CN1928557A - 中国人2型糖尿病新血清标志物的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测2型糖尿病新血清标志物的试剂盒，更具体地，本发明涉及利用所鉴别的2型糖尿病的一个血清标志物galectin－1，以及其在2型糖尿病病人体内出现的表达水平的改变设计的检测试剂盒。本发明还涉及galectin－1在制备2型糖尿病的诊断剂和治疗药物中的应用。

Description

中国人2型糖尿病新血清标志物的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及2型糖尿病的一种血清标志物，该血清标志物为Galectin-1，即可溶性的半乳糖苷酶结合的凝集素蛋白1型(lectin，galactoside-binding，soluble，1)。本发明还涉及利用所鉴别的标志物galectin-1，以及其在病人体内出现的表达水平的改变而设计的检测试剂盒。更进一步地，本发明还涉及该血清标志物在糖尿病诊断中的作用，以及作为糖尿病治疗药物设计的靶点。

背景技术

众所周知，2型糖尿病是一种多基因控制的复杂性状疾病，有着明显的遗传倾向。目前认为参与胰岛素信号传导途径、葡萄糖转运途径、糖原合成途径、脂肪酸的吸收和合成、脂细胞分化途径的有关蛋白质分子都可能与糖尿病的发生相关。研究糖尿病发病机理，阐明分子机制、鉴定血糖调节基因及其功能的研究对糖尿病的预防和治疗均有十分重要的意义。其中，胰岛素信号传导途径是目前研究较多的一个领域，该途径十分复杂，包括胰岛素受体、胰岛素受体底物等，并和Akt信号传导途径、MAPK信号传导途径、CAP/Cb1信号传导途径等联系在一起。胰岛素受体属于受体酪氨酸激酶，包括IGF-I和IRR。目前至少鉴定了9个胰岛素受体激酶底物，其中包括4个胰岛素受体底物IRS1、IRS2、IRS3和IRS4。胰岛素受体底物(IRS)具有高度同源性，但是作用各异，相互补充。IRS-1基因敲除小鼠表现为出生前和出生后生长迟缓，胰岛素耐受，葡萄糖耐受受损等症状。IRS-2基因敲除小鼠表现为在肝脏等组织胰岛素耐受以及包括脑组织等多个区域生长缺陷，最终发展成2型糖尿病。

目前，糖尿病的诊断主要是依赖测定血糖水平，糖耐量能力和胰岛素水平。由于80％以上的早期糖尿病病人没有明显的症状，往往导致延误了糖尿病的预防和及时治疗。因此，寻找简便快捷，准确有效的新的糖尿病早期诊断的方法对于糖尿病的预防和治疗都有极为重要的意义。

2型糖尿病是一种多基因遗传病。伴随着2型糖尿病病程的发生和发展，各种症状和并发症逐一出现和产生。而实际上，远在各种症状为病人自身所察觉之前，与这些症状出现相关的蛋白的表达水平就已经出现了变化。2型糖尿病的早期诊断就包括对这些相关蛋白的正确检测，它能有效地帮助糖尿病的预防和治疗，提高糖尿病人的生活质量。因此，寻找和鉴定2型糖尿病的蛋白标志物有着极大的实用价值。

蛋白质鉴定技术的发展与基因组计划的完成，使得“蛋白质组学”这一全新的研究领域得以诞生和发展。蛋白质组学是在基因组学的基础上研究蛋白质的表达与功能的科学。它的出现为我们进一步了解整个生物体系提供了一种可靠的方法。用于检测蛋白表达的二维电泳技术(2DE，two-dimensional polyacrylmide gel electrophoresis)和用于蛋白质鉴定的质谱技术(MS，mass spectrometry)对蛋白质组学产生了至关重要的作用。蛋白质表达水平的变化是机体在出现病变之后产生的反应的一部分。这包括对蛋白质合成速度的调控，在翻译水平的基因表达调控，蛋白的翻译中和翻译后的共价修饰(如磷酸化，酰基化或糖基化)以及蛋白质的降解速度。因而，对整体蛋白质组的研究就反映了环境条件的变化，包括复杂网络多级调控的蛋白质浓度的变化(如mRNA合成，翻译，修饰，转运，蛋白水解过程和降解)。可以说，蛋白质组的比较研究有助于理解细胞的调控网络。所以，它是疾病标志物鉴别，药物靶标确认，药物的行为机理研究和药理学推理的有用工具。

