CN1913918A - 用作免疫佐剂的gm1结合缺陷的外毒素 - Google Patents
用作免疫佐剂的gm1结合缺陷的外毒素 Download PDFInfo
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Abstract
向用于免疫的制剂(如免疫原或疫苗)或系统(如贴片或试剂盒)中添加细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)增强被实验者对制剂中一种或多种组分的免疫反应。然而BARE的B亚基在体内与被实验者的神经节苷脂GM1的结合介导毒性并限制天然的bARE佐剂化的应用。突变B亚基或在体外将其偶联到配体例如GM1抑制其在体内与GM1的结合,从而消除毒性但保留所需的佐剂活性。使用这样去毒的GM-1结合缺陷的外毒素为开发有效的免疫制剂提供安全的和高效的新策略。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年12月9日提交的临时U.S.专利申请No.60/527,751,2004年6月15日提交的临时U.S.专利申请No.60/579,288,和2004年9月28日提交的临时U.S.专利申请No.60/613,520的优先权,所有的申请在此以其全文引作参考。
发明领域
本发明属于免疫佐剂领域。本发明涉及一种用作毒性降低的体内免疫佐剂的制剂,包含突变B亚基和/或在体外将B亚基与其同源的受体、其结合部分或者任何其它的化学配体偶联和/或结合而修饰的细菌ADP-核糖基化外毒素,以抑制随后在体内结合到复合的神经节苷脂。
背景技术
外毒素比如,例如,霍乱菌毒素(CT),大肠杆菌热-不稳定肠道毒素(LT),白喉毒素(DT),百日咳毒素(PT),和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeniginosa)外毒素A(ETA)是增强免疫反应的细菌产物。在通过口服、肌内、含服、鼻、直肠、肺、皮内、皮下或者表皮的途径给药后,细菌外毒素可以诱导对自身以及对共同给药的抗原的局部和/或全身性免疫反应(Elson & Dertzbaugh,1994;Tomasi等,1997;Enioutina等,2000;Glenn等,2000;Scharton-Kersten等,2000)。
细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)的形式为由一个A和五个B亚基组成的A:B异二聚体(AB5)。使用其中缺失A或B亚基的外毒素的研究显示A和B亚基都具有佐剂活性(De Haan等,1998;De Haan等,1999;Lian等,2000;Scharton-Kersten等,2000),尽管不总是如完整的异二聚体一样好。已经描述了外毒素在免疫中的应用,但由于严重的毒性例如炎症和腹泻而在人体的应用受到限制(Clemens等,1988;vanGinkel等,2000;U.S.专利6,576,244)。为产生其毒性作用;B亚基结合到细胞表面上的神经节苷脂GM1,随后A亚基进入细胞。然后,肠上皮细胞中的A亚基的细胞内ADP-核糖基化活性导致液体流失和腹泻(Krueger & Barbieri,1995;Scars & Kaper,1996)。为降低毒性,描述了修饰的外毒素,其中A亚基被突变或者缺失以分别降低或者消除核糖基化活性(WO03/047619;U.S.专利6,436,407和6,576,244;De Haan等,1998;De Haan等,1999)。然而,由于剩余的核糖基化活性或者具有痕量完整的毒素污染,这些制剂可以维持毒性。或者,佐剂活性的不想要的丧失(Lycke等,1992;Tamura等,1994)。
总的看来,据信非共价与结合GM1的五聚体B亚基复合的具有核糖基化活性完整的A亚基外毒素具有最佳佐剂活性。干扰细胞结合的具有B亚基修饰的外毒素通常不被考虑作为有效的佐剂。使用容易评估副作用的口服疫苗递送途径,尝试通过使导致佐剂活性不想要的降低或改变的B亚基突变而降低毒性(Guidry等,1997;Aman等,2001)。只有在一些使用鼻内给药的研究中B亚基突变才显示佐剂活性(DeHaan等,1998;De Haan等,1999)。然而,非典型鼻粘膜环境与外毒素(或外毒素亚基)和共同给药的抗原的特异性转位到中枢神经系统引起对于不想要的毒性的关注有关,该毒性在目前可用的动物模型中难以预测(van Ginkel等,2000;Couch,2004)。
还没有通过偶联到B亚基结合配体而修饰的bARE的佐剂活性的描述。Beignon等(2001)最近报道了在体内给药用于在透皮免疫(TCI)之前,体外复合到GM1的LT是差的免疫原。基于这一观察,假定该复合物也不具有佐剂活性。此外,在B亚基中具有点突变以阻止GM1结合的的LT突变体不能引发强烈的免疫反应(Guidry等,1997)。这支持了干扰体内GM1结合对于开发疫苗的目的是有害的假设(Tomasi等,1997)。
发明简述
本发明涉及神经节苷脂结合缺陷的外毒素的应用,所述外毒素解决了降低毒性而保持佐剂活性的问题。下文将讨论其他的优点和改进,或通过此处的公开而变得显而易见。给药的方式是明确阐述的,并且不包括鼻内给药。
附图简述
图1A-B.用液体配制的LT/GM-1佐剂化(adjuvanted)的破伤风类毒素进行透皮免疫(TCI)。在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备C57B1/6小鼠。刮剃后的皮肤被胶带去皮(tape stripped)(10X),并紧在免疫之前用盐水水化皮肤。每组5只小鼠通过施用25μl体积只含有10Lf TT,混合有10μg LT的TT,或混合有与GM-1复合的LT的TT(10μg,15μg或20μg)而免疫。施加溶液1小时,随后用温水淋洗以除去过量的疫苗。所有组被免疫3次(第1,15,29日),并在第三次免疫后两周收集血清。血清抗-TT IgG(图A)和抗-LT IgG效价可以通过ELISA方法测定。各动物的抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示各组的几何平均效价。使用T检验来比较单独用TT免疫的小鼠和用LT或LT/GM-1佐剂化的疫苗免疫的小鼠之间的差别。
图2.LT,LTGly33Asp(LTG33D)和LTGM1液体配制的贴片的局部免疫和佐剂活性。在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备C57B 1/6小鼠。紧在免疫前,用盐水水化刮剃后的皮肤,并用砂纸预处理(10次)以破坏角质层。贴片由固定到粘性背衬的1cm2纱布贴片构成,并载有25μl含有10Lf破伤风类毒素(TT)的磷酸盐缓冲盐水(无LT),或混合有野生型(wt)LT(10μg),或LTGly33Asp(10和50μg)或LT-GM1(10和50μg)。贴片施用1个小时,然后除去并用水淋洗皮肤。每组9-10只小鼠用贴片在研究的第1和15日免疫,在第二次剂量后2周收集血清。通过ELISA方法测定血清抗-TT IgG效价。抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示各组的几何平均效价。使用T检验来比较接受有佐剂的TT的组和接受无佐剂的疫苗的组之间抗体效价的差别。
图3.用野生型(wt)LT和LTGly33Asp(LTG33D)佐剂化的卵清白蛋白(OVA)透皮免疫。在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备C57B1/6小鼠。紧在贴片施用前,用盐水水化刮剃后的皮肤,并用砂纸预处理(10次)以破坏角质层。贴片由固定到粘性背衬的1.0cm2纱布贴片构成。贴片载有25μl仅含有150μg OVA(无LT)的溶液或混合有25μg野生型(wt)LT,或LTGly33Asp。贴片施用过夜,然后除去并用水淋洗皮肤。所有小鼠被免疫3次剂量(第1,15和29日),在第三次剂量后2周收集血清。通过ELISA方法测定血清抗OVA抗体效价。抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示每组10只小鼠的几何平均效价。
图4A-B.LT和LTGly33Asp(LTG33D)加强局部共同给药卵清白蛋白(OVA)的细胞免疫反应。在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备C57B1/6小鼠。紧在免疫前,用盐水水化刮剃后的皮肤,并用砂纸预处理(10次)以破坏角质层。OVA(150μg)混合有磷酸盐缓冲的盐水,或混合有25μg野生型(wt)LT或LTGly33Asp,并向固定剂粘性背衬的1cm2贴片加载25μl。贴片施用过夜,并用水淋洗皮肤。3次免疫(第1,15和29日)后2周收集每组10只小鼠的淋巴结(LN)和脾,合并,并用OVA或LT在细胞培养物中重刺激淋巴细胞。通过ELISPOT分析确定被诱导产生IFN-γ(A图)和IL-4(B图)的OVA和LT淋巴细胞的数量。
图5A-B.局部递送野生型LT和LTGly33Asp(LT(G33D))和增强用破伤风类毒素疫苗肠胃外免疫的体液免疫反应。在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备C57B1/6小鼠。紧在免疫前,用盐水水化刮剃后的皮肤,并用砂纸预处理(10次)以破坏角质层。皮内注射破伤风类毒素(0.2Lf)至预处理过的皮肤内,固定到粘性背衬的1.0cm2纱布贴片载有25μl磷酸盐缓冲盐水(无佐剂)或指定剂量的野生型(wt)LT,或LT(G33D)。贴片施用过夜,然后用水淋洗皮肤。每组8-10只小鼠用贴片在研究的第1和15日免疫,并在第二次剂量后2周收集血清。通过ELISA方法测定血清抗破伤风类毒素(TT)和抗LT效价(分别见A图和B图)。抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示各组的几何平均效价。
图6A-B.局部递送野生型LT和LTGly33Asp(LT(G33D))和增强用卵清蛋白肠胃外免疫的体液免疫反应。在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备C57B1/6小鼠。紧在免疫前,用盐水水化刮剃后的皮肤,并用砂纸预处理(10次)以破坏角质层。皮内注射卵清蛋白(150μg)至预处理过的皮肤内,固定到粘性背衬的1.0cm2纱布贴片载有25μl磷酸盐缓冲盐水(无佐剂)或指定剂量的野生型(wt)LT,或LT(G33D)。贴片施用过夜,然后用水淋洗皮肤。每组5-9只小鼠用贴片在研究的第1和15日免疫,在第二次剂量后2周收集血清。通过ELISA方法测定血清抗卵清蛋白和抗LT效价(分别为A图和B图)。抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示各组的几何平均效价。
图7A-B.利用可溶性GM1神经节苷脂减轻LTArg192Gly(LTR192G)的反应原性而不影响对旁观(bystander)抗原的免疫刺激活性。A图.CS7B1/6小鼠组(N=7/组)在靠近尾基部处刮剃,并皮内注射0.5μg单独的野生型LT或LTR192G,或与可溶性GM1神经节苷脂以摩尔比1∶16复合的野生型LT或LTR192G。用卡钳在指定时间点测量注射位置硬化的直径。B图小鼠在免疫前一天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备。皮内注射单独的10Lf破伤风类毒素(TT)(的PBS溶液)或与0.5μg LTR192G混合的破伤风类毒素而免疫小鼠组。LTR192G与0.5ng,12.5ng或750ng可溶性GM1神经节苷脂复合。所有组在第1和15日免疫,在第二次剂量后1周收集血清。通过ELISA方法测定血清抗TT IgG效价。抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示每组5只小鼠的几何平均效价。
图8A-B.皮肤磨损对ID注射的破伤风类毒素的免疫反应的影响。各组小鼠在免疫前1-2天刮剃去毛。一组未被预处理且不接受贴片。紧在免疫之前,第二组用PBS水化并用砂纸预处理(10次)。两个组都通过在刮剃的区域ID注射而免疫以0.5Lf破伤风类毒素。第2组接受施加到注射位置的安慰剂贴片,在18小时后除去。通过ELISA方法测定对TT的抗体效价。抗TT效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示各组的几何平均效价(N=5/组)。A图.单次免疫后两周(研究的第14日)。B图.第二次免疫后两周(研究的第28日)。
图9A-B.皮肤磨损对肠胃外注射的破伤风类毒素的免疫反应的影响。图9A.C57131/6小鼠在免疫接种前2天通过刮剃背部尾侧表面的毛而预备免疫用C57B1/6小鼠。紧在免疫之前,刮剃过的皮肤用盐水化并用砂纸预处理(10次)以破坏角质层(第2-5组)。皮内注射0.5Lf破伤风类毒素,在注射位置施用1cm2粘性背衬上的纱布贴片。贴片载有25μl磷酸盐缓冲的盐水(安慰剂)或LT(0.1,1.0或10μg)。贴片施用过夜(约18小时)然后除去,并用水淋洗皮肤。单独的组(1)通过皮内注射而免疫以0.5Lf破伤风类毒素,没有皮肤预处理,也没有贴片。在免疫后2周收集血清,并通过ELISA方法测定对TT的抗体效价。抗体效价被报告为ELISA单位(EU),其等于在405nm处1OD单位的血清稀释度。显示每组7-8只小鼠的几何平均效价(GMT)。图9B.学生T检验被用于测定组间差异。
图10.通过用LTGly33Asp免疫产生LT毒素中和抗体。在研究的第1,22和43日以皮内注射0.5μg突变LT或局部施用25μg野生型LT而免疫CS7B1/6小鼠。第三次免疫后两周收集血清。来自未免疫的(幼稚)和免疫过的小鼠的血清被2倍系列稀释并与毒性量(5ng)的野生型LT混合。30分钟后,混合物被添加到位于96孔微量培养板中的Y1细胞(5×105细胞/ml)。细胞在37℃培养过夜。通过向培养物添加0.05ml 0.01%中性红而染色细胞2-3小时。然后用磷酸盐缓冲的盐水洗涤培养物以除去圆形未吸附的细胞。用乙酸和乙醇从残留的吸附细胞中提取染料,并用ELISA读板机在530nm读取颜色。
图11.LT的完整cDNA序列(SEQ ID NO:5)
图12.来自H10407、具有连接的信号序列的野生型(wt)氨基酸序列LT A(SEQ ID NO:6)
图13.没有连接信号序列的野生型LT A核苷酸序列(SEQ IDNO:7)
图14.没有连接信号序列的野生型LT A氨基酸序列(SEQ IDNO:8)
图15.野生型LT B核苷酸序列(SEQ ID NO:9).
图16.野生型LT B氨基酸序列(SEQ ID NO:10).
图17.LT B G33D核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。LT和CT突变体的残基位置基于没有信号序列的野生型B亚基氨基酸序列。
图18.LT B G33D氨基酸序列(SEQ ID NO:12).
图19.LT-K63突变体氨基酸序列(SEQ ID NO:13).
图20.LT-R72氨基酸序列(SEQ ID NO:14).
图21.LT-R192G氨基酸序列(SEQ ID NO:15).
图22.CT核苷酸序列(SEQ ID NO:16).
图23.CT A氨基酸序列(SEQ ID NO:17).
图24.CT B氨基酸序列(SEQ ID NO:18).
