CN1929831A - 改变胰岛素分泌的方法 - Google Patents

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Abstract

胰岛细胞中糖皮质激素诱导的激酶SGK1的活性的调节可恢复胰岛素释放。本发明还公开了可用于治疗糖皮质激素诱导的2型糖尿病的方法和化合物。

Description

改变胰岛素分泌的方法
技术领域
本发明涉及改变胰岛素分泌的方法，其包括使表达SGK1的胰岛细胞与调节SGK1的物质接触，并且其中SGK1的抑制涉及葡萄糖去极化作用的逆转，引起电压门控钙通道的活化和胰岛素的释放。
背景技术
糖皮质激素治疗诱导2型糖尿病，其在停药后可迅速逆转(Hoogwerf和Danese 1999；Schacke等人，2002)。除了外周胰岛素抗性和通过刺激糖原异生增加肝葡萄糖生成(McMahon等人，1988)外，糖皮质激素还干扰胰腺细胞的胰岛素分泌(Lambillotte等人，1997；Pierluissi等人，1986)。尽管进行了广泛的研究，但是对其分子机理仍无定论。抗孕激素米非司酮(RU486)—一种核糖皮质激素受体(nuclear glucocorticoid receptor)拮抗剂—完全抵消了地塞米松诱导的胰岛素分泌抑制(Lambillotte等人，1997)，表明与糖皮质激素依赖性基因的表达有关。
血清和糖皮质激素诱导的激酶SGK1属于糖皮质激素敏感基因(Webster等人，1993b；Webster等人，1993a，US6326181)。SGK1受许多刺激影响(Lang等人2001)，例如盐皮质激素(Chen等人1999，Naray-Fejes-Toth等人1999，Shigaev等人2000，Brennan等人2000，Cowling等人2000)。
已经显示SGK1通过胰岛素样生长因子IGF1、胰岛素和经由涉及磷脂酰肌醇(phosphoinositol)-3-激酶(PI3激酶)和磷脂酰肌醇依赖性激酶PDK1的信号级联通过氧化应激进行调节(Kobayashi & Cohen 1999，Park等人1999，Kobayashi等人1999)。通过PDK1进行的SGK1活化涉及丝氨酸422的磷酸化。此外还已证明，丝氨酸422向天冬氨酸(S422DSGK1)的突变导致持续活化的激酶(Kobayashi等人1999)。
多种测定系统可用于糖皮质激素诱导的激酶SGK1活性的测定。在闪烁亲近测定法(Sorg等人，J.of.Biomolecular Screening，2002，7，11-19)和闪烁板(flashplate)测定法中，测定蛋白质或肽底物与γATP的放射性磷酸化。在存在抑制性化合物的情况下，检测不到放射性信号或检测到降低的放射性信号。此外，均相时间分辨荧光共振能量转移(HTR-FRET)和荧光偏振(FP)技术可用于测定方法(Sills等人，J.of Biomolecular Screening，2002，191-214)。其它基于非放射性ELISA的测定方法使用特定的磷酸抗体(AB)。磷酸-AB仅与磷酸化的底物结合。该结合可通过化学发光用过氧化物酶轭合的抗绵羊二抗检测(Ross等人，2002，Biochem.J.，immediatepublication，manuscript BJ20020786)。
早期的结果显示SGK1是肾上皮Na+通道的强效刺激物(De la Rosa等人1999，Boehmer等人2000，Chen等人1999，Naray-Fejes-Toth等人1999，Lang等人2000，Shigaev等人2000，Wagner等人2001)。
与SGK1有关的另一发现是在具有(CC/CT)核苷酸组合的外显子8中的单核苷酸多态性和另外的在内含子6中的多态性(CC)与血压升高有关(Busjahn等人2002)，由此推断SGK1对于血压调控和高血压可能是重要的。
由于SGK1的活性增加与肾上皮Na+通道活性有关(其通过肾对钠的重吸收增加导致高血压)(Lifton 1996；Staessen等人，2003；Warnock 2001)，所以确定无疑的是：取决于SGK1的等位基因变体的组合，可能出现肾对Na+的重吸收增加，其进而将升高血压(Busjahn等人2002)。
迄今为止，没有显示胰岛的分泌胰岛素的细胞表达相关量的SGK1(Klingel等人2000)，并且一般认为未经处理的胰岛细胞不表达或仅在较小程度上表达SGK1。
长时间的高剂量糖皮质激素治疗至少部分通过损害胰岛素分泌使人易发生糖尿病。根本机理尚不清楚，并且目前也未发现可进行治疗干预的靶标。本申请定义了这样的新机理和分子靶标，同时还教导了如何鉴别干扰上述致病机理以消除糖尿病的新化合物。