将蛋白质组学应用于疾病生物标志物蛋白质的检测已经取得了令人瞩目的成绩。在用CyA处理产生肾毒的大鼠肾脏中发现28kD蛋白calbindin-D持续减少(Benito et al.，1995；Steiner et al.)，并且同时伴随着尿钙排泄物和皮层脊髓管内石灰化的增加(Aicher et al.)。另一个生物标记蛋白的成功鉴别的例子来自膀胱鳞状细胞癌进程的长期研究(Celis et al.1998)。

在临床诊断中，血清作为最易采集的样品而备受关注。越来越多的研究者将目光集中到应用蛋白质组学手段在血清中寻找潜在的疾病标志物。血清中存在着丰富的蛋白，携带了非常可贵的信息。但是，血清中存在的白蛋白占到所有蛋白的80％以上，这就干扰了其他低丰度蛋白的分离和鉴定。迄今为止，应用蛋白质组学手段寻找糖尿病的血清标志物的工作还十分少见。

本发明人收集临床确诊的散发性2型糖尿病人血清和正常人血清，采用蛋白质组学方法，通过双向电泳比对胶图得到在2型糖尿病中有差异表达情况的蛋白点，然后利用质谱的方法确定蛋白种类，最后采用该蛋白的特异性抗体在病人和正常人血清中通过酶连免疫的方法对这种蛋白的表达水平进一步验证确定。最终，本发明人确定了一种2型糖尿病的血清标志物galectin-1，并在此基础上完成了此项发明。

发明内容

根据本发明的一个方面，本发明人提供了一个可用于检测2型糖尿病生物标志物的试剂盒。该试剂盒包含针对galectin-1的抗体和正常的应用酶连免疫吸附检测血清中蛋白水平的试剂盒所含的常规组件。

在此，本发明人提供了一个2型糖尿病的血清标志物。本发明涉及一种多肽分子，名为galectin-1，即半乳糖苷酶结合凝集素1型。

本发明还涉及针对该多肽分子的抗体，包括能识别整体分子，该分子某一结构域以及某一个或几个特异的抗原决定簇的所有抗体。

更进一步，本发明还涉及galectin-1在制备用于2型糖尿病诊断的诊断剂中的应用，以及作为潜在的药物靶点制备2型糖尿病的治疗药物中的应用。

定义：

疾病血清标志物(biomarker)：是指在疾病的发生和发展过程中，由于疾病所引起的生理上的变化，如糖代谢或脂代谢的异常，而造成的某些分子，特别是蛋白分子的表达异常。这些出现表达异常的蛋白分子往往可以作为这些疾病诊断标志物，应用于临床。能在血清中出现并被检测的就被称为血清标志物。通过对这些标志物的研究，还可以进一步联系疾病的发生机理，研究和涉及疾病治疗的新途径。

肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint)：MALDI-TOF分析可产生肽质量指纹图谱。通过与序列数据库中的理论肽谱和断裂谱比较，可以鉴定所检测样品的确切身份。

蛋白质组(proteome)：是指一个细胞和组织基因组所表达的全部蛋白。由于同一基因组在不同细胞和不同组织中的表达情况各不相同，即使是同一个细胞或组织，在不同的发育阶段和不同的生理，病理条件下，或是不同环境因子的影响下，蛋白质的表达和存在状态都不相同。因此，蛋白质组是一个在时间和空间上动态变化的概念。