发明详述
外毒素结合到细胞上的神经节苷脂。外毒素包括至少一个在本领域通常称作“A亚基”的催化亚基和至少一个在本领域通常称作“B亚基”的结合亚基。一大类外毒素天然结合细胞上的GM-1受体。此处使用的“GM-1结合缺陷的外毒素”是指已经被修饰的外毒素,其以足够降低毒性的方式抑制或者降低GM-1结合。
GM-1结合缺陷的外毒素可以通过置换外毒素的至少一个B亚基的一个或多个氨基酸和/或通过将外毒素的至少一个B亚基偶联到有效抑制外毒素结合到GM-1的分子而产生。例如,可以使用包含通过突变B亚基和/或在体外将B亚基与其同源的受体、受体的结合部分或者任何其它的化学配体偶联和/或结合而修饰以抑制随后体内结合到复合的神经节苷脂的细菌ADP-核糖基化外毒素的制剂,用于具有降低的毒性的体内免疫佐剂。可以在GM-1结合口袋中引入一个或多个单个点突变形式的氨基酸取代。外毒素可以包括具有一个或多个突变的一个或多个亚基,具有一个或多个在体外偶联的配体或者配体的任何结合部分的一个或多个亚基,具有一个或多个结合的配体或者配体的任何结合部分的一个或多个亚基,具有一个或多个同源的受体或者受体任何的结合部分的一个或多个亚基,或者具有上述任何的组合的一个或多个亚基。合适的配体的例子包括甘露糖,免疫球蛋白,CpG,整联蛋白基序和其任何的组合。所述包含结合缺陷的外毒素的制剂可以包括一个或多个不同类型的结合缺陷的外毒素,此处予以更详细描述。另外,包含结合缺陷的外毒素的制剂还可以进一步包括至少一种非结合缺陷的外毒素的外毒素分子。
向用于免疫的制剂(例如,免疫原或者疫苗)或者系统(例如,贴片或者试剂盒)中添加细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)增强试验对象中对制剂的一个或多个组分的免疫反应。就LT和CT而论,bARE的B亚基体内结合到受试者细胞上的细胞表面受体,然而,介导A亚基的毒性和限制天然的bARB佐剂化的使用。B亚基的突变或者在体外将B亚基偶联到同源的受体或者化学配体,例如神经节苷脂GM1或者其它的神经节苷脂,α2巨球蛋白受体,低密度脂蛋白受体-相关蛋白质(LRP),或者其B亚基结合部分,抑制体内结合到某些细胞表面受体,从而消除毒性但是维持需要的佐剂活性。这些外毒素的应用为开发有效的免疫和疫苗接种以及诱导抗原特异性免疫应答的制剂提供安全和有效的新策略。
本发明的实施方案包括含有GM-1结合缺陷的外毒素产品,它们的生产,以及它们在免疫、诱导抗原特异性免疫应答以及疫苗接种中的应用。同源的受体可以是结合到外毒素的B亚基的细胞表面受体的任何部分。结合毒素的配体可以是体内阻断B亚基随后结合到神经节苷脂的任何化学结构。此外,本发明还包含具有B亚基的任何突变导致丧失或者减弱结合到内源性的GM1或者其它的神经节苷脂的外毒素的应用。本发明包含这些无毒的外毒素制剂在不同递送策略中的应用,包括皮内、肌内、皮下以及局部给药方式,并且有效用于疫苗制剂和诱导对多种抗原的免疫反应的方法。此处使用的局部给药不包括鼻或者鼻内给药。外毒素制剂包括在乳膏剂、凝胶、水凝胶、乳浊液、脂质体、喷雾干燥制剂,喷雾剂,或注射流体中的用法。干的制剂可以各种形式提供:例如,细小或者粒化粉末,均匀的薄膜,球和片剂。制剂可以溶解然后在容器内或者在平面(例如皮肤)上干燥,或者可以简单地撒布在平面上。其可以空气干燥,高温干燥,冻干或喷雾干燥,涂布或喷雾在固体基材上然后干燥,撒布在固体基材上,在真空下迅速冷冻然后缓慢干燥,或者其组合。如果制剂的活性成分是不同的分子,它们可以在溶液中混合然后干燥,或者仅以干燥的形式混合。
外毒素制剂包含在粘性贴片和其它装置或者用于局部递送的方法中(WO 99/43350,WO 00/61184和WO 02/74325)。对胃肠外递送而言,外毒素制剂包含在增压容器装置或注射器和微型针头中。本发明另外的方面从以下详细说明和权利要求以及其概括中对本领域技术人员而言将变得容易理解。
佐剂是刺激抗原特异性免疫应答的物质。抗原定义为当递呈到生物体的免疫细胞后诱导特异性免疫应答的物质。佐剂可以被选择以诱导免疫系统的特定组分(Edelman,2000),例如特异性抗体或抗体亚类反应(例如IgG1,IgG2,IgM,IgD,IgA,IgE)或T细胞反应(例如,CTL,Th1,Th2)。
佐剂被添加到抗原制剂以增强对抗原的免疫反应。制剂可以或者是抗原和佐剂的组合或者是抗原佐剂的单独制剂。例如,第一制剂可以包括至少一种GM-1结合缺陷的外毒素,而第二制剂可以包括至少一种抗原。制剂可以通过肌内、皮内、皮下、或者局部的途径施用。当抗原接触到所述免疫系统时,可以直接诱导免疫反应或者通过将加工的抗原递呈到T细胞的抗原递呈细胞(例如,巨噬细胞,朗氏细胞,其它的树状细胞,B细胞)诱导免疫反应。朗氏细胞和真皮树状细胞是皮肤中最有效的抗原递呈细胞(Udey,1997)。佐剂被认为通过例如将抗原靶向到抗原递呈细胞(APC),增加通过APC的抗原吸收和加工,增强对T细胞的递呈或者其组合而增强免疫反应(Udey,1997;Glenn等,2000)。
来自ADP核糖基化毒素家族的细菌外毒素(bAREs)是体液和细胞介导的对自身和共同给药的抗原的免疫反应有效的刺激物(Snider,1995)。BAREs的例子是霍乱毒素(CT),大肠杆菌热不稳定肠道毒素(LT),白喉毒素(DT),百日咳毒素(PT)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)外毒素A(ETA)。许多bAREs由含有细胞膜结合的B亚基和产生ADP核糖基化活性的A亚基构成。CT和LT的B亚基结合到位于哺乳动物细胞细胞表面的神经节苷脂GM1。结合到细胞表面GM1打开含水膜孔允许A亚基得以通向使其执行ADP核糖基化活性的细胞质。涉及腺苷酸环化酶系统活化的G蛋白质(Gsα)ADP核糖基化导致产生毒性的持续合成cAMP(Sears & Kaper,1996)。因此,结合到细胞表面GM1是支撑外毒素毒性机制关键的第一步骤。
GM1(Gal-β 1,3-GalNAc-β 1,4-(NeuAc-α2,3)-Gal-β 1,4-Glc-β1,1-神经酰胺)是一种遍在的细胞膜神经节苷脂。这是细胞表面上以高亲合力结合B五聚物的主要受体。GM1的寡糖部分负责结合外毒素。LT和外毒素-GM1复合物的三维晶体结构是已知的(Sixma等,1991;Merritt等,1998)。两个末端的糖:半乳糖和唾液酸对于GM1结合到外毒素有最大的贡献。LRP,α2-巨球蛋白受体-低密度脂蛋白受体-相关蛋白质是铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)的受体。如本发明中提出的,新方法将阻断或者减弱体内结合到GM1以阻止毒性而维持佐剂活性。这可以通过突变B亚基,或者将外毒素在体外与配体和/或同源的受体或者以上两者结合以阻断随后B亚基与GM1体内相互作用而完成。
树突细胞的活化是外毒素佐剂性质的关键因素(Glenn等,2000)。树状细胞在它们的细胞表面表达将它们与组织中的周围细胞区分开来的特定分子或受体。因此,用树状细胞受体的特定配体进一步修饰B亚基可以增加外毒素靶向到树状细胞。朗氏细胞在所述皮肤表达甘露糖受体,Fc受体,和植物血凝素,其在通过胞吞的抗原结合和摄取中起作用(de la Salle等,1997;Condaminet等,1998;Doug等,1999;Valladeau等,2000)。因此,通过甘露糖基化、连结到免疫球蛋白片段或连结到植物血凝素结合整联蛋白而进一步修饰B亚基将增加特异性递送到树状细胞和降低不相关旁观细胞非特异性的靶向,有助于减少毒性而维持有益的免疫活化(U.S.专利5,807,988和6,046,158)。
细菌外毒素在体外偶联到GM1通过将外毒素与GM1在盐水中室温下温育60分钟而完成。对于其它类型的底物,可以要求温育时间、pH、离子强度或温度的改变以对外毒素的结合最佳。一些底物的偶联可能需要包括化学或酶的偶联剂以促进结合作用的方法,例如用三肽GGH的Ni(II)络合物和过氧化物氧化剂氧化酪氨酸,活性Lys和Gln与特定的肽酰接头交联,葡聚糖聚醛介导的蛋白质交联,或N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)介导的通过二硫键连接的结合作用。
在体外通过突变或结合到它们的受体对应物(例如,GM1、GM1衍生物、部分GM1分子、GM2、GM3、GD2、GD3、GD1b和其它神经节苷脂)而完全或部分失活B亚基内的结合部位将显著地减少体内结合从而减弱毒性。结合分子可以是神经节苷脂、神经节苷脂的B亚基结合部分、低密度脂蛋白受体相关蛋白质(LRP)、LRP的B亚基结合部分、α巨球蛋白受体和α巨球蛋白受体B亚基结合部分中的任一种。还可能通过高亲合力化学底物例如通过聚乙二醇修饰自由氨基或通过乙酸酐烷基化游离羧基而完成结合部位的失活。制剂中可能留有痕量的全毒素,因为这可能对佐剂活性增加好处而无毒性(Tamura等,1994)。此外,无毒小量接触致敏原或LPS衍生物(例如,脂质A,CpG)可以被添加以增强佐剂活性。描述了在结合GM1的B亚基中含有突变产生完全丧失对GM1结合的外毒素(Nashar等,1996)。例如,包含单个氨基酸取代的G33D突变,即在33位残基以天冬氨酸取代甘氨酸。33位残基侧链的大小较大不起作用,因为用更大的精氨酸取代维持GM1结合(Merritt等,1997)。33位残基侧链的关键性质明显是由于对毒素和糖类皆可用的有限范围的细微重排以适应受体结合(Merritt等,1997)。一种B亚基包含103个氨基酸残基的序列。G33之外的其它残基对GM1结合是关键的,例如Tyr-12,而这些位置的突变产生无毒的、非GM1结合的突变体。本发明具体实施了导致丧失对GM1结合的任意位置的任意B亚基突变。
利用非GM1结合的突变体进行的若干研究没有显示有效的免疫调节作用,支持了假说:GM1结合对外毒素佐剂活性是关键的(Nashar等,1996;Guidry等,1997)。出乎意料,我们发现G33D突变和GM1-LT复合物维持佐剂活性。通过透皮免疫(TCI),伴随皮内、皮下和肌内免疫接种的免疫刺激贴片策略,和用抗原和佐剂通过胃肠外免疫来观察佐剂活性。出乎意料地发现佐剂活性与体内结合到GM1无关。我们预想降低对遍在表达的GM1的结合可能导致外毒素的细胞摄取降低到无毒但仍然足够诱导免疫刺激作用的水平。然而,还可能存在可替代的细胞结合和摄取机制,将外毒素靶向到具有免疫刺激能力的更离散的细胞群体,从而避免损伤旁观细胞。
大肠杆菌感染哺乳动物的机制依赖于特定的生物株系。在肠内存在许多有益的大肠杆菌(Escherichia coli)。由于与腹泻性痢疾的发生相关,鉴定了五类致痢疾的大肠杆菌:肠产毒素性大肠杆菌(ETEC),肠致病性大肠杆菌(EPEC),肠出血性大肠杆菌(EHEC),肠凝集性大肠杆菌(EAggEC),和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)。
根据特征性毒力性质,例如毒素和定居因子的加工利用和/或通过与肠上皮细胞特定类型的相互作用,对它们分类。ETEC是最常见的致痢疾大肠杆菌,并对旅行者产生最大的危险。从人培养得到的株系包括137A(CS6,LT,STa),H10407(CFA/1,LT,STa)和E24377A(C53,CS1,LT,STa)。
它们可以作为全细胞抗原来源单独或组合使用提供各种不同毒素和定居因子。需要特异性针对产肠毒素的大肠杆菌的疫苗,其产生与更常见的定居和毒力因子交叉反应并交叉保护更常见定居和毒力因子的抗体。在一些更流行的产肠毒的大肠杆菌株系中发现菌毛蛋白的C54-CFA/I家族:这个家族有六个成员,ETEC抗原,CPA/I,CS1,CS2,CS4,CS17和PCIF 0166。
ETEC的定居因子抗原(CFA)在细菌定居和粘附到肠上皮细胞的初始步骤中是重要的。在对患有痢疾的成人和儿童的流行病学研究中,CFA/I在大多数起因于ETEC的发病中发现。CFA/I以纤毛(菌毛)形式存在于细菌表面上,所述纤毛是刚性的由重复的菌毛蛋白亚基构成的直径为7nm的蛋白质纤维。CFA/I抗原促进以显著的唾液酸灵敏度对人刷状缘的耐甘露糖粘附。因此,已经假定建立针对这些蛋白质的免疫力的疫苗可以阻止粘附到宿主和防止随后产生疾病。
其他的抗原包括CS3、CS5和CS6。CFA/I、CS3和CS6可以单独出现,但罕见的例外是只发现CS1与CS3,CS2与CS3,CS4与CS6以及CS5与CS6一起出现。血清学研究显示取决于研究的地点,株系中出现这些抗原占ETEC的比例多至大约75%和少至大约25%。
开发针对ETEC疫苗的另一方法是靶向造成临床疾病原因的肠道毒素。ETEC产生两种肠道毒素,被命名为热稳定毒素(ST)或热不稳定毒素(LT)。ETEC不同株系产生一种或两种毒素。在侵染人的ETEC株系中,75%产生ST,超过50%产生LT。因为这些毒素在人体是反应原性的,一直不可能产生对这些毒素的疫苗。因此,在本说明书的上下文中,我们证实使用非反应原性的LT Gly33Asp作为疫苗来产生中和野生型LT的毒性作用的抗体是可行的。在这个研究中,小鼠被皮内注射0.5μg LTGly33Asp而免疫,单独组被局部免疫25μg野生型LT。两个组都免疫3次(第1,15和29日),并在第3次免疫后2周收集血清。通过在Y1细胞分析中抑制LT细胞毒性而测定LT中和抗体效价。如图10所示,用突变的LT免疫的小鼠具有高抗体效价,其有效中和野生型LT的细胞毒性活性。这些结果支持以下概念:非反应原性突变LT可以被给药而没有副作用,并引发产生中和毒素的高效价抗体。
制剂
液体或固体形式的制剂可以与一种或者多种佐剂和/或抗原在相同或分开的位点施用,或是同时或是以一定的频率重复施用。当抗原和外毒素配制在分开的制剂中,它们可以通过不同途径在相同或分开的位点给药。
本发明包含神经节苷脂结合缺陷的bARE佐剂化在胃肠外和局部的疫苗制剂中的应用。局部施用包括贴片递送系统。“贴片”是指包含固体基材(例如,闭合或非闭合的外科敷料)以及至少一种活性成分的产品。可以在贴片中引入液体(即,湿的贴片)。制剂的一种或者多种活性组份可以施加在基材上,引入到基材或贴片的粘合剂内,或其组合。液体制剂可以保持在储液器中或可以与储液器的内容物混合。干的贴片可以使用或可以不使用贮液器来溶解制剂。贴片的隔室或腔可用于隔离活性成分以便在给药前只有一种抗原或佐剂存于干燥形式;用这样的方式分离液体和固体允许控制至少一种干的活性成分的溶解时间和速率。相似的,所述佐剂和抗原可以是作为单独的贴片施用。
贴片可以包括控释储液器或可以使用允许逐步释放佐剂和/或抗原的控速基质或膜。贴片可以包含具有佐剂和/或抗原的单个储液器,或多储液器以分隔单独的抗原和佐剂。贴片可以包括另外的抗原使得施用贴片诱导对多抗原的免疫反应。在这种情况下,抗原可以或可以不源自于相同的来源,但是它们具有不同的化学结构以便诱导特异性针对不同抗原的免疫反应。可以同时施用多个贴片,单个贴片可以包含多个储液器。为了有效治疗,多个贴片可以以时间间隔施用或在一段时间内恒定施用,它们可以在不同时间施用,持续重叠的时期,或同时施用。在给药前至少一种佐剂和/或佐剂可以保持在干的形式。随后从储液器释放液体或将液体进入含有所述制剂的干成分的储液器将至少部分地溶解该成分。
固体(例如,纳米或微米尺寸的颗粒)也可以引入到制剂中。固体形式(例如,纳米颗粒或微颗粒)可以帮助活性成分分散或溶解;帮助携带制剂通过皮肤的表层;提供佐剂、抗原或两者对可以被抗原递呈细胞调理的基材的附着点,或其组合。制剂从作为贮藏库的板状、杆状或珠状的多孔质固体延长释放。
可以在对恰当的管理机构(例如,FDA)可接受的条件下制造用于生物制剂和疫苗的制剂。任选的,在所述制剂中可以包括组分诸如粘合剂,缓冲剂,色剂(coloring),干燥剂,稀释剂,湿润剂,防腐剂,稳定剂,其它的赋形剂,粘合剂,增塑剂,增粘剂,增稠剂,贴片材料,或其组合,即使它们是非免疫活性的。然而它们可以具有其它提高制剂功效的理想性质或特征。
提供适于给药的单剂量或单位剂量制剂。单位剂量中佐剂或抗原的数量可以是大约0.001μg到大约10mg的广泛范围。这个范围可以从大约0.1μg到大约1mg;狭窄的范围从大约5μg到大约500μg。其它合适的范围在大约1μg到大约10μg之间,大约10μg到大约50μg之间,大约50μg到大约200μg之间,和大约1mg到大约5mg之间。毒素优选的剂量为大约50μg或100μg或更少(例如,从大约1μg到大约50μg或100μg)。抗原和佐剂之间的比例可以是大约1∶1(例如,ADP核糖基化外毒素,其既是抗原也是佐剂),但是更高的比例可能适于差的抗原(例如,大约1∶10或者更小),或抗原对佐剂的更低比例也可以使用(例如,大约10∶1或更多)。本领域技术人员使用公知的方法和技术容易地测定待给药的抗原和/或佐剂的剂量。
包含佐剂和抗原或多核苷酸的制剂可以施用到人或动物对象的皮肤上,抗原被递呈给免疫细胞,诱发抗原特异性免疫应答。这可以发生在被病原体感染前、感染中和感染后。如果制剂的免疫原性足以不需要佐剂活性,可以只需要抗原或编码抗原的多核苷酸,而不需要其他的佐剂。所述制剂可以包括另外的抗原使得施用制剂引发针对多抗原(即,多价抗原)的免疫应答。在这种情况下,抗原可以或可以不源自于相同的来源,但是它们具有不同的化学结构以便诱导特异性针对不同抗原的免疫反应。抗原特异性淋巴细胞可以参与免疫应答,在由B淋巴细胞参与的情况下,抗原特异性抗体可以是免疫应答的部分。上面描述的所述制剂可以包括本领域已知的粘合剂,缓冲剂,色剂,干燥剂,稀释剂,湿润剂,防腐剂,稳定剂,其它的赋形剂,胶粘剂,增塑剂,增粘剂,增稠剂,和贴片材料。
