CN1871342A - p18对干细胞的调控 - Google Patents

Abstract

一种通过降低或遏制“p18”蛋白存在，增加未分化人干细胞培养或细胞系自我更新能力的方法。

Description

p18对干细胞的调控

                         发明人：程涛

相关申请：本申请享有程涛的临时专利申请号60/514,329(2003年10月24日提出申请)和60/＿＿＿(2004年10月19日提出申请)的优先权，其内容引入本文参考文献。

政府利益：因受美国国立卫生院基金(基金编号：DK02761-01和/或HL70561)资助，本申请某些权利要求可能已被归纳整理实施。

技术背景：干细胞(例如造血干细胞，简称“HSCs”)在体内具有广阔的治疗前景。干细胞具有向多种成熟细胞分化的能力，提示这些未分化的干细胞能被临床用于治疗例如恶性(如慢性髓细胞白血病，急性髓细胞白血病)和非恶性(如重症再生障碍性贫血，遗传性代谢性疾病)疾病。然而，人干细胞的体内实验始终存在技术瓶颈，即干细胞向各种成熟细胞分化的同时，细胞系自我更新或形成新的未分化干细胞(称为“自我更新”)的能力减弱，特定的人干细胞培养的寿命缩短。因此，本技术通过增加自我更新能力提高人干细胞培养或细胞系的寿命。

概述：本人找到了提高人兼容性干细胞自我更新的方法。本发明通过降低或去除未分化干细胞培养体系中p18蛋白的表达，提高干细胞自我更新。这可以通过例如下调p18基因表达，或用酶或化学物质降解p18多肽来实现。

本技术中，“p18”(p18^INK4C，INK4C，Cdkn2c)是已知蛋白。如H.HIRAI等“新INK4蛋白，p19和p18，周期素D-依赖激酶CDK4和CDK6的特异性抑制剂”，15(5)MOL.CELL.BIOL.2672(1995)(发现小鼠p18的主要氨基酸序列)；K.L.GUAN等“p16INK4/MTS1-和p14INK4B/MTS2-相关CDK6抑制剂p18抑制生长作用，与野生型pRb功能有关”，8(24)GENES DEV.2939(1994)(发现人p18的主要氨基酸序列)。p18是周期素依赖激酶抑制剂(CKI)之一，作用于细胞周期G1早期的INK4家族蛋白。

p18对抑制体内造血干细胞(HSCs)的自我更新有独特的作用。体外p18缺失能提高干细胞的自我更新。为了说明这一点，我们首先用Dexter法长期培养骨髓细胞，计数鹅卵石区域形成细胞(CAFC)。该法是小鼠HSC体外定量的替代方法。

p18^-/-(p18敲除的基因型)和p18^+/+培养瓶中CAFC的产量在培养前4周无明显差异。然而，自第6周起直至第19周，p18^-/-明显比p18^+/+(p＜0.04，n＝4)培养瓶中持续产生更多的CAFCs。令人惊奇的是，第19周的p18^-/-培养物的CAFC频率与第5周的水平相同，而第19周的p18^+/+培养物已经几乎丧失了产生CAFCs的能力。此外，p18^-/-培养物中CAFCs的产量增高也和非贴壁细胞的生成量增多有关，后者主要是髓系的分化细胞。

这提示此差异是由于HSCs中p18的固有缺失造成的，但还没有得到证实。为证实这一点，而采用经照射的野生型骨髓基质细胞作为极限稀释法长期培养p18^-/-或p18^+/+骨髓细胞的基质层。结果，p18-/-组的CAFC频率(5-6周)比p18^+/+组的增加了2倍。

为了在特定亚群中进一步评价HSC的增殖能力，我们体外研究了高度纯化HSCs的细胞分裂，即CD34^-Lin^-c-Kit⁺Sca-1⁺(CD34^-LKS)细胞。分选的CD34^-LKS细胞(CD45.2)重建能力，经极限稀释法测定竞争性造血重建单位(CRU)在同基因小鼠(CD45.1)上验证。移植后3个月，我们可以测定到约20个p18^+/+骨髓CD34^-LKS细胞中含有1个CRU，约10个p18^-/-骨髓CD34^-LKS细胞中含有1个CRU。单个CD34^-LKS细胞置于Terasaki板中(1个细胞/孔)，用含有SCF、Flt3L和TPO的无血清培养基培养。虽然大多数细胞在培养3天内进入细胞周期，这与之前的研究一致，但令人吃惊的是，p18^-/-和p18^+/+CD34^-LKS细胞的分裂速度并无显著差异(＞100个细胞/实验，5次实验)。

这一结果提示p18缺失并不增加HSC的增殖速度，而可能使HSC发生对称性分裂比例增大。为了直接证实这一假设，将单个CD34^-LKS体外培养2天，第一次分裂产生的两个子细胞分别和极少量的Sca-1^-竞争性细胞(CD45.1/2，F1)分别移植不同受体。结果在单个子细胞移植小鼠体内均发现阳性植入。

