CN1891823B - 具有特定单核苷酸多态性的cetp基因及其检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因及其检测方法，该基因的核苷酸序列与在GenBank中序列号(GeneID)是1071的CETP基因相比，-971G/A多态性位点的等位基因为G。本发明还涉及体外筛查冠心病相关基因的方法。本发明还涉及体外检测待测样品中是否存在本发明的冠心病相关基因的易感位点的方法及体外预测待测个体冠心病危险性的方法。本发明最后涉及检测具有启动子区域特定单核苷酸多态性的CETP基因的试剂盒。

Description

具有特定单核苷酸多态性的CETP基因及其检测方法和用途

技术领域

本发明涉及具有特定单核苷酸多态性的基因及其检测方法和用途，更特别地，本发明涉及一种启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因，及其检测方法和用途。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病，简称冠心病(CHD)，是由于动脉粥样硬化造成的冠状动脉管腔狭窄，使冠状动脉供血不足并导致心肌缺血，从而引起各种临床症状。冠心病是一类严重危害人们健康、影响人们生活质量的疾病。在世界范围内是最常见致死、致残的病因并引起医疗费用的过高增长，上述现象在老龄社会更为严重。根据2002年美国心脏协会公布的数字，1999年美国死于冠心病的人数为53万，每死亡5人中，就有1人死于冠心病。在我国，冠心病年发病率在10/10万-110/10万；年龄在40-74岁的人群心肌梗死粗年发病率：124.7/10万；死亡率：58.4/10万。尽管我国冠心病发病率和死亡率低于多数发达国家，但上升速度很快，患者和死亡的绝对人数巨大。疾病监测和死因统计显示，今后20年在我国冠心病死亡率和发病率仍将呈上升趋势。预计到2020年，冠心病仍是世界范围内威胁人类健康的首要疾病，这必将成为社会一笔巨大的开支。医学界对冠心病的基础及临床进行了大量研究工作，尤其对其危险因素的研究与干预更是当前临床研究者关注的焦点。

疾病的发生发展不是孤立存在的，而是多因素协同作用所致。CHD是一种复杂的多基因病，是遗传因素与环境因素共同作用的结果。虽然冠心病的病因迄今尚未阐明，然而家族和遗传因素在冠心病的发生中起着至关重要的作用。可以推测，不良的生活习惯及环境因素首先促使具有冠心病遗传易感性的人群发病。因此，对CHD遗传基础的研究将在疾病危险预测、高危人群筛查及个体化医疗等方面发挥重要意义。但因CHD确切发病机制目前尚不清楚，以及存在着遗传异质性、种族差异、节俭基因型等因素，客观上限制了其易感基因的研究进展。目前常用的多基因遗传病遗传分析方法有：连锁分析和关联研究等。连锁分析是通过鉴定致病基因在后代的血缘一致性(IBD)来获得有关家系成员间致病等位基因共享信息，优势在于不须明确疾病的遗传模式。但连锁分析的分辨率最高仅有1cM，只能用于疾病的粗略定位。而关联研究的优势在于可进行精细的定位，并且在复杂疾病的遗传学研究中具有更大的把握度。其通过检测遗传标记在正常对照人群与疾病人群之间存在的频率分布差异，识别易感基因的位置。其方法学基础是：标记位点与易感基因连锁，且处于连锁不平衡状态或者标记位点本身就是易感基因。可以说，候选基因关联研究是研究多基因疾病与遗传因素之间存在的可能致病通路的第一步。

胆固醇酯转移蛋白(Cholesteryl Ester Transfer Protein，CETP)基因的主要作用是在脂蛋白间转移中性脂质如胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)，即催化了CE从HDL₂(HDL-C的大颗粒的形式)向极低密度脂蛋白(VLDL)、LDLs及中间密度脂蛋白(IDL)的转运，同时也催化了TG以等分子比例向相反方向的转运。CETP是已知唯一具有这一功能的蛋白。另外，在CETP和肝甘油三酯脂酶(HTGL)协同作用下，颗粒较大且密度较低的HDL₂转换为颗粒较小而密度较高的HDL₃，HDL₃又作为细胞胆固醇的受体参与胆固醇的吸收和转运。可见，CETP不仅调节了血浆HDL-C水平，而且促进了HDL颗粒的重塑。由于CETP将CE从HDL转移到LDL和VLDL，降低了具有保护作用的HDL-C浓度，从而CETP似乎具有致动脉粥样硬化作用。而另一方面，许多流行病学研究已证实血浆HDL-C水平与冠心病危险呈强的负相关，其主要抗动脉粥样硬化机制之一是参与了胆固醇逆向转运(RCT)，即将外周细胞中过量的胆固醇转运回肝脏并经胆汁排出体外。而胆固醇酯转移蛋白在RCT过程中起了关键的作用，使得CE在需要胆固醇的肝脏或组织间重新分配，从这一功能来看CETP似乎又具有抗动脉粥样硬化作用。所以，从理论上讲CETP对冠心病的作用是矛盾的。最近的研究表明，CETP能够将HDL-CE优先转运到小而密的低密度脂蛋白(sLDL)和VLDL，从而促进了sLDL的形成。抗CETP的单抗能阻断中性脂质的转运，减少了LDL中CE和TG的组成，使LDL抗氧化，巨噬细胞对氧化的LDL(ox-LDL)的摄入也减少，从而减少了发生动脉粥样硬化的危险。因此，许多临床及动物试验的证据支持CETP具有致动脉粥样硬化作用而抑制CETP活性则起到抗动脉粥样硬化的效果。但是，针对CETP基因多态性与冠心病之间的关系，以及该基因的多态性在预测预报和新药开发中的应用前景，国内外尚未有专利。