蛋白质组学(proteomics)：是应用各种方法和手段来研究蛋白质组的一门新的学科。通过从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成，表达水平，修饰状况以及蛋白质之间和蛋白质与其他分子之间的相互作用，从而了解蛋白质的功能及其在生命过程中的作用。目前比较成熟的蛋白质组学研究平台是以双向电泳为代表的分离技术和以质谱为核心的鉴定技术

具体实施方式

本发明人利用蛋白质组学方法，通过比对2型糖尿病病人和正常人血清中蛋白的表达情况，确定galectin-1为一种与2型糖尿病相关的差异表达的蛋白。Galectin是一类β半乳糖苷酶结合蛋白，主要在于调节细胞之间或是细胞与基质之间的相互作用。它是一种自分泌的负调节生长因子，主要调节细胞增殖。根据已有的报道显示，galectin-1在人间质干细胞(mesenchymal stem cell)的免疫功能中有作用。Galectin-1能通过caspase非依赖(caspase-independent)的线粒体途径诱导细胞凋亡的发生。它诱导线粒体的凝聚，出芽和裂解，并伴随着裂解相关分子的水平升高和再分配。Galectin-1再细胞与基质的相互作用以及体外抑制Colo201肿瘤细胞增殖中都有作用，其表达与细胞凋亡相关。受体氨酸磷酸酶(Receptor tyrosine phosphatase)CD45能与galectin-1结合，但并不介导它在Jurkat细胞中的凋亡。Galectin-1能与HIV-1结合，介导细菌紧密地黏附到细胞表面。T细胞地活化过程中，galectin-1的表达受Lck和Fyn激酶的调节以及涉及MEK/ERK，p38MAP激酶和p70 S6激酶的信号传导途径的调节。Galectin-1还能就道星型细胞分化并强烈地抑制星型细胞增殖，并且能增强星型细胞产生BDNF的能力，BDNF很可能是受伤后防止神经元丢失地一种新机制。在对裸鼠大脑中galectin-1的表达的研究显示其增强了肿瘤星型细胞的迁移性，也就是增强了它们的生物攻击性。在暴露于炎症因子的嗜中性白细胞中，galectin-1具有激活NAPDH氧化酶的能力。在galectin-1基因所在的11kb的区域中，包括了14个已知的SNP位点和在日本人群中发现的两个基因型变异。Galectin-1包含一个细胞生长抑制位点。该位点并不是β-半乳糖苷酶的结合位点，包括一个表面环，涉及25-30位的氨基酸残基以及将内部的β链连接起来，形成该抑制位点的一部分。

实施例1  双向电泳和质谱联用分析糖尿病人和正常人血清中的差异

表达蛋白

1、中国汉族人群2型糖尿病患者及正常对照标本的收集

本发明所用2型糖尿病组和正常组人群外周血样(10ml)主要来自北京协和医院内分泌科门诊。糖尿病病例可为散发，也可为糖尿病家系的成员(但此时每一家系中通常只有一个患者入选，同一家系中没有任何血缘关系的成员可以选择一个以上)；正常对照来自正常人群，要求其家庭三代以内没有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，对照组与患病组年龄及性别相匹配。

2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1985年颁发的标准执行。即：空腹血葡萄糖浓度≥7.8mmol/L或餐后2小时血糖≥11.1mmol/L为糖尿病。OGTT的判断标准为：服糖后2小时血葡萄糖浓度＜7.8mmol/L为正常，≥11.1mmol/L为糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之间为糖耐量低减(impaired glucose tolerance，IGT)。

入选的每个成员记录一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、身高、体重、心率、呼吸、血压等项目，调查并在必要时行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬化等疾病。除上述项目外，对糖尿病患者还记录发病年龄、既往最高体重、血脂、糖化血红蛋白及糖尿病并发症等项目，对正常对照组还测量空腹血糖并排除有糖尿病家族史者。