综上所述，p18缺失有利于HSC进行对称性细胞分裂，且这一作用不依赖细胞周期。下调p18能在体外实现干细胞扩增，可用于扩增干细胞和明确其它促进干细胞扩增的活性物质。由于造血细胞表达p18是非特异性的，因此还可以用于体内其它类型干细胞。

附图简述

图1显示首次竞争性骨髓移植(”cBMT”)后的长期植入，相对于p18^+/+细胞，p18^-/-造血细胞的生长优势。

图2显示二次竞争性骨髓移植后，再生的p18^-/-造血干细胞(”HSC”s)的持续多向分化能力和主导地位。

图3显示稳态时p18^-/-小鼠HSCs池扩大，HSC移植后p18^-/-HSCs再生能力增强。

图4显示体内p18^-/-HSCs分裂次数增加的直接证明。

图5显示体内3种成熟程度不同的细胞亚群(未分化干细胞，中间态细胞和完全分化细胞)的BrdU掺入率测定图。

图6，7，8显示体外单个干/祖细胞的增殖速度。结合图5，数据支持p18蛋白缺失促进干细胞对称性分裂，而不是非特异性地加快细胞增殖速度。

图9显示长期培养体系中选择性扩增鹅卵石区域形成细胞(”CAFC”)(干细胞的体外替代实验)。基于体内实验数据(图1-5)，下调p18能允许干细胞在体外扩增，本实验室结合此数据和下述图10的数据对这一假设进行了检验。

图10显示体外培养19周后，p18^-/-干细胞的长期植入效应。为了进一步证实Dexter培养条件下培养19周的干细胞仍具有体内造血重建能力(图9)，我们将2-20×10⁵细胞(包括悬浮和贴壁细胞)移植致死剂量照射小鼠。p18^-/-移植组中3/7的小鼠获得长期植入(植入率0.5-33％)，而p18^+/+移植组没有植入(n＝7)。此外，p18^-/-细胞二次移植受体中(n＝3)，长期植入(7个月)率达持续水平(平均38.6％)，并具有多向分化能力，表明经过长期培养扩增的HSCs具有自我更新能力。绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞为移植细胞。这些数据充分说明p18缺失能显著降低HSCs在体外培养过程中发生的分化效应，并为p18应用于人造血干细胞扩增提供了充分的依据。

图11显示RT-PCR法检测p18在人造血干细胞中的表达。M：分子量标记物；1-2：人脐带血干细胞样本(2个复孔)；3：Hela细胞阳性对照；4：阴性对照-无逆转录酶；5：阴性对照-无mRNA模板。

图12显示p18 RNA干扰技术能显著降低p18蛋白在人干细胞中的表达。图12a显示p18蛋白的Western分析。NS：非特异性寡RNA的阴性对照；p18 siRNA：用p18小干扰RNA处理后的细胞；NT：未处理的阴性对照。图12b显示多次实验的结果总结，说明经p18 siRNA处理，2天内70％的p18蛋白被抑制。

图13显示高效能电穿孔方法将siRNA导入人干细胞的可行性。A&C：未进行电穿孔的对照细胞；B&D：通过优化电穿孔方法导入了螯合有绿色荧光蛋白的p18 siRNA的测试细胞。上排是显微镜的直接影像，下排是流式细胞仪的定量分析。

图14显示通过慢病毒(lentiviral)转染法成功将p18 siRNA转入人干细胞的例子。绿色是p18 siRNA转入细胞内的指示信号。

图15显示体内模型检测p18缺失的人干细胞的实验流程图。

图16显示图1和2中大量应用的竞争性骨髓移植(cBMT)和序贯移植的实验流程。

图17显示通过免疫标记和流式细胞分选分离人造血干细胞的流程。

图18显示检测干细胞功能的方法，即竞争性造血重建单位(CRU)。

详细描述

正常生理状态下，干细胞在体内具有维持自我更新、分化以及死亡平衡的独特机制。细胞周期调控是决定细胞命运的基本机制之一。越来越多的数据显示，细胞周期本质上是决定干细胞或祖细胞功能的重要因素，但是参与这一过程的分子事件目前大部分还未明确。哺乳动物中，细胞进入细胞周期需要周期素依赖激酶(CDK)4/6和CDK2的序列激活，而二者分别被INK4蛋白(p16^INK4A，p15^INK4B，p18^INK4C和p19^INK4D)和Cip/Kip蛋白(p21^Cip1/Waf1，p27^Kip1和p57^Kip2)抑制。