人类CETP基因位于16号染色体(16q21)，与卵磷酯胆固醇酰基转移酶(LCAT)基因邻近，由16个外显子和15个内含子组成，全长25kb，结构如图1所示。外显子的大小范围在32bp(外显子13)-250bp(外显子16)之间，而内含子大小范围在87bp(内含子3)-6000bp(内含子2)之间。人类CETP基因启动子区转录起始位点上游有一个类似于“TATA”盒的序列及SP1结合位点，同时还包含类似于转录因子CCAAT/增强结合蛋白(C/EBP)结合位点的序列，这一序列对维持CETP基因启动子活性有一定作用。另外在CETP基因的启动子区还存在核激素受体，包括ARP-1和它的同源序列Ear-3/COUP-TF，这些都是维持CETP基因转录活性所必需的。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因。

本发明的一个目的是提供一种检测本发明的启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的方法。

本发明的一个目的是提供一种体外检测冠心病相关基因的方法。

本发明的一个目的是提供一种体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的易感位点的方法。

本发明的另一目的是提供一种体外预测待测个体冠心病危险性的方法。

本发明的另一目的是提供一种体外检测启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的试剂盒。

附图说明

图1为CETP基因在16号染色体的结构示意图。图中的数字1-16分别代表外显子1-16，外显子之间的区域为内含子。

图2为CETP基因的-971G/A多态性位点及其侧翼序列。图中加黑的G/A为CETP基因的-971G/A多态性位点，前后序列分别为其侧翼序列。

图3为CETP基因序列多态性的筛查流程示意图。

图4显示利用Phred/Phrap/consed程序识别的-971G/A多态性位点及基因型。

图5为CETP基因-971G/A多态性位点的酶切图谱。

具体实施方式

本发明通过大量的实验研究，提供了一种启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因，该基因的特定单核苷酸多态性的侧翼序列如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示(同时请参见图2所示)。本发明的基因与在GenBank中序列号(GeneID)是1071的CETP基因相比，为启动子区域具有特定单核苷酸多态性，具体地，为-971G/A多态性位点的等位基因为G。-971G/A多态性位点为按照在CETP基因组中的位置定义的，具体来说：根据NCBI公开数据库中获得CETP全基因序列，参考Agellon等报道的CETP基因5’调控区结构，以转录起始位点(起始密码子上游27个核苷酸处)作为+1，其上游方向核苷酸(3’→5’)依次定义为-1、-2…，自转录起始位点之后核苷酸依次定义为+2、+3…。单核苷酸多态若位于非编码区，则以核苷酸相应变化和该核苷酸在核苷酸序列中的位置定义此多态；因为该位点位于转录起始位点上游第971位核苷酸处，所以命名为“-971G/A”，此外没有改变氨基酸的编码，因此它无氨基酸编码的改变。

本领域普通技术人员已知，所谓“基因多态性”指的是在人群中，各个体基因的核苷酸序列存在的差异。本领域普通技术人员已知，本发明所述的多态性位点为单核苷酸多态性(SNP)位点，即基因组序列中单个核苷酸发生改变；核苷酸序列的差异可以体现在DNA水平上或者RNA水平上，所以，本发明的CETP基因可以体现在DNA水平，RNA水平上，优选DNA水平，更优选基因组DNA。