发明概述
本申请出乎意料地证明：在用糖皮质激素预处理的分泌胰岛素的胰岛细胞中，胰岛细胞显示出SGK1转录水平和表达的显著增加。
糖皮质激素过量至少部分通过损害胰岛素分泌使人易发生糖尿病，本发明的方法用于调节胰岛细胞中SGK1的活性，从而在需要这类治疗的个体中减少糖皮质激素诱导的2型糖尿病。
另一方面，本发明教导了鉴别可用于恢复胰岛素分泌的治疗活性化合物的方法，该方法使表达SGK1的胰岛细胞与调节SGK1的物质接触。从而逆转葡萄糖的去极化作用，引起电压门控钙通道的活化和随后的胰岛素释放。
当应用于用SGK1基因的单核苷酸多态性定义的临床相关表型或基因型时，SGK1的调节是特别有用的。因此，对取自需要治疗的个体的样本中的多态SGK1 SNP变体的分析可能是另一种应用。此外，本发明提供了通过测定SGK1的表达而确定疾病的进展、消退或发作的方法。取自患病个体的样本还可对所选择的SGK1 SNP变体和它们与易于罹患该疾病或其它例如由长期糖皮质激素治疗诱导的病症的关系进行分析。另一方面涉及用于鉴别调节与SGK1有关的疾病的新药候选者的筛选方法。特别有用的调节剂是干扰SGK1功能从而导致胰岛素分泌上调的化合物。SGK1的抑制剂特别可用于治疗患有2型糖尿病症状的个体。SGK1的调节剂也可用于治疗患有应激诱导的高血糖的个体或患有低血糖的个体。
根据本发明进行的药物筛选方法已经导致了定向于SGK1的治疗化合物的发现。已经鉴别出两种不同种类的化合物，一种属于酰基腙衍生物，另一种属于吡啶并嘧啶衍生物。在包含药学上有效的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物中的所选择的抑制SGK1的化合物可用于治疗糖皮质激素诱导的2型糖尿病。对于本发明而言至关重要的是，用于鉴别具有所需治疗特性的新药物的筛选方法不局限于本申请中所公开的化合物。此外，对于专业人员显而易见的是，用于筛选调节SGK1的化合物的一步方法或两步方法均可应用。这类筛选的第一步包括鉴别干扰SGK1激酶活性的化合物。可使用多种测定形式，优选的测定法使用SGK1催化的蛋白质或肽底物与γATP的放射性磷酸化的测定。在存在SGK1抑制性化合物的情况下，检测不到放射性信号或检测到降低的放射性信号。在筛选的第二步中，测定抑制SGK1的化合物在糖皮质激素处理的胰岛细胞例如INS-1细胞中恢复胰岛素分泌的潜力。在SGK1抑制后，测定胰岛素的释放，但是，测定其它读出活性也可能是有用的。
发明详述
糖皮质激素诱导的糖尿病的根本机理迄今为止尚不清楚。在本发明中，显示糖皮质激素如地塞米松在分泌胰岛素的细胞中上调血清和糖皮质激素诱导的激酶SGK1的转录和表达，该作用可被米非司酮(RU486)—一种核糖皮质激素受体拮抗剂—逆转。当在爪蟾卵母细胞中共表达时，SGK1增加电压门控K+通道Kv1.5的活性。在INS-1细胞中，地塞米松刺激Kv1.5的转录，增加复极化外向电流，并降低葡萄糖诱导的胰岛素释放。后两种作用可被K+通道阻滞剂4-AP和TEA逆转。事实上，地塞米松可抵消由野生型小鼠分离得到的胰岛的葡萄糖诱导的胰岛素释放，在由SGK1敲除小鼠分离得到的胰岛中该作用显著减弱。总之，糖皮质激素刺激SGK1的转录，该转录进而上调电压门控K+通道的活性。随后的超极化抵消葡萄糖的去极化作用，并防止电压门控Ca2+通道的活化、Ca2+的进入和胰岛素的释放。
本发明涉及在调节胰岛素分泌中SGK1的作用和SGK1依赖性通道的活性。
根据实时PCR，在未经处理的INS-1细胞中SGK1转录水平低(图1A)，该发现与先前报道的关于人胰岛的低转录水平(Kingel等人，2000)相对应。但是，将INS-1细胞与100nM地塞米松一起孵育2-23小时增加mRNA转录水平，该作用可被糖皮质激素受体拮抗剂RU486完全抵消(图1A)。在23小时内，地塞米松增加细胞SGK1转录水平，用地塞米松处理后在小鼠胰岛中该转录水平增加(图1A)。相似地，在其它细胞类型中也观察到了糖皮质激素对SGK1转录的强刺激(Itani等人，2002；Rozansky等人，2002)。从蛋白质印迹法可明显看出，在未经处理的细胞中检测不到SGK1蛋白，但在暴露于地塞米松(100nM)的2小时内其已经出现并在接下来的23小时内进一步增加(图1B)。SGK1蛋白丰度的增加可被RU486完全逆转。因此，地塞米松刺激分泌胰岛素的细胞中SGK1的表达。