INK4和Cip/Kip家族都包括了一类重要的细胞周期抑制剂，称为CDK抑制剂(CKIs)。当一系列复杂的细胞内外信号转导途径参与细胞周期控制时，CKIs以自主方式调节细胞周期。在前期小鼠造血干细胞实验中，p21缺失能在稳态下扩大造血干细胞(HSC)池，但在应激状态下干细胞功能受损。由于两个CKI家族分别作用细胞周期的不同部位，我们假设INK4蛋白作用于G1早期，并以独特方式影响干细胞对丝裂原刺激信号的应答。新近研究证实p16^INK4A和p19^ARF是Bmi-1蛋白调控HSC自我更新的下游因子，这也间接支持以上假设。INK4家族成员p18^INK4C在包括造血组织在内的多种组织均有表达，p18缺失小鼠表现为器官肿大，细胞数增多，并随着年龄增长或在致癌物作用下肿瘤发生率较野生型增高。目前我们通过p18缺失骨髓重建小鼠造血以及其它大量体内干细胞功能评价方法报道了p18对HSC自我更新的抑制作用。

造血干细胞能长期重建照射小鼠的造血组织，因此骨髓移植可以作为研究干细胞功能的模型。我们首先采用竞争性骨髓移植直接评价p18缺失对造血重建的可能影响。数据见图1。

图16是“竞争性序贯骨髓移植”的图示。本实验中多次采用竞争性骨髓移植(”cBMT”)(连续地)。

图16中，分别取等量(2×10⁶)p18^+/+和p18^-/-小鼠骨髓有核细胞，共移植致死剂量照射受体。半定量PCR检测各基因型的相对比例。基于不同比例p18^-/-和p18^+/+细胞混合后在相同PCR条件下产生的标准化结果(见图1a)，p18^-/-血细胞平均占93.3％(p18^+/+基因型平均占6.7％)。因此，在相同细胞数量条件下，p18^-/-骨髓细胞的长期重建能力(LTRA)平均约为p18^+/+骨髓细胞的14倍。

为了说明p18^-/-基因型细胞植入率增加是出现在HSC还是造血祖细胞(HPC)水平，进行了集落形成实验(CFC)(体外替代HPC)和长期培养起始细胞(LTC-IC)(体外替代HSC)，并随后对集落进行PCR基因型检测。结果p18^-/-基因型均显著过度呈现，见表1。

                          表1.cBMT后单个干/祖细胞p18^-/-基因型随访结果

		A	B	C	D	E	F	G
									首次cBMT	实验1	CFC	10	3	39	38	1	97.5
实验2	CFCLTC-IC	7101410	3333	12210814448	11510714345	7113	94.399.199.393.7
								实验3		CFCLKS	81212	332	85122220	72110201	131219	80.0*90.1*91.4
二次cBMT**		CD34-LKS	12或22***	3	109	101	8										92.7

说明：

A栏：克隆培养

B栏：骨髓移植后月数

C栏：实验小鼠样本量

D栏：可分析克隆总数

E栏：p18^-/-克隆总数

F栏：p18^+/+克隆总数

G栏：p18^-/-占主导地位(占总克隆数百分比)

此外，我们发现91.4％的Lin^-c-Kit⁺Sca-1⁺细胞(LKS，体内富集HSCs的细胞群)在竞争性骨髓移植后12个月，仍为p18^-/-基因型(表1)。该数据表明相对于野生型造血细胞，p18^-/-造血细胞(包括HSC)具有很强的竞争优势。

为了证明植入率增高是否与p18缺失后造血细胞自我更新能力增强有关，我们设计了一组竞争性连续骨髓移植。在首次竞争性骨髓移植后10个月取受体小鼠骨髓细胞，进行第二次竞争性骨髓移植。即将首次移植受体小鼠骨髓有核细胞和相同剂量(2×10⁶)的新分离的8周龄p18^+/+小鼠骨髓有核细胞再次进行竞争性移植。

显著的是，p18^-/-造血细胞相对于共移植的p18^+/+细胞仍具有明显生长优势，二次竞争性骨髓移植8-12个月后在新受体中仍占主导地位。结果见图2。

图2显示二次竞争性骨髓移植后重建的p18^-/-HSCs能维持长期多向分化能力，并在骨髓中占主导地位。首次竞争性骨髓移植后10个月的小鼠骨髓细胞和新鲜分离的8周龄野生型小鼠骨髓细胞1∶1混合，二次移植致死剂量照射野生型小鼠(总计4×10⁶个细胞/小鼠)。二次竞争性骨髓移植后对小鼠外周血进行半定量PCR检测。图2a显示二次竞争性骨髓移植8个月后的外周血典型数据。图2a中，8-14栏代表7只实验小鼠。由于两批DNA样品在相同条件下同时扩增，因此使用的标准化曲线同图1a。图2b显示系列分化情况。二次竞争性骨髓移植后12个月，小鼠(8，9，10号)骨髓细胞分别用粒细胞(G)、单核细胞(M)、T细胞(T)或B细胞(B)的系列抗原标记，用图1描述的半定量PCR方法对经分选后的每个细胞系进行基因型分析。