这里所说的“易感基因”是指决定易于罹患某种(某类)疾病的基因。冠心病易感基因的携带者表现为携带易感基因的个体患冠心病的危险性增大。

本发明采用在遗传学研究中具有更大把握度的关联研究，其通过检测遗传标记在正常对照人群与疾病人群之间存在的频率分布差异，识别易感基因的位置。具体地，本发明先从病例组中随机挑选48例冠心病患者作为筛查对象，构成96条染色体，获得CETP基因潜在的功能性SNP位点，然后，本发明通过大样本的统计分析(801例冠心病患者和相应的818例对照)，针对其中的-971G/A多态性位点进行关联研究，最后确定具有本发明的-971G/A多态性位点的CETP基因为冠心病相关基因。其中，在本发明的一个实施方式中，单因素分析发现(参见实施例二)，-971G等位基因在病例组中的频率显著高于对照组(P＝0.013)，-971G等位基因携带者冠心病危险显著增加，是AA基因型的1.85倍(P＝0.014)。在本发明的一个实施方式中，进一步分析-971G/A多态位点与环境及其他冠心病危险因素的相互作用对发生冠心病危险的影响(参见实施例二)，应用二元logistic回归模型并调整血脂水平、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、年龄及性别等冠心病的传统危险因素，-971G/A多态与冠心病的关系不受性别和吸烟的影响。而-971G/A多态与不饮酒在冠心病发病危险上可能具有协同作用，不饮酒的-971G等位基因携带者冠心病危险较饮酒的-971AA基因型个体升高183％。肥胖的-971G等位基因携带者更易引起冠心病，是非肥胖-971AA基因型个体的4.08倍。-971G/A多态与高血压在冠心病发病危险上有明显的协同作用。同样，糖尿病患者-971G等位基因显著升高冠心病危险，是非糖尿病-971AA基因型个体的10.21倍。两者具有显著的协同作用。此外，为进一步分析-971G/A多态位点对冠心病危险度的贡献，在调整了性别、年龄、HDL-C、TG、LDL-C、BMI、高血压、糖尿病、吸烟及饮酒。应用多变量非条件logistic回归分析检测-971G/A多态位点对冠心病危险的独立预测作用。结果显示-971G/A多态与冠心病危险独立相关，-971G等位基因携带者发生冠心病的危险是-971AA基因型个体的2.0倍，且其对冠心病的危害程度超过了吸烟。

本发明还提供了一种检测本发明的启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的方法。本领域技术人员已知，可以用多种技术在DNA水平上体外检测CETP基因序列的多态性位点。可以经与用放射性标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，以鉴别位点多态性。也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和具有特定多态性的PCR引物，在聚合酶链式反应(PCR反应)的底物中加入荧光标记的核苷酸，根据反应产物中有无荧光出现，确定在扩增所用的引物中有无碱基变化，从而检测特定多态性。通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带具有特定多态性基因之间的序列差异。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。各种DNA及DNA片段的核苷酸序列的测定也可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，74：5463-5467)。此外，核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒或自动测序仪等。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。也可以采用限制性片段多态性分析(RFLP)来体外检测CETP基因序列的多态性位点。

限制性片段长度多态性分析方法的原理为：由于基因具有特定多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测这DNA片段的大小和数量，判断是否具有特定多态性。优选该方法与PCR技术结合(PCR-RFLP)，方法是：在设计PCR扩增实验时，引物位于基因多态性部位的两侧，先将目的基因扩增，使其易于检测，由于特定多态性引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片段大小或数量与正常对照作出判断。本发明中优选检测所述CETP基因-971G/A位点的多态性的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

本发明同时也为获得冠心病相关基因提供了一个新的思路。目前寻找疾病相关基因的方法多为寻找结构基因的变化。而本发明从一个侧面说明不仅基因的编码区具有特定多态性可以导致蛋白质水平发生改变，进而导致患冠心病的危险性增大，而且在非编码区的特定单核苷酸多态性，也可以导致患冠心病的危险性增大。在本发明中就是CETP基因的启动子区域具有特定单核苷酸多态性。

本发明还提供了一种体外筛查冠心病相关基因的方法，该方法包括：

(1)针对潜在的功能性单核苷酸多态性位点，进行冠心病患者和对照组之间的关联研究；

(2)确定统计学上具有显著差异的单核苷酸多态性位点。

冠心病是遗传、环境及行为因素等长期相互动态作用的结果，是复杂遗传性状疾病。关联分析不仅检出效力强，而且能够实现精确定位，是多基因疾病易感基因定位研究中倍受推崇的方法。为进一步从遗传学的角度探讨CETP基因和冠心病发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据，本实施例运用PCR-RFLP的国际通行的基因分型方法，在收集到的大样本冠心病病例对照研究中，体外检测来自待测个体的样品中-971G/A位点的多态性，从而分析-971G/A位点在冠心病患者和正常对照人群的分布差异。经过本发明的大量实验研究，本发明确定具有-971G/A多态性位点的CETP基因为冠心病的相关基因；而CETP基因启动子区-971G等位基因(-971G/A多态性位点为G等位基因)为冠心病的易感位点；-971G/A多态位点为-971G等位基因的CETP基因为冠心病的易感基因。

另一方面，本发明还提供了一种体外检测待测样品中是否存在冠心病相关基因的易感位点的方法，该方法包括：

1)提取待测样品的DNA，针对CETP基因-971G/A位点设计引物进行PCR扩增；

2)对所述的PCR产物进行分析；

3)鉴定CETP基因-971G/A位点是否为G。

待测样品可以从来自试验者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选来自血液。

对所述的PCR产物进行分析的方法可以采用前述关于检测本发明的启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的方法中提到的任何一种方法，例如，包括但不限于，利用放射性标记进行检测，利用荧光标记进行检测，直接测序进行检测，采用限制性片段多态性分析(RFLP)进行检测。优选对所述的PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