除抗原和佐剂之外,制剂可以包括媒介物。例如,所述制剂可以包含AQUAPHOR,Freund,Ribi,或Syntex乳剂;油包水乳剂(例如,含水油膏,ISA-720),水包油乳剂(例如,含油乳剂,ISA-51,MF 59),微乳剂,无水的脂质和水包油乳剂,其它类型的乳剂;凝胶,脂肪,蜡,油,硅酮,和湿润剂(例如,甘油)。可以使用本领域技术人员公知的许多其它媒介物,并预期用于本发明的实施中。
抗原可以是溶解在缓冲液或水或有机溶剂比如醇或DMSO中,或并入到凝胶、乳剂、脂质微囊或小泡,和油膏中。合适的缓冲液包括,但是不限于,无Ca++/Mg++的磷酸盐缓冲盐水,磷酸盐缓冲盐水,正常的盐水(150mM NaCl的水),和Hepes或Tris缓冲液。可溶于中性缓冲液的抗原可以溶解在10mM乙酸中,然后用中性缓冲液例如PBS稀释到需要的体积。就只可溶在酸性pH的抗原而论,酸性pH的醋酸盐-PBS可以用作溶解在稀释乙酸之后的稀释剂。二甲亚砜和甘油可以是用于本发明合适的非水缓冲液。
疏水性抗原可以溶解在去污剂或表面活性剂中,例如含有跨膜结构域的多肽。此外,对含有脂质体的制剂而言,去污剂溶液中的抗原(例如,细胞膜提取物)可以与脂质混合,然后可以通过稀释、透析或柱层析除去去污剂而形成脂质体。某些抗原(例如,膜蛋白)本身是不必要可溶的,而是可以直接插入脂膜(例如,病毒体),插入单独病毒粒子的悬浮液或微球或热灭活细菌的悬浮液,所述抗原可以被活化抗原递呈细胞摄入(例如,调理)。抗原也可以与WO 99/43350所述的渗透增强剂混合。
制造药物制剂的方法是已知的。制剂的组分可以与药物可接受的载体或媒介物以及任选的添加剂(例如,至少一种粘合剂、缓冲液、色剂、干燥剂、稀释剂、湿润剂、防腐剂、稳定剂、其它的赋形剂、或其组合)的任何组合结合。通常参见,Ullmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry,第6版(电子版,1998);Remington′s Pharmaceutical Sciences,第22版(Gennaro,1990,Mack出版社);Pharmaceutical Dosage Forms,第2版(多种编辑,1989-1998,Marcel Dekker);和PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems(Ansel等,1994,Williams &Wilkins)。
优良制造规范(GMP)是药品行业公知的,并由政府机构(例如,FDA)管理。液体制剂可以通过将所需的制剂成分溶解在足够量的合适溶剂中而制备。通常,通过将制剂的各种组分引入到包含分散介质的媒介物中而制备分散体。为从液体制剂生产固体形式,可以在室温下或炉中蒸发溶剂。在表面吹氮气或空气流加速干燥;替代地,可以使用真空干燥或冷冻干燥。固体制型(例如,粉末,颗粒,小粒,片剂),液体制型(例如,安瓿、胶囊、小瓶中的液体)和贴片可以从制剂的至少一种活性成分或组分产生。
用于制造各种剂型和生产贴片合适的方法是已知的。还可以通过封入至少一种活性成分或组分的固体或液体形式,或使它们保持在单独的隔室或腔中而产生所述制剂。贴片可以包括含有媒介物(例如,盐溶液)的隔室,其通过压力而破裂随后溶解贴片的干燥制剂。各剂量的大小和给受试者服药的时间间隔可以用于决定容器、隔室或腔的合适大小与形状。
为有效给药到受试者(例如,动物或人),剂量内活性成分的相对量和服药时间表可以合适地调整。这种调整可以取决于受试者的具体疾病或体况,以及目的是治疗还是预防。为简化给药制剂到受试者,各单位剂量将包含用于单轮次免疫循环的预定量的活性成分。
用于实施例的方法
免疫方法
为了透皮免疫,6到8周龄的小鼠(例如,BALB/c,C57BL/6,DBA)被刮剃除毛而没有任何皮肤的损伤(例如,伤口,刺激)。所述刮剃的区域可以是背部,腹部,颈部,或腿部。在刮剃前,小鼠作耳部标记用于识别,并取血获得免疫前的血清。刮剃两天后,刮剃的皮肤通过用盐水湿润的纱布揉搓而水化。水化五分钟后,含有佐剂和抗原的制剂的免疫溶液被滴加到刮剃的皮肤上。在接触一个小时后,刮剃的区域在流动的自来水下冲洗。作为将液体滴加到皮肤上替代的方法,可以通过过夜施用含有制剂的皮肤贴片而完成抗原佐剂制剂的递送。
为了人的免疫,粘性贴片下(WO 00/61184,WO 02/74325)含有抗原-佐剂制剂的纱布垫可以与上臂水化的皮肤接触六个小时。用于人时,不需要刮剃。
此外,皮肤可以通过用胶带去皮(stripping)或用浮石、刚砂板、砂纸摩擦或其它的技术而预处理小鼠以增强递送(WO 99/43350)。对胶带去皮而言,例如胶带(3M邮寄带、Staples #8958)被牢固粘附到皮肤并迅速的撕去。该方法在不同方向被重复五到十次,每次用一条新的带子。为磨损皮肤,例如,细等级的砂纸(GE Medical Systems,#E9OO1CK)或浮石垫(Electrode Prep Pads,PDI #B59800)在轻微压力下施用到皮肤并在相同的方向擦五到十次。
QM-1结合缺陷的外毒素也可以用于肌内、皮内和皮下的给药。小体积的佐剂/抗原制剂(例如,在小鼠中25μl到100μl)被注射/插入到真皮、肌肉中或真皮下。
抗体应答
使用ELISA测定对佐剂或抗原特异性的抗体。抗原或佐剂以浓度2μg/ml溶解在PBS中,每孔50μl溶液被施加到IMMULON-2聚苯乙烯板上,并在室温下孵育过夜。然后用0.5%酪蛋白/1% Tween 20的PBS(即,封闭缓冲液)封闭一个小时。血清或其它的体液用0.5%酪蛋白/0.025% Tween 20的PBS稀释,转移到板上,孵育2小时或过夜。然后用含有0.05% Tween 20的PBS洗涤培养板,用山羊抗小鼠IgG辣根过氧化酶(HRP)连接的第二抗体在室温下温育一个小时。再一次洗涤培养板,用HRP底物温育,在405nm通过分光光度计分析显色结果。使用合适的亚类特异的试剂,通过相似的方法应用于测定抗体的特定亚类(例如,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgM,IgA)。
CTL增殖
从小鼠中分离脾和/或淋巴结,挤压组织通过尼龙筛而产生单细胞悬浮液。将细胞悬浮在组织培养基中(48.5%v/v RPMI-1640,48.5%v/vEHAA Click氏培养基,2mM谷氨酰胺,1%v/v青霉素/链霉素溶液,0.5%v/v自体的正常小鼠血清,0.1%v/v β-巯基乙醇,和0.5%v/v 1MHEPES)。细胞在CO2孵育箱在37℃与抗原培养4天,然后与1μCi[3H]-胸腺密啶核苷在50μl温育16小时到18小时。通过掺入放射性胸腺密啶核苷测量增殖。
ELISPOT
硝化纤维素垫底的微量滴定板用细胞因子特异性初级抗体的PBS在4℃包被过夜。用含有0.5%w/v BSA的PBS在37℃封闭板30分钟。用RPMI-1640和10%v/v FBS培养基洗涤板。从小鼠脾和/或淋巴结分离出的细胞悬液经系列稀释后添加到板上,向细胞添加抗原,37℃下在CO2孵育箱培养6-24小时。然后用含有0.05%v/v Tween 20的PBS洗涤培养板,随后用蒸馏水洗涤以裂解细胞。生物素标记的抗细胞因子抗体被添加到板上,接着洗涤和随后用碱性磷酸酶标记的亲和素D温育。再一次洗涤板,用底物(BCIP/NBT溶液)使斑点呈现。计算反映分泌特定细胞因子的细胞数量的斑的数量。
使用液体积累模式在体内评估毒性
用悬浮在500μl 10%w/v碳酸氢钠(NaHCO3)溶液中的外毒素佐剂口服攻击幼稚的和/或免疫的小鼠。对照动物只接受500μl10%NaHCO3。为阻止食粪性,所述小鼠被转移到具有金属网地面的笼子。在攻击以前和攻击过程中小鼠被禁食12小时。攻击六小时后,将动物称重并处死。然后解剖小肠(幽门瓣到回肠-盲肠的交界),结扎以防止液体损失并称重。通过测量与体重有关的小肠液积累而测定毒性(Yu等,2002)。
神经节苷脂结合
从动物(例如,牛)或人来源获得神经节苷脂(例如GM1,GM2等)(Svennerholm的Methods in Carbohydrate Chemistry,Vol.VI,464)。在用作佐剂以前,在体外通过将外毒素和神经节苷脂一起混和在PBS中随后在37℃温育90分钟而完成外毒素结合到神经节苷脂。结合的神经节苷脂的数量可以通过使用一定范围的外毒素对神经节苷脂的摩尔比率(即,1∶0.5到1∶500)而改变。可以通过ELISA测量外毒素对神经节苷脂的结合。神经节苷脂包被的ELISA板用2% w/v BSA和0.05%v/v Tween 20的PBS在室温封闭1个小时。用洗涤缓冲液(0.05%Tween的PBS)洗涤板,试验样品被添加到板温育过夜。然后再一次洗涤板和用抗外毒素抗体温育。再一次洗涤板,随后用山羊抗小鼠IgG HRP温育。洗涤后,添加底物,并定量结合到板的外毒素的量。
外毒素生物活性的体外分析
Y-1肾上腺细胞在补充有2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,和10% v/v FBS的HamF12培养基中生长(37℃/5%CO2)。为进行试验分析,细胞被胰蛋白酶化,以每孔2×104细胞,重铺板在96孔板上,培养另外的3-5天。然后,用含有不同浓度外毒素的培养基培育细胞6-8小时,在倒置显微镜下测定细胞的约数。
实施例
以下实施例仅仅说明此处描述的本发明的实施方案,不是打算限制或者其他方式限定其实施。
实施例1
通过用高亲合力受体拮抗剂阻断体内结合到GM1神经节苷脂受体而减弱AB5毒素的肠毒性。为评价修饰的佐剂的毒性,幼稚的BALB/c小鼠用亚致死剂量的外毒素口服攻击,测量小肠的肿胀作为毒性的量度(Yu等,2002)。通过取出和称重肠和尸体而测定肠与尸体的比例。在这个研究中,成年BALB/c小鼠被禁食过夜。紧在攻击之前,小鼠被饲喂碳酸氢钠溶液以中和胃酸。然后通过口服25μg LT或LT/GM-1复合物而攻击小鼠。在6小时后,处死动物并在取出小肠之前结扎小肠两端。称重肠和尸体,计算出肠对尸体的比例(G∶C)。表1中的结果显示每组10只小鼠的平均G∶C。未处理对照小鼠的G∶C是0.054。饲喂25μg LT的小鼠与缓冲液对照组相比G∶C(0.13)增加2.4倍。被饲喂与过量GM-1神经节苷脂(37.5μg或6.25μg)复合的25μgLT的小鼠的G∶C等于未攻击对照组(G∶C分别为0.052和0.057)。将GM1神经节苷脂减少到1.25μg,G∶C显示在水肠中的适度积累(与缓冲液处理组相比为1.6倍)(G∶C=0.085),而接受与极低剂量GM-1神经节苷脂(0.25μg)复合的25μg LT的组具有与用25μg LT但无GM-1处理的组相当的G∶C比例(0.123)。这些结果表明当使用过量摩尔比率的高亲合力受体拮抗剂时可以通过阻断B亚基上所有的五个受体结合位点而完全抑制LT的肠毒性。通过阻断少至3个受体结合结构域而实现部分减弱,而阻断1个结合部位对肠毒性没有显著的影响。因此,以前进行的相似研究显示使用非GM1结合的突变体LTGly33Asp没有肠肿胀(Guidry等,1997)。
表1.用LT或LT-GM1口服攻击小鼠
组别 | 口服攻击 | 受体拮抗剂 | LT/GM1(摩尔比) | 小肠肿胀重量(肠/尸体) |
1 | 缓冲液 | --- | --- | 0.054±0.005 |
2 | LT(25μg) | --- | --- | 0.131±0.022 |
3 | LT(25μg) | GM1(37.5μg) | 1∶83 | 0.052±0.004 |
4 | LT(25μg) | GM1(6.25μg) | 1∶14 | 0.057±0.007 |
5 | LT(25μg) | GM1(1.25μg) | 1∶2.8 | 0.085±0.014 |
6 | LT(25μg) | GM1(0.25μg) | 1∶0.6 | 0.123±0.027 |
Balb/c小鼠被单独提供或与LT和不同量的GM1混合提供500μl缓冲液(10% NaHCO3的水)。在攻击六个小时后,测量小肠相对于体重的重量。数据表示每组10只小鼠的平均值±SD。
实施例2
通过在体内用高亲合力受体拮抗剂阻断结合到GM1神经节苷脂而减弱AB5诱导的皮肤炎症。当纯LT注射入真皮或皮下组织时,其是高度反应原性的。注射的LT引起注射位点的红斑和肿胀,而这随后变得隆起和硬化并可以持续超过一个星期。因此,评价毒性的另外的方式是测量响应皮内注射LT的皮肤肿胀(形成皮肤小结)。例如,皮内注射0.5μg LT导致所有的小鼠平均直径1.24cm的皮肤小结(表2,组1)。注射0.5μg LT连同0.075μg可溶的GM1神经节苷脂在7只小鼠中的4只引发炎症反应(表2,组2),而注射0.5μg LT与0.75μg可溶的GM1在7只注射的小鼠中的6只不导致皮肤小结(表2,组3)。可溶的GM1神经节苷脂是非炎性的(组4)。
在皮内注射LT和LT/GM-1之后,进行全厚度活组织切片用于组织学检查。与大体观察一致,从注射后1-2天的小鼠获得的活体是在整个表皮、真皮和皮下组织具有扩散的多形核白细胞的水肿。在数天之内,注射部位被遍及表皮、真皮和皮下组织层的单核细胞浸润。与之相反,注射LT/GM-1的皮肤的组织学检查显示出正常的皮肤结构和缺少炎性细胞。基于总体检查和组织学检查,当ID注射时,LT/GM-1不引起显著的炎性反应。与之相反,LT注射引起持续好几天的炎性反应。总之,当B亚基的GM1结合结构域不能与高亲和力受体在体内相互作用时,LT的肠毒性和皮肤反应原性被减弱。在实施例1和2,我们使用可溶的GM1神经节苷脂作为高亲合力受体拮抗剂以占据B亚基受体结合口袋。使用这个策略,我们显示LT的炎性性质通过用GM1神经节苷脂在给药前预先吸收LT而被减轻或完全阻止。LT和类似的其它AB5外毒素的体内毒性,通过阻断体内结合到高亲合力GM1神经节苷脂受体而被减弱。用受体拮抗剂配制外毒素是有效的减弱毒性的方法。
表2.在皮内注射LT或LT-GM1后形成皮肤小结
组别 | 皮内注射(μg) | 分析值1-7皮肤小结直径(cm)小鼠个体 | 平均平均值±SD | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |||
1 | LT(0.5μg) | 1.1 | 1.3 | 1.3 | 1.0 | 1.4 | 1.25 | 1.3 | 1.24±0.13 |
2 | LT(0.5)+GM1(0.075) | 0 | 0 | 0.7 | 0 | 0.7 | 0.65 | 0.75 | 0.4±0.35 |
3 | LT(0.5)+GM1(0.75) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.95 | 0.14±0.33 |
4 | GM1(0.75) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C57B1/6小鼠接受皮内注射25μl含LT和/或GM的PBS。次日,测量皮肤的肿胀。
实施例3
通过破坏GM1神经节苷脂结合的突变减轻AB5毒素诱发的炎症。显示体内受体结合和毒性之间关系另外的方法是使用不能结合到GM1神经节苷脂受体的LT的突变体。非特异性的和位点定向突变已经被用于产生不结合到GM1神经节苷脂受体的LT的突变形式。突变的LT在B亚基的第33位具有单个残基置换,其中Gly被Asp置换。所述突变体,LTGly33Asp(LTG33D)不结合GM1神经节苷脂受体(Tsuji等,1985和Guidry等,1997)。如实施例2所述,皮内注射0.5μg野生型LT导致表现为在注射位点隆起、硬化的小结(1.04cm直径)的炎性反应。注射等量的LT-Gly33Asp或媒介物(磷酸盐缓冲的盐水,PBS)不导致在注射位置发展小结。LT-Gly33Asp的注射位点的组织学评估显示与野生型LT不同没有显著的水肿或炎症,例如红斑(表3)。如两种不同的方法所显示的,通过GM1神经节苷脂结合介导LT毒性。通过干扰体内受体结合而减弱肠毒性和皮肤反应原性。
表3.在皮内注射LT或LT-Gly33Asp后形成皮肤小结
组别 | 皮内注射 | 皮肤小结(cm) |
1 | PBS | 0 |
2 | LT(0.5μg) | 1.04±0.15 |
3 | LT-Gly33Asp(0.5μg) | 0.06±0.12 |
C57B1/6小鼠接受皮内注射单独的25μl PBS,或与LT/LT-Gly33Asp混合的PBS。次日测量肿胀的皮肤,数据显示为每组10只小鼠的平均值±SD。
实施例4
当通过皮下和肌内注射给药时,LTGly33Asp和LT/GM1缺少反应原性。进行另外的研究以调查通过其它胃肠外的途径,包括肌内(IM)和皮下(SC)使用LTGly33Asp和LT/GM复合物的潜能。在这个研究中,小鼠被皮肤下或大腿肌肉内注射0.5μg野生型LT。如同用ID注射观察的一样,SC注射野生型LT引发形成大的小结,而IM注射引起大腿肌肉肿胀。与之相反,IM和SC注射0.5μg LT-Gly 33Asp或0.5μg LT/GM1不引起明显的炎性反应体征,这不同于注射PBS媒介物对照。当通过通常用来胃肠外免疫接种的途径给药时,LT-Gly33Asp和LT/GM1不是反应原性的。
