的浓度)。两种其它血管紧张素受体AT₃和AT₄亚型也已有描述。

在啮齿动物中，AT₁受体有两种功能上截然不同的亚型AT_1A和AT_1B，并且具有95％以上的氨基酸序列同源性。

第二种主要血管紧张素受体同工型是AT₂受体。它与AT_1A或AT_1B受体具有低氨基酸序列同源性(～34％)。尽管确切的信号传导途径以及AT₂受体的功能作用还不清楚，但是在生理条件下，这些受体可以拮抗AT₁介导的作用、抑制细胞生长以及诱导细胞凋亡和血管舒张。AT₂受体在心血管疾病中的确切作用仍然有待界定。

除AT₁和AT₂以外，Ang II的其它受体也是已知的，通常被称为非典型AT(参见Kang等，Am.Heart J.127：1388-1401(1994))。对Ang II作用的抑制已被用于治疗，例如用于治疗高血压和心力衰竭。这已通过许多方式实现：利用肾素抑制剂，它阻断血管紧张素原至血管紧张素I(Ang II的前体)的转化；利用血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，它阻断血管紧张素I至Ang II的转化(还阻断缓激肽和前列腺素的生物转化)；利用抗Ang II抗体；以及利用Ang II受体拮抗剂。

β阻断剂最常用于治疗心律失常。抗心律失常药物取得了有限的全面成功，钙通道阻断剂有时会诱发心律失常。除胺碘酮有可能例外以外，其它没有一种药物特别优秀。短期抗心律失常的益处可能被对死亡率的中和效应或负面效应所抵销(Sanguinetti MC和Bennett，PB：Anti-arrhythmic drug target choices and screening(抗心律失常药物靶的选择和筛选)，Circulation 2003，93(6)：491-9257-263)。显然，需要更好的抗心律失常药物。

Lancet发表的文章(Lindholm，LH等，Effect of Losartan on suddencardiac death in people with diabetes：data from the LIFE study(氯沙坦对糖尿病患者的突发性心脏死亡的影响：来自LIFE研究的数据)，TheLancet，2003，362：619-620)揭示，AT₁受体拮抗剂除了通常有益于CHF患者以外，还降低了突发性心脏死亡的发生率。一些研究表明，AT₁拮抗剂对心肌梗塞或在LAD结扎后再灌注诱发的心律失常具有抗心律失常作用(Harada K等，Angiotensin II Type 1a Rceptor isinvolved in the occurrence of reperfusion arrhythmias(在再灌注心律失常事件中涉及血管紧张素II 1a型受体)，Circulation，1998，97：315-317。Ozer MK等，Effects of Captopril and Losartan on myocardialischemia-reperfusion induced arrhythmias and necrosis in rats(卡托普利和氯沙坦对大鼠心肌缺血性再灌注诱发的心律失常和坏死的作用)，Pharmacological research，2002，45(4)，257-263，Lynch JJ等，EXP3174，the AII antagonist human metabolite of Losartan，but not Losartan nor theangiotensin-converting enzyme inhibitor captopril，prevents thedevelopment of lethal ischemic arrhythmias in a canine model of recentmyocardial infarction(既不是氯沙坦也不是血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利，而是EXP3174(AII拮抗剂，氯沙坦在人体的代谢物)在近期心肌梗塞的犬模型中防止发生致命的缺血性心律失常)，JACC，1999，34876-884)。

现已发现，可以利用靶向造影剂在体内Ang II受体位点显像，所述靶向造影剂中靶向结合配体对Ang II受体位点具有亲和力。在所述造影剂给予到血流后，Ang II受体通常很容易接近它们。据此，利用这样的靶向造影剂可以检测出诸如心力衰竭、动脉粥样硬化和血流受限之类的疾病和病症以及其它血管疾病和病症，还可以监测对这些疾病和病症的治疗进展。