采集血样前确保所有成员都了解采血目的，即有知情权，并在“知情同意书”上签字。将收集的资料严格保密，不对外公布供血成员的姓名、年龄、疾病等所有资料。

2.血清样品的处理，去除血清中的白蛋白和Ig-G

将收集到的血清样品过柱，去除血清中的白蛋白和Ig-G。首先，用10mM Tris-HCl pH 7.4(血清bind buffer)溶液平衡柱料。将柱料中的溶液成分甩干后，在eppendorf管中称取0.02克的干柱料。然后，将25ul的血清以1∶3的比例，用10mM Tris-HCl pH 7.4溶液稀释，加入到盛有柱料的eppendorf管中，摇床上振荡40分钟。接着，离心收集上清。同时，用10mM Tris-HCl pH 7.4溶液平衡Protein A，离心后称取0.04克的干柱料Protein A，与上述血清混合，摇床上振荡结合40min。再次离心收集上清，即可测定蛋白浓度，准备进行后续的双向电泳。

3.血清样品进行第一向的等电聚焦(IEF)

预先将所需长度和数量的strip holder用软毛牙刷和专用洗液彻底清洗并晾干。准备泡胀液：取出1ml分装的泡胀液，在其中加入与选定strip的pH梯度相同的IPG Buffer 5ul(终浓度：0.5％)和DTT 3mg，混匀。接着，按所选择的strip长度、pH梯度范围和样品的具体情况选择上样量；按所选择的strip长度确定样品与泡胀液的总量，将上样液小心均匀滴加至strip holder中，将二者充分混匀，注意尽量不要产生气泡。然后，取出一条所需长度和pH范围的IPG strip，从酸性端(即尖端)剥离胶面的保护膜，用镊子或用手持住strip两端，慢慢放入strip holder中，并前后上下移动几次，以确保上样液在holder中分布均匀，在整个过程中要尽量避免产生气泡。放好strip后，在上面覆盖一层cover fluid，以避免上样液的蒸发和尿素析出。盖好holder上盖，将holder置于IPGphor的电极板上，借助直尺保持holder方向与电极平行，并确保holder的两个电极都与电极板接触。最后，根据strip的长度和pH范围设定IEF电泳参数，进行等电聚焦。在电泳进行中随时监测电压的情况，若电压达不到规定要求，则要适当延长电泳时间，以达到所要求的伏小时数。电泳结束后，将strip取出，进行平衡或置于塑料管内-80℃保存。

IEF电泳结束后，将strip取出，胶面朝上置于干燥滤纸上。另取一张稍稍润湿的厚滤纸，覆盖在strip上，轻按几下，吸去上面吸附的油滴。同时，取所需体积的平衡液，每10ml加入100mg DTT，使其充分溶解。将strip条放入盛有所需体积平衡液的管中，支持膜面贴管壁，在摇床中振摇15min。然后，取出strip条，用蒸馏水冲洗几次。接着，取所需体积的平衡液，每10ml加入250mg碘代乙酰胺，使其充分溶解。将strip条放入盛有所需体积平衡液的管中，支持膜面贴管壁，在摇床中振摇15min。将strip取出，胶面朝上置于干燥滤纸上，吸去支持膜上的水分，将strip侧面在滤纸上蘸一下，吸去胶面的水分。这时就可以准备进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

4.血清样品进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶的配制：将模具倾斜放置，将所需玻璃板放入其中，其余位置用挡板填充，各对玻璃板之间用塑料隔片隔开，最后再放入几片隔片以充分占据模具内的空间，盖上外盖，将螺丝拧紧。配制足够量的胶液。预备好足量的替换液。在灌胶口上插入漏斗，将胶液倒入至接近所需高度，迅速倒入替换液，使替换液没过V型槽。用移液枪在玻璃板上端加入一薄层水饱和的正丁醇。待胶聚合完全(约1小时后)，将模具拆开，小心取出玻璃板，去除粘在玻璃板外壁的凝胶，弃去上端的正丁醇，用蒸馏水冲洗多次，用滤纸吸干多余的水，即可进行电泳。