实施例5
毒素在体内结合到GM1神经节苷脂受体引起介导毒性。为进一步指出体内GM1神经节苷脂结合作为LT介导的毒性的基本机制的作用,研究GM2/GD2合成酶敲除的小鼠(Takamya等,1996)。这些小鼠不能合成包括GM1的复合的神经节苷脂,因此,缺乏高亲合力受体。在纯合敲除的小鼠皮内注射0.5μg野生型LT不导致发展皮肤小结(表4,组2),而注射同样的LT剂量到杂合的同胎小鼠产生在注射位置形成炎性小结的明显的炎性反应(表4,组1)。采集注射部位的活组织切片,通过组织学方法检查组织。来自敲除的小鼠(无GM1神经节苷脂)注射部位的组织学检查显示缺少炎性细胞或水肿。对杂合的同胎小鼠(正常表达GM1神经节苷脂)检查显示在注射野生型LT后注射部位有限的水肿和炎症。这些结果与LT的体内毒性通过结合到GM1神经节苷脂受体而介导相一致。
表4.在GM2/GD2合成酶敲除的缺乏GM1的小鼠皮内注射LT
组别 皮肤小结(cm)
1 GM2/GD2合成酶杂合子 1.2±0.1
2 GM2/GD2合成酶敲除 0.18±0.15
小鼠接受皮内注射25μl与0.5μg LT混合的PBS。次日测量肿胀的皮肤,数据显示为每组4只小鼠的平均值±SD。
实施例6
通过阻断高亲合力受体结合减弱其它的AB 5毒素的毒性。霍乱毒素(CT)是另一AB5外毒素的例子,其与LT有关。CT与LT有大约80%氨基酸同一性,全毒素由单个A亚基构成,其与五个B亚基非共价连接。GM1神经节苷脂也是CT的天然高亲合力受体。皮内或肌内注射0.5μg CT导致皮肤小结和肌肉肿胀,类似于LT。与之相反,注射CT/GM1复合物不产生炎性反应。这些结果证实破坏体内结合到GM1神经节苷脂受体是减弱AB5毒素的毒性通常有效方法。其它类型的佐剂的毒性效应可以通过在体外结合到受体分子(例如,结合Toll样受体2和4的LPS衍生物,结合TNFR家族的INF-α)而消除。
实施例7
通过毒素结合到细胞表面GM1神经节苷脂介导的细胞中毒。除体内评估之外,基于迅速的体外细胞培养的分析被用于研究AB5毒素的细胞毒性。例如,用不同量的LT或LT-Gly33Asp孵育已经培养的Y-1肾上腺细胞。外毒素结合到细胞表面显露的GM1神经节苷脂受体,被摄入细胞,刺激ADP核糖基化活性,cAMP积累和随后破坏微管稳定性,引起这些细胞集拢和从塑料基材上脱离。变圆的Y1细胞的百分比通过显微镜检验培养物而测定,并通常用作LT和CT细胞毒性的读数。LT在浓度0.8ng/ml导致70-100%的培养细胞在8小时之内变圆,而LT-Gly33Asp在直至100ng/ml的任何浓度没有观察到变圆。结果显示下表5中。总的来看,LT和CT的体内毒性和体外细胞毒性通过结合到细胞上的GM1神经节苷脂受体而介导。阻断毒素结合到该受体能减弱毒性。AB5毒素结合可以通过产生干扰受体结合的突变体和通过利用阻断B亚基中受体结合的结构域的小分子而完成。
表5.评估Y-1肾上腺细胞中的LT毒性
ng/ml 100 50 25 12.5 6.3 3.1 1.6 0.8 0.4 0.2 0.1 0.05
LT +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ + --- ---
LT-Gly33Asp --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
汇合Y-1肾上腺细胞与不同浓度的LT或LT-Gly33Asp在37℃温育6-8小时。然后在显微镜下测定变圆的细胞的百分比,+++70-100%变圆的细胞,++50-75%,+25-50%,---<25%。
实施例8
最新的研究调查在施用到皮肤上之前在体外将CT偶联到GM1对CT免疫原性的影响。然而,没有研究对共同给药的抗原的佐剂活性(Beignon等,2001)。当显示佐剂性质可以不依赖组织炎症或其它的毒性时,GM-1结合缺陷的外毒素将变得尤其有吸引力。然而,对缺乏GM1结合能力的LT突变体的若干研究也缺乏显著的免疫调控活性(Aman等,2001;Nashar等,1996)。
用液体配制的LT/GM1佐剂化的破伤风类毒素在完整的皮肤上透皮免疫(TCI)。出乎意料,我们现在表明透皮和胃肠外给药LT/GM1或LTGly33Asp对共同给药的抗原具有基本的佐剂活性,而对佐剂自身的免疫应答(即,免疫原性)被降低。例如,通过伴随着有或没有10μg LT或LT-GM1复合物直接施加破伤风类毒素(TT)到刮剃过的完整皮肤上而局部免疫C57B1/6小鼠。在45分钟后,用水清洗皮肤以除去过量疫苗和佐剂。通过相同的方法每两周给药三次剂量而免疫小鼠,在第三剂量后两周收集血清样品,分析TT特异性的抗体。单独用TT(无佐剂)免疫小鼠产生低的抗体效价(组3,几何平均182EU),而以相同数量的10μg LT或LT-GM1佐剂化的TT免疫的小鼠产生很高的抗TT抗体效价。在用LT免疫的组中几何平均效价(GMT)是179,646,在用LT-GM1佐剂化的疫苗免疫的组为57,710(表6)。这些结果证明当局部给药在完整的皮肤上时,LT和LT-GM1是同样有效的佐剂。佐剂是对共同给药的抗原TT产生显著的免疫应答所需要的。
表6.用LT或LT-GM1透皮免疫(TCI)后对破伤风类毒素(TT)的血清IgG
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂(μg) | 辅因子(μg) | 检测 | 分析值(1-10) | 几何平均值 | ||||
(ELISA单位) | ||||||||||
小鼠个体 | ||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||||
6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||||||
1 | TT(10) | LT(10) | ---- | TT IgG | 204102 | 146225 | 183724 | 323948 | 202170 | 179646 |
185486 | 85832 | 163652 | 208284 | nsa | ||||||
2 | TT(10) | LT(10) | GM1(5) | TT IgG | 75059 | 58546 | 21953 | 17492 | 343311 | 57710 |
25055 | 77573 | 109287 | Nsa | nsa | ||||||
3 | TT(10) | ---- | ---- | TT IgG | 44 | 7 | 18 | 32 | 9385 | 182 |
3072 | 15 | 2193 | 1334 | nsa |
含有单独地或与10μg LT或LT-GM1混合的10Lf单位TT的50μl PBS被施加到刮剃的水化的小鼠背部。在45分钟后,背部用温水洗涤。最后一次免疫两周后,通过ELISA测量血清抗体效价;nsa,没有可用的血清。显示的数据代表三次免疫后对破伤风类毒素的血清IgG。
实施例9
用LTGly33Asp佐剂透皮免疫。使用与实施例8描述的相同的研究设计,9-10只小鼠的组是局部免疫TT和10μg LT或非GM1神经节苷脂结合的突变体,LT-Gly33Asp。单独用TT局部免疫的小鼠产生低的抗TT IgG效价(GMT=187),而与之相反,用LT-Gly33Asp或野生型LT佐剂化的TT免疫的组产生高抗TT抗体效价(GMT分别为62,817和53,177),显示野生型和Gly33Asp LT是等效的佐剂(表7)。
表7.用LT或LT-Gly33Asp透皮免疫后对破伤风类毒素(TT)的血清IgG
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂(μg) | 检测 | 分析值(1-10) | 几何平均值 | ||||
(ELISA单位) | |||||||||
小鼠个体 | |||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |||||
1 | TT(10) | LT(10) | TT IgG | 83436 | 63293 | 50116 | 121818 | 176340 | 53177 |
114780 | 131805 | 6246 | 11745 | 31797 | |||||
2 | TT(10) | LT-Gly33Asp(10) | TT IgG | 40458 | 91175 | 87899 | 95561 | 74721 | 62817 |
40067 | 88870 | 5229 | 256217 | 86429 | |||||
3 | TT(10) | ---- | TT IgG | 87 | 67 | 886 | 28333 | 140 | 187 |
49 | 71 | 88 | 44 | nsa |
含有单独地或与10μg佐剂,LT或LT-Gly33Asp混合的10Lf单位TT的50μl PBS被施加到刮剃的水化的小鼠背部。在45分钟后,背部用温水洗涤。最后一次免疫两周后,通过ELISA测量血清抗体效价。显示的数据代表三次免疫后对破伤风类毒素的血清IgG。
实施例10
破坏角质层帮助局部递送抗原和佐剂进入皮肤。在透皮免疫中使用GM-1结合缺陷的外毒素的重要因素是皮肤预处理。以前的研究显示经由屏障被破坏的皮肤可增强免疫(Seo等,2000;U.S.专利5,464,386)。我们发现某些大分子和病毒颗粒的局部递送通过破坏外皮层(即,角质层)成功转运进入皮肤(Guebre-Xabier等,2003)而提高。例如,对小鼠水化的皮肤施加流感抗原和LT不能诱导针对流感显著的抗体应答。然而,当用砂纸预处理皮肤10下,LT/流感制剂被有效递送,产生针对流感的高效价抗体(LT/Flu在砂纸处理过的皮肤上,组2几何平均数11,172相对LT/Flu在水化过的皮肤上,组1几何平均数116)(表8)。
表8.透皮免疫(TCI)后对流感(Flu A)的血清IgG
组别 | 抗原(μg) | 佐剂(μg) | 预处理 | 检测 | 分析值1-5 | 几何平均值 | ||||
(ELISA单位) | ||||||||||
小鼠个体 | ||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||||
1 | Flu A(25) | LT(10) | 水化 | Flu A IgG | 150 | 102 | 47 | 45 | 642 | 116 |
2 | Flu A(25) | LT(10) | 砂纸 | Flu A IgG | 15498 | 3137 | 6852 | 18563 | 28151 | 11172 |
C57B1/6小鼠被局部免疫与LT混合的流感抗原。皮肤仅被水化预处理或水化+10次砂纸摩擦预处理。第3次免疫两周后收集血清样品,通过ELISA测定针对流感的血清抗体效价。
胶带去皮或通过用砂纸摩擦轻微磨损是临床使用除去角质层的安全的技术,并被我们证明对递送复合抗原是有效的。其它的增强递送的皮肤预处理方法包括使用微针,激光切除术或其它的物理和化学渗透增强技术(例如,U.S.专利3,964,482和5,879,326;WO99/43350)。皮肤预处理对外毒素的佐剂活性的增强效果可以导致降低诱导合适的免疫反应需要的剂量。
实施例11
减毒的LT/GM1是有效的佐剂,但是当利用皮肤预处理局部给药时免疫原性不佳。各种方法可用于局部施用疫苗和佐剂到皮肤上。如实施例8和9所述,通过共同给药佐剂和旁观抗原显著提高在完整皮肤上的局部免疫接种。可选择地,皮肤可以用软质磨料(砂纸或研磨垫)或胶带去皮,目的是破坏或去除角质层。角质层的作用是作为防护屏障阻止病原体和环境变应原进入身体。可以破坏角质层以提高大的蛋白质疫苗和抗原的局部递送。如实施例所述皮肤用盐水、磷酸盐缓冲盐水或甘油短暂水化,随后用研磨剂或胶带去皮处理以破坏外部屏障。最简单的方法是直接向预处理的皮肤施加含有疫苗和LT佐剂的液体溶液。这个方法的例子显示在图1。在这个研究中,在免疫前一天刮剃小鼠靠近尾基部的毛发。刮剃的皮肤被胶带去皮(10次)以除去角质层。单独地或与10μg LT或10μg LT/GM-1(10μg,15μg和20μg GM-1)混合的破伤风类毒素(10Lf)被直接施加到预处理的皮肤1个小时。充分清洗皮肤以除去过量TT和LT。用3-剂量(第1,15和29天)免疫所有组,在最后一次剂量后两周收集血清。图1A的结果显示各组对TT的血清抗体效价。单独用TT免疫的组产生相对低效价抗体(GMT=8,230)。用LT佐剂化的TT免疫的组产生抗TT IgG效价比无佐剂组的效价大34倍(GMT=282,000)。此外,用LT/GM-1减毒的佐剂和疫苗免疫的小鼠也产生与无佐剂免疫组相比显著更高(9到20倍)的抗TT IgG效价(GMT=76,000到189,000)。也检查对LT的血清抗体,结果描述在图1B。用LT局部免疫的小鼠产生针对LT的高抗体效价(GMT=196,000),而接受LT/GM-1复合物的小鼠很少或没有抗LT抗体效价(GMT=26-37)。这些结果表明减毒的LT/GM1佐剂与LT同样有效,当给药在预处理以破坏角质层的皮肤上时免疫原性不佳。
实施例12
用贴片递送的减毒的AB 5佐剂和抗原透皮免疫。局部给药抗原和佐剂的另一方法是利用贴片。图2示例了应用贴片递送以LT、LTGly33Asp或LT/GM1佐剂化的TT疫苗。在这个研究中,小鼠被刮剃并用砂纸预处理皮肤。贴片由固定到粘性背衬的1cm2纱布垫构成。纱布载有单独地或与LT(10μg),LTGly33Asp(10μg和50μg)或LT/GM1(10μg和50μg)混合的10Lf TT。这些贴片被施用1个小时,除去并清洗皮肤。所有的动物被免疫两次(第1和15日),在第二剂量后数周收集血清。图2的结果表明LT、LTGly33Asp和LT/GM1显著增强对共同给药的TT的免疫应答(p≤0.007)。在10μg剂量,LT/GM1比LT(P=0.001)或LTGly33Asp(P=0.034)的佐剂性能稍弱。当在贴片中与疫苗抗原给药时LT和LTGly33Asp是等效的佐剂(P=0.07)。
通过佐剂-抗原制剂产生的免疫反应可以包括引发抗原特异性抗体和细胞毒性的淋巴细胞(CTL)。可以通过免疫分析技术或功能性中和分析检测抗体。在体外免疫分析中,系列稀释的血清或其它体液与抗原一起孵育,其后通过用荧光染料标记检测抗原结合的抗体。在中和分析中,研究系列稀释的血清(或其它体液)阻断特定的细胞应答的潜力,例如抗原介导的信号转导,蛋白质生产,毒性,或被特定的病原体感染的感染力。特定的CTL可以在体外通过增殖和/或细胞因子分泌分析而检测。在增殖分析中,T细胞与抗原一起培养然后通过放射性胸苷的掺入测量这些细胞的增殖。细胞因子分泌分析包括用抗原刺激T细胞,随后检测细胞因子,例如干扰素-γ,白介素-2,-4,-5,-10,或-12的胞内或胞外浓度。
实施例13
用LT-Gly33Asp佐剂透皮免疫加强抗原特异性的细胞免疫反应。除抗体反应之外,一些感染通过细胞介导的免疫反应来控制。以前的报告显示LT诱导针对共同给药的抗原的细胞以及体液免疫应答的能力(Hammond等,2001;Yu等,2002;Guebre-Xabier等,2003)。我们研究了是否GM1结合缺陷的制剂也能够诱导细胞的免疫反应。例如,小鼠在背部用单独地或同LT或LTGly33Asp组合的TT局部免疫。在三轮免疫(第1,15和29日)后三周,分离各试验组的引流腹股沟淋巴结,合并,通过轻轻摩擦穿过尼龙纱布筛而转化为细胞悬液。细胞在存在或不存在TT的条件下培养过夜,通过ELISPOT检测分泌细胞因子的淋巴细胞。我们发现用LT或LTGly33Asp佐剂化的TT疫苗免疫动物产生对TT的细胞免疫反应。如下面的表9所示,从单独用TT免疫的小鼠的淋巴结回收的淋巴细胞少有生产IFNγ(13个斑/106细胞)和产生IL4(36个斑/106细胞)的淋巴细胞。与之相反,从用LT佐剂化的疫苗免疫的小鼠回收的淋巴结包含比用TT单独免疫产生多10倍的IFNγ(136个斑/106细胞)和IL4(223个斑/106细胞)的淋巴细胞。相似地,从用LTGly33Asp佐剂化的疫苗免疫的小鼠回收的淋巴结包含比无佐剂组多大约10倍的产生IFNγ(131个斑/106细胞)和IL4(281个斑/106细胞)的淋巴细胞(表9)。这些结果清楚地表明对旁观抗原的细胞免疫反应和体液抗体反应通过共同给药LT或LTGly33Asp而显著增强。此外,发现突变体LT与野生型LT同样有效,而没有野生型LT的毒性(表3)。
表9.来自TCI免疫的小鼠腹股沟引流淋巴结的破伤风类毒素(TT)特异性免疫细胞分泌IFNγ和IL 4
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂(μg) | 检测 | 分析值斑/106细胞 |
123 | TT(10)TT(10)TT(10) | LT(10)LTGly33Asp(10)---- | IFNIL4IFNIL4IFNIL4 | 1362231312811336 |
免疫三周后,收集各组的腹股沟淋巴结,合并,在有TT存在的条件下培养细胞。通过解剖显微镜对显示存在分泌IFNγ或IL4的细胞的斑点计数(ELISPOT)。显示的数据表示每106个细胞中TT特异性免疫细胞的数量。
实施例14