相关技术说明

WO98/18496(Nycomed imaging AS)公开了包含标记的Ang II受体拮抗剂的造影剂，用于体内显像。

美国专利5,138,069公开了用作Ang II受体阻断剂的取代咪唑。

此外，美国专利5,264,581(Cariani)公开了放射性碘标记的咪唑Ang II拮抗剂。

发明概述

在具有相对较大的报告部分(reporter)(例如体积庞大的螯合物)的缀合物(coniugate)中使用咪唑类(例如氯沙坦)作为结合配体时，该类配体对所选结合位点的亲和力可能受到负面影响。

象氯沙坦之类的药物(包括药物以及螯合物缀合物(chelateconjugate))面临的问题是，它们主要通过肝排泄(超过80％)，并且具有的亲和力(Ki)小于天然激素Ang II。这使得在使用这类组合物作为靶向造影剂时，产生两个问题：首先，在被肝吸收以前，所给予的组合物只有少量结合到Ang II受体位点，其次，肝吸收导致本底活性增加，例如来自肝的本底可能干扰心脏患病部位的显像。

现已发现，在靶向配体与螯合物或报告部分间引入包含氨基酸的生物改性部分/连接部分可以减少肝吸收，还可以增加对Ang II受体位点的结合亲和力。生物改性部分/连接部分可以是直链或支链的。因此，本发明物质的组合物是有用的诊断造影剂，用于哺乳动物体内显像。此外，接受显像术的患者还可以用“沙坦”类药物进行治疗。“沙坦类”药物(例如氯沙坦)是用于治疗高血压的Ang II受体拮抗剂。靶向Ang II受体的造影剂将与结合相同受体位点的治疗药物产生竞争。因此，需要考虑开发对AT₁受体具有比处方药更高亲和力的造影剂，从而避免冷药(cold drug)(即处方中不可检出的“沙坦”类药物)的有害竞争作用。

体内可检测部分(报告部分)可以是在体内诊断显像术(例如MRI、光学显像术、闪烁显像术、SPECT、PET、X射线、超声波、电阻抗或磁力测定法)中能够被直接或间接检测的任何部分。

本发明物质的组合物可用于一系列疾病状态(充血性心力衰竭(CHF)、动脉粥样硬化、器官(如心脏、肺和肝)纤维化)的体内诊断显像，已知所述疾病状态涉及Ang II受体位点的上调。

发明详述

本发明第一方面提供下式I的物质成分：

V-L-R    (I)

其中V是对血管紧张素II受体位点具有结合亲和力的有机基团，L是含氨基酸的生物改性部分或连接部分，R是在人或动物体的体内显像术中可检测到的部分。

配体V可以是对Ang II受体具有亲和力的任何有机化合物。通常，优选对特定类型的Ang II受体(例如AT₁或AT₂)具有显著亲和力的化合物。优选咪唑Ang II拮抗剂配体，最优选诸如氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦和依普沙坦的配体。

对于可用于诊断、尤其是体内诊断的造影剂，R部分必须能够承载显像部分(一个或多个)标示的M。“承载”是指在R部分与M之间任何形式的结合(例如化学键(例如共价键或电价键或离子键)、吸附作用或者任何其它形式的结合)。R可以是任何可显像部分。在M是金属实体时，则Y₁为螯合剂。R和/或Y₁M的性质将随诊断中利用的显像方式而定。R和/或Y₁M必须能够在体内诊断显像术中被直接或间接检测到，它们包含例如以下部分：可发射或被诱使发射可检出辐射(例如放射性衰变、激发荧光、自旋共振激发等)的部分，影响局部电磁场的部分(例如顺磁性物质、超顺磁性物质、铁磁性物质或亚铁磁性物质)、吸收或散射辐射能的部分(例如生色团、粒子(包括含小泡的气体或液体)、重元素及其化合物等)、产生可检测物质的部分(例如气体微泡发生器)。