如图1D中所示，SGK1和Kv通道在爪蟾卵母细胞中的共表达将异种表达的Kv1.5通道的活性上调约2倍(图1D)。先前已经证明这些通道在INS-1细胞(Su等人，2000)以及啮齿和人β细胞(Philipson等人，1994；Roe等人，1996)中被表达。在INS-1细胞中，这些通道可被K+通道阻滞剂4-AP抑制(Su等人，2001)。如图2A和2B所示，用地塞米松处理的确可增加4-AP敏感性电压门控外向电流。在未经处理的细胞中，K+通道阻滞剂4-AP仅抑制10％(0.1mM)和28％(1mM)的外向电流。在用100nM地塞米松处理4小时后，4-AP敏感性电流增加至28％(0.1mM 4-AP)和40％(1mM 4-AP)。这些数据表明，在分泌胰岛素的细胞中，地塞米松可提高Kv1.5通道的活性。已经发现糖皮质激素可增加Kv1.5通道在心脏(Takimoto和Levitan1994)、骨骼肌和垂体中的表达，但是不增加其在下丘脑和肺中的表达(Levitan等人，1996)。此外，在造成甲状腺功能减退的肾上腺切除动物的左心室中，对于T3而言地塞米松是增加Kv1.5 mRNA水平所必需的(Nishiyama等人，1997)。实时PCR显示，用地塞米松(100nM)处理在4小时内使Kv1.5 mRNA在INS细胞中的丰度增加约10倍。因此，地塞米松刺激SGK1的表达，该表达进而增加Kv通道的活性。
为了阐明Kv通道和SGK1对地塞米松减弱胰岛素释放的影响，进行了另外的实验。如图3所示，将INS-1细胞用地塞米松(100nM)预处理抑制62％的葡萄糖诱导的胰岛素分泌。该抑制作用可被Kv通道阻滞剂TEA和4-AP逆转，表明地塞米松介导对胰岛素分泌的抑制作用依赖Kv通道的活性。
为了估计SGK1对地塞米松的胰岛素分泌抑制作用的贡献，比较了在SGK1敲除小鼠(sgk-/-)中和在野生型同窝出生小鼠(sgk1+/+)中地塞米松对胰岛素分泌的作用。在不进行地塞米松预处理的情况下，在由sgk-/-和sgk1+/+分离得到的胰岛中，在暴露于葡萄糖(16.7mM)、活化腺苷酸环化酶(5μM福斯高林)或刺激蛋白激酶C(100nM PMA)后，胰岛素分泌没有显著差别(图4A和B，黑色条形)。但是，地塞米松处理在sgk1+/+胰岛中比在sgk-/-中更显著地降低葡萄糖、福斯高林或PMA对胰岛素分泌的刺激作用。这些数据表明SGK1参与地塞米松对胰岛素分泌的下调。
总之，本实验公开了胰岛素分泌调节中的新机理。糖皮质激素地塞米松促进SGK1在分泌胰岛素的细胞中的转录和表达。激酶上调包括Kv1.5在内的电压门控K+通道。Kv通道的过量表达超极化β-细胞质膜，从而妨碍电压门控Ca2+通道的活化。因此，在糖皮质激素过量时，激酶对抑制胰岛素释放有作用。
附图简要说明
图1：地塞米松诱导SGK1在分泌胰岛素的INS-1细胞中的表达。
在培养物中将INS-1细胞用100nM地塞米松或载体(DMSO)处理给定时间。在2小时内地塞米松显著诱导SGK1的表达。在1μmol/l下RU486完全抑制地塞米松的作用。
(A)使用逆转录酶M-MuLV(Roche Diagnostics GmbH，Roche AppliedScience，Mannheim，德国)将细胞的RNA转录入cDNA。在light cyclersystem(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德国)中通过实时PCR对SGK1 mRNA进行定量。所用的引物是：SGK1上游：5′-TTT TTT TTC CCA ACC CTT GC-3′；下游：5′-AAT GAA CAAAGG TTG GGG GG-3。所给出的是给定数量的实验的均值±SEM。
(B)将全细胞裂解物用1％SDS-PAGE处理并转移至硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell，Dassel，德国)上显图。将该图与抗SGK1抗体(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，美国)一起进行孵育。用与辣根过氧化物酶偶合的二抗来显示结合的抗体。
(C)使用light cycler system(Roche Diagnostics GmbH，Roche AppliedScience，Mannheim，德国)对Kv1.5进行实时PCR。如图1A所述的实验那样对相同的RNA制品进行分析。所给出的是3个独立实验的均值±SEM。
(D)在爪蟾卵母细胞中SGK1和Kv通道的共表达增加K+电流。将人SGK1(μg/ml)和Kv1.5(μg/ml)的mRNA注射入卵母细胞，注射后2天用2-电压箝法测定全细胞电流。所给出的是代表性迹线和均值±SEM。
图2：地塞米松提高INS-1细胞中kv通道的活性。