用不结合GM1的毒素透皮免疫增强对免疫原性不良的旁观抗原的细胞免疫应答。可以通过利用佐剂显著增强对免疫原性不良的抗原例如卵清蛋白(OVA)的免疫应答。比较通过以LT和LTGly33Asp佐剂化的OVA局部免疫引起的体液和细胞免疫反应。在这个研究中,通过刮剃和用砂纸预处理盐水水化的皮肤以破坏角质层而预备局部免疫用小鼠。由1cm2固定到粘性背衬的纱布垫构成的贴片被载有单独地或与25μg LT或LTGly33Asp混合的150μg OVA。贴片被佩戴过夜,除去并用水清洗皮肤。10只小鼠的组被免疫三个剂量(第1,15和29日),在第三次免疫两周后收集血清、腹股沟淋巴结和脾。如图3的描述,用LT和LTGly33Asp佐剂化的OVA免疫的小鼠产生比用OVA单独免疫组(GMT=229)显著更高的抗体效价(GMT分别为32,000和7,000)。ELISPOT分析被用于表征对局部免疫的细胞免疫应答。图4A和4B的结果显示当与OVA或LT培养过夜,刺激产生IFN-γ和IL-4的淋巴结(LN)和脾细胞的比例。从用OVA单独地(无佐剂)免疫的动物回收的LN缺乏对用OVA或LT再次刺激应答的细胞。与之相反,从用LT或LTGly33Asp佐剂化的OVA免疫的小鼠回收的LN通过产生IFN-γ和IL-4响应在体外用OVA或LT的再次刺激。也表征从免疫的小鼠回收的脾细胞对OVA和LT的反应。图4A显示从用OVA和无佐剂免疫的小鼠回收的脾细胞包含很少或不包含产生IFN-γ的淋巴细胞。与之相反,来自用LT或LTGly33Asp佐剂化的OVA局部免疫的小鼠的脾通过产生IFN-γ而响应再次刺激。由于高背景值,通过脾细胞产生IL-4不能下结论被中断。这些研究表明LT佐剂在产生对通过局部途径递送的免疫原性不良的抗原的免疫反应中的关键作用。非GM1神经节苷脂受体结合的LTGly33Asp的确引起可与野生型LT佐剂相比较的OVA特异性抗体和细胞免疫反应。这个例子是显著的,因为其示例了使用无反应原性突变体佐剂刺激针对免疫原性不良的疫苗的体液的和细胞的免疫反应的优点。
实施例15
非GM1神经节苷脂受体结合AB5毒素可用于胃肠外注射疫苗和抗原的佐剂。LT和CT的反应原性限制了它们在人口服、鼻或胃肠外(例如,皮下、皮内和肌内)注射的佐剂的应用。以下实施例表明非GM1神经节苷脂结合的AB5毒素当通过注射给药后可用于刺激对旁观抗原的免疫反应而没有毒性。在这个实施例中(表10),10只小鼠的组被皮内注射单独地TT(组5)或注射可溶的GM1神经节苷脂对照(组4)。以0.5μg LT,LT-Gly33Asp或LT-GM1(分别为组1,2和3)佐剂化的TT免疫单独的组。两轮免疫(第1和15日)后两周,收集血清样品并分析对TT的抗体效价。用单独地或与可溶的GM 1混合的TT免疫的小鼠产生中等的抗TT效价(GMT分别=13,010和20,019)。这与通过用LT(GMT=204,271),LTGly33Asp(GMT=112,842)或LT/GM1(GMT=146,794)佐剂化的TT免疫的小鼠产生的抗体效价相比有很高的增加(9到16倍)。对注射部位的检查显示仅仅注射野生型LT的组在注射位置发展水肿和炎症,如前所述(表2和3)。当通过肌内和皮下途径给药抗原和佐剂时,获得相似的结果。这些结果表明LTGly33Asp和LT/GM1是可与野生型LT相当的有效佐剂。然而与野生型LT不同,这些减毒的佐剂还可以通过胃肠外的注射给药而不导致局部的反应原性或全身的毒性。
表10.以LT,LT-Gly33Asp或LT-GM1皮内免疫后对破伤风类毒素(TT)的血清IgG
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂或辅因子(μg) | 检测 | 分析值(1-10)ELISA单位小鼠个体 | 几何平均值 | ||||
16 | 27 | 38 | 49 | 510 | |||||
1 | TT(0.01) | LT(0.5) | TT IgG | 122765 | 138671 | 78521 | 182431 | 378770 | 204271 |
465820 | 239767 | 153676 | 352020 | 226657 | |||||
2 | TT(0.01) | LTGly33Asp(0.5) | TT IgG | 171451 | 89280 | 94985 | 123969 | 108867 | 112842 |
91830 | 103277 | 67078 | 269941 | 99338 | |||||
3 | TT(0.01) | LT(0.5)+GM1(0.25) | TT IgG | 141182 | 86535 | 146028 | 150863 | 120443 | 146794 |
202250 | 204134 | 185446 | 120203 | 155735 | |||||
4 | TT(0.01) | GM1(0.25) | TT IgG | 12720 | 37868 | 12063 | 21612 | 28277 | 20019 |
11094 | 18919 | 16826 | 27529 | 29941 | |||||
5 | TT(0.01) | ---- | TT IgG | 2378 | 39743 | 26603 | 8307 | 13146 | 13010 |
9436 | 12522 | 15869 | 33684 | 8010 |
小鼠接受在背部皮内注射25μl含有单独地或与0.5μg佐剂LT,LT-Gly33Asp或LT-GM1混合的0.01Lf单位TT的PBS。在最后一次免疫后两周,通过ELISA方法测定血清抗体效价。显示的数据代表免疫两周后针对破伤风类毒素的血清IgG。
实施例16
非GM1神经节苷脂结合的AB5佐剂可用于刺激针对胃肠外注射的疫苗和抗原的免疫反应。LTGly33Asp用作胃肠外注射的佐剂与其他抗原一起进一步评价。例如,小鼠的组被皮内注射灭活流感疫苗,有或者没有LTGly33Asp。两轮免疫(第1和15日)后两周,收集血清样品并使用ELISA方法分析针对流感抗原的抗体。单独用流感疫苗免疫的小鼠发展低效价抗体(GMT=761),突变体LT佐剂化的疫苗免疫的小鼠发展的抗体效价(GMT=34,540)比无佐剂的高45倍(表11)。LTGly33Asp通常可以用作佐剂以刺激对旁观疫苗和抗原的免疫反应。非GM1神经节苷脂结合AB5毒素优于野生型AB5,因为这些佐剂当注射入组织后是非炎性的。
实施例17
非GM1结合的AB5毒素与通过肌内和皮下途径注射的疫苗的应用。前述的实施例显示减毒的AB5增强对皮内注射的共同给药的抗原的免疫应答。因为LTGly33Asp和LT/GM1当通过IM或SC途径注射(实施例4)时是非炎性的或反应原性的,这些佐剂也可以与通过不同途径给药的疫苗和抗原一起使用。例如,小鼠被肌内(im)注射(大腿肌肉)或皮下(sc)注射单独的TT或LTGly33Asp佐剂化的TT。两轮免疫(第1和15日)后两周,收集血清样品并分析TT特异的抗体效价。表12的结果表明IM注射小剂量(0.01Lf)TT引发针对TT的低效价(GMT=131)抗体,而以0.5μg LTGly33Asp作佐剂的疫苗引起抗体效价非常显著增加277倍(GMT=36,250)。通过SC途径免疫的小鼠,对TT的应答不佳(GMT<10),而共同给药LT-Gly33Asp与TT引起抗体效价增加6,700倍(GMT=40,154)。当通过不同的胃肠外注射途径(ID,IM和SC)给药时,LTGly33Asp是有效的佐剂。与野生型LT相反,当通过任何这些途径给药时突变体LT是非炎性的。
表11.在用LT-Gly33Asp皮内免疫后对来自炭疽芽孢杆菌(Bacillu anthracis)(rPA)的重组保护抗原或流感抗原(Flu)的血清IgG
组别 | 抗原μg) | 佐剂(μg) | 检测 | 分析值(1-5)(ELISA单位)小鼠个体 | 几何平均值 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
1 | Flu(0.1) | --- | Flu A IgG | 487 | 619 | 292 | 2585 | 1120 | 761 |
2 | Flu(0.1) | LT-Gly33Asp(0.5) | Flu A IgG | 27328 | 13324 | 74772 | 41288 | 43735 | 34540 |
小鼠接受在背部皮内注射25μl含有单独地或与0.5μg LT-Gly33Asp混合的0.1μg Flu(三价断裂病毒抗原)的PBS。在最后一次免疫后两周,通过ELISA方法测定血清抗体效价。显示的数据代表免疫两周后针对rPA或Flu A的血清IgG。
表12.在肌内或皮下用LT-Gly33Asp免疫后对破伤风类毒素(TT)的血清IgG
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂(μg) | 途径 | 检测 | 分析值(1-5)(ELISA单位)小鼠个体 | 几何平均值 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||||
1 | TT(0.01) | --- | im | TT IgG | 17 | 22 | 15 | 3086 | 2200 | 131 |
2 | TT(0.01) | LT-Gly33Asp(0.5) | im | TT IgG | 27043 | 31175 | 52400 | 39738 | 35655 | 36250 |
3 | TT(0.01) | --- | sc | TT IgG | 1 | 1 | 23 | 464 | 1 | 6 |
4 | TT(0.01) | LT-Gly33Asp(0.5) | sc | TT IgG | 43510 | 50691 | 42889 | 17876 | 61734 | 40154 |
小鼠接受肌内或皮下注射25μl含有单独地或与0.5μg LT-Gly33Asp混合的0.01LfTT的PBS。在最后一次免疫后两周,通过ELISA方法测定血清抗体效价。显示的数据代表两次免疫后针对TT的血清IgG。
实施例18
非GM1神经节苷脂霍乱菌毒素(CT)作为无毒佐剂的应用。霍乱菌毒素(CT)是AB5外毒素,其与LT有大约80%氨基酸同一性。还检查通过B亚基修饰而去毒的其它外毒素的佐剂活性。例如,通过局部或通过胃肠外注射(ID和IM)单独地或与CT或CT/GM1复合物混合的TT而免疫小鼠。两轮免疫(第1和15日)后两周,收集血清样品并分析对TT特异的抗体效价。在下面的表13中,当单独地通过ID注射(组1,GMT=116),IM注射(组4,GMT=201)或通过局部途径(组7,GMT=1,104)给药时TT引起低效价抗体。CT或CT/GM1佐剂化并ID注射的TT产生的效价比无佐剂化疫苗的效价高823到435倍(分别为组2和3)。在小鼠中CT或CT/GM1佐剂化并通过IM途径注射的TT产生的对TT的效价比无佐剂疫苗的效价高426到272倍(分别为组5和6)。CT或CT/GM1佐剂化并局部给药于小鼠的TT产生的针对TT的抗体效价比无佐剂化疫苗的效价高105到30倍(分别为组8和9)。与CT不同,当通过ID或IM注射给药时CT/GM1是非炎性的。此外,CT仅比CT/GM1活性稍多(1.6到3倍)。这些结果表明体内不结合GM1神经节苷脂受体的其它AB5毒素的制剂也可以用于刺激对旁观抗原的免疫反应而没有毒性的副作用。突变体CTGly33Asp全毒素预期具有与CT/GM1,LT/GM1,LTArg192Gly/GM1(参见实施例27)和LTGly33Asp相同的性质。
表13.用CT或CT-GM1胃肠外或局部免疫后对破伤风类毒素(TT)的血清IgG
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂(μg) | 途径 | 检测 | 分析值(1-5)(ELISA单位)小鼠个体 | 几何平均值 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||||
1 | TT(0.01) | --- | id | TT IgG | 98 | 216 | 1569 | 6 | 107 | 116 |
2 | TT(0.01) | CT(0.5) | id | TT IgG | 49754 | 228291 | 66812 | 129812 | 80294 | 95419 |
3 | TT(0.01) | CT-GM1 | id | TT IgG | 38868 | 85050 | 65498 | 50482 | 29897 | 50449 |
4 | TT(0.01) | --- | im | TT IgG | 1085 | 23955 | 12 | 150 | 7 | 201 |
5 | TT(0.01) | CT(0.5) | im | TT IgG | 71077 | 113082 | 75238 | 123721 | 61438 | 85603 |
6 | TT(0.01) | CT-GM1 | im | TT IgG | 46043 | 36864 | 45759 | 97140 | 64631 | 54653 |
7 | TT(10) | --- | TCI | TT IgG | 3722 | 2305 | 2010 | 103 | 925 | 1104 |
8 | TT(10) | CT(25) | TCI | TT IgG | 11222 | 14300 | 29533 | 63092 | 125687 | 32734 |
9 | TT(10) | CT-GM1 | TCI | TT IgG | 18690 | 7510 | 14793 | 7480 | 9791 | 10874 |
小鼠接受胃肠外(皮内,id;肌内,im)注射或局部(透皮,TCI)施用25μl含有0.01Lf单位(肠胃外)或10Lf单位(局部的)TT的PBS。对胃肠外应用而言,TT被单独地或与0.5μg CT或0.5μg CT+0.25μgGM1混合而给药。对局部施用而言,TT被单独地给药或与25μg CT或25μg CT+12.5μg GM1混合给药。在最后一次免疫后两周,通过ELISA方法测定血清抗体效价。显示的数据代表免疫两周后针对TT的血清IgG。
实施例19
无毒的非GM1神经节苷脂AB5毒素用作佐剂增强对肿瘤相关抗原的免疫反应以治疗免疫原性的癌。对开发有效的治疗性疫苗以治疗癌症很大的限制是缺乏有效的佐剂。肿瘤相关抗原(TAA)通常是不良的免疫原。为尝试提高疫苗效力,已经采用了一些策略包括使用纯化的MHC表位,体外活化以TAA脉冲的患者的树突状细胞,使用减毒的病毒载体和DNA疫苗以刺激免疫反应。除用于传染病的疫苗之外,我们也研究了LTGly33Asp作为佐剂用于治疗性癌症疫苗。为了说明这个应用,使用小鼠模型来评价癌症疫苗的效力和使用减毒的AB5佐剂的免疫策略。在这个模型中,小鼠首先被皮下接种MO5癌细胞,其被遗传修饰以表达鸡蛋白质OVA。然后用OVA免疫荷瘤小鼠。通过测量肿瘤大小和监测存活时间而测定疫苗的效力。例如,C57B1/6小鼠被皮下注射少量MO5细胞。三天后,小鼠被皮内注射单独的或以LT-Gly33Asp为佐剂的OVA而免疫。十天后进行加强免疫。一段时间后,监测小鼠皮下肿瘤的生长。肿瘤接种三周之后,在50%的非OVA免疫的小鼠(组1,表14)观察到明显的肿瘤生长(平均肿瘤直径43mm2)。用OVA单独免疫的小鼠中有40%发展可测量的肿瘤(组2,平均直径32mm2)。然而,此时在用以LTGly33Asp为佐剂的OVA免疫的小鼠中没有发现肿瘤(组3)。如表14所示,以免疫原性不良的OVA单独免疫的小鼠发展低效价抗OVA IgG(GMT=255)和在淋巴结(1个斑/106细胞)和脾(4个斑/106细胞)检测很少的抗原特异性可诱导IFNγ的淋巴细胞。这与以LTGly33Asp为佐剂的OVA免疫的组形成对比,其中在淋巴结(426个斑/106细胞)和脾(378个斑/106细胞)检测到大量抗原可诱导的产生IFNγ的淋巴细胞。结果,增强的免疫应答能够破坏表达OVA的靶细胞和抑制肿瘤生长。这些结果表明GM1结合缺陷的LT制剂在作为癌症以及传染病领域的疫苗佐剂中的益处。
表14.通过LT-Gly33Asp诱导免疫应答和肿瘤控制
组别 | 抗原(μg) | 佐剂(μg) | 荷瘤小鼠数量% | 抗原效价几何平均值(EU) | 分泌IFNγ的细胞的数量(斑/106细胞) | |
淋巴结 | 脾 | |||||
1 | --- | LT-Gly33Asp(0.5) | 50 | 5 | 1 | 1 |
2 | OVA(150) | --- | 40 | 255 | 1 | 4 |
3 | OVA(150) | LT-Gly33Asp(0.5) | 0 | 29416 | 426 | 378 |
在第0日小鼠经过透皮注射被接种105表达OVA的MO5细胞。三天后,通过皮内注射150μg卵清蛋白(OVA)和/或0.5μg LT-Gly33Asp免疫小鼠,随后每2周加强免疫。肿瘤接种三周之后测定荷瘤小鼠的数量。最后一次免疫两周后通过ELISA测量针对OVA的血清抗体效价。收集各组的腹股沟淋巴结和脾,在存在5μg/ml SIINFEKL,OVA的免疫显性肽的条件下培养。通过解剖显微镜计数表明分泌IFNγ的细胞存在的斑(ELISPOT)。