在优选的实施方案中，一个R部分直接共价结合到L上，形成N-烷基甘氨酸单元。

还特别优选下文中式(II)和(e)的螯合剂。

许多合适的显像部分是已知的，参见例如WO98/18496，其全部内容通过引用结合到本文。

在下文中更详细地介绍显像方式和显像部分R和M：

在第一个实施方案中，式(I)化合物包含Y₁部分，Y₁承载一个或多个可用于Radio和SPECT显像方式的显像部分M。优选M是具有低α和低β发射或没有α和β发射的γ发射体，其半衰期超过1小时。优选的M是放射性核素⁶⁷Ga、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、⁸¹mKr、⁹⁹Mo、⁹⁹mTc、²⁰¹Tl和¹³³Xe。最优选⁹⁹mTc。

M还可以为以下的同位素或同位素对，用于显像和治疗而无需改变放射性标记方法或螯合剂：⁴⁷Sc₂₁；¹⁴¹Ce₅₈；¹⁸⁸Re₇₅；¹⁷⁷Lu₇₁；¹⁹⁹Au₇₉；⁴⁷Sc₂₁；¹³¹I₅₃；⁶⁷Cu₂₉；¹³¹I₅₃和¹²³I₅₃；¹⁸⁸Re₇₅和^99mTc₄₃；⁹⁰Y₃₉和⁸⁷Y₃₉；⁴⁷Sc₂₁和⁴⁴Sc₂₁；⁹⁰Y₃₉和¹²³I₅₃；¹⁴⁶Sm₆₂和¹⁵³Sm₆₂；以及⁹⁰Y₃₉和¹¹¹In₄₉。

当M是指金属放射性核素时，则Y₁是指适合与M形成稳定螯合物的螯合剂。这样的螯合剂是公知的现有技术，这类螯合剂的典型实例参见WO01/77145的表1。

特别优选下式(II)的螯合剂：

其中：

R¹、R²、R³和R⁴各自独立地为H、C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10烷基胺基或C_1-10氟烷基，或者两个或两个以上的R基团与它们所连接的原子一起构成饱和或不饱和的碳环或杂环。

更优选这样的式(II)螯合剂：其中R¹、R²和R³为氢或甲基，R⁴为烷基胺基，最优选式(e)化合物，本文中用cPN216表示。对于下文的各种结构，星号表示可能的连接位置。对于式(e)来讲，星号表示胺基。

最优的Y₁是在螯合物为cPN216且显像部分M是^99mTc时的Y₁。

其它优选的螯合剂可以由下式a、b、c和d表示。

WO03/006070介绍了式(II)和(e)的螯合剂的合成方法。

其它相关螯合剂是下式(III)的螯合剂：

其中

Q₁-Q₆独立地为Q，其中Q为H、烷基、芳基或胺保护基团，

W₁为-NR-、-CO₂-、-CO-、-NR(C＝S)-、-NR(C＝O)-、-CONR-或Q；

每个Y都独立地为D-氨基酸或L-氨基酸、-CH₂-、-CH₂OCH₂-、-OCH₂CH₂O-或W₁；

p为1-8的整数；

q为0-30的整数；

R为H、C_1-4烷基、C_2-4烷氧基烷基、C_1-4羟基烷基或C_1-4氟烷基。

式(III)的四胺螯合剂的合成方法可以参见英国专利申请GB0416062.8。

非金属放射性核素(例如¹²³I、¹²⁵I和¹³¹I)可以通过现有技术中公知的取代反应或加成反应而共价连接到L部分。

在第二个实施方案中，式(I)化合物包含可用于PET显像方式的R部分。于是，R表示具有正电子发射特性的放射性发射体。R优选放射性核素¹¹C、¹⁸F、⁶⁸Ga、¹³N、¹⁵O和⁸²Rb。特别优选¹⁸F。还优选与螯合剂Y₁螯合的金属放射性发射体⁸²Rb和⁶⁸Ga。

WO03/080544(其全部内容通过引用结合到本文)介绍了硫醇偶合化学过程、¹⁸F-合成子以及利用硫醇偶合化学过程制备的标记的肽。

有关利用硫醇偶合化学过程标记肽的说明可以参见英国专利申请0317815.9，其全部内容通过引用结合到本文。

当M表示金属放射性核素时，则Y₁表示适合与M形成稳定螯合物的螯合剂。这样的螯合剂是公知的现有技术，这类螯合剂的典型实例参见WO01/77145的表1以及有关Radio和SPECT显像的上一部分。