进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：将电泳槽后端的拨动开关拨至循环位置，将约10升电泳缓冲液注入电泳槽内。将玻璃板上端加满融化的封胶液，将平衡好的IPG胶条放入，使其与胶上端充分接触。待封胶液完全凝固，将玻璃板和挡板放入电泳槽中，放入时最好先将玻璃板用电泳液润滑一下。接下来设置电泳参数，一般采用恒功率电泳，即将电压与电流都设为最大，只控制功率的大小。然后合上上盖，开始电泳，一般约需5-7小时。待电泳结束后，用取胶器将玻璃板取出，小心打开玻璃板，取出凝胶，进行染色。

5.胶图的染色和分析

胶图染色-银染：小心取下电泳凝胶，固定30分钟或更长时间。固定液为40％乙醇10％冰醋酸。然后致敏30分钟，溶液为75ml乙醇，17g乙酸钠，28.2g三水乙酸钠，0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml。接着，水洗凝胶3次，每次10分钟。取0.625g AgNO₃，100ul 37％甲醛加水到终体积250ml混合均匀。在染液中进行银染20分钟。然后水洗两次，每次1分钟注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色。显色液为6.25g Na₂CO₃，50ul 37％甲醛加水到终体积250ml。显色时注意观察，根据显色的情况确定显色时间。最后，在终止液中终止反应10分钟。终止液为3.65g EDTA.Na₂.2H₂O或者1g甘氨酸加水到终体积250ml。

胶图分析：扫描胶图，根据染色的深浅和蛋白点的大小处理分析蛋白表达量的大小。比对2型糖尿病病人和正常对照组得到的蛋白点的差异，确定有表达量差异变化的蛋白点。在此，本发明人发现一个蛋白点在糖尿病人和正常人的电泳胶图中出现了表达量的显著变化，在糖尿病人血清中表达量升高，为糖尿病人血清中表达量的4倍以上。

6.胶图中差异蛋白点的质谱分析鉴定

胶内消化：小心割取有表达量差异的蛋白胶点，置于洁净Eppendorf管中，同时准备阴阳性对照。用50μl Milli-Q H₂O洗两次，每次5分钟，弃去上层清液。用银染脱色液洗两次，每次30分钟，弃去上层清液，直到颜色消失。为30mM铁氰酸钾，银染脱色液B为100mM硫代硫酸钠。将5×的银染脱色液A 50ml与5×的银染脱色液B 50ml混合后补水到500ml，混匀备用。然后，用50μl ACN脱水20分钟，使胶变成不透明；弃去上层清液，在真空浓缩离心机中干燥胶条。接下来，加入适量的含10mM DTT的25mM NH₄HCO₃，以没过胶条为准，置于56℃水浴1小时。取出胶条，使其温度缓降到室温。弃去上层液，加入适量的含55mM IAM的25mM NH₄HCO₃浸没胶条，置于黑暗处45分钟。再次弃去上层液，依次用25mMNH₄HCO3、50％ACN、ACN洗一次，每次10分钟，弃去上层液。重复这步操作一次。再接下来，在真空浓缩离心机中干燥胶条。同时，根据实验需用量，取适量的Trypsin按使用说明书溶解为Trypsin原液。再根据消化样品的数量，Trypsin原液(0.1mg/mL)按1∶40(质量比)(trypsin：蛋白量)加入，用25mM NH₄HCO₃稀释为Trypsin工作液。每管加入适量(以没过胶粒为准)Trypsin工作液，放置20分钟，使Trypsin完全渗入胶内。接着，加入25mM NH₄HCO₃10-20μl，使溶液完全浸没胶；置于37℃水浴酶解4-6小时。向管中加入3倍消化液体积67％ACN，使终浓度达到50％ACN，2.5％TFA，水浴30分钟-1小时，每10分钟振荡一次。最后，将样品在真空浓缩离心机中浓缩至5-10μl，-20℃或-80℃下保存。