实施例20
从贴片局部递送的无毒、非GM1神经节苷脂AB5佐剂用于增强对注射的抗原的免疫反应。免疫刺激剂(IS)贴片是设计成能提高胃肠外注射的疫苗效力和功效的佐剂递送系统。IS贴片被配制为在免疫接种时简单施用在注射位置,与Band-Aid相似。LT或CT是用于配制IS贴片的活性成分。在这个应用中,LT被直接递送到位于表皮表层的皮肤树突状细胞,郎氏细胞(LCs)。临床前研究和人临床试验表明在胃肠外免疫时,皮肤LCs的LT活化显著增强对注射的抗原的抗体和细胞免疫反应。
尽管是中度和自消除的(self-resolving),当局部施用到被预处理以破坏角质层的皮肤上时,LT可以是反应原性的。进行研究来评价当局部使用LTGly33Asp以刺激对注射的抗原的免疫反应的佐剂活性。TT被用作评价这一概念的模式抗原。通过在免疫前一天刮剃背部尾侧而预备各组小鼠(N=8-10/组)。紧在免疫前,刮剃的皮肤被盐水水化并轻微地用砂纸预处理以破坏角质层。破伤风类毒素(0.2Lf)被ID注射入预处理的皮肤,并在注射位置施用载有磷酸盐缓冲盐水(媒介物对照)或10μg LT或LTGly33Asp(10μg或50μg)的1cm2纱布贴片。次日除去贴片并用水清洗皮肤。在研究第1和15日免疫小鼠,在第二次免疫后2周收集血清。图5的结果显示接受ID注射TT和安慰剂贴片的组产生中度的抗TT IgG效价(GMT=43,000)。接受ID注射TT与LT IS贴片的组具有显著更高(p≤0.00003)的抗体效价(GMT=150,000)。同样地,接受含有10μg LTGly33Asp贴片的组也产生显著更高(P≤0.00003)的对TT的抗体效价(GMT=207,000)。增加LTGly33Asp剂量到50μg不影响对TT的抗体效价(GMT=182,000)表明10μg LTGly33Asp剂量为刺激对TT的最佳免疫应答的最大有效剂量或高于最大有效剂量。
IS贴片的优点是其可用于提高免疫原性不良的抗原的免疫原性而不改变疫苗制剂或注射的疫苗的给药途径。OVA是这样的抗原的例子。为示例的目的,如图6所述预备用于免疫的小鼠。向刮剃的预处理的皮肤内皮内注射高剂量OVA(150μg)。固定到粘性背衬的1cm2纱布贴片载有PBS(安慰剂对照)或25μg LT或LTGly33Asp,被直接施加在注射部位上。次日除去贴片并清洗皮肤。5-9只小鼠的组被免疫三个剂量(第1,15和29日),第三次剂量后两周收集血清。图6的结果表明三个剂量OVA与安慰剂贴片引发低效价抗体(GMT=1,401)。在接受LTGly33Asp或LT IS-贴片的组,抗OVA效价各自被提高10倍(GMT=12,000)和37倍(GMT=51,000)。LTGly33ASP和LT引起可比较的抗LT IgG效价(GMT分别=20,000和30,000)。免疫原性不良的抗原和疫苗的效力可以通过在注射疫苗时局部应用LTGly33Asp(和LT/GM-1)被显著的提高。
通过突变、化学衍生物和受体阻断拮抗剂产生非GM1神经节苷脂结合的AB 5毒素。LT和CT全毒素(AB5毒素)和它们各自的B五聚体,EtxB和CtxB,作为高亲合力结合到细胞表面受体的结果介导对旁观抗原的免疫应答的深刻影响。两种外毒素结合到相同的受体,GM-1神经节苷脂(Spanger,1992)。通过五个B亚基与细胞表面暴露的受体相互作用介导受体结合。所述结合对于CT和CtxB(Kb=6×10-10M)和对于LT和EtxB(KD=7×10-10M)是高亲合力的。GM1是哺乳动物细胞中遍在表达的并且其由五糖部分构成,其通过神经酰胺尾部锚定在质膜中。与CT不同,LT也具有对于GD1b,脱唾液酸-GM-1,乳糖基神经酰胺和一些半乳糖蛋白质降低的亲合力(Spanger,1992综述)。广泛的科学文献讨论GM1受体结合对免疫刺激活性是必要的。这从许多的报告看来是明显的,这些报告表明当GM1神经节苷脂受体结合被干扰后丧失免疫刺激的活性(Nasher等,1996,威廉等,1997,Nasher等,1997,Nasher,2001,Bone等,2002,Truitt等,1998和Jobling和Holms,2002)。出乎意料的发现是观察到非受体结合的毒素,例如,LTGly33Asp当局部使用时是有效的佐剂并且是非反应原性的。
许多策略可用于产生AB5毒素,所述毒素不结合,或以降低的亲合力结合到细胞上的GM1神经节苷脂。以下是可用于降低亲合力或阻止受体结合的方法的例子。这些策略包括,例如,1)使用随机的和位点-特定的突变以通过置换GM1神经节苷脂结合口袋内的不同残基而置换野生型的氨基酸;2)突变以产生结合口袋之外或邻近的氨基酸替换,以导致受体口袋内不稳定的构象变化;3)通过对受体结合关键的残基引入化学修饰而阻断GM1神经节苷脂结合;4)产生阻断五糖(OS)-GM1结合部位的受体拮抗剂;和5)产生空间阻断GM1结合口袋的遗传融合蛋白(例如组氨酸n)。以下例子描述可用于产生AB5毒素变体的方法,这些变体对于GM1神经节苷脂具有降低的亲合力或无亲合力,显示出减弱的毒性,并刺激对旁观抗原的体内免疫反应。通过这些方法产生的AB5变体预计具有类似于LTGly33Asp,LT/GM1,LTArg192Gly/GM1(参见实施例27)和CT/GM1的特征。
实施例21
受体口袋突变。已经测定LT和CT的晶体结构。对LT和CT结合口袋的高分辨率分析显示它们是相同的[13,34]。起作用的氨基酸除残基13之外是保守的,在CT中残基13是组氨酸,而在LT中可以是组氨酸或精氨酸。CTB五聚体和受体复合物的三维图像已经解释成乳糖(Sixman等,1992),半乳糖(Merritt等,1994),D-半乳糖吡喃糖基β-D-硫代-半乳糖吡喃糖苷和间位-硝基苯基-D-半乳糖吡喃糖苷(Merritt等,1997)。这些研究鉴定了CT和LT中12个以上残基,这些残基直接与GM1神经节苷脂的OS-GM1互相作用。这些研究表明OS-GM1在通过Glu11,Tyr12,His13(或Arg13),Asn14,Glu51,Gln56,His57,Gln61,Trp88,Asn90和Lys91形成的口袋内结合。随机和位点定向突变已经用于鉴定口袋内对结合关键的那些残基。使用这个方法,各残基可以系统的用不同的氨基酸置换,使用GM1 ELISA方法测定变化对毒素与GM1神经节苷脂或OS-GM1结合的影响(De Haun等,1996)。
这个方法已经被用于鉴定对结合非关键的以及对结合关键的残基。例如,在51位用Lys置换Glu(Glu51Lys)或用Asp置换Lys 91(Lys91Asp)以与野生型CtxB相同的亲合力结合OS-GM1表明位置51和91对受体结合不是非常关键的。与之相反,用Asp置换Tyr12(Tyr12Asp)完全破坏B五聚体与其受体的相互作用(Jobling和Holms,2002)。位点定向突变也被用于通过制造与结合结构域邻接的氨基酸保守性置换而使结合口袋不稳定。例如,用Asp置换95位Ala(Ala95Asp)只轻微降低结合受体的结合亲合力。因此,结构-功能方法可用于产生其它突变的LT和CT(例如,Tyr12Asp),它们不识别细胞表面上的GM1神经节苷脂。这些突变体预计具有与LTGly33Asp和LT/GM1相同的生物学性质。此外,可使用相同的方法产生对GM1受体具有降低的亲合力的其它突变体(例如,Ala95Asp)。这种突变体预期与野生型毒素相比具有佐剂活性和显示出降低的毒性图。
实施例22
突变的毒素在体外具有高亲合力OS-GM1结合但是缺乏细胞上的GM1神经节苷脂受体的结合。尽管GM1 ELISA是鉴定干扰GM1神经节苷脂或OS-GM1结合的替换的快速方法,这个筛选方法不总是预测完整细胞表面上对受体的稳定结合。因此,还应该评价突变体或变体毒素对已知敏感于毒素的哺乳动物细胞系表面上GM1神经节苷脂的结合。例子是B亚基上57位用Ala置换His(His57Ala)。如通过ELISA方法所确定,这个CT突变体显示出对于OS GM1的高亲合力;然而,当施用至极化的人T84细胞时,其是完全失活的(Rodighiero等,2001)。在这种情况下,His57Ala置换使结合口袋不稳定,从而在生理温度(37℃)下这个突变的毒素具有对于GM1神经节苷脂的低亲合力,不能交联细胞表面受体。结果,His57Ala毒素不诱导内体形成,并因此不诱导突变的毒素转运到高尔基体和内质网,其中A亚基前酶被活化。结构分析显示His57与OS-GM1的末端半乳糖形成弱的离子相互作用。用Ala置换His 57足以导致口袋内Glu51和口袋外Ile58取向的移位,导致与受体的复合物不稳定(Rodighiero等,2001)。因此,变体毒素例如CT-His 57Ala被预期显示出很少或没有体外和体内毒性,而维持免疫刺激活性。
因此,包含在这些说明书中的是添加的必要条件,即突变的或修饰的AB5毒素使用生理条件也被评价受体结合。应该使用活细胞(例如,Y1,Caco2,CHO和HT29)测试突变的或修饰的AB5毒素对于GM1神经节苷脂结合以建立结合。使用ELISA评估方法显示对于GM1神经节苷脂的高或降低的亲合力的突变毒素可能不结合到培养细胞上或体内天然的受体。
突变的或化学修饰的毒素结合到GM1神经节苷脂受体的能力可以随不同给药途径而不同。例如,在降低的pH下显示对受体结合不佳或没有结合的突变的毒素在口服或局部给药时可以没有毒性,其中局部的pH是酸性的。与之相反,如果通过胃肠外注射或鼻给药毒素,其中局部pH是中性的,毒性可能是明显的。因此,使得毒素不能与天然的高亲合力受体在生理条件下形成复合物的替换或其它的修饰被预期在体内具有降低的毒性或没有毒性,并且是免疫刺激性的。出于这些原因,当通过不同途径给药时,使结合口袋不稳定的替换可以显示出不同的毒性。为公开本发明的目的,预期氨基酸替换例如B亚基His57Ala。此外,为给药佐剂以阻止或避免结合到高亲合力GM1受体从而避免局部的或全身性的毒性而不影响免疫刺激活性之目的,我们预期选择的给药途径是特别选定的。
实施例23
OS-GM1受体结合结构域外部的毒素突变。也可以通过引入结合口袋外部的突变而破坏受体结合。Gly33是OS-GM1结合口袋外部的氨基酸的例子,其对受体结合是必要的。在带负电荷的或疏水性的33位氨基酸置换(Glu、Asp、Ile、Val和Leu)显著地降低OS-GM1的亲合力,其中带正电荷的置换(Ala、Lys、Arg)不是使配体结合去稳定化的。尽管Gly33在结合口袋的外部,口袋内部关键残基的取向可以稍微移出位置。例如,Tyr12的精确位置对于与OS-GM1的唾液酸接触和对于形成唾液酸和氨基酸Glu11和His13之间的氢键是重要的。因此在位置33的氨基酸置换通过损害由Tyr12获得的稳定性影响GM1神经节苷脂结合。因此,本说明书包含带有B亚基位置33带负电荷的或疏水性置换的突变的AB5毒素,包括例如Gly33Glu,Gly33Ile,Gly33Val和Gly33Leu。具有这些置换的突变体毒素预计具有降低的体外和体内毒性,并且当与旁观抗原体内共同给药显示出免疫刺激活性。不是所有结合口袋外部的氨基酸置换影响结合到细胞表面GM1神经节苷脂。例如,用Gln置换Glu36(Glu36Gln)或用Lys置换Glu51(Glu51Lys)不影响毒素-受体结合亲合力(Jobling和Holmes,2002)。
实施例24
通过化学修饰使LT和CT去除毒性。产生不与天然受体复合的LT和CT的另一方法是化学修饰对结合关键的氨基酸。有很多方式修饰氨基酸侧链以影响静电荷和疏水性。例如,B亚基结合口袋在位置88包含单个色氨酸残基(Trp88),其对受体结合是关键的。Trp88可以通过De Wolf等(1981)描述的方法被修饰。用2-硝基苯基亚磺酰氯或2,4-二硝基苯基亚磺酰氯(NPS)修饰Trp88已经显示完全阻止NPS修饰的毒素结合到被引入脂质体或表达在质膜上的GM1神经节苷脂。当用硝基苯基亚磺酰基(NPS)化的毒素处理红细胞或甲状腺膜时,正如由腺苷酸环化酶活性所判断,控制化学反应,以使得只修饰各B亚基的Trp88(每个全毒素有5NPS部分)而不导致修饰A亚基的Trp残基。此外,与天然的CT不同,NPS-CT显示当注射入兔皮肤内时不引起炎性反应(De Wolf等,1981)。还可以通过甲酰化选择性修饰Trp88。用HCl饱和的甲酸处理毒素导致Trp88甲酰化,而不引起对结合口袋内其它氨基酸的修饰。甲酰化的Trp88毒素已经显示缺乏与GM1神经节苷脂的结合(Ludwig等,1985)。因此,选择性化学修饰与毒素结合到高亲合力GM1神经节苷脂受体有关的残基是产生具有类似于LTGly33Asp和LT/GM1生物学性质的去毒性的肠道毒素的有效方式。
通过位置91的Lys,使OS-GM1部分在结合口袋内稳定。带正电荷的Lys91与OS-GM1的唾液酸形成两个离子键。Lys91可以通过将LT或CT与柠康酐在0.2M硼酸盐缓冲液(pH 8)中反应而化学修饰。用乙酸酐酰化或用琥珀酸酐琥珀酰化将中和或使Lys 91带负电荷(Tsuji等,1985)。在各情况下,影响Lys 91净电荷的修饰干扰毒素结合到带负电荷的唾液酸并将阻止OS-GM1部分进入受体口袋(Ludwig等,1985)。因此,对LT或CT的化学修饰导致与GM1神经节苷脂形成稳定复合物被预期显示出毒性完全的或部分的降低,尽管免疫刺激性质被预期类似与未修饰的毒素。
两个半-半胱氨酸在氨基酸位置9和86是保守的。这些残基在各B亚基形成单个链内二硫键。形成二硫键对B五聚体和AB5全毒素组装和对受体结合是关键的。可以通过8M尿素在pH 8.1处使毒素变性和用还原剂诸如二硫苏糖醇(100mol/mol Cys)还原Cys9和Cys86二硫键而破坏二硫键。通过用过量的碘乙酰胺(比二硫苏糖醇过量2.5摩尔/升)而阻止二硫键的重新形成。然后通过逐步减少尿素(4M,2M,1M和0.5M)随后交换到0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)而使还原的毒素复性。通过这个方法处理的LT或CT不与高亲合力受体结合(Ludwig等,1985)。这个方法可以用于产生不与天然受体结合的EtxB和CtxB。
实施例25
毒素受体拮抗剂。超显微结构分析,定点突变和化学修饰提供了对AB5毒素OS-GM1结合口袋的了解。使用这个信息,可使用组合化学开发起受体拮抗剂作用的小分子。在这个应用中,目标是设计对于B亚基内的受体结合口袋具有高亲合力的小分子。基于OS-GM1如何适应结合口袋的结构分析提供设计小分子有价值的信息,其以高亲合力适应进入口袋并从而阻断毒素在体内结合到GM1神经节苷脂受体,与可溶性GM1被用于干涉LT或CT结合到细胞的方式完全相同。使用半乳糖、乳糖或Gal-β1,3-GalNAc-β1,4-(NeuAc-α2,3)-Gal-β1,4-Glc-β1(OS-GM1)作为设计的结构骨架,新的化合物可以使用组合化学合成,或者,可以“采摘(cherry picked)”现有的化学库以选择具有预测适应受体结合口袋的结构特征的化合物。例如,评价现有的化学库,并选择具有类似于半乳糖、乳糖或OS-GM1的核心结构的那些化合物。在初轮筛选中包含具有需要的核心结构但是具有不同R-基团的物质。Available Chemicals Directory(Molecular Design Ltd.,San Leandro,CA)是库的例子,其可用于鉴定用于筛选的化合物(Minke等,1999a)。替代地,化学接头可以被加到半乳糖、乳糖或OS-GM1核心结构上。为简化合成,不同类的侧基被共价偶联到各骨架结构,从这些骨架结构合成新的化合物家族。Gal-βNHCO-(CH2)n-R和Gal-α-O-(CH2)2-NHCO-(CH2)n-R是可以共价偶联到半乳糖核心结构的接头的例子(Minke等,1999b)。
无论化学库如何产生,需要迅速的筛选方法以鉴定先导化合物。GM1 ELISA是筛选数百或数千化合物的理想分析方法。该方法主要如方法部分所述。简单的说,96孔微量滴定板被OS-GM1,GM1神经节苷脂或GD1b(0.2μg到1μg)的0.5M碳酸氢盐缓冲液在4℃包被过夜。用100μl具有0.1%BSA和0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PTB)封闭孔。LT或CT(0.2μg/ml)被系列稀释(0.5mM到5mM)的测试化合物在室温下预温育1-2小时。测试样品(100μl)在室温下被添加到孔中作用30分钟,并通过洗涤板而除去未结合的毒素。最佳稀释度(通常1∶1,000到1∶5,000)兔抗-LT或CT IgG被添加到孔作用1小时,洗涤板以除去未结合的抗体。用PTB缓冲液稀释的辣根过氧化酶结合的抗兔IgG被添加到孔内(100μl),在添加底物(O-间苯二胺的柠檬酸缓冲液)以前充分洗涤孔。在室温下放置30分钟以呈色,在450nm用ELISA读板机测定OD。鉴定被发现阻断毒素结合到OS-GM1,GM1神经节苷脂或GD 1b的化合物,并选择用于另外的评估。这个方法被用于鉴定对于B亚基的OS-GM1口袋具有一些亲合力的化合物类型。受体拮抗剂进一步在基于细胞的分析中鉴定毒性。例如,使用Y1,Caco2或CHO细胞评价作为LT或CT细胞毒性拮抗剂的先导化合物(Cheng等,2000,Giannelli等,1997和Sixma等,1992)。选择那些被发现在体外阻止细胞毒性的化合物,使用一种或者多种动物模型,对其作为毒素拮抗剂进行评估。这样的筛选模型包括,例如,专利小鼠模型(Cheng等,2000和Dickenson和Clements,1995),兔回肠环模型(Giannelli等,1997)和鼠科皮肤炎症模型(表2,3)。对于体内试验,在给药前LT或CT与假定的拮抗剂以不同摩尔比混合。对于专利小鼠模型通过强饲法,对于兔模型通过注射入回肠环,或对于鼠科模型通过皮肤注射而给药混合物。肠毒素或皮肤反应原性的量与纯LT或CT相比以测定拮抗剂对毒性的影响。