在另一个优选实施方案中，Y₁是DOTA螯合剂，M是⁶⁸Ga，利用微波化学方法很容易将⁶⁸Ga引入螯合物。

非金属放射性核素(例如¹⁸F)可以通过现有技术中公知的取代反应或加成反应而共价连接到L部分，还可参见例如WO03/080544，通过引用结合到本文。

在第三个实施方案中，式(I)化合物的R包含承载一个或多个显像部分M的Y₁，所述M可用于MR显像方式。这里的M是指例如美国专利4,647,447中提到的顺磁性金属，特别优选Gd³⁺、Dy³⁺、Fe³⁺和Mn²⁺，Y₁是指螯合剂，尤其是指例如无环或环状聚氨基甲酸酯类的螯合剂(例如DTPA、DTPA-BMA、DOTA和DO3A)，例如美国专利4,647,447和WO86/02841中介绍的螯合剂。M还可以为金属氧化物，例如超顺磁性、铁磁性或亚铁磁性金属氧化物，它们可以被R吸附，例如R作为金属氧化物的涂层。例如美国专利6,230,777(通过引用结合到本文)介绍了用于MR造影剂的金属氧化物。

在第四个实施方案中，式(I)化合物的R包含承载一个或多个显像部分M的Y₁，所述M可用于X射线显像方式。这里的M是指重金属(例如W、Au和Bi)，优选为可被R吸附的氧化物形式。R还可为碘化芳基衍生物，尤其是众所周知的为X射线造影剂的碘化芳基衍生物，例如lopamiron^TM和Omnipaque^TM。这些试剂可以通过例如酰胺或胺官能团连接到式(I)的V。

在进一步的实施方案中，式(I)化合物包含充满气体的微泡形式的R。这样的超声波显像剂在例如起结合肽的作用时，可以用于受体的显像，现有技术例如WO98/18500介绍了此用途。

在本发明第六个实施方案中，式(I)化合物的R部分可以是在光学显像术中能够被直接或间接检测的任何部分。可检出部分可以是光散射体(例如有色或无色的粒子)、吸光剂或发光体。更优选R为染料，例如发色团或荧光化合物。R部分可以是任何在电磁波谱中与紫外光至近红外波长范围内的光相互作用的染料。优选R具有荧光特性。

优选的有机染料包括具有广泛离域电子系统的有机染料，例如花青类、部花青类、靛花青类(indocyanines)、酞菁类、萘酞菁类(naphthalocyanines)、三苯甲烷类(triphenylmethines)、卟啉类、吡啶(pyrilium)染料、噻喃(thapyrilium)染料、方酸(squarylium)染料、croconium染料、薁(azulenium)染料、靛苯胺类、苯并吩嗪(benzophenoxazinium)染料、苯并硫杂吩噻嗪(benzothiaphenothiazinium)染料、蒽醌类、萘醌类(napthoquinones)、阴丹士林类(indathrenes)、邻苯二甲酰吖啶酮类(phthaloylacridones)、三苯酚合苯醌类(trisphenoquinones)、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移的染料及染料络合物、环庚三烯酮类、四嗪类、双(二硫醇烯)络合物、双(苯-二硫醇盐)络合物、碘苯胺染料、双(S，O-二硫醇烯)络合物。还可使用荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)和具有不同吸收/发射特性的改性GFP。当某些稀土金属(例如铕、钐、铽或镝)的络合物是荧光纳米晶(量子点)时，在某些情况下也可使用这些络合物。

挪威专利申请200303115(其内容通过引用结合到本文)对适用于光学显像术的部分进行了更详细介绍。

本发明可以通过氯沙坦衍生物示例说明，基于在咪唑的5位连接生物改性部分/连接部分以及报告部分。其原理也适用于具有类似结构的其它化合物，例如缬沙坦、坎地沙坦和依普沙坦，它们在与氯沙坦咪唑环相应的部分具有适当的结合位点。