在进行实验之前，将细胞用100nm地塞米松处理4小时。(2A)用200ms的电压脉冲诱导全细胞电流，电压以10mv的幅度从-70mv增加至+50mv。(2B)在用地塞米松处理之前(黑色柱)和之后(白色柱)在细胞中测试对4-ap(0.1和1mm)和tea(1和10mm)的敏感性。应用200ms持续时间的从-70至50mv的电压脉冲。所给出的是给定数量的实验的均值±SEM。*表示在对照、相同抑制剂浓度下未经处理的细胞中电流的显著性(p＜0.05)。如之前所述培养Ins-1细胞(Abel等人，1996；Asfari等人，1992)。外部膜片箝溶液含有(以mmol/l为单位)：140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖和10HEPES，PH 7.4。内部溶液含有(以mmol/l为单位)：30KCL、95K+-葡糖酸盐、1MgCl2、1.2NaH2PO4、4.8Na2HPO4、5Na2ATP、1Na3GTP、5mmol/l EGTA，PH 7.2。使用Epc9膜片箝放大器(HekaElectronic，Lambrecht，德国)测量电流。
图3：Kv通道抑制逆转地塞米松诱导的INS-1细胞的胰岛素分泌抑制。
在实验之前，将INS-1细胞在培养物中用100nM地塞米松处理4小时。将细胞洗涤两次，并于37℃下在HEPES缓冲盐溶液中进行预孵育，所述的HEPES缓冲盐溶液含有(以mmol/l为单位)：140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖、10HEPES和5g/l牛血清白蛋白，pH 7.4。其后，将细胞在含有适宜浓度的供试物质的新鲜溶液中于37℃下孵育30分钟。通过使用大鼠胰岛素抗血清(Linco，Biotrend Chemikalien GmbH，Cologne，德国)、I125-胰岛素(CIS Diagnostik GmbH，Dreieich，德国)和大鼠胰岛素(Novo Nordisk，Mainz，德国)作为标准的放射免疫测定法或通过胰岛素Elisa试剂盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)测定胰岛素。
图4A和B：地塞米松不影响SGK1敲除小鼠的胰岛的分泌。
将离体胰岛在含有11mmol/l葡萄糖的RPMI 1640中培养过夜。在实验之前5小时加入地塞米松(100ng/ml)或DMSO(对照)。在培养后，将胰岛在孵育缓冲液中于37℃下预孵育1小时，所述孵育缓冲液含有(以mmol/l为单位)：140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、2.8葡萄糖、10HEPES，pH 7.4和5g/l牛血清白蛋白(fraction V，Sigma，Deisenhofen)。其后，如各实验所示，将5个胰岛/0.5ml的各批次于37℃下在存在供试物质的情况下孵育30分钟。使用Elisa试剂盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)测定胰岛素。
另外的方法和材料
实施例1：Sgk1-/-小鼠的产生
有条件的打靶载体由一个7-kb片段产生，该片段包含位于12个外显子上的完整转录区域(Wulff等人，2002)。新霉素抗性表达盒两侧各有一个loxP位点，将该表达盒插入内含子11中。通过在内含子3中插入第三个loxP位点将编码sgk1激酶结构域的外显子4-11分隔(“floxed”)。将具有第一和第三loxP位点之间的重组(I型重组)的克隆注入C57BL/6胚细胞中。使雄性嵌合体与C57BL/6和129/SvJ雌性交配。使杂合的sgk1缺失小鼠与129/SvJ野生型小鼠回交两代，然后杂交，产生纯合的sgk1-/-和sgk+/+同窝生小鼠。
实施例2：细胞培养和胰岛素分泌测定
将来自大鼠胰岛素瘤的INS-1细胞(由瑞士University of Geneva的CB Wollheim惠赠)在HEPES缓冲的RPMI 1640中进行培养，所述RPMI1640中补充有10％胎牛血清(Biochrom，Berlin，德国)、1mmol/l HEPES、1mmol/l丙酮酸钠、10μmol/lβ-巯基乙醇(Sigma，Munich，德国)和别处所述的抗生素(Abel等人，1996；Asfari等人，1992)。将细胞以2.0-2.5×105个细胞/ml的密度接种在24孔培养板中并在实验之前培养2天。将细胞用HEPES缓冲盐溶液洗涤两次，所述HEPES缓冲盐溶液含有(以mmol/l为单位)：140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖、10HEPES和5g/l牛血清白蛋白，pH 7.4，并在37℃下预孵育30分钟。其后，丢弃培养基，加入含有适宜浓度的供试物质的新鲜培养基。将细胞在37℃下孵育30分钟。