使用这个方法,已经鉴定出亲合力比半乳糖提高(100倍)的化合物,尽管这些化合物的结合比OS-GM1少50,000倍(Minke等,1999a)。通过多轮筛选和合成,鉴定先导化合物。发现具有受体拮抗剂潜力的化合物包括例如,m-硝基苯基α-半乳糖苷,p-氨基苯基-半乳糖苷和melibionic acid。对先导化合物进行进一步修饰以产生新的具有更大的受体亲合力,改进的药物学性质和降低的体内毒性的化合物家族。此外,合乎需要的是选择不导致对蛋白质的分子修饰(例如,氧化或脱酰胺基作用)的R-基团,所述R-基团会影响毒素或疫苗抗原的免疫刺激活性和保质期。因此,可以使用常规的组合化学产生新的高亲合力受体拮抗剂。
使用GM1神经节苷脂或OS-GM1作为高亲合力受体拮抗剂的例子,我们已经表明LT和CT的毒性被减弱而不影响免疫刺激活性。相似地,可以使用配制为与其它的小分子拮抗剂的复合物的毒素,并预期具有与用GM1神经节苷脂或OS-GM1预吸附的毒素相同的体内性质。尽管化合物例如m-硝基苯基α-半乳糖苷(IC50=0.6-0.7mM),p-氨基苯基-α-半乳糖苷(IC50=4.8-12mM)和melibionic acid(IC50=5-11mM)的亲合力比D-半乳糖和乳糖(IC50=45-60mM)高100倍,但亲合力需要被基本上改进以成为体内有效的拮抗剂。结合亲合力范围10-5M到10-10M的化合物对于这个应用是合乎需要的。亲合力等于或大于GM1神经节苷脂(10-8M到10-10M)的化合物对于这个应用是最优选的。
毒素与拮抗剂的摩尔比取决于拮抗剂的结合亲合力并可以被预定的给药途径影响。作为最低要求,毒素将通过与拮抗剂以比例混合而配制,其中1,2,3,4或5个B亚基被一个拮抗剂分子占位。利用很高亲合力的拮抗剂,1到4个结合口袋的占位被预期使细胞上的受体结合部分地不稳定(表1和图7)。如我们在表1中描述的,LT与GM1神经节苷脂比例1∶3足够导致鼠科模型中肠毒性部分降低。这样的毒素/拮抗剂制剂被预期与纯毒素相比显示出降低的毒性或无毒性。以这些摩尔比,毒素被预期显示出对于细胞表面上GM1神经节苷脂受体降低的亲合力,和显示出对例如培养的Y1细胞降低的细胞毒性,或无细胞毒性(表5)。因为结合口袋的占位在溶液中或当给药到身体后是动态的,相对于AB5毒素具有过量的拮抗剂是更合乎需要的。例如,高亲合力拮抗剂(Kd=6-7×10-9M到1×10-10M),例如可溶的OS-GM1或GM1神经节苷脂与全毒素以摩尔比1∶15到1∶30(毒素对拮抗剂)组合。这个比例被发现足够降低LT体内毒性和免疫原性,而不干扰对旁观抗原的免疫反应的增强(图1和7)。增加摩尔比到1∶30完全消除体内毒性和降低毒素免疫原性,而不影响毒素的佐剂活性。对结合口袋具有高亲合力的拮抗剂而言,理想摩尔比是1∶30。对B亚基受体结合口袋具有低亲合力(即,6.0×10-2M到6.0×10-4M)的拮抗剂而言,拮抗剂将需要超过毒素1-5×104倍。
为制剂的目的,LT或CT以已经测定为去毒最佳的而不影响免疫刺激活性的摩尔比混合。因为LT和CT在冷藏温度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中是稳定的,毒素可以与拮抗剂一起配制并存储在2-8℃。替代地,LT或CT可以与拮抗剂混合并在药物制剂中冻干或冷冻干燥。为了使用,干粉可以在盐水或无菌水中复溶。
解毒的佐剂与疫苗的配制取决于疫苗与佐剂/拮抗剂制剂的稳定性和相容性。佐剂/拮抗剂可以与疫苗预先混合并提供为佐剂化的疫苗。替代地,佐剂可以单独提供在小瓶或注射器中,并在肌内、皮下或皮内注射或局部给药之前立即与疫苗混合(表14)。用于胃肠外注射,毒素/拮抗剂可以以0.5μg到500μg蛋白质的剂量范围给药。胃肠外免疫接种的理想剂量范围是0.5μg到150μg。注射优选的剂量范围是0.5μg到50μg。对于局部皮肤递送,用于递送野生型LT或CT的相同制剂还可以被用于配制毒素/拮抗剂和疫苗抗原。
体内拮抗LT结合到GM1的另一方法是通过添加过量B亚基到制剂中。B亚基本身是无毒的而且被认为是不良的佐剂。过量B亚基将与完整的全毒素体内竞争结合到GM1,减少全毒素与GM1受体的相互作用。这种制剂被预期是毒性较低的,但是具有与LTGly33Asp或LT-GM1复合物相似的免疫刺激能力。
实施例26
使用亲脂的毒素拮抗剂提高CT和LT佐剂的体内递送。渗透增强剂是一类促进共同给药的物质经生物膜递送和渗透的化合物。渗透增强剂包括,例如,表面活性剂,胆酸盐,脂肪酸,亚砜,多元醇和一元醇。渗透增强剂通常被用于提高小分子药物的透皮递送。AB5毒素拮抗剂可以设计成帮助AB5佐剂与渗透增强剂配制。毒素拮抗剂的设计利用GM1神经节苷脂受体的结构,其中细胞表面暴露的OS-GM1通过神经酰胺(Gal-β-1,3-GalNAc-β1,4-(NeuAcα-2,3)-Galβ-1,4-Glc-β1-神经酰胺)被锚定在亲脂的质膜中。神经酰胺是由stericacid和神经鞘氨醇构成的甘油二酯。例如,含有由单糖(例如,半乳糖),二糖(例如,乳糖),五糖(例如,OS-GM1)或其它的寡糖构成的核心结构的半乳糖被共价偶联到甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯以产生半乳糖苷拮抗剂。合成的半乳糖苷然后与渗透增强剂例如表面活性剂(例如,月桂酸钠,Tween 80或聚山梨酸酯),胆酸盐(例如,脱氧胆酸钠或甘胆酸盐),脂肪酸(例如,油酸,甘油酯或辛酸),多元醇(例如,丙二醇,聚乙二醇,甘油或丙二醇),醇(例如,乙醇或异丙醇)或脂质体一起配制。CT或LT被添加到注入半乳糖苷的渗透增强剂,毒素允许结合到脂质体或微团表面上暴露的糖部分。替代地,可以使用有效的摩尔比将CT或LT与合成的半乳糖苷混合(表1和实施例25)。对于高亲合力拮抗剂,毒素和半乳糖苷在室温或冷藏温度被充分混合1小时。对于低亲合力拮抗剂,毒素和半乳糖苷在室温或冷藏温度混合12-24小时。然后毒素/半乳糖苷复合物与渗透增强剂组合。因为当受体结合口袋被占位后,CT和LT毒性减弱,配制的毒素/拮抗剂/渗透增强剂与旁观疫苗或抗原在给药以前混合。此外,通过将毒素/拮抗剂与渗透增强剂配制以促进佐剂和旁观抗原递送入表皮,LT或CT局部递送的效率可以显著提高。
非受体结合的突变体和化学修饰的LT和CT用于进一步减弱A亚基毒素。通过A亚基片段的酶活性介导细胞中毒。毒素通过B五聚体结合到宿主细胞GM1神经节苷脂受体。CT和LT被内吞到细胞内的内体小泡并以完整的全毒素逆向转运到高尔基体。A亚基(240个氨基酸)在转运入ER前从B五聚体分离。ER内单个二硫键(Cys187-Cys199)被还原,就LT而论,Arg192和Met195之间的酶切活化酶原并释放A1(残基1-192)和A2(193-240)多肽(O′Neal等,2004)。A1被转运到细胞液,在那里它与ADP-核糖基化因子(ARF)相互作用。A1结构域具有球状结构并包含酶催化部位,所述酶修饰质膜上的Gsα,引起细胞内cAMP积累、前列腺素产生和小肠液积累。突变是用于确定A亚基中催化结构域和鉴定A1多肽内对细胞中毒负责的残基的主要方法。在本发明上下文的范围内,我们预想开发减毒的毒素佐剂,其将一种或者多种A1多肽突变与对GM1神经节苷脂受体具有降低的亲合力或无亲合力的B五聚体组合。所述组合导致更高度减毒的非反应原性的佐剂。
实施例27
进一步减毒耐蛋白酶活化的LT毒素。LT毒素的体内毒性通过细胞内活化A酶原而介导。活化需要酶切割和单个二硫键的还原。A亚基内胰蛋白酶敏感的切割位点(187-CGNSSRTITGDTC-199环)(SEQ IDNO:1)已经通过用Gly置换192位置的Arg(Arg192Gly)使得LT抗体外胰蛋白酶活化(Dickenson和Clements,1995)。可以使用定点突变用Gly置换A亚基192位置的Arg残基来部分弱化LT毒性以产生LTArg192Gly(国际专利申请WO 96/06627)。该置换使得LT酶原抵抗由胰蛋白酶消化的活化。在短期Y1细胞培养物中,当口服给药到小鼠时,突变的LT不刺激ADP-核糖基转移酶和cAMP积累并缺乏肠毒性(Cheng等,2000)。然而这个突变体保留粘膜佐剂性质(Hagiwar等,2001)。尽管LT-Arg192Gly肠毒性已经被减弱,这个突变体引起兔回肠环模型的液体积累,并且当用Y1细胞培养延长期(>8小时)其是细胞毒性的(Giannelli等,1997)。此外,皮内注射0.5μg LT-Arg192Gly或等量野生型LT是同样炎性的并且产生持续大于2周的硬结(图7A)。与之相反,当LT-Arg192Gly或LT用可溶的GM-1神经节苷脂(1∶16摩尔比)在注射以前预吸收,完全消除毒素诱发的炎症。这些结果表明AB5毒素的A亚基内的突变只部分地减弱体内毒性。LT-Arg192Gly突变体可以变得完全无反应原性并且适于用作注射佐剂,只要GM1神经节苷脂受体结合被体内阻止。此外,LT-Arg192Gly毒性的完全弱化不影响其佐剂性质,因为与用非佐剂化的TT免疫相比,共同给药LT-Arg192Gly/GM1与破伤风类毒素(TT)引起抗TT IgG效价增加27倍(图7B)。LT-Arg192Gly/GM1效力与非减毒的野生型LT相当。因此,部分减毒的AB5毒素的毒性可以通过阻断体内结合到高亲合力GM1神经节苷脂受体而进一步减弱。在这个例子中,我们显示可溶的GM1神经节苷脂可以用作高亲合力受体拮抗剂,其有效阻断野生型或部分减毒的AB5毒素体内识别GM1神经节苷脂。
进一步减弱A亚基突变的毒素例如LTArg192Gly毒性的另一方法,是产生双突变的毒素。例如,定点突变可用于产生具有A亚基置换Arg192Gly结合B亚基置换Gly33Asp的双突变的LT或CT,以产生高度减毒的双突变体。如图7所示,组合了抵抗酶的活化和阻断高亲合力受体结合的AB5毒素具有优于单个A亚基置换的安全谱,而不损害免疫刺激活性。LT-Arg192Gly/Gly33Asp是新的组成。可以使用相同的策略产生高度减毒的CT佐剂。
还可以使用替代的方法进一步降低酶抗性突变体诸如LTArg192Gly的毒性。构造以抗酶原活化的突变的毒素还可以使用实施例24描述的方法在受体结合口袋内化学修饰以阻止GM1神经节苷脂受体结合。进一步减弱LTArg192Gly和相似的突变体的另一方法是用高亲合力拮抗剂阻断受体结合口袋,如图7和实施例25所述。OS-GM1,p-氨基苯基α半乳糖苷和其它合成半乳糖苷是这种拮抗剂的例子。
实施例28
具有氨基酸置换的亚基突变体被设计为阻止ADP核糖基转移酶的活性。突变已经被广泛用于产生具有在体外降低的ADP核糖基转移酶活性或无ADP核糖基转移酶活性的LT和CT变体。Catalyase活性存在于球状的A1多肽。很多报告描述不同氨基酸置换对催化活性和体外及体内毒性的影响。通常,定点突变被用来产生A1多肽内不同位置上的氨基酸置换。ADP核糖基化活性通常通过测量Caco2细胞的cAMP积累或Y1,CHO或HT29细胞的形态变化来测定(Spangler综述,1992)。通常通过对成年BALB/c小鼠喂1-250μg毒素,数小时后收获肠并测定积累的水重量和计算肠对尸体比例而测定肠毒性(Cheng等,2000)。替代地,突变型和野生型毒素的肠毒性可以通过注射到分离的兔回肠和液体积累而测定(Giannelli等,1997)。作为例子,在LT的A亚基的位置63用Lys置换Ser(Ser63Lys)导致ADP核糖基化活性和肠毒性的完全丧失(Giannelli等,1997和Stevens等,1999)。用Arg置换LT Ala 72(LT-Ala 72Arg)(Neidleman等,2000)或用Ser置换CT的Pro106(CT-Pro106Ser)显示出Y1细胞分析中ADP核糖基化活性的降低,以及根据兔回肠环模型的积水判断,各突变体具有与野生型毒素相比降低的毒性。然而当通过鼻或口服途径给药,这些突变的毒素增强对共同给药的旁观抗原(例如,OVA,KLH和百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis))的免疫反应(Pizza等,2001)。通常,更高剂量的这些A1突变体全毒素是获得与野生型毒素相同水平的佐剂活性所需要的。因为这些突变的毒素通常具有残余水平的毒性,获得与野生型相同的佐剂反应通常需要更高剂量,许多A1突变体毒素在它们适合作为人和其它动物的佐剂使用以前将需要进一步减毒。
已经对A1多肽作出大量其它的氨基酸置换,A1多肽影响LT的catalyase活性。一些例子包括用Lys置换Glu112(Glu112Lys),用Phe置换Ser61(Ser61Phe),用Gly置换Ala 69(Ala69Gly)或用Arg置换His44(His44Arg)都缺乏ADP核糖基转移酶活性或具有降低的活性,并显示出对培养的Y1降低的细胞毒性(Cheng等,2000)。在专利小鼠模型中,Ala69Gly突变体显示出与野生型LT相比肠毒性降低50%,而Glu112Gly和Ser61Phe突变体不引起攻击的小鼠肠中液体积累(Cheng等,2000和Verniej等,1998)。与野生型LT相比,His44Arg突变的LT在Y1细胞分析中和在回肠环模型中毒性较低(Hagiwar等,2001,Douce等,1998和Douce等,1999)。尽管这些突变体的细胞毒性和肠毒性被部分减弱,当与破伤风类毒素鼻部给药时它们保持有些佐剂活性(Cheng等,2000)。
已经在LT的A1亚基的催化部位内部和附近位置进行其它的置换。Val53Asp和Arg7Lys位于催化部位内,而Val97Lys和Tyr104Lys是与催化部位相邻或在其外侧的置换。在体外,发现所有这些突变体组装成LT全毒素,对Y1细胞无毒性,并缺乏ADP核糖基转移酶活性(Stevens等,1999)。这些突变体包括A亚基的位置72用Arg置换Ala(LT-Ala72Arg),在A亚基的位置50用Gly或Phe置换Thr50(LT-Thr50Gly和Thr50Pro)和在A亚基的位置53用Gly或Pro置换Val 53(Val53Gly)和(Val53Pro)(Neidlernan等,2000和Verweij等,1998)。具有一个或多个A亚基催化部位突变的Gly33Asp B亚基的组合被预期进一步降低或消除体外和体内毒性。相似地,使用上面描述的方法破坏GM1神经节苷脂结合将导致高度减毒的毒素,该毒素可以安全地作为免疫刺激剂给药到人和其它动物。
概括地说,我们预期许多具有影响ADP核糖基转移酶活性的置换的AB5毒素将需要进一步减毒。通过构建在A1多肽的催化结构域内具有一个或多个置换的毒素而产生新的高度减毒的佐剂,所述A1多肽降低或消除ADP核糖基化活性以及干扰GM1神经节苷脂结合的一个或多个B亚基置换。可以容易地在LT或CT A和B基因内使用定点突变产生多个置换以引入DNA碱基改变,所述碱基改变将导致影响ADP核糖基转移酶活性和干扰B亚基的受体结合袋的一种或者多种突变体的表达。双突变毒素被预计当在高剂量使用时具有很少毒性或没有毒性,仍然对共同给药的抗原刺激抗体和细胞的免疫应答。影响A1多肽catalyase活性的氨基酸置换结合B亚基置换Gly33Asp各自是高度减毒的AB5佐剂并代表新的组成。这些组成包括例如,LT-Ser63Lys/Gly33Asp,LT-Ala72Arg/Gly33Asp,LT-Glu112Lys/Gly33Asp,LT-Ser61Phe/Gly33Asp,LT-Ala69Gly/Gly33Asp,LT-Ser61Phe/Gly33Asp,Ala69Gly/Gly33Asp,LT-His44Arg/Gly33Asp,LT-Val53Asp/Gly33Asp,LT-Arg7Lys/Gly33Asp,LT-Val97LysIGly33Asp,LT-Tyr104LysIGly33Asp,LT-Thr50Gly/Gly33Asp,LT-Val53Gly/Gly33Asp和CT-Pro106Ser/Gly33Asp。替代地,还可能通过对GM1神经节苷脂结合所需要的必需氨基酸进行化学修饰(实施例24)以阻断GM1受体结合或将这些突变毒素与受体拮抗剂复合以干扰体内受体结合(实施例25)从而进一步减弱ADP核糖基化活性缺陷的毒素的毒性。
实施例29
通过AB5毒素融合蛋白而减毒。可用于部分地或完全地减弱CT和LT毒性的另一方法是将肽融合到A亚基的N末端。Sanchez等(2002)显示从通过遗传方法融合到A亚基N末端的产肠毒性的大肠杆菌表达具有热稳定的肠毒素(STa)的CT全毒素是可行的。构建由APRPGP-(6聚体),(SEQ ID NO:2)ASRCAELCCNPACPAP-(16聚体)(SEQ ID NO:3)和ANSSNYCCELCCNPACTGCYPGP(23聚体)(SEQ ID NO:4)组成的CTA融合体并且其显示与B五聚体组装形成全毒素。融合的全毒素显示除肠毒性外具有CT活性,与野生型CT相比,在6-聚体融合CT中毒性被降低10倍,在16-聚体融合CT中被降低100倍,在23-聚体融合CT中被降低1000倍。降低的毒性归于CTA中ADP核糖基化活性部位的位阻影响。此外,当CT融合体与旁观抗原共同鼻部给药时,其显示维持免疫增强活性(Sanchez等,2002)。