生物改性部分/连接部分L的作用之一是可以使体积相对较大报告部分(例如金属络合物)远离结合配体V的活性位点。可以选择生物改性部分/连接部分，以本发明组合物(composition)增加对受体的结合亲和力。

生物改性部分/连接部分包含1-40个氨基酸，优选1-20个氨基酸，更优选1-10个氨基酸，最优选1-5个氨基酸。生物改性部分/连接部分还可包含一个或多个二羧酸单元(例如二乙醇酰基(diglycoloyl)单元、乙醇酰基单元、丁二酰基、戊二酰基单元)、乙二醇单元、二胺类、PEG、PEG样单元或者它们的组合。

还可利用连接部分的性质，改善缀合物的最终金属络合物在体内的分布，例如引入具有不同特性的氨基酸可以降低肝吸收。

本发明部分化合物对AT₁受体具有高亲和性。“高亲和性”是指化合物的Ki≤5nM，优选小于0.1nM，最优选Ki在pM或亚pM范围，采用对AT₁的竞争性结合测定结果计算Ki，Ki值通过与已知的高亲和性载体¹²⁵I-Sar₁Ile₈-血管紧张素II竞争确定。在此测试系统中，Ang II的Ki大约为5nM。

由常说的“沙坦”类药物(例如缬沙坦、坎地沙坦和依普沙坦，优选氯沙坦)衍生的Ang II受体拮抗剂在用显像部分标记后，可在人或动物体内的显像术中用作诊断显像剂(imaging agent)。

本发明的一个优选实施方案是^99mTc标记的造影剂：^99mTc(氯沙坦-Leu-二乙醇酰基-cPn216)、^99mTc(氯沙坦-Leu-Gly-二乙醇酰基-cPn216)、^99mTc(氯沙坦-Leu-β-Ala-二乙醇酰基-cPn216)和^99mTc(氯沙坦-Leu-Lys(丙酰基-PEG(12)-Ac)-二乙醇酰基-cPn216)。

式(I)的造影剂优选以包含式(I)化合物的药物制剂形式给药，所述药物制剂为适合给予哺乳动物(例如人)的剂型。适当的给药方式是注射或滴注制剂(例如水性溶液剂)。所述制剂可以包含一种或多种药物可接受的添加剂和/或赋形剂，例如缓冲剂；增溶剂，例如环糊精；或表面活性剂，例如泊洛沙姆(Pluronic)、吐温(Tween)或磷脂。还可以加入稳定剂或抗氧剂(例如抗坏血酸、龙胆酸或对氨基苯甲酸)以及冻干用增量剂(例如氯化钠或甘露糖醇)。

本发明还提供一种药物组合物，该组合物包含有效量(例如在体内显像术中有效增强图像对比度的量)的通式I的化合物或其盐以及一种或多种药物可接受的辅料、赋形剂或稀释剂。

本发明的再一方面提供式I化合物在制备造影剂中的用途，所述造影剂用于诊断方法，诊断方法涉及将所述造影剂给予人体或动物体，产生人体或动物体至少一个部位的图像。

本发明的又一方面提供一种在人体或动物体产生增强图像的方法，该方法预先给予人体或动物体包含式I定义的物质的造影剂组合物，所述方法包括产生人体或动物体至少一个部位的图像。

本发明还提供一种监测心力衰竭以及与AT₁受体上调相关的其它疾病的治疗效果的方法。

本发明另一方面提供一种用于制备式(I)的放射性药物组合物的药盒，该药盒包含配体-螯合物缀合物和还原剂。还原剂优选二价锡盐。所述药盒还包含一种或多种稳定剂、抗氧剂、冷干用增量剂以及增溶剂。