在一个实施方式中，对所述PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合(PCR-RFLP)。将包含目的SNP位点的PCR产物用特定的限制性内切酶作酶切，则包含有该SNP位点的个体其PCR产物会产生切成两个或三个片段或切不动三种情况。在本发明中对于-971G/A位点，采用PCR扩增后，获得了309个碱基长的PCR产物，对309个碱基长的PCR产物选用AvaI限制性内切酶(上海生物技术工程有限公司)进行酶切，当切割后产生了210和99bp两种长度的片段时，说明-971G/A位点的等位基因为G，当只有309碱基长的PCR产物时，说明-971G/A位点的等位基因为A。当同时存在309、210和99bp三种长度的片段时，说明-971G/A位点的基因型为G/A杂合子(具体参见实施例一)。

另一方面，本发明提供了一种体外预测待测个体冠心病危险性的方法，该方法包括体外检测来自待测个体的样品中-971G/A位点的多态性，其中携带-971G等位基因的个体(携带-971GG和-971GA基因型)患冠心病的危险性明显高于携带-971A等位基因的纯合子。优选所述待测个体为中国汉族。本发明通过大样本的统计分析，在排除实验误差的基础上，以确凿的实验证据证明了携带G等位基因个体患冠心病的危险性是AA纯合子个体患冠心病危险性的1.9倍。单变量分析显示，-971G等位基因在冠心病组中的频率显著高于正常对照组(P＝0.013)。G/A显隐性遗传模式进一步分析发现，携带-971G等位基因的个体患冠心病的危险性是-971AA基因型个体患冠心病危险性的1.85倍(R＝0.014)，在此基础上，本发明在调整了年龄、性别、吸烟、饮酒、生化指标、高血压、糖尿病等冠心病其它危险因素的影响后，多变量logistic回归模型分析表明-971G/A多态性为冠心病的独立危险因素，-971G等位基因携带者发生冠心病的危险是-971AA基因型个体的2倍，其对冠心病危害的影响超过了冠心病的传统危险因素吸烟(具体参见实施例二)。

本领域普通技术人员已知，可以采用前述任何能够检测-971G/A位点多态性的方法检测来自待测个体样品中-971G/A位点的多态性。在本发明的一个实施方式中，检测来自待测个体样品中-971G/A位点的多态性方法为聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合或聚合酶链式反应与直接测序法相结合。

在本发明大样本的统计分析的基础上，可以单独使用本发明的方法，即检测来自待测个体样品中-971G/A位点的多态性，以体外预测待测个体患冠心病的危险性。同时，本领域技术人员已知，冠心病的发生、发展是多因素共同作用的结果，正如从本发明的实施例二中可以看出，-971G/A多态与不饮酒在冠心病发病危险上具有协同作用。肥胖的-971G等位基因携带者更易引起冠心病，是非肥胖-971AA个体的4.08倍。在高血压患者-971G等位基因携带者冠心病危险较正常的-971AA个体升高642％，-971G/A多态与高血压在冠心病发病危险上有明显的协同作用。同样，糖尿病患者-971G等位基因显著升高冠心病危险，是非糖尿病-971AA基因型个体的10.21倍，两者具有显著的协同作用。而这些因素在临床上也经常被用来预测冠心病的危险性。因此，可以在检测本发明的-971G/A多态的同时、之前或之后，对上述其他因素进行检测，以达到更进一步体外预测待测个体患冠心病危险性的目的。

另一方面，本发明提供一种体外检测启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的试剂盒。所述试剂盒内可以装有一个或多个容器，容器内装有用以检测含有-971G/A多态性位点的CETP基因的一种或多种组分。按照具体检测方法及检测多态性位点的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。在本发明的一个实施方式中，提供一种体外检测启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的试剂盒，该试剂盒包含：

(1)扩增-971G/A位点的引物；

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)检测-971G/A位点的试剂。

本领域普通技术人员已知，所述扩增多态性位点的引物，可以依据本发明已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45％-50％左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，例如(0ligo 6.53软件)。如本发明实施例一所示，提供一种扩增-971G/A位点的引物：

5’TGG GCT AAA GGG CTC ACC TC 3’(SEQ ID N0：30)

5’GAT GTG GGC AGG ATG CTG TG 3’(SEQ ID NO：31)

本领域普通技术人员已知，PCR扩增的酶可以为Tag DNA聚合酶、Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。试剂盒中检测-971G/A位点的试剂根据检测方法的不同而不同。例如，采用聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合方法来检测-971G/A多态性位点时，试剂盒中可以含有限制性内切酶和相应的酶切图谱，例如AvaI限制性内切酶和相应的酶切图谱。

本发明的检测启动子区域具有特定单核苷酸多态性的CETP基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性。

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为本领域熟知的常规方法和常规条件，例如参见Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例一、CETP基因潜在功能SNPs的选择和检测

一、CETP基因序列多态性筛查

1、方法

从病例组中随机挑选48例冠心病患者作为筛查对象，构成96条染色体，这个样本量可提供95％的把握度检测到少见等位基因频率大于1％的序列变异。所有个体均为汉族，且无任何血缘关系。从NCBI公开数据库中获得CETP全基因序列。检测多态性的方法是利用PCR产物直接测序。利用0ligo6.53软件设计PCR引物，扩增CETP基因的启动子区域(以转录起始位点上游大约1.2kb区域)、全部16个外显子，以及外显子/内含子交界区域。引物序列见表1。

