CN1943890A - 原位微生物修复有机物污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种原位微生物修复有机物污染土壤的方法，以延长投放的功能微生物的存活时间，提高污染物降解率。该方法对功能菌投放后的修复过程条件进行分阶段控制，在三个不同的阶段分别提供不同的扰动频率，氧化剂、表面活性剂浓度及营养盐条件，以满足不同阶段功能微生物生长和代谢的需要。在不同土样应用的结果表明，本发明的方法大大提高了修复过程的有机污染物降解率。
Description
技术领域
本发明涉及污染土壤的修复技术，尤其涉及微生物修复有机物污染土壤的方法。
背景技术
对有机物，尤其是石油类污染土壤的修复，目前使用最广泛有效的是微生物修复。它利用土壤-微生物-污染物系统所自有的物理、化学和生物过程，使石油类污染物在微生物的代谢循环中得到转化和去除。原位生物处理是向污染区域投放氮、磷营养物质或供氧，促进土壤中依靠有机物作为碳源的微生物的生长繁殖，或接种经驯化培养的高效微生物等，利用其代谢作用达到降解有机污染物的目的。该方法具有费用低、效果好、无二次污染的特点。许多国家将这种技术用于处理被有机物污染的土壤或海水，取得了较好的成效。然而，由于原位微生物修复的方法在开放的生态系统中应用，所投放的功能微生物的存活率及存活时间受变化的环境理化因素影响很大，这也直接决定功能微生物的利用率及其对污染物降解率。目前原位微生物修复技术中常常使用单一条件控制，即在投放功能微生物的同时投放所需的营养物质，而在此后修复过程中不再进行条件控制。功能微生物的存活期限较短，其功能发挥也不充分。因此，调整微生物生存环境的理化条件，使土壤环境适应微生物的存活需求，从而延长功能微生物存活时间，延长功能微生物活性持续的时间，提高其利用率便是本发明的主导思路。
发明内容
本发明的目的在于提供可以延长功能微生物存活时间从而提高污染物降解率的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种原位微生物修复有机物污染土壤的方法，包括功能微生物群的筛选和建立及功能微生物的投放，其特征在于还包括修复条件的分阶段控制，包括三个阶段：
| 修复阶段 | 时间(天) | 扰动频率(次/天) | 氧化剂(v％) | 表面活性剂(v‰) | 油∶NH4NO3∶K2HPO4(质量份数) |
| 初期中期后期 | 0～1213～2223～30 | 1～480～13080～130 | 0.1～0.6％0.6～1.0％0.6～1.0％ | 0.1～0.5‰0.2～0.8‰0～0.2‰ | 50～85∶5～12∶1～550～85∶5～12∶1～550～85∶5～12∶1～5 |
其中，所述氧化剂是浓度为0.3％的H2O2溶液，按待修复土壤总体积的百分比计算加入量；
表面活性剂是Tween-80，按待修复土壤总体积的千分比计算加入量。
所述方法中，功能微生物的投放以投放微生物悬浮培养液的形式进行，所投放的功能微生物培养液体积为待处理土壤体积的0.5～3％，功能微生物培养液中菌体密度为107个/毫升。
所投放的功能微生物群中包含不动杆菌属、假单胞菌属及无色杆菌属的菌株各一株。
本发明所公开的修复有机物污染土壤的方法对功能微生物投放后的修复条件进行了分阶段调控，延长了功能微生物存活的时间，大大提高了修复过程，尤其是修复后期的有机污染物降解率。
具体实施方式
实施例1
修复辽东湾滨海湿地油污染土壤的方法。
1.目标微生物的筛选、鉴定
土样采自辽东湾滨海湿地，功能微生物的筛选方法参见微生物学(无锡轻工业学院.中国轻工业出版社，1992，554-563)
(1)使用的培养基为陈海水培养基2216，溶剂为陈海水，所含组分包括5g/L蛋白胨、1g/L酵母膏，培养基pH7.4～7.6；固体培养基中还含有15～20g/L琼脂；。
(2)优势底物的选择：苯甲酸、石油、烷烃类(庚烷、十一烷、二氯甲烷、三氯甲烷)、苯系物(苯、甲苯、二甲苯、乙苯、苯酚)；
(3)操作步骤：
在三角烧瓶中装入45mL灭菌2216培养基，加入5g土样和底物(1mg/mL)。30℃振荡培养3d，取5mL培养液接种到新的含60mg底物的培养基中，再培养3d，如此重复几次(碳源相应递增)。选取这几批培养液中浊度最高的培养液1mL，与9mL无菌水相混合，做成10-1稀释液，以此类推，做到10-5稀释液。取1mL涂布在分离固体培养基上，30℃培养72h，选取培养基上高浓度区域分散的单菌落，然后根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘形状和菌落颜色的差别，最终挑取菌落边缘清晰的优势菌落，划线纯化二次，最后将纯化到的单菌移到牛肉膏蛋白胨斜面上保存，置于40℃冰箱各用，并进行复筛。
将初筛的菌株分别接种于10mL 2216培养基中，30℃，150rpm摇床培养6h，以2％的接种量接入100mL土壤液中的三角瓶中，30℃，150rpm摇床培养，每4h测一次土壤液中油的浓度。选取降解能力强的菌株。
单菌株悬液：把单菌株从斜面移种到2216培养液中，发酵20h后制成细胞悬液(107/mL)；混合菌：按等比例混合单菌作为混合菌。
筛选出三株降解能力强的菌株A、B和C，经生理生化检验及16srDNA序列分析鉴定，它们分别属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和无色杆菌属(Achromobacter sp.)。