图2a显示二次移植受体p18^-/-造血细胞的LTRA平均为p18^+/+细胞的8倍。图2b显示，经过流式细胞仪分析，二次移植受体小鼠外周血和骨髓各细胞系列生长无明显差异，与未移植野生型小鼠类似。

为了进一步说明p18^-/-细胞所能发育的细胞类型，根据不同的系列标志分选二次竞争性骨髓移植后12个月的骨髓细胞，检测其基因型比例。与外周血的结果相似，几乎所有的细胞类别均以p18^-/-基因型为主(图2c)。该数据说明二次移植受体中持续存在重建的具有多向分化潜能的HSCs。

随着连续骨髓移植，干细胞数量会逐渐减少，并且我们先前的研究观察到在p21缺乏小鼠中出现了HSCs的过早耗竭。为了检测p18^-/-HSCs是否也会出现同样的结果，我们从小鼠体内分离了二次竞争性骨髓移植后12个月小鼠HSCs，即CD34^-LKS细胞，并在单细胞水平检测其基因型。结果见表1。

图17显示通过免疫表型分选造血干细胞CD34^-LKS。为了分离最早期的干细胞，我们首先去除成熟细胞，并用Sca-1/c-kit抗体富集干细胞，最后设门在CD34阴性亚群。

表1显示在来自3只小鼠的109个克隆中，92.7％的CD34^-LKS细胞是p18^-/-。见表1最后一行。因此，p18^-/-基因型能在近2年的连续竞争性骨髓移植中始终保持主导地位，并无明显耗竭。另一组独立的连续移植实验的LTC-IC结果也证实了该结果(数据未显示)。p18缺失所引起的自我更新能力增加，并没有在其它CKI(p21或p27)缺失模型中观察到。

在竞争性移植模型中，p18^-/-CD34^-LKS相对于其野生型所具有的生长优势，提示在稳态下p18^-/-非移植小鼠可能存在HSCs扩增。我们也分析了同胞或年龄匹配的p18^+/+和p18^-/-小鼠的干细胞表型，CD34^-LKS。结果见图3。

图3显示在稳态下p18^-/-小鼠HSCs池扩大，HSC移植后p18^-/-HSCs增殖加快。

图3a显示HSCs的表型定量。流式分析p18^-/-小鼠(8-12周)和性别匹配的p18^+/+小鼠骨髓有核细胞(n＝9)。系列标记和CD34阴性，c-kit和Sca-1阳性，称之为“CD34^-LKS”细胞，HSCs(见图17)。

图3b显示极限稀释后HSCs重建造血能力。不同数量(10，20或40)的CD34^-LKS细胞(CD45.2⁺)和10⁵Sca-1阴性竞争性骨髓细胞(CD45.1⁺/CD45.2⁺)混合，移植致死剂量照射受体小鼠(CD45.1)(n＝10/剂量组)。移植后5周和14周分别检测外周血各系列分化情况。阳性植入定义为小鼠CD45.2⁺细胞比例大于等于2.5％，并存在多向分化。L-Calc软件计算CRU值(Stem Cell Technologies)。本图显示移植后5周(5W)和14周(14W)时CRU值的差异。

图3c显示移植更高剂量HSCs的重建造血能力。80个CD34^-LKS细胞和10⁵Sca-1阴性竞争性骨髓细胞共移植致死剂量照射受体小鼠(n＝5)。该图显示测试细胞的重建造血能力表现为移植后5周(5W)和14周(14W)时血液中CD45.2和CD45.1/CD45.2的比例。图3d显示多向分化情况。6色流式细胞分析用于检测多向分化。“GM”，“T”和“B”分别代表髓系(Gr-1⁺和Mac-1⁺)，T细胞系(CD3⁺)和B细胞系(B220⁺)。

图3a显示我们观察到每只p18^-/-小鼠骨髓CD34^-LKS细胞富集的频率和产率分别增加了2倍和3倍。相反，缺乏HSC活性，仅包含定向分化HPC亚群的更趋向于成熟的Lin^-c-Kit⁺Sca-1^-(LKS^-)细胞，产生的频率变化不明显。因此，p18缺乏增加了HSC的数量，而不是HPC。

p18^-/-骨髓HSC频率(CD34^-LKS)增加2倍并不足以解释p18^-/-细胞在连续竞争性骨髓移植过程中，相对于p18^+/+细胞的显著植入优势(图1b和图2a)。此外，另一种可能是移植后p18^-/-HSCs在不断持续增殖。为了进一步解释这一现象，我们以极限稀释法移植CD34^-LKS细胞(10，20或40个CD34^-LKS/只小鼠，10只/剂量组)检测竞争性造血重建单位(CRU)。原有的C57BL/6；129/Sv品系和纯C57BL/6L-Ly5.2(CD45.2)背景品系回交10代，使得我们能在同基因小鼠品系中完成实验。(见图18)。