本文使用的氨基酸的三字母缩写词具有以下的含义：

Ala    丙氨酸

Asp    天冬氨酸

Arg    精氨酸

Glu    谷氨酸

Gly    甘氨酸

Lys    赖氨酸

Leu    亮氨酸

Sar    肌氨酸

Val    缬氨酸

Tyr    酪氨酸

Ile    异亮氨酸

His    组氨酸

Pro    脯氨酸

Phe    苯丙氨酸

Nal    2-氨基-3-萘基丙酸

Cha    2-氨基-3-环己基丙酸

本文使用的其它缩写词的含义如下：

DOTA   1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸

PEG    聚乙二醇

DIEA   二异丙基乙胺

DPPA   叠氮磷酸二苯酯

DBU    1，8-氮杂-双环(5，4，0)十一碳-7-烯

DMF    二甲基甲酰胺

MDP    亚甲基二膦酸盐

TFA    三氟乙酸

THF    四氢呋喃

HATU   六氟磷酸N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵N-氧化物

PyAOP  六氟磷酸7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)

Fmoc  9-芴基甲氧基羰基

通用方法

流程1展示了氯沙坦连接基螯合剂缀合物的固相合成法。圆圈表示固体载体粒子。

流程1

测定K_i

化合物的亲和力根据离解常数(K_d)确定，通过置换已知亲和力的放射性标记的配体进行测量。

采用表达AT₁受体的CHO细胞的细胞膜，在竞争性测试法中测定了化合物对AT₁受体的亲和力。¹²⁵I-Sar₁-Ile₈-血管紧张素II(是一种非常有效地结合AT₁受体的配体)的结合作用与不同浓度的试验物质进行竞争。K_i是在竞争测试中，在没有放射性配体存在下，竞争性配体将占据50％受体的浓度。使用以下的Cheng-Prussoff方程计算K_i：

K_i＝IC₅₀/(1+(L)/K_d)

其中(L)是所用放射性标记的配体的浓度，K_d是放射性标记的配体对受体的离解常数。IC₅₀是竞争性配体可置换50％特异性结合的放射性配体的浓度。根据不同的放射性配体浓度，化合物在各次实验中的IC₅₀值可能不同，而K_i是绝对值。

^99mTc标记方案

如下制备制剂：将0.1mg冷冻干燥的cPn216衍生的化合物溶于0.2ml无氧蒸馏水。将此溶液转移到10ml充满氮气的小瓶内。加入0.5ml碳酸盐缓冲液、0.5ml Na^99mTcO₄溶液和0.1ml Sn-MDP溶液。将制剂在室温下放置20分钟。

碳酸盐缓冲液：碳酸盐缓冲液的pH为9.2，每毫升水中含有8.4mgNaHCO₃和10.6mg Na₂CO₃。临用前用氮气净化至少15分钟。

Na^99mTcO₄溶液：锝发生器(例如Ifetec发生器)洗出液，稀释至放射性浓度为2GBq/ml，无氧。

Sn-MDP溶液：此溶液每毫升水中含有0.131mg SnCl₂*2H₂O和0.925mg MDP(亚甲基二膦酸盐)。在不断通入氮气的情况下，在临用前制备新鲜的溶液。

实施例

实施例1经过短PEG连接部分用cPn216衍生的氯沙坦-Leu(固相 合成法)

所有反应都在手动氮气起泡器中进行。

a)氯沙坦连接到三苯甲基衍生的固体载体上

将氯沙坦(MSD，0.236g，0.558mmol)和三乙胺(Fluka，0.233ml，1.67mmol)加入到三苯甲基氯树脂(Novabiochem，取代度1.24mmol/g，0.300g)的DMF(5ml)悬浮液中。4天后，排干树脂，洗涤。使一等分量树脂断裂(二氯甲烷/TFA/三异丙基硅烷，92.5∶5.0∶2.5，15分钟)。HPLC分析(柱：Phenomenex Luna C₁₈(2)3μm 4.6mm×50mm，溶剂：A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA；梯度：10-40％B，10分钟；流速2.0ml/min，在214nm和254nm进行UV检测)产生一个对应于氯沙坦的峰，t_R＝6.7分钟。树脂用二氯甲烷/甲醇/二异丙基乙胺溶液(17∶2∶1，20ml，1h)处理，用二氯甲烷洗涤，干燥。