2.微生物功能群的构建：
考察①不添加菌；②单独添加菌A、B或C；③添加由A、B、C三种菌液等体积混合组成的混合菌等不同条件下的修复效果，以对油污染物的降解率计算。
按照待处理土样的总体积接种2％的待检测菌液，按土样总体积均匀添加0.3‰的Tween-80以及0.4％的浓度为0.3％的H2O2溶液；并按照油∶NH4NO3∶K2HPO4(质量比)＝75∶8∶3添加NH4NO3和K2HPO4。检测不同时间的油降解率，结果如下表所示：
| 时间(天) | 添加混合菌的降解率(％) | 添加A的降解率(％) | 添加B的降解率(％) | 添加C的降解率(％) | 未添加菌的降解率(％) |
| 0481216202428 | 06.2216.4429.6239.9648.9157.9766.63 | 05.2413.1119.3721.8524.4426.0335.63 | 09.1117.5524.4425.3427.4128.4132.24 | 07.4415.6926.6929.5032.2134.8037.06 | 01.111.882.623.153.794.355.07 |
由上表结果可见，功能菌的添加大大提高了对污染物的降解率；添加混合菌的修复效果优于添加单独的功能菌，因此确定功能微生物群是由A、B、C组成的混合菌。
3.分段控制修复条件与单一条件两种情况下油污染物的降解率比较：
两种条件下均添加A、B、C组成的混合菌菌液，添加量为待处理土样体积的2％；
单一条件还包括：按土样总体积添加0.3‰的Tween-80以及0.4％的浓度为0.3％的H2O2溶液，并按照油∶NH4NO3∶K2HPO4(质量比)＝75∶8∶3添加NH4NO3和K2HPO4。
分段控制修复条件还包括
| 修复阶段 | 时间(天) | 扰动频率(次/天) | 氧化剂(v％) | 表面活性剂(v‰) | 油∶NH4NO3∶K2HPO4(质量份数) |
| 初期中期后期 | 0～1213～2223～30 | 210090 | 0.4％0.85％0.85％ | 0.3‰0.5‰0 | 75∶8∶375∶8∶375∶8∶3 |
其中，所述氧化剂是浓度为0.3％的H2O2溶液，按待修复土壤总体积的百分比计算加入量；
表面活性剂是Tween-80，按待修复土壤总体积的千分比计算加入量。
结果如下表所示：
| 时间(天) | 未添加菌的降解率(％) | 单一条件下的降解率(％) | 分阶段控制修复条件下的降解率(％) |
| 0481216202428 | 01.111.882.623.153.794.355.07 | 06.2216.4429.6239.9648.9157.9766.63 | 05.3515.0138.2249.1359.6371.3285.36 |
由上表结果可见，分阶段控制修复条件可以有效地在整个修复过程中提高污染物的降解率，尤其在修复后期，功能微生物的活性得以保持，与单一条件下的结果相比降解提高近30％。
实施例2
修复大连港湾滨海湿地油污染土壤的方法。
将实施例1中建立的由菌株A、B、C组成的功能微生物群经大连港湾油污湿地土壤驯化培养2～5个周期。按照3％接种量投放到装有1m3大连港湾湿地土壤的土壤槽中，控制条件如下：
| 修复阶段 | 时间(天) | 扰动频率(次/天) | 氧化剂(v％) | 表面活性剂(v‰) | 油∶NH4NO3∶K2HPO4(质量份数) |
| 初期中期后期 | 0～1213～2223～30 | 48080 | 0.2％0.6％0.6％ | 0.5‰0.8‰0.2‰ | 80∶10∶480∶10∶480∶10∶4 |
其中，所述氧化剂是浓度为0.3％的H2O2溶液，按待修复土壤总体积的百分比计算加入量；
表面活性剂是Tween-80，按待修复土壤总体积的千分比计算加入量。
10～30d时油降解率为83.22％。
Claims (3)
1.原位微生物修复有机物污染土壤的方法，包括功能微生物群的筛选和建立及功能微生物的投放，其特征在于还包括修复条件的分阶段控制，包括三个阶段：
修复阶段
时间(天)
扰动频率(次/天)
氧化剂(v％)
表面活性剂(v‰)
油∶NH4NO3∶K2HPO4(质量份数)
初期中期后期
0～1213～2223～30
1～480～13080～130
0.1～0.6％0.6～1.0％0.6～1.0％
0.1～0.5‰0.2～0.8‰0～0.2‰
50～85∶5～12∶1～550～85∶5～12∶1～550～85∶5～12∶1～5
其中，所述氧化剂是浓度为0.3％的H2O2溶液，按待修复土壤总体积的百分比计算加入量；
表面活性剂是Tween-80，按待修复土壤总体积的千分比计算加入量。
2.根据权利要求1所述的原位微生物修复有机物污染土壤的方法，其特征在于功能微生物的投放以投放微生物悬浮培养液的形式进行，所投放的功能微生物培养液体积为待处理土壤体积的0.5～3％，功能微生物培养液中菌体密度为107个/毫升。
3.根据权利要求1所述的原位微生物修复有机物污染土壤的方法，其特征在于所投放的功能微生物群中包含不动杆菌属、假单胞菌属及无色杆菌属的菌株各一株。
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