移植后5周和14周分别检测小鼠CD34^-LKS细胞的CRU频率。有趣的是，p18^+/+CD34^-LKS细胞CRU频率仅由1/22轻度增加至1/14，而p18^-/-CD34^-LKS细胞则由1/12大幅度增至1/4(图3b)。将骨髓CD34^-LKS细胞的频率和产率标准化后，移植后14周p18^-/-骨髓(2条股骨和2条胫骨)的CRU频率增加了约7倍，产率增加了约10倍。CRU检测结果和移植高剂量CD34^-LKS细胞(80个/只小鼠)的结果吻合(图3c)。移植后3个月p18^-/-组植入率相对于竞争性细胞增加了7倍，并且无明显系列分化改变(图3d)。如果将全骨髓CD34^-LKS细胞增加2倍标准化，图1b所示的竞争性骨髓移植，p18^-/-LTRA增加14倍。见图3a，左栏。

CD34^-LKS细胞选择性增加，这一现象在趋于成熟的LKS^-细胞中则未观察到(图3a)，以及CD34^-LKS细胞CRU的自我更新(图3b)，都提示p18对HSCs有特异性作用。为了直接阐述此观点，我们检测了骨髓移植(BMT)后受体各免疫表型亚群细胞的细胞分裂次数。移植前用5，6-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染料标记供体细胞，骨髓移植后2天用HSCs和HPCs表面标记物共标记收集的骨髓细胞。受体中各细胞群体的CFSE强度用于定量初始细胞的分裂次数。

实验共检测到3次细胞分裂，相对于p18^+/+对照，p18^-/-Lin^-Sca-1⁺和p18^-/-Lin^-Sca-1^-母代细胞群分裂的细胞数量均明显增多，并保持原有的表型(流式细胞仪用“前体细胞频率”测算)。然而，在p18^-/-细胞中，较为早期的Lin^-Sca-1⁺细胞亚群比较为成熟的Lin^-Sca-1^-细胞亚群的细胞分裂要显著增多(约大于2倍)。数据见图4。

图4直接显示了p18^-/-HSCs体内分裂增加。将CFSE标记的骨髓细胞移植致死剂量照射受体小鼠，并在移植后2天收获，用于测算细胞的分裂次数。用方法部分介绍的具体方法以系列标记物和干细胞标记物标记细胞。在特定的免疫表型设门，分析CFSE标记的细胞。

图4a为流式细胞仪分析的示意图。右侧蓝色峰表示未分裂细胞(母代细胞)，依次向左的每个峰代表一次细胞分裂或一代细胞。一次代表性实验中参与分裂的细胞比例标示在图中。图中显示了结果相同的4次重复实验当中的一次结果。

图4b为4次独立实验平均值的总结。根据电脑模型，假设各细胞群(Lin⁺vs.Lin^-Sca-1^-vs.Lin^-Sca-1⁺)中，通过各子代细胞的增殖，细胞总数将增加一倍。用ModFit LT软件计算“前体细胞频率”，即计算实验开始时的细胞总数所占的比例。(通过模型倒推计算)，并且这些细胞在随后的细胞分裂过程中发生了增殖。数据显示了p18^-/-和p18^+/+细胞群前体细胞频率的比例(重复4次实验，每次实验3-5个供体小鼠/基因型)。

因此，图4说明p18缺乏并不引起各系列细胞增殖的普遍增加。相反，p18缺乏优先影响较原始细胞的分裂，从而增加了HSC的自我更新。

图5显示BrdU掺入率的测定图。为了评价体内不同造血细胞亚群的细胞周期状态，分别给予移植或非移植小鼠单次剂量的溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)，第2日处死小鼠，结合不同的造血细胞表面标记分析BrdU的掺入率。我们发现p18^-/-和p18^+/+组造血细胞亚群的BrdU掺入率并无差异。由于我们未以最严格的方式明确记录BrdU掺入率在干细胞水平的差别，所以我们的数据只能说明p18^-/-骨髓干细胞子代的细胞增殖速度无明显提高。

图6，7，8显示单个干/祖细胞的体外增殖速度。为进一步在单细胞水平评价干细胞的增殖，我们在体外观察了CD34^-Lin^-c-Kit⁺Sca-1⁺(CD34^-LKS)或Lin^-c-Kit⁺Sca-1⁺(LKS)细胞的细胞分裂。将单个CD34^-LKS或LKS细胞置于Terasaki板(1个细胞/孔)，并用添加了SCF、Flt3L和TPO的无血清培养基培养。虽然大多数细胞在3天内进入细胞周期，与之前的报道吻合，但令人吃惊的是，p18^-/-和p18^+/+CD34^-LKS细胞和LKS细胞的细胞分裂速度均无显著差异(＞100个细胞/细胞亚群/实验，共重复5次实验)。此外，CD34^-LKS细胞的首次细胞分裂速度也无差别。这表明p18缺乏并不影响HSC的增殖速度，而是调节HSC的分裂更趋向于对称性分裂。然而有人也许会提出异议，在各免疫表型的细胞亚群中，尤其在LKS亚群中是否有污染祖细胞的可能。但根据我们的数据，充分证明祖细胞池中的增殖速度无明显提高。