表1、扩增CETP基因相应片段的引物序列及扩增参数

外显子5’UTR和外显子1外显子2外显子3-5外显子6-7外显子8外显子9外显子10外显子11外显子12-13外显子14-15外显子16和3’UTR

引物序列(5’→3’)ccc agg ggc aat cag ctt atg t(SEQ ID NO：3)gca atg cag cta gga cct tct cac(SEQ ID N0：4)gga tcc aga ggc tag ggt atg a(SEQ ID N0：5)ggg ctg ttg gag agg ttg ata c(SEQ ID NO：6)cca ccc aga taa cct agg atc at(SEQ ID NO：7)gtt agt gtg gtg ctt gga atg(SEQ ID NO：8)ttc agg cca ttt tct gac tc(SEQ ID NO：9)cac cca ttt gtc ctg agt tct(SEQ ID N0：10)tgg gca ctc atc cat gta ct(SEQ ID NO：11)ctt tgc tgg gat cct tgt agt(SEQ ID NO：12)cca cgt ctg tct ggt tca ct(SEQ ID NO：13)ctg tgc cca gtc tgg act t(SEQ ID NO：14)cac agt ggg gag cag aag(SEQ ID NO：15)ggt cgg tgt gag cac tga(SEQ ID NO：16)ggc cca gag agg aca aga gt(SEQ ID NO：17)agg agc cat gtg caa gag ac(SEQ ID NO：18)cgg ttt tca gaa gag cag tag(SEQ ID NO：19)aag ggc tct ccc aaa aga c(SEQ ID N0：20)tcc cca ggg cga agg aaa gac(SEQ ID NO：21)cag gtg ctc agg gaa gcc aaa gtc(SEQ ID NO：22)gcc tct tcg aca tca tca ac(SEQ ID NO：23)agg gga aca ggt gtg aac tac(SEQ ID NO：24)

扩增片段长度(bp)1446573128989963256345249085716561395

退火温度(℃)656563626364.5646461.56564

基因组模板来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酚-氯仿法或者用盐析法提取出来即可。

PCR反应体系(25μl)：基因组模板DNA50ng、dNTPs200μmol/L、Taq酶(Takara公司)1U、MgCl₂ 2.0mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、KCl 50mmol/L及引物200pmol/L。PCR反应条件见表2。

表2、CETP基因SNPs筛查PCR扩增反应条件

应用Millipore公司生产的纯化板对PCR产物纯化，纯化2遍后进行测序反应。以PCR引物作为测序引物，大于1kb的PCR产物需在中间大约450bp左右增加一条测序引物，测序引物见表3。由于外显子1合并启动子区域大约有1.4kb，所以在序列扩增反应后，大约每450bp增加一条测序引物。同样道理，外显子3和外显子4合并外显子5大约1.3kb，外显子16合并3’下游区域大约1.4kb，各增加一条测序引物。而外显子14合并外显子15大约1.7kb，所以在中间增加两条测序引物。在普通PCR仪上进行扩增及测序反应，其产物在ABI3700测序仪(美国PE公司)上读取序列。CETP基因序列变异的筛查流程见图3。

表3、测序引物序列

外显子5‘UTR和外显子1外显子3-5外显子14-15(1)外显子14-15(2)外显子16和3’UTR

测序引物序列(5’→3’)gga aag gtc gat gct aga gt(SEQ ID NO：25)aga tcg act ctg cca ttg ac(SEQ ID NO：26)ggt att gca cgc caa tga ct(SEQ ID NO：27)atg gct tag gta gga gag ga(SEQ ID NO：28)gag tac gga gat gga gat t(SEQ ID NO：29)

引物长度(mer)2020202019

退火温度(℃)5050505050

测序在ABI3700测序仪上完成。在SUN工作站上应用Phred/Phrap/consed程序进行序列拼接和DNA序列变异的识别。Polypred是一个用于序列拼接的程序，可以用它来对DNA测序的结果进行分析，也可以用于寻找SNP位点。其工作平台是SUN工作站，远程用户可以在Linux界面下操作。它的看图原理就是分别将四种碱基赋予不同的颜色：A是绿色；T是红色；G是橙色；C是蓝色。Phred/Phrap/consed是其中的四个命令。具体操作如下：

登录进入Linux

创建四个文件夹：edit_dir；phd_dir；chromat_dir；poly_dir

将测序结果(图谱文件)输入到chromat_dir文件夹。

转入到edit_dir文件夹，运行Polyphrad和Consed命令

图谱分析结果出来，直接用目测可以看到系统用红色标出的SNP位点。

2、结果

以中国北方汉族人群为研究对象，经过系统的序列筛查工作，从CETP基因序列中共发现23个SNP位点。测序的总长度为1,0300个碱基。根据上述SNP的命名规则命名发现的23个SNPs。从中选择了最具代表性的-971G/A多态性位点进行进一步研究，其少见等位基因频率为0.16，杂合度0.268。图4显示利用Phred/Phrap/consed程序识别的-971G/A多态性位点及基因型。