在冰上停止孵育，取出培养基并在-20℃下冷冻，直至胰岛素释放进入上清液，通过使用大鼠胰岛素抗血清(Linco，Biotrend Chemikalien GmbH，Cologne，德国)、I125-胰岛素(CIS Diagnostik GmbH，Dreieich，德国)和大鼠胰岛素(Novo Nordisk，Mainz，德国)作为标准的放射免疫测定法或通过胰岛素Elisa试剂盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)对其该培养基进行测定。在4℃下用酸乙醇(1.5(v/v)％HCl/75％乙醇)提取过夜后，测定胰岛素含量。
对于从SGK1 KO和野生型同窝出生小鼠中分离胰岛，将3ml含有1mg/ml胶原酶(Serva，Heidelberg，德国)的胶原酶溶液通过主胆管(ductuscoledochus)注入位于原位的胰腺中。取出整个腺体，在37℃下消化10分钟。然后通过在解剖显微镜下将胰岛收集入新鲜培养基中而将胰岛与外分泌组织分离。将胰岛在含有11mmol/l葡萄糖和地塞米松(100ng/ml)或DMSO(对照)的RPMI 1640中培养过夜。在培养后，将胰岛在孵育缓冲液中于37℃下预孵育1小时，所述孵育缓冲液含有(以mmol/l为单位)：140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、2.8葡萄糖、10HEPES，pH 7.4和5g/l牛血清白蛋白(fraction V，Sigma，Deisenhofen)。其后，如各实验所示，将5个胰岛/0.5ml的各批次于37℃下在存在供试物质的情况下孵育30分钟。使用Elisa试剂盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)测定胰岛素。
实施例3：膜电流的测定
将INS-1细胞以合适的细胞密度(1.2×106个细胞/ml)在用聚-L-鸟氨酸(10mg/l Sigma，Munich，德国)包被的玻璃盖玻片上培养2-4天。在倒置显微镜的载物台上，将盖玻片在恒温槽(bath chamber)中封固。如各实验所示，将细胞保持在室温或34℃，用溶液浇盖(superfused)，所述溶液含有(以nmol/l为单位)：140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖和10HEPES，pH 7.4。用DMZ-万能拉出器(Zeitz，Augsburg，德国)拉出电阻为4-6MΩ的膜片箝吸液管(Clark-Medical，Reading，英国)。它们充有内部溶液，该内部溶液含有(以mmol/l为单位)：30KCl、95K+-葡糖酸盐、1MgCl2、1.2NaH2PO4、4.8Na2HPO4、5Na2ATP、1Na3GTP、5mmol/l EGTA，pH 7.2。使用EPC9膜片箝放大器(Heka Electronic，Lambrecht，德国)进行电流的测量。仅仅稳定的电流测量值(即取出各个抑制性药物后电流达到对照电流的至少90％时)被用于分析。
实施例4：实时PCR
在70cm2的烧瓶中培养INS-1细胞，取出培养基，加入600μl裂解缓冲液(Mini kit，Qiagen，Hilden，德国)。刮下被裂解的细胞，将裂解物收集入Eppendorf管中。用Qiagen Mini kit分离细胞RNA，并使用逆转录酶M-MuLV(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德国)将2μg RNA转录入cDNA中。使用相应于各实验中所示RNA量的cDNA的等分试样通过实时PCR对mRNA进行定量，使用light cyclersystem(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德国)，所用的大鼠Kv1.5通道的特定引物，有义：5′-ATC TTC AAG CTCTCC CGC CAC TCC AAG GG-3′；反义：5′-GGG TTA TGG AAA GAGGAG TTA-3′。所用的大鼠SGK1引物为：有义：5′-TTT TTT TTC CCAACC CTT GC-3′；反义：5′-AAT GAA CAA AGG TTG GGG GG-3。如所示的那样对离体的小鼠胰岛进行培养并用地塞米松处理。其后，收集胰岛，在裂解缓冲液(Mini kit，Qiagen，Hilden，德国)中裂解，并通过反复抽吸将胰岛吸入胰岛素注射器中。