图9显示长期培养CAFC的选择性扩增。为了说明p18缺乏是否能在体外增加干细胞的自我更新，我们用Dexter法长期培养骨髓细胞，并计数CAFC。p18^-/-和p18^+/+组在培养的前4周内CAFC产量无差别。然而，自第6周至第19周，p18^-/-组持续产生的CAFCs显著高于p18^+/+组(n＝4)。显著的是，p18^-/-培养物第19周和第5周的CAFC频率持平，而p18^+/+培养物在第19周几乎丧失了产生CAFCs的能力。与此相反，二者第7天的CFU频率无明显差异(体外造血祖细胞检测)。应该指出的是，其他研究者已大量证明在体外小鼠模型中CAFC与长期重建干细胞的功能相关。

实施例

为了收集以上数据，并证实本理论的可操作性，我们进行了以下实验：

实施例1-p18+/+和p18-/-小鼠来源

C57BL/6；129/Sv背景的p18^+/-小鼠来自于Purdue大学David Franklin实验室。p18^-/-或p18^+/+小鼠均由p18^+/-配对产生。小鼠饲养于Pittsburgh大学肿瘤研究所的具有动物饲养合格证的动物中心。PCR检测尾部DNA确定小鼠基因型(引物见下文)。同胞或年龄匹配的小鼠(8-12周)用于竞争性骨髓移植和干细胞免疫表型分析。

杂合背景小鼠和C57BL/6-Ly5.2(CD45.2)背景小鼠杂交10代用于纯化的干细胞移植和CRU检测。骨髓移植用C57BL/6129背景野生型受体小鼠和B6.SJL-Ly5.1(CD45.1)同基因小鼠均购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。所有有关小鼠的操作均经Pittsburgh大学实验动物管理与使用委员会批准。

实施例2-竞争性骨髓移植

将相同数量的p18^+/+和p18^-/-骨髓有核细胞(分别为2×10⁶)混匀，移植10Gy全身照射处理的受体小鼠，照射剂量率为5.96Gy/min或0.94Gy/min，取决于不同实验中使用的特定¹³⁷Cs放射源衰变率。

二次竞争性骨髓移植过程中，将首次竞争性骨髓移植后10个月的小鼠骨髓细胞和新鲜分离的野生型小鼠骨髓细胞(8周龄小鼠的未移植细胞)以1∶1混合，二次移植至经致死剂量照射的野生型受体小鼠(8周龄)。移植后不同时间点采血，用半定量PCR进行基因型检测。在首次或二次竞争性骨髓移植后的不同时间点，处死部分小鼠，用骨髓有核细胞进行不同系列基因型分析和HSC或HPC细胞亚群实验，包括单细胞或集落实验。

结果见图1。图1显示p18^-/-造血细胞在首次竞争性骨髓移植后长期植入过程中具有生长优势。p18^-/-和p18^+/+小鼠骨髓细胞以1∶1混合，移植致死剂量照射受体小鼠(总量4×10⁶个细胞/小鼠)。竞争性骨髓移植后不同时间点半定量PCR检测造血重建各基因型的比例。图1a显示胶上各条带p18^-/-总体信号的相对强度与两个细胞群的实际比例之间关系的标准化结果。图1b显示竞争性骨髓移植后7个月血细胞的代表性数据。图1b，1-7道条带分别代表7只受体小鼠。根据标准品，p18-/-细胞转化比例显示于PCR胶。

实施例3-半定量PCR和单集落PCR

半定量PCR检测p18^+/+和p18^-/-细胞的比例，引物如下：

p18WT-F(5’-AGCCATCAAATTTATTCATGTTGCAGG-3’)

p18MG-47-R(5’-CCTCCATCAGGCTAATGACC-3’)

PGKNEO-R(5’-CCAGCCTCTGAGCCCAGAAAGCGAAGG-3’)

p18^+/+和p18^-/小鼠脾脏细胞以不同比例混合作为PCR反应的标准。对于单克隆PCR，显微操作挑取单个克隆，在含有2.5mM MgCl₂，100ug/ml蛋白酶K的1xPCR缓冲液中60℃孵育1小时，然后95℃20分钟中止反应。