b)用叠氮化物置换羟基

将叠氮磷酸二苯酯(Aldrich，0.481ml，2.23mmol)和DBU(0.611ml，4.09mmol)加入到结合树脂的氯沙坦(0.372mmol，a)步骤)的THF(10ml)悬浮液中。将反应物放置过夜。在a)所述条件下，使一等分量树脂断裂。LC-MS分析(柱：Phenomenex Luna C₁₈(2)3μm50mm×4.60mm，溶剂：A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA；梯度：20-80％B，10分钟；流速：1ml/min，在214nm进行UV检测，ESI-MS)产生一个与所需结构对应的峰，t_R＝7.3分钟，m/z448.1(MH⁺)。

c)使叠氮基还原为胺

向树脂b)的THF(4ml)悬浮液中加入氯化锡(II)(Acros，0.141g，0.744mmol)、苯硫酚(Fluka，0.304ml，2.976mmol)和三乙胺(Fluka，0.311ml，2.23mmol)。1.5小时后，在a)所述条件下，使一等分量树脂断裂。LC-MS分析(柱：Phenomenex Luna C₁₈(2)3μm50mm×4.60mm，溶剂：A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA；梯度：20-80％B，10分钟；流速：1ml/min，在214nm进行UV检测，ESI-MS)在1.9分钟获得一个峰，m/z422.2(MH⁺)，为所需的胺。

d)氯沙坦-Leu-二乙醇酰基-PEG(4)-二乙醇酰基-cPn216

将Fmoc-Leu-OH(Novabiochem，0.030g，0.084mmol)和Fmoc-氨基PEG二甘醇酸(polypure，0.045mg，0.084mmol)相继与一等分量结合树脂的氨基-氯沙坦(0.042mmol，步骤c))在DMF中偶合，采用标准偶合剂(HATU和DIEA)和标准Fmoc断裂方案(20％哌啶的DMF溶液)。通过标准Kaiser测试检查偶合反应的完成情况。使用二甘醇酸酐(Aldrich，0.010g，0.084mmol)和DIEA(0.014ml，0.084mmol)引入第二个二乙醇酰基单元。向树脂(包含末端羧基官能团)中加入螯合物cPn216(0.029g，0.084mmol)、PyAOP(Applied Biosystems，0.022g，0.042mmol)和DIEA(0.014ml，0.084mmol)。2小时后，化合物从树脂断裂(二氯甲烷/TFA/三异丙基硅烷溶液，92.5∶5.0∶2.5，30分钟)。将溶液过滤，浓缩，用制备型HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C₁₈(2)5μm 10.0mm×250mm，溶剂：A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA；梯度：25-30％B，60分钟；流速：5.0ml/min，在214nm进行UV检测)，冷冻干燥后得到3mg产物。LC-MS分析(柱：Phenomenex LunaC₁₈(2)3μm 50mm×4.60mm，溶剂：A＝水/0.1％TFA，B＝乙腈/0.1％TFA；梯度：10-80％B，10分钟；流速：0.3ml/min，在214nm和254nm进行UV检测，ESI-MS)，t_R＝5.9分钟，m/z 1266.5(MH⁺))证实为所需结构。

体外测试了化合物对血管紧张素II受体AT₁的结合作用(K_i0.5nM)。

实施例2-18氨基酸取代的氯沙坦衍生物

将表1所列通式(IV)的氨基衍生物在实施例1介绍的固体载体上合成。产物通过反相色谱纯化(Phenomenex Luna C₁₈(2)柱，合适梯度的乙腈/水，含0.1％TFA)，通过LC-MS(电喷雾电离)进行分析。