二、采用PCR-RFLP方法检测CETP基因启动子区-971G/A多态性

1、方法

限制性片段长度多态性分析方法的原理为：由于基因的多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测这DNA片段的大小和数量，判断是否具有特定多态性。

本发明优选RFLP与PCR技术结合(PCR-RFLP)，方法是：在设计PCR扩增实验时，引物位于基因多态性部位的两侧，先将目的基因扩增，使其易于检测，若特定多态性引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片段大小或数量与正常对照作出判断。若特定多态性未能引起限制性内切酶位点改变，则通过碱基错配引入一个已知限制性内切酶位点，使得特定多态性引起该限制性内切酶位点发生改变。

PCR反应体系(10μl)：基因组模板DNA50ng、dNTPs200μmol/L、Taq酶(Takara公司)0.5U、MgCl₂ 2.0mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、KC1 50mmol/L及引物200pmol/L；引物序列如下：

5’TGG GCT AAA GGG CTC ACC TC 3’(SEQ ID NO：30)

5’GAT GTG GGC AGG ATG CTG TG 3’(SEQ ID NO：31)

在96孔PCR自动循环仪9700(美国PE公司)上进行PCR反应，PCR循环参数：94℃预变性5分钟，经95℃1分钟，62℃45秒，72℃50秒，循环30周后于72℃延伸8分钟。对309个碱基长的PCR产物选用AvaI限制性内切酶(上海生物技术工程有限公司)进行酶切。酶切体系(10μL)：取PCR反应产物5μL，加限制性内切酶5U，37℃消化过夜。经1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下读取酶切结果并确定基因型。-971G/A多态位点的PCR扩增产物及AvaI限制性内切酶的识别序列如下：

CAGCCCCCACCCTGGCAGGGCCGATGGTACATGCTCACTCAGTGAGGGGGCTCCAGAGGTCTGTGGGTACGAACCCAAGGGCTGGTGCCCAGGGGCAATCAGCTTATGTCTCTGAGCCTTGGGAAACAGTGAGGGTCAGCCCGGCTCCCCACGTGCTTCTGGGCAGCTTTGGTATTGGAGCAGGTGCAAACTCG[A]GGACTAGGGCAGGACCCCCTGAGAGGCGACTGAGCAAGGCCATCCCGACTCATGTTTCCTTGGCCCTGCCCGGGG

(SEQ ID NO：32)

方框内的序列为引物序列，G[A]为-971G/A多态位点，带下划线的序列为AvaI限制性内切酶的识别序列。AvaI内切酶的识别序列为：5’C*PyCGPuG 3’(Py代表C或T碱基；Pu代表A或G碱基，“*”处为酶切位点)。-971位的A等位基因可以改变这一序列从而不被酶解。而-971G纯合子个体基因组DNA的PCR产物酶切后产生两个片断。

2、结果

如图5所示，309碱基长的PCR产物切割后产生了210和99bp两种长度的片段，说明-971G/A位点的等位基因为G，当只有309碱基长的PCR产物时，说明-971G/A位点的等位基因为A。当同时存在309、210和99bp三种长度的片段时，说明-971G/A位点的基因型为G/A杂合子。由于图5所示的待测样品为来自待测个体的DNA，所以，如泳道I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-8、I-10、I-12、II-1、II-3和II-11所示，产生210和99bp二种片段，则该待测个体-971G/A位点的基因型为G/G，携带G等位基因。如泳道II-2、II-8和II-9所示，只有309bp一种长度的片段，该待测个体的-971G/A位点为A/A纯合子，携带A等位基因。如泳道I-6、I-7、I-9、I-11、I-13、II-4、II-5、II-6、II-7、II-10和II-12存在309、210和99bp三种片段，则该待测个体-971G/A位点的基因型为G/A杂合子，携带A等位基因和G等位基因。

三、利用PCR与直接测序法检测CETP基因启动子区-971G/A多态性

通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带特定多态性基因之间的序列差异。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。

1、方法

首先对-971G/A位点进行PCR反应，具体条件及引物参见上述“二、采用PCR-RFLP方法检测CETP基因启动子区-971G/A多态性”。对PCR产物在ABI3700测序仪上直接读取序列。

2、结果

如图4所示，为Phred/Phrap/consed程序识别本发明的-971G/A多态性位点及待测个体的基因型，其中图4的右侧测序图中上至下分别显示本发明待测个体的-971G/A多态性位点为G/G纯合子，A/A纯合子及G/A杂合子。

实施例二、CETP基因启动子区-971G/A多态位点与冠心病的关联研究

一、研究对象的入选标准

病例组为随机选取1997年10月至2000年9月期间在中国医学科学院阜外心血管病医院住院的北京地区的冠心病患者801例(男性621例，女性180例，冠心病诊断时平均年龄54岁)，并满足下列入选标准：(1).急性心肌梗死且完全恢复在3个月以上。(2).经心电图动态改变确诊既往患过陈旧性心肌梗死。(3).经外科搭桥手术或内科介入治疗的冠脉功能不全和心绞痛患者。(4).冠状动脉造影证实至少一支主要冠状动脉狭窄超过70％或左主干狭窄超过50％。并经各项检查除外心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心力衰竭、严重的肾脏及肝脏疾病、继发性高血压、心肌病、家族性高胆固醇血症及可疑冠心病患者。急性心肌梗死诊断标准：根据WHO1979诊断标准，即典型胸痛症状持续30分钟以上；心电图连续2个导联ST段抬高(肢体导联≥0.1mv，胸导联≥0.2mv)并有动态改变；心肌酶学升高并大于正常值高限的2倍，24小时内有动态演变，心肌同工酶升高更有助于诊断。