实施例5：蛋白质印迹法
在不存在(对照)或存在100ng/ml地塞米松的情况下，将INS-1细胞在在70cm2烧瓶中培养给定时间。其后，取出培养基，将细胞在溶液中裂解，所述溶液含有300mM NaCl、20mM TrisHCl，pH 7.4、1％(v/v)TritonX-100、1％去氧胆酸钠、0.1％SDS、2.5mM EDTA、10μg/ml抑胃酶肽A、10μg/ml抑酶肽和0.1mM PMSF。将用考马斯蓝G染色(Bradford dye assay，Biorad Laboratories GmbH，Munich，德国)定量的50μg总细胞蛋白进行SDS-PAGE(1％)处理，转移至硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell，Dassel，德国)上显图。用该图与抗SGK1抗体(New England Biolabs，Beverly，MA，美国)一起进行孵育。用与辣根过氧化物酶偶合的二抗来显示结合的抗体。
实施例6：调节SGK1的化合物
6.1.通式I的化合物和其可药用的衍生物、盐、溶剂合物和立体异构体，包括混合物。
Figure A20058000725100131
其中
R1，R5为H、OH、OA、OAc或甲基，
R2，R3，R4，R6，R7，R8，R9，R10为
H、OH、OA、OAc、OCF3、Hal、NO2、CF3、A、CN、OSO2CH3、SO2CH3、NH2或COOH，
R11为H或CH3，
A为具有1、2、3或4个碳原子的烷基，
X为CH2、CH2CH2、OCH2或-CH(OH)-，
Hal为F、Cl、Br或I。
式I的化合物，其选自下组的化合物：
(3-羟基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-羟基-苯基)-乙酸-[1-(4-羟基-2-甲氧基-苯基)-亚乙基]-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
苯乙酸-(3-氟-4-羟基-亚苄基)-酰肼，
(4-羟基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3，4-二氯-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
间甲苯基-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
邻甲苯基-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(2-氯-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-氯-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(4-氟-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(2-氯-4-氟-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-氟-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2，6-二甲基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(3-氟-4-羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-[1-(4-羟基-2-甲氧基-苯基)-亚乙基]-酰肼，
(3-甲基磺酰氧基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3，5-二羟基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-氟-苯基)-乙酸-(3-氟-4-羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-乙酸基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-三氟甲基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