MALDI-TOF质谱分析：吸取0.5ul基质溶液点在MALDI样品靶上，在其未干之前立即加入0.5ul样品或标准品到基质中。室温下使溶剂挥发至少15分钟，然后将样品靶转入质谱仪的真空室中。接着，先用超过离子化域值较多的激光强度获得初步质谱，然后降低激光强度同时调整电压等一系列参数使质谱结果优化，并用标准品校正质谱仪。重复以上操作，获取未知样品的质谱图，并进一步用质谱图中的胰酶峰(2163.05，2273.15)做内标校正质谱图。由此，根据质谱得到的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint)检索数据库的结果，本发明人确定，在双向电泳中出现的差异表达的蛋白点为galectin-1。

实施例2  应用酶联免疫吸附(ELISA)的方法在2型糖尿病病人和正常人血清中检测该蛋白的表达水平

1)血清包被  将PBS稀释(1∶1000至1∶10000)的血清加入酶标孔中100μl/孔，4℃包被过夜

2)标准蛋白包被  将PBS梯度稀释的标准蛋白加入酶标孔中100μl/孔4℃包被过夜

3)封闭  将脱脂奶粉溶于PBS配成5％的封闭液，倒掉包被液，按200μl/孔加入封闭液，37℃，2h。倒掉封闭液，如不马上使用可在超净台中吹干，用胶带封好，4℃保存。

4)将稀释好的抗apolipoprotein A-I抗体(纯化的IgG、血清、腹水等)加入酶标孔，100μl/孔，4℃过夜，或37℃，3-4h。

5)倒掉一抗，用PBST(即含0.1％Tween 20的PBS)洗孔3次，加入用PBS-T配制的HRP标记的相应二抗(按厂家推荐稀释)，37℃，1-2h。

6)PBS-T洗孔3次，加入邻苯二胺显色液，100μl/孔，37℃，30min，加2M硫酸终止反应，以酶标仪测定OD_492(490)。

7)根据标准蛋白所得到的OD值做标准曲线，计算每一血清样品的蛋白含量。

                           序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>中国人2型糖尿病新血清标志物的检测试剂盒

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>135

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Ala Cys Gly Leu Val Ala Ser Asn Leu Asn Leu Lys Pro Gly Glu

1                 5                      10                     15

Cys Leu Arg Val Arg Gly Glu Val Ala Pro Asp Ala Lys Ser Phe Val

             20                      25                      30

Leu Asn Leu Gly Lys Asp Ser Asn Asn Leu Cys Leu His Phe Asn Pro

        35                      40                    45

Arg Phe Asn Ala His Gly Asp Ala Asn Thr Ile Val Cys Asn Ser Lys

    50                     55                       60

Asp Gly Gly Ala Trp Gly Thr Glu Gln Arg Glu Ala Val Phe Pro Phe

65                               70                                75

80

Gln Pro Gly Ser Val Ala Glu Val Cys Ile Thr Phe Asp Gln Ala Asn

                  85                        90                     95

Leu Thr Val Lys Leu Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Lys Phe Pro Asn Arg

              100                    105                     110

Leu Asn Leu Glu Ala Ile Asn Tyr Met Ala Ala Asp Gly Asp Phe Lys

         115                     120                    125

Ile Lys Cys Val Ala Phe Asp

     130                     135

Claims (3)

1.一种多肽，其为具有Galectin-1的完整氨基酸序列的全长蛋白或其具有生物学活性的片段。

2.抗权利要求1的多肽的抗体，包括能识别整体分子，分子某一结构域以及某一个或几个特异的抗原决定簇的所有抗体。

3.权利要求1或2的多肽分子作为糖尿病诊断的血清标志物的用途。