CN1867819A - 用于测量细胞多种生理特性的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
一种分析置于容器内培养基中的细胞的方法包括以下步骤：提供一个容器，其具有原始容积的包围细胞的培养基，减小该原始体积的包围至少一部分细胞的培养基，限定一个减少了体积的培养基，并对与该减少了体积的培养基内的细胞有关的组分进行分析。一种用于分析细胞的装置包括，一个平台，其适合于接收一个装有细胞和一定体积培养基的容器，一个柱塞，其适合于接收一个隔挡件，从而在含有至少一部分细胞的容器形成一个减少了体积的培养基，该隔挡件适合于通过与平台和柱塞进行相对运动插入到容器内，和一个传感器，其与该减少了体积的培养基感测相通，其中该传感器用于分析该减少了体积内的组分。
Description
相关专利申请
本申请要求获得美国临时专利申请系列号60/502,417和美国专利申请系列号10/688,791的利益，其中60/502,417于2003年9月10日申请，10/688,791于2003年10月17日申请；本文引用这两个专利申请的全部公开内容作为参考。
技术领域
本申请总体上涉及高通量筛选技术，更明确地，涉及测量活细胞周围的细胞外培养基的组分(分析物)。本文引用的所有专利、文献和其它参考资料构成了本专利申请的一部分，并且本文引用它们各自公开的全部内容作为参考。
背景技术
活细胞典型地消耗来自周围培养基的营养物质和氧气，并将代谢副产物，包括离子、二氧化碳、乳酸盐和各种蛋白质释放到细胞外环境中。这些分析物的吸收和排泄速率能够提供各种有关细胞内正在进行的代谢过程的有价值的信息。
常规的生物学化验具有先天的显著局限性。理想的生物学化验应当是均一的(也就是，不要求引入外来物质，例如染料)，非侵入式的(也就是，对生物过程无毒害作用)和快速的。
人们开发出了许多工具，利用内在化的报告物，例如荧光染料，探测细胞的代谢过程。一种特别有用的装置应当能够在与现有的非侵入式工具兼容的容器内用非侵入式的、均一的化验测量细胞外分析物。
由于呼吸能够看作是细胞生存能力的一个基本度量标准，因此先前的一些方法涉及测量氧的通量速率。人们已经开发出了许多装置，通过确定细胞外培养基中氧的消耗速率，在体外对呼吸进行监视。最初的装置依赖于密封容器内总气压的变化，它们假定这种变化主要是由于氧的消耗造成的。
二十世纪六十年代，Clark电极(Clark，L.C.Jnr.Ann.NY Acad.Sci.1962；102：29-45)和后来的小型Clark电极使人们能够更精确地测量氧分压。Clark设计相对复杂并且电极自身消耗氧气，这一事实可能阻碍了它集成为一个适合于广泛应用的高度平行的装置。然而，这些装置被认为足以成功地测量细胞的生存能力(Gesinski RM，Morrison JH，Toepfer JR.“用极谱法测量大鼠骨髓细胞的氧消耗”(Measurement of oxygen consumption of rat bone marrow cells bypolarographic method)J Appl Physiol.1968；24(6)：751-754)，描述(profile)药物和化学品的毒性作用(Shenoy MA，Biaglow JE，VarnesME，Hetzel FW.“氯丙嗪对人工培养的人肿瘤细胞氧利用的抑制”(Inhibition of cultured human tumor cell oxygen utilization bychlorpromazine)Adv Exp Med Biol.1983；159：359-68)，以及显示作用物，如胰岛素，对细胞代谢过程的影响(Panten U and Klein H.“用Clark型电极测量微培养系统中离体胰岛的氧消耗”(O2 consumptionby isolated pancreatic islets，as measured in a Microincubation systemwith a Clark-type electrode)Endocrinology 1982；111：1595-1600)。
更晚些时候，人们开发出了几种能够非侵入地、均一地读出细胞呼吸的氧传感器。现在已经可以获得能够通过氧淬灭现象消除其响应的荧光化合物。这些化合物能够嵌入到氧可透过的膜内并暴露于细胞培养基中，同时能够用低成本的、光纤耦合的半导体光源和传感器加以阅读(Wolfbeis OS，2002.“光纤-光化学传感器和生物传感器”(Fiber-Optic Chemical Sensors and Biosensors)Annal of Chem.2002；74：2663-2678)。
离子感光场效应晶体管(ISFET)的栅区域暴露在液体分析物中，其通过用酶将氧(O2)催化转换成能够用传感器检测出的H+离子，来测量氧压(Lehmann，M，Baumanm W，Brischwein M，Gahle H-J，FreundI，Ehret R，Dreschler S，Palzer H，Kleintges M，Sieben U and Wolf B.“利用单一CMOS ISFET.2001同时测量细胞呼吸和酸化”(Simultaneous measurement of cellular respiration andacidification with a single CMOS ISFET.2001.)Biosensors &Bioelectronics.2001；16：195-203)。
已经说明和/或例证的装置，它们在含有细菌或哺乳动物细胞的样品室内安装有氧淬灭荧光团、ISFET和其它的氧传感器，用于测量呼吸速率、生存能力或药物或毒素的作用。这些装置的尺寸范围从附着于大细胞培养瓶内壁上的荧光片(Tolosa L，Kostov Y，Harms P，Rao G.“摇瓶内溶解氧的非侵入式测量”(Noninvasive measurement ofdissolved oxygen in shake flasks)Biotechnol Bioeng 2002 Dec 5；80(5)：594-7)，到嵌入到用微流体技术制造的显微流动池内的荧光传感器(Lhdesmki