3-(3-甲氧基-苯基)-丙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2，4-二羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯氧基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-硝基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(5-氯-2-羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2-羟基-5-硝基-亚苄基)-酰肼，
2-羟基-2-苯基-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2-乙氧基-4-羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-溴-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-甲氧基-苯基)-乙酸-[1-(4-羟基-苯基)-亚乙基]-酰肼，
(3，5-二氟-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲氧基-亚苄基)-酰肼，
(3-羟基-苯基)-乙酸-(4-羟基-2-甲基-亚苄基)-酰肼，
(3-羟基-苯基)-乙酸-(2-乙氧基-4-羟基-亚苄基)-酰肼，
(3-羟基-苯基)-乙酸-(2-甲氧基-4-羟基-6-甲基-亚苄基)-酰肼，
(2-氟-苯基)-乙酸-(2-甲氧基-4-羟基-亚苄基)-酰肼。
6.2.通式II的化合物和其可药用的衍生物、盐、溶剂合物和立体异构体，包括混合物。
Figure A20058000725100151
其中
R1，R2，R3，R4，R5为H、A、OH、OA、链烯基、炔基、NO2、NH2、NHA、NA2、Hal、CN、COOH、COOA、-OHet、-O-亚烷基-Het、-O-亚烷基-NR8R9或CONR8R9，选自R1、R2、R3、R4、R5的两个基团还为-O-CH2-CH2-，-O-CH2-O-或-O-CH2-CH2-O-，
R6，R7为H、A、Hal、OH、OA或CN，
R8，R9为H或A，
Het为饱和或不饱和的具有1至4个氮、氧和/或硫原子的杂环，该杂环被一个或多个Hal、A、OA、COOA、CN或羰基氧(＝O)取代，
A为具有1至10个碳原子的烷基，其中1至7个氢原子可被氟和/或氯取代，
X，X’为NH或不存在，
Hal为F、Cl、Br或I。
式II的化合物，其选自下组的化合物：
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-氯-5-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，4-二氟-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，6-二氟-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(3-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-甲基-5-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，3，4，5，6-五氟-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，4-二溴-6-氟-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-6-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-5-甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，3，4-三氟-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-溴-2，6-二氟-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-3-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-(1-叔丁氧羰基-哌啶-4-基)-苯基]-脲，