一种相似的策略是将聚组氨酸融合到LT A亚基的N末端以产生LTA(His10)(DeHann等,1999)。尽管在本研究中不产生全毒素,融合蛋白显示在体外具有与野生型LT相比降低的ADP核糖基化活性。当鼻部给药时,LTA(His10)不能引起血清或粘膜抗体,然而增强对共同给药的抗原的免疫应答(流感株B/Harbin/7/94)。根据Sanchez等(2002)的报道和LTA(His10)具有体内佐剂活性和毒性降低的证明,极有可能还可以产生LT全毒素融合蛋白。阻断或破坏CT和LT融合蛋白与GM1神经节苷脂受体形成复合物的能力极可能进一步减弱这类佐剂的体内毒性。
实施例30
通过物理的、机械的或化学的破坏活化皮肤的免疫细胞。尽管局部使用佐剂是刺激皮肤树状细胞活化和增强对局部给药或注射的抗原的免疫应答的有效和高效的方法,树状细胞还可以通过其它的方法完成,包括物理破坏表皮的角质层和表层。尽管在控制的皮肤创伤情况下,皮肤损伤对用于随后朗氏细胞活化是不明显的,然而皮肤损伤可以用于增强对递送到皮肤的抗原的免疫应答。因此,作为这些说明书的一部分,我们包括机械的、物理的和化学的方法用于非特异性活化皮肤中的免疫细胞以促进对递送到皮肤的胃肠外注射或局部给药的疫苗抗原或抗原的免疫应答。更具体地说,刺激的目的是导致定居在表皮的朗氏细胞活化,定居在真皮的树突状细胞活化或树突状细胞从血液招募进入已处理的皮肤中。可以通过,例如增加共刺激抗原的表达(例如,MHC II类,CD80和CD86),抗原endopinocytosis,树突细胞的形态变化和从皮肤迁移到组织引流淋巴结而评价免疫细胞活化。最终,活化性刺激的效力是增强对给药的抗原的免疫应答。
以下是物理的、机械的或化学的刺激如何可以施加到皮肤以增强对疫苗抗原的免疫应答的例子。用于例证的目的,软质磨料被用于紧在疫苗给药之前破坏角质层。通常,活化刺激可以在抗原给药1-2小时前后施加。理想的是,活化刺激与疫苗同时给药。就注射的疫苗而言,当直接施加在皮内,皮下的或肌肉注射的位置之上或邻近的位置时活化刺激是最有效的。靶向相同的引流淋巴结以破坏皮肤和递送抗原使得这些发生在相同的引流淋巴结区域可以具有特定的优点。就局部给药的疫苗而言,紧在施加疫苗到皮肤之前或与之同时用刺激物预处理皮肤。
通过用研磨垫轻微破坏角质层而改进对注射的抗原的免疫应答。图8的结果说明轻微研磨垫(砂纸)作为活化免疫部位之上皮肤树突状细胞的方法的应用。在这个例子中,在免疫前1-2天刮剃小鼠背侧尾部表面。紧在免疫之前,通过用细粒砂纸轻微摩擦刮剃过的皮肤(10次)而预处理一半的小鼠,紧接着皮内注射0.5Lf破伤风类毒素(TT)至磨损的皮肤。在注射部位施加安慰剂贴片过夜。剩余的小鼠被皮内注射免疫0.5LfTT而不处理皮肤。免疫两周后,收集血清通过ELISA方法测定对TT的抗体效价。如图8A所示,用一个剂量疫苗免疫而不磨损皮肤的动物产生相对低效价的抗TT抗体(GMT=6,000)。与之相反,用研磨垫预处理的动物产生显著更高(p=0.005)的抗TT抗体效价(GMT=38,900)。相似的,第二个剂量之后(图8B)用砂纸预处理的小鼠产生与不用研磨垫预处理的组(GMT=42,000)相比显著更高(p=0.002)的抗TT效价(GMT=266,000)。这些结果表明对注射的疫苗的免疫应答可以通过轻微磨损注射部位的皮肤以活化皮肤树突状细胞而显著的提高。这个技术可用于增强对初次剂量疫苗的免疫应答以及加强免疫的疫苗的免疫应答。当通过皮下和肌内途径给药疫苗时,获得相同的效果。
通过对用活化刺激预处理的皮肤局部给药佐剂而增强对胃肠外注射的抗原的免疫应答。提高对注射的抗原的免疫应答的另一方法是将物理破坏角质层与局部给药佐剂组合。为说明这个例子,小鼠的组在免疫前两天被刮剃。紧在免疫之前,用砂纸预处理刮剃的皮肤(10次)以破坏角质层。单独的组不接受皮肤预处理。然后7-8只小鼠的组通过在预处理的皮肤皮内注射0.5Lf TT而免疫。固定到粘性背衬的1.0cm2纱布垫载有磷酸盐缓冲盐水(无LT佐剂)或增加量的LT(0.1μg,1.0μg和10μg)。次日除去贴片并用水清洗皮肤。免疫两周之后收集血样,并通过ELISA方法测定对TT的血清抗体效价。图9的结果显示皮内注射TT免疫而无皮肤预处理或佐剂的组产生相对低效价的TT抗体(GMT=5,300)。与之相反,用研磨垫(无佐剂)处理的组产生显著更高的(p=0.047)抗TT效价(GMT=15,500),再一次显示对皮肤的轻微损伤足以增强对注射的疫苗的免疫应答。通过对用研磨垫预处理的皮肤局部施用LT佐剂而进一步提高抗TT效价。如图9所示,通过局部施用1或10μg LT到预处理的皮肤,抗TT效价被显著提高(p小于或等于0.012)。这些结果表明胃肠外注射位置上的活化刺激(轻微磨损)组合局部施用佐剂(例如LT)显著增强对注射的疫苗的免疫应答。当疫苗通过皮下或肌内途径给药时获得相同的效果。
皮肤外层的轻微破坏增强对局部给药的抗原的免疫应答。表15的结果说明在产生对局部给药的疫苗的免疫应答后用研磨剂破坏角质层的效果。在这个例子中,在免疫前1-2天刮剃小鼠背部尾侧的毛发。紧在局部免疫之前,刮剃的皮肤被水化和用砂纸轻微预处理以破坏角质层。然后含有10Lf TT带有和没有LT佐剂的50μl PBS被施加到皮肤作用1小时,其后用温自来水清洗皮肤。10只小鼠的组被免疫两次(研究的第1和15日),通过ELISA方法测定血清抗TT IgG效价。从检查表15可以显见,局部单独免疫TT而不使用皮肤研磨剂的组具有很差的免疫应答(GMT=39)。与之相反,用研磨垫预处理和接受TT的组产生针对TT的高抗体效价(GMT=40,725)。此外,局部免疫LT佐剂化的TT的组产生更高的抗TT抗体效价(GMT=193,986)。这些结果清楚的表明通过紧在局部给药疫苗之前破坏角质层而显著提高对局部给药的抗原的免疫应答。在这个例子中,免疫应答的提高部分是由于角质层的破坏和疫苗递送到树突状细胞的改善,部分是由于通过磨损引起的树突状细胞非特异性活化。如这个例子显示的,组合皮肤预处理及共同给药佐剂和抗原是刺激对旁观抗原的免疫应答高度有效的方法。
表15.带有皮肤磨擦和没有皮肤磨擦的透皮免疫(TCI)之后对破伤风类毒素(TT)的血清IgG
组别 | 抗原(Lf) | 佐剂(μg) | 预处理 | 检测 | 分析值(1-10)ELISA单位小鼠个体 | 几何平均值 | ||||
16 | 27 | 38 | 49 | 510 | ||||||
1 | TT(10) | --- | 水化 | TT IgG | 21 | 27 | 13 | 1119 | 119 | 39 |
46 | 17 | 43 | 7 | nsa | ||||||
2 | TT(10) | --- | 砂纸 | TT IgG | 38607 | 5484 | 19316 | 73699 | 27961 | 40725 |
66563 | 91558 | 87180 | 45328 | 61830 | ||||||
3 | TT(10) | LT(10) | 砂纸 | TT IgG | 188314 | 222731 | 178753 | 88333 | 192934 | 193986 |
201494 | 169482 | 379919 | 73992 | 615173 |
C57B1/6小鼠被局部免疫单独的破伤风类毒素素(TT)或与LT混合的TT。只用水化或水化+10下砂纸处理来预处理皮肤。第二次免疫两周之后,收集血清样品,通过ELISA测定针对TT的血清抗体效价。
当局部给药时,可以在给药制剂之前、与之同时或在其后处理皮肤。以下的一种或者多种方式可被用于这种处理:研磨剂;微型擦皮器;包含显微投影(microprojection)的装置;胶带去皮(tape stripping);化学去皮剂(peel);产生微通道、微孔或两者的装置;微针阵列;高频超声;热烧蚀(thermal ablation)或激光切除(laser ablation)。许多装置和方法可用于制备用于免疫的皮肤。目的是进行破坏或穿透表皮的角质层和/或最外层的最小侵入性处理。如这些例子中所述,研磨剂可用于擦亮(buff)注射部位的皮肤或在局部给药疫苗以前擦亮皮肤。可以使用常见的医疗器械制备用于电极的皮肤。这种装置的例子包括砂纸(GE Medical Systems),ECG Prep Pads(Marquette Medical Systems)和电极Prep Pads(professional Disposables,Inc.)。类似于使用研磨垫,还可以使用微型擦皮器以紧在免疫之前处理皮肤。实际上,微型擦皮器推动氧化铝或氯化钠晶体,所述晶体摩擦皮肤并通过除去皮肤的角质层和表层而产生浅表的损伤。其它的装置比如OnVax(BecktonDickinson)也可以用于这个应用中。这些装置设计有安装在手持涂药器上的直至400个显微投影/cm2,所述涂药器在皮肤上杷动。显微投影长度为200到300μm并产生透过角质层的槽纹。由破坏角质层和穿透表皮引起损伤足以导致损伤和非特异性活化处理区域的树突细胞。通常用于除去角质层的其他技术是通过用胶带去皮。D-squame带子(CuDerm公司)通常被用于这个应用,尽管其它的带子也可以使用。还有可能引起皮肤更深层创伤的装置将具有相似的佐剂效果。
化学去皮是用于治疗光老化的技术。不同试剂可用于除去皮肤的外层。例如,通常使用的是α羟酸,三氯乙酸(TCA)和酚。在促进对局部给药的疫苗的免疫应答的情况下,需要注意使化学试剂和疫苗佐剂之间的相互作用最小化。实际上,化学试剂将被用于皮肤一定时间,并在应用疫苗和佐剂之前洗去。在肠胃外注射的疫苗的情况下,可以注射疫苗,随后应用化学试剂。
设计成能帮助经皮递送小分子药物的装置也可以用于产生对皮肤的轻微损伤。这种装置被设计成能产生透过角质层和进入真皮的微通道或微孔,其中小分子量药物被递送到微容器。在皮肤免疫的情况下,这些装置可用于通过破坏角质层和穿透表皮而产生损伤。已经发展了数项技术可用于在该例子的情况下在皮肤的不同层(角质层,表皮和真皮)导致轻微损伤提供对朗氏细胞和真皮树突状细胞的活化刺激。已经开发了许多用于在皮肤内产生微通道或微孔的装置。这些装置的差别在于用于产生穿透的方法。例如,微针阵列被设计成在小区域(cm2)具有数百或数千的微针。通过轴长度控制穿透深度(25μm到>400μm)。
还可以通过利用高频超声和热能和光产生浅表的损伤。聚焦超声可用于导致对皮肤机械的和热的破坏。在1-2W/cm2超声被用来导致透过角质层的最小穿透作用,而大于或等于3W/cm2的超声导致渗透进表皮。可以通过时间控制损伤的量。此外,可以通过激光切除术或通过热烧蚀汽化角质层。不考虑用于诱导对皮肤损伤的方法,常见的目的是诱导对皮肤外层浅表的损伤,所述损伤导致定居在皮肤中的免疫细胞的刺激。随着对皮肤损伤加大,还可能来自血液的树突状细胞被补充损伤的组织中。在这种情况下,血液树突状细胞还可以起到增强对给药的疫苗的免疫应答的作用。
实施例31
通过抗原和佐剂在皮肤中浅表放置控制剂量和反应原性。在皮肤的表皮和真皮层浓缩皮肤树突状细胞。在皮肤免疫的情况下,皮肤预处理的目的有两点:1)提供定居在这些皮肤浅表层的免疫细胞获得抗原和佐剂;和2)通过对皮肤的轻微损伤或通过递送免疫刺激性的佐剂而刺激树状细胞活化和成熟。因此,提供在表皮准确地获得疫苗和佐剂的预处理方法和装置是降低产生最大的免疫应答所需要的疫苗和佐剂的剂量最有效的方式。浅表递送的第二个优点是降低或消除由疫苗和佐剂引起的反应原性。在人当中,角质层的深度可以随个体变化并可以在不同的解剖学部位而不同。然而,5μm到约20μm的范围是在文献中通常报道的。表皮为大约100μm到150μm,真皮为1,000到4,000μm。导致角质层和表皮破坏深度大约5μm到大约150μm,例如深度40μm到大约60μm的皮肤处理方法有效地递送大分子量抗原和佐剂到皮肤的免疫细胞。因此,汽化角质层的激光和热装置可用于递送疫苗到裸露的表皮表面(5-20μm)。在皮肤产生微通道和微孔的超声,热细丝和微针装置可用于递送疫苗和佐剂到表皮中。在这种情况下,目的是限制深度穿透到真皮而不进入表皮。穿透深度25μm到100μm是合乎表皮递送需要的。在一些情况下,需要将抗原和佐剂递送到定居在皮肤真皮层的树突状细胞。在这种情况下,需要产生深度为1000到4000μm的微通道和微孔。超声,热细丝和微针装置适于产生这个深度的穿透。
总之,存在许多产生皮肤穿透或用于除去皮肤不同层的技术。如这里公开的,这些不同的方法和装置还可以随皮肤免疫的应用而修改。与处理技术或使用的装置无关,主要的目的是递送抗原和佐剂到表皮和真皮的免疫细胞,以刺激对给药的的免疫应答。
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上述所有引用的参考文献,文章,书籍,专利,科学论文和发表的专利申请是本领域技术人员水平的标志,在此处以它们整体引入参考。
落在本发明权利要求的含义和它们的法定等同物范围的所有修饰和置换将被包括在它们的范围之内。因此此处公开的单个元素所有可能的组合和变换被视为本发明的一部分。根据以上所述,对本领域人员显而易见的是本发明可以以其它特定的形式实现而不背离其精神或基本特征。
Claims (24)
1.一种在有需要的受试者中诱导对一种或多种抗原的抗原特异性免疫应答的方法,包括给药含有至少一种GM-1结合缺陷的外毒素的第一制剂和含有至少一种抗原的第二制剂,其量足以诱导所述受试者的所述抗原特异性免疫应答,其中所述给药选自皮内、肌内、皮下和局部给药。
2.权利要求1的方法,其中所述第一制剂通过皮内、肌内或皮下给药,以及第二制剂通过局部给药。
3.权利要求1的方法,其中两种制剂均通过皮内、肌内或皮下给药。
4.权利要求1的方法,其中两种制剂均通过局部给药。
5.权利要求4的方法,其中第一制剂给药的部位与第二制剂给药的部位分开。
6.一种在有需要的受试者中诱导对一种或多种抗原的抗原特异性免疫应答的方法,包括给药含有至少一种GM-1结合缺陷的外毒素和至少一种抗原的制剂,其量足以诱导所述受试者的所述抗原特异性免疫应答,其中所述给药选自皮内、肌内、皮下和局部给药。
7.权利要求6的方法,其中所述至少一种抗原是ETEC抗原。
8.一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法,包括给药至少一种GM-1结合缺陷的外毒素,其量足以诱导所述受试者的所述免疫应答,其中所述给药选自皮内、肌内、皮下和局部给药。
9.权利要求6或8的方法,其中给药是局部给药。
10.权利要求1,6或8之一的方法,其中所述给药是局部给药,且所述方法还包括在所述给药之前,给药同时或给药之后处理皮肤。
11.权利要求10的方法,其中所述处理包括用以下的一种或多种方式进行处理:研磨剂;微型擦皮器;包含显微投影的装置;胶带去皮;化学去皮;产生微通道、微孔或两者的装置;微针阵列;高频超声;热烧蚀或激光切除。
12.权利要求11的方法,其中所述处理破坏大约5μm到大约150μm的角质层。
13.权利要求12的方法,其中所述处理破坏大约40μm到大约60μm的角质层。
14.权利要求1,6或8之一的方法,其中所述GM-1结合缺陷的外毒素通过置换外毒素的至少一个B亚基中的一个或多个氨基酸和/或将外毒素的至少一个B亚基偶联到有效抑制与GM-1结合的分子而产生。
15.权利要求14的方法,其中置换包括在GM-1结合口袋中至少一个点突变。
16.权利要求15的方法,其中GM-1结合缺陷的外毒素是修饰的细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)。
17.权利要求16的方法,其中所述GM-1结合缺陷的外毒素是LTG33D。
18.权利要求14的方法,其中分子选自神经节苷脂,神经节苷脂的B亚基结合部分,低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP),LRP的B亚基结合部分,α巨球蛋白受体,和α巨球蛋白受体的B亚基结合部分。
19.权利要求18的方法,其中所述神经节苷脂选自GM1,GM1突变体,部分GM1分子,GM2,GM3,GD2,GD3和GD1b。
20.权利要求18的方法,其中所述神经节苷脂包括唾液酸和半乳糖残基。
21.权利要求14的方法,其中所述分子是选自甘露糖、免疫球蛋白、CpG、整合素基序和它们任意组合的配体。
22.权利要求18或21的方法,其中GM-1结合缺陷的外毒素是修饰的细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)。
23.一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法,包括给药细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE),其量足以诱导所述受试者的所述免疫应答,其中所述给药是皮内和/或局部给药,并且其中所述给药包括破坏深度为大约5μm到大约150μm的角质层。
24.权利要求23的方法,其中所述给药破坏深度为大约40μm到大约60μm的角质层。
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