对照组为随机选取居住在北京，年龄(±2)和性别(频数匹配)与病例匹配的社区人群818例(男性621例，女性197例，入选时平均年龄53岁)。且既往无冠心病或其他动脉粥样硬化病史，无胸痛、胸闷等心脏病症状，心电图无明显缺血性改变。

二、-971G/A多态基因型及等位基因频率在病例对照样本中的分布

研究人群的一般特征见表4。病例组与对照组在性别及年龄上无显著性差异。Hardy-Weinberg平衡定律是群体遗传学的基本定律。即在一个不发生突变、迁移和选择的无限大的互相交配的群体中等位基因频率和基因型频率将保持均衡。这样既有遗传多态性，又具备遗传的稳定性。在进行关联研究分析之前均应检验Hardy-Weinberg平衡，以排除试验误差。-971G/A基因型结果不论在病例组及对照组均符合Hardy-Weinberg平衡(χ²＝1.015，P＝0.314；χ²＝1.346，P＝0.246)。单因素分析结果见表5。-971G等位基因在病例组中的频率显著高于对照组(P＝0.013)，-971G等位基因携带者(包括携带GG和GA两种基因型的个体)冠心病危险显著增加，是AA基因型的1.85倍(P＝0.014)。

表4、研究人群的人口统计学及生物化学特征

连续性变量或数值变量用“均数±标准差”表示，括号内为最小值和最大值；分类变量用个体数表示，括号内为百分数；

a：数值变量的统计学检验均经对数转换后；b：病例组年龄为CHD诊断时年龄；对照组年龄为入选时年龄。

表5、CETP基因-971G/A多态等位基因频率及基因型频率在病例对照中的分布

SNP	变量名	病例组(801例)	对照组(818例)	OR	P
						-971G/A	GG/GA/AA(GG+GA)/AAG/A	519/257/25776/250.867/0.133	501/271/46772/460.833/0.167	-1.8501.306	0.0350.0140.013

三、CETP基因-971G/A多态与环境及其他危险因素相互作用对冠心病危险的影响

应用二元logistic回归模型并调整血脂水平、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、年龄及性别等冠心病的传统危险因素，进一步分析-971G/A多态位点与环境及其他冠心病危险因素的相互作用对发生冠心病危险的影响。

分析结果如表6所示，-971G/A多态与冠心病的关系不受性别和吸烟的影响。不饮酒的-971G等位基因携带者冠心病危险较饮酒的-971AA个体升高183％，-971G等位基因和不饮酒同时存在时，对冠心病危险的影响大于各自单独作用之和，因此，-971G/A多态与不饮酒在冠心病发病危险上可能具有协同作用。肥胖的-971G等位基因携带者更易引起冠心病，是非肥胖-971AA个体的4.08倍。在高血压患者-971G等位基因携带者冠心病危险较正常的-971AA个体升高642％，-971G/A多态与高血压在冠心病发病危险上有明显的协同作用。同样，糖尿病患者-971G等位基因显著升高冠心病危险，是非糖尿病-971AA基因型个体的10.21倍。两者具有显著的协同作用。

表6、-971G/A多态与环境及其他危险因素相互作用对冠心病危险(OR值)的影响^§

§：OR值分别调整了TG、LDL-C、HDL-C、BMI、高血压、糖尿病、性别、年龄、吸烟和饮酒，下面小字为OR值95％可信区间。ref：参照组。

四、多变量分析检验-971G/A多态位点与冠心病的关系

为进一步分析-971G/A多态位点对冠心病危险度的贡献，在调整了性别、年龄、HDL-C、TG、LDL-C、BMI、高血压、糖尿病、吸烟及饮酒后，应用多变量非条件logistic回归分析检测CETP多态位点对冠心病危险的独立预测作用。

结果请参见表7，显示-971G/A多态与冠心病危险独立相关，-971G等位基因携带者(包括GG和GA基因型的个体)发生冠心病的危险是-971AA基因型个体的2.0倍，且其对冠心病的危害程度超过了吸烟。