表1

AA1	AA2	MW(精确值)	MH+(实测值)
				Lys		549.27	550.2
Glu		550.22	551.1
				Leu		534.26	535.1
D-Lys		549.27	550.2
				D-Glu		550.22	551.2
D-Leu		534.26	535.3
				Leu	Lys	662.36	663.3
Leu	Glu	663.30	664.2
				Leu	Leu	647.35	648.2
D-Leu	D-Lys	662.36	663.7
				D-Leu	D-Glu	663.30	664.6
D-Leu	D-Leu	647.35	648.7
				Leu	D-Leu	647.35	648.7
D-Leu	Leu	647.35	648.7
				Phe		568.25	569.7
Nal		618.26	619.6
				Cha		574.29	575.7

实施例19-46含报告部分的氯沙坦-亮氨酸衍生物

通式(V)的化合物在表2中列出，在实施例1介绍的固体载体上合成。生物素和荧光素-NHS酯分别购自Fluka和Pierce。在Tc螯合物cPN216通过连接基戊二酰基连接时，使用三种不同的合成方法。大多数情况下使用式(VI)的活性酯。一种替代方法是，采用诸如PyAOP或HATU的试剂使相应的游离酸偶合，但是这种情况下，偶合反应必须重复进行几次。而且，按照实施例1中用于相应二乙醇酰基衍生物的方法，分两步反应连接戊二酰基-cPn216部分：首先，使树脂与戊二酸酐反应，其次，活化结合树脂的羧酸，偶合cPn216(式(VII)的游离胺)。对于含四胺螯合物的化合物的合成，使用完全被Boc保护的结构单元(VIII)(GB 0416062.8)。产物用反相色谱纯化(Phenomenex Luna C₁₈(2)柱，合适梯度的乙腈/水，含0.1％TFA或甲酸)，通过LC-MS(电喷雾电离)进行分析。

表2

Claims (11)

1.一种下式I的造影剂：

                 V-L-R    (I)

其中V是对血管紧张素II受体位点具有结合亲和力的有机基团，L是含氨基酸的直链或支链生物改性部分或连接部分，R是在人或动物体的体内显像术中可检测到的报告部分。

2.权利要求1或2的造影剂，其中V是氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦或依普沙坦。

3.权利要求1或2的造影剂，其中L包含1-40个氨基酸残基。

4.权利要求1-3中任一项的造影剂，其中L还包含一个或多个二羧酸单元、乙二醇单元、PEG样组分或者它们的组合，优选包含一个或多个二乙醇酰基、乙醇酰基、戊二酰基或丁二酰基单元或者它们的组合。

5.前述权利要求中任一项的造影剂，其中L是支链的。

6.权利要求1-5中任一项的造影剂，其中螯合剂是下式II的螯合剂：

其中：

R¹、R²、R³和R⁴各自独立地为R基团；

每个R基团都独立地为H、C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10烷基胺基或C_1-10氟烷基，或者两个或两个以上的R基团与它们所连接的原子一起构成饱和或不饱和的碳环或杂环。

7.前述权利要求中任一项的造影剂，其中螯合剂是下式(e)的螯合剂：

8.前述权利要求中任一项的造影剂，其特征在于所述造影剂是^99mTc(氯沙坦-Leu-二乙醇酰基-cPn216)、^99mTc(氯沙坦-Leu-Gly-二乙醇酰基-cPn216)、^99mTc(氯沙坦-Leu-β-Ala-二乙醇酰基-cPn216)或^99mTc(氯沙坦-Leu-Lys(丙酰基-PEG(12)-Ac)-二乙醇酰基-cPn216)。

9.一种药物组合物，该组合物包含有效量的通式I的化合物或其盐以及一种或多种药物可接受的辅料、赋形剂或稀释剂，用于在体内显像术中增强图像对比度。

10.一种在人体或动物体产生增强图像的方法，该方法包括预先给予人体或动物体包含式I所限定的化合物的造影剂组合物，并且产生人体或动物体至少一个部位的图像。

11.一种用于制备式I的放射性药物组合物的药盒，该药盒包含配体-螯合物缀合物和还原剂。

Images