N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-2，4-二氯-苯甲酰胺，
N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-4-氯-5-三氟甲基-苯甲酰胺，
N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-2-氟-5-三氟甲基-苯甲酰胺，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-5-三氟甲基-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[(2-氟-5-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[5-氟-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氯-5-三氟甲基-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-[2-(哌啶-1-基)-乙氧基]-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-[2-(吗啉-4-基)-乙氧基]-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-[2-(吗啉-4-基)-乙氧基]-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氯-2-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氯-5-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，
包括它们的可药用的衍生物、溶剂合物、盐、互变异构体和立体异构体，包括它们任意比例的混合物。
实施例8：SGK1核苷酸多态性
定义兼性(facultative)高血压患者的内含子6的核苷酸序列为...aattacatt Cgcaacccag...，而代表健康人群的核苷酸序列为...aattacatt Tgcaacccag...。通过登录号GI 2463200的2070位可得到这两种序列。
兼性高血压患者的外显子8序列为纯合的..tactga Cttcggact..或....tactgaTttcggact....或杂合的.tactga Cttcggact...和...tactgaTttcggact..。通过登录号NM_005627.2的777位可得到这些序列。
具有TT核苷酸组合的纯合个体是受保护的，即使在内含子6中同时存在CC单核苷酸多态性也是如此。
实施例9：统计
数据均以均值±SEM表示。用多组的ANOVA和Student’s t-检验进行统计分析。p值＜0.05被认为表示统计学显著。
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Claims (15)

1.改变胰岛素分泌的方法，其包括使表达SGK1的胰岛细胞与调节SGK1的物质接触。
2.权利要求1的方法，其中被表达的SGK1包含选择的SNP变体。
3.权利要求1-2的方法，其中SGK1的调节剂是抑制剂。
4.权利要求1-2的方法，其中所述的调节剂是SGK1的活化剂。
5.权利要求1的方法，其中SGK1的抑制包括葡萄糖去极化作用的逆转、电压门控钙通道的活化和胰岛素的释放。
6.权利要求5的方法，其中多态SGK1SNP变体在抑制之前被诊断。
7.权利要求1-4的方法，其以胰岛素分泌的上调为特征。
8.权利要求1-4的方法，其中被治疗的个体患有2型糖尿病的症状。
9.在需要这类治疗的个体中减少糖皮质激素诱导的2型糖尿病的方法，该方法调节胰岛细胞中SGK1的活性。
10.权利要求1-4的方法，其中被治疗的个体具有应激诱导的高血糖。
11.权利要求1-4的方法，其中被治疗的个体具有低血糖。
12.通过测定SGK1的表达来确定疾病的进展、消退或发作的方法，其包括从患病个体取样。
13.权利要求12的方法，其中SGK1包含选择的SNP变体。
14.药物组合物，其包含SGK1抑制剂以及药学上有效的载体、赋形剂或稀释剂。
15.选自所列的具有通式I或II的化合物的SGK1抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗由胰岛素分泌受损引起的障碍。
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