实施例4-CFC和LTC-IC培养

将骨髓细胞培养于甲基纤维素培养基M3434(StemCell Technologies)中并接种于24孔板。培养7-14天于倒置显微镜下计数CFC克隆，挑取克隆用PCR检测基因型。同前所述的极限稀释法进行长期培养。简而言之，将全骨髓细胞置于铺有15Gy照射后的原代小鼠基质细胞层的96孔板中，每孔含有添加了10^-6M氢化考的松的M5300培养基(Stem Cell Technologies)150ul。每孔最低剂量大约包含1个长期培养起始细胞(LTC-IC)。每周半量换液，长期培养第5周每孔加100ul M3434(Stem Cell Technologies)。10天后计数板中CFC克隆数量。显微操作分离这些克隆，PCR检测p18基因型。

实施例5-流式细胞仪分析

为进行干细胞定量，骨髓有核细胞分别染以小鼠CD3，CD4，CD8，B220，Gr-1，Mac-1和TER-119生物素化抗体混合物(Caltag)，随后标记链亲合素-PE-Cy7，抗Sca-1-PE，抗c-Kit-APC和抗CD34-FITC(BD PharMingen)。碘化丙啶(Propidium iodide)用于标记死亡细胞。用MoFlo高速细胞分选仪(DakoCytomation)和Summit(3.1版本，DakoCytomation)获取数据并分析。系列表型分析，用抗CD3-PE和抗B220-FITC或抗MAC-1-PE和抗Gr-1-FITC标记50ul外周血。FACS溶解缓冲液(BD Bioscienoes)溶解红细胞，并用Beckman-Coulter XL流式细胞仪进行分析。

实施例6-单个干细胞的分选和培养

根据厂商(StemCell Technologies)说明，用EasySpe试剂盒从骨髓细胞中分离Sca-1⁺细胞，随后染以上述的系列特异性抗体混合物、抗c-kit-APC和抗CD34-FITC。用MoFlo高速细胞分选仪(配备CyCLONE自动Cloner和SortMasterDroplet Control子系统)将LKS或CD34-LKS细胞分选于384孔板(Nunc)，每孔1个细胞。每孔含有50ul添加50ng/ml Flt3配体(Flt3-L)、50ng/ml SCF和10ng/ml TPO的IMDM。培养14天后，显微镜下观察各克隆形态，并挑出克隆溶解后进行PCR。

实施例7-极限稀释法干细胞移植

分选C57BL/6(CD45.2)背景p18^-/-小鼠的CD34^-LKS细胞用于测定竞争造血重建单位(CRU)。将有限剂量的CD34^-LKS细胞(40，20或10个细胞/只小鼠)与1×10⁵来自C57BL/6和B6.SJL(CD45.1⁺和CD45.2⁺)F1子代小鼠的Sca-1^-骨髓细胞混合。将细胞悬液通过尾静脉移植经11Gy剂量分次照射的B6.SJL(CD45.1⁺)小鼠。每个剂量组10个受体。移植后采血，用PE-CD45.1和FITC-CD45.2标记，检测供体细胞的植入率。阳性植入定义为大于等于2.5％的CD45⁺细胞，且包含粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。采用Beckman-Coulter XL细胞仪采集数据。基于阴性植入小鼠的Poisson分布，用L-Calc软件(Stem Cell Technologies)计算CRU值，并表现为散点图。围移植期死亡的动物不纳入分析。作为一项独立的测定植入水平的实验，每组另有5只受体动物移植了较高剂量的CD34^-LKS细胞(80个细胞/只小鼠)。

实施例8-追踪细胞分裂的体内实验

如前所述，用1uM CFSE(Molecular Probes)标记骨髓。1×10⁸经CFSE标记的p18^+/+或p18^-/-骨髓细胞移植致死剂量照射小鼠。移植后2天，受体骨髓细胞染以系列标记抗体混合物，Sca-1和c-Kit。用MoFlo高速细胞分选仪获取数据，用ModFit LT软件(3.0版本，Verity Software House)分析细胞增殖。

统计学分析

Student’s t检验分析p18^-/-和p18^+/+组间的统计差异，p值标示于相应图表中。

总结

虽然p21和p18都影响早期原始细胞的细胞周期动力学，但它们作用方式不同：p21^-/-干细胞出现未成熟耗竭，而p18^-/-干细胞自我更新增强。p18^-/-HSCs再生增加提示p18^-/-缺失使分化和自我更新杠杆更偏向于自我更新，且不引起其它细胞亚群非特异性增殖。这一想法被其他研究者的研究结果间接证实，即表达p18的细胞非对称性分裂增加。人们普遍认为细胞命运决定于细胞周期G1期。一旦丝裂原刺激细胞，周期素D表达上调并与CDK4/6相互作用，导致Rb磷酸化，推动细胞周期向前。虽然Cip/Kip蛋白(如p21)在G1/S期广泛抑制CDK2，并可能在M期抑制CDK1，但它们不能在G1早期抑制CDK4/6活性。相反，INK4蛋白(如p18)能在G1早期与周期素D特异性竞争结合CDK4/6。考虑两个CKI家族在干细胞调控中的不同作用，我们设计了一个模型，在细胞周期的特定位置调控某个或某一类CKI，这可能是调控干细胞自我更新和分化的重要机制。下调p18能加强干细胞扩增，目前这一结果正在成体细胞中实验。