表7、-971G/A多态位点对冠心病发病危险的多变量非条件logistic回归分析

五、结论

中国汉族人群中，CETP基因和冠心病显著关联，尤其-971G/A多态位点与冠心病显著相关。环境因素对-971G/A多态与冠心病的关系起着效应修饰作用，多数环境危险因素与-971G/A多态的高危险基因型在发生冠心病危险上有相加或协同作用。与携带-971AA基因型的个体相比，携带-971G等位基因的个体(包括GG和GA基因型的个体)患冠心病的风险显著升高。这一发明是迄今为至国内外首次发现。本发明同时也为获得冠心病相关基因提供了一个新的思路。目前寻找疾病相关基因的方法多为寻找结构基因的变化。而本发明从一个侧面说明不仅基因的编码区具有特定单核苷酸多态性可以导致蛋白质水平改变，进而导致患冠心病的危险性增大，而且在非编码区具有特定单核苷酸多态性，也可以导致患冠心病的危险性增大。在本发明中就是CETP基因的启动子区域具有特定单核苷酸多态性。

实施例三、体外检测冠心病相关基因CETP基因启动子区域具有特定单核苷酸多态性的试剂盒

本实施例提供一种体外检测冠心病相关基因CETP基因启动子区域具有特定单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包含：

1)扩增-971G/A位点的引物

5’TGG GCT AAA GGG CTC ACC TC 3’(SEQ ID NO：30)

5’GAT GTG GGC AGG ATG CTG TG 3’(SEQ ID NO：31)

2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

3)AvaI限制性内切酶(上海生物技术工程有限公司)和相应的酶切图谱。

并在试剂盒的适用说明中指出，可以按照实施例1所述的方法进行检测。

应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。

序列表

<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司

     中国医学科学院阜外心血管病医院

<120>具有特定单核苷酸多态性的CETP基因及其检测方法和用途

<130>GBI05CN0324

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>150

<212>DNA

<213>智人

<400>1

gagggggctc cagaggtctg tgggtacgaa cccaagggct ggtgcccagg ggcaatcagc     60

ttatgtctct gagccttggg aaacagtgag ggtcagcccg gctccccacg tgcttctggg    120

cagctttggt attggagcag gtgcaaactc                                     150

<210>2

<211>150

<212>DNA

<213>智人

<400>2

ggactagggc aggaccccct gagaggcgac tgagcaaggc catcccgact catgtttcct     60

tggccctgcc cggggcacag catcctgccc acatccctgc agccctggct ccttcctagg    120

ggctctgagg aggcagcact tggccatctg                                     150

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cccaggggca atcagcttat gt                                              22

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gcaatgcagc taggaccttc tcac                                            24

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ggatccagag gctagggtat ga                                               22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gggctgttgg agaggttgat ac                                               22

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

ccacccagat aacctaggat cat                                              23

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

gttagtgtgg tgcttggaat g                                                21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

ttcaggccat tttctgactc                                                  20

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

cacccatttg tcctgagttc                                                            21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

tgggcactca tccatgtact                                                            20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

ctttgctggg atccttgtag                                                            21

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ccacgtctgt ctggttcact                                                            20

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

ctgtgcccag tctggactt                                                             19

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

cacagtgggg agcagaag                                                              18

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

ggtcggtgtg agcactga                                                              18

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

ggcccagaga ggacaagagt                                                            20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

aggagccatg tgcaagagac                                                            20

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

cggttttcag aagagcagta g                                                          21

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

aagggctctc ccaaaagac                                                             19

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

tccccagggc gaaggaaaga c                                                          21

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

caggtgctca gggaagccaa agtc                                                       24

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

gcctcttcga catcatcaac                                                            20

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

aggggaacag gtgtgaacta c                                                          21

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

ggaaaggtcg atgctagagt                                                            20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

agatcgactc tgccattgac                                                            20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ggtattgcac gccaatgact                                                            20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

atggcttagg taggagagga                                                            20

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

gagtacggag atggagatt                                                             19

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

tgggctaaag ggctcacctc                                                            20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

gatgtgggca ggatgctgtg                                                            20

<210>32

<211>309

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<222>(214)..(214)

<223>n＝g或a

<400>32

tgggctaaag ggctcacctc cagcccccac cctggcaggg ccgatggtac atgctcactc     60

agtgaggggg ctccagaggt ctgtgggtac gaacccaagg gctggtgccc aggggcaatc    120

agcttatgtc tctgagcctt gggaaacagt gagggtcagc ccggctcccc acgtgcttct    180

gggcagcttt ggtattggag caggtgcaaa ctcnggacta gggcaggacc ccctgagagg    240

cgactgagca aggccatccc gactcatgtt tccttggccc tgcccggggc acagcatcct    300

gcccacatc                                                            309

Claims (4)

1.检测来自待测个体的样品中CETP基因-971G/A位点的多态性的试剂在制备用于体外预测待测个体冠心病危险性的制剂或试剂盒中的应用，其中CETP基因-971位的G等位基因携带者比AA基因型的个体患冠心病的危险性显著升高；其中所述检测来自待测个体的样品中CETP基因-971G/A位点的多态性的试剂包括如下引物：

5’TGG GCT AAA GGG CTC ACC TC 3’

5’GAT GTG GGC AGG ATG CTG TG 3’；

其中所述的待测个体为中国汉族人。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述试剂为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的方法中所使用的试剂，或聚合酶链式反应与直接测序法相结合的方法中所使用的试剂。

3.如权利要求1所述的应用，其中所述的样品来自血液、尿、唾液、胃液或头发。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述的样品来自血液。

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