尽管之前本文已详细介绍了一些具体的实施例，按照本发明中的指导，该技术中的技巧还能衍生出其它不同的实验方法。因此，本人认为该专利范围不是由特定的摘要或本发明介绍的实施例限定的，而是由所附的权利要求及其等同的法律效力限定的。

在权利要求中，使用特定的方式定义某些术语。例如：单数允许多数(如权利要求措词，“一种选自包含A，B和C的组合的复合物”涵盖了含有至少一种和可能两种或两种以上所列举化合物的组合物)。

权利要求术语“对称性自我更新细胞亚群”包含了体外细胞培养和体内培养，例如治疗性或实验性植入。

权利要求术语“人兼容性”表示能在人体内植活。这可以通过如下方式实现，例如使用仅引起微弱的或不引起免疫反应的非免疫源性细胞系，或给病人联合应用其它免疫抑制剂，抑制干细胞植入诱发的免疫反应。非免疫源性细胞可以是例如病人自身的干细胞，将其从人体分离后经过体外培养，再自体回输。

术语“细胞内环境”表示干细胞培养的细胞内环境。术语“基本不包含”表示低于抑制细胞系自我更新的量。我们可以通过如下方式控制细胞内环境，例如通过敲除或使p18基因突变(得到p18^-/-基因型细胞)，或敲除或使其启动子突变(得到p18-基因型细胞)，或下调启动子基因，或用具有结合能力的化合物中和p18蛋白，以达到限制p18蛋白表达的目的。已知可通过“RNA干扰”下调基因表达来抑制p18表达，即使用小RNA干扰片断或者针对RNA的基因沉默。本人在此不暗示任何未阐明的暂时性限定，例如本人认为本发明权利要求涵盖了p18转录本的暂时下调，或p18蛋白的暂时性结合或酶解，这样一旦去除p18抑制性因素，细胞可以恢复p18⁺表型。

在权利要求中，术语“p18”表示本领域已知的多肽(参见如上所述)，但也表示任何发生突变，但与其本身无实质变化的多肽。从而，例如，野生型变种或突变尽管与公布的p18序列不尽相同，但均具有抑制细胞再生能力的相似功能，故野生型变种或突变在所附权利要求中也被认为是“p18”。

p18表达水平的变化或细胞系p18功能的抑制可用于筛选可能促进干细胞自我更新的药物候选物，并检验可能的药物候选物对p18⁺和p18^-细胞的有效性。因此，在权利要求中，术语“候选物成分”表示可用于某治疗用途的候选物成分；其可以是小分子量有机化学物质，例如，或多肽。

Claims (22)

1.一种方法，其特征在于，它包括：在基本上不含有p18的细胞内环境中，调控人兼容性干细胞群的自我更新。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞主要指未分化的干细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人兼容性干细胞指人干细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人兼容性干细胞表达的野生型p18蛋白比野生型干细胞少。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞群的自我更新在人体内至少部分出现。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的人体内细胞群的自我更新包括将干细胞移植给人体作为治疗用途。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的干细胞主要指未分化的干细胞。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的人兼容性干细胞指人干细胞。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的人兼容性干细胞表达的野生型p18蛋白比野生型干细胞少。

10.一种组合物，其特征在于，它包括人兼容性干细胞的自我更新细胞群，所述的干细胞具有不含p18的细胞内环境。

11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述的干细胞主要指未分化的干细胞。

12.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述的人兼容性干细胞指人干细胞。

13.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述的人兼容性干细胞表达的野生型p18蛋白比野生型干细胞少。

14.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述的细胞群的自我更新在人体内至少部分出现。

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述的人体内细胞群的自我更新包括将干细胞移植给人体作为治疗用途。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述的干细胞主要指未分化的干细胞。

17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述的人兼容性干细胞指人干细胞。

18.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述的人兼容性干细胞表达的野生型p18蛋白比野生型干细胞少。

19.一种方法，其特征在于，它包括：

a)在不含p18的细胞内环境中调控干细胞群的自我更新；

b)在含有p18的细胞内环境中调控对照干细胞群的自我更新

c)将候选物作用于所述的自我更新细胞群和所述的自我更新对照细胞群；

d)检测候选物作用于所述的自我更新细胞群和所述的自我更新对照细胞群的效果；和

e)比较候选物作用于所述的自我更新细胞群和所述的自我更新对照细胞群的效果。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的候选物选自包括如下的组合：多肽，有机化学物质和无机化学物质。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的候选物包括有机化学物质。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的候选物包括多数有机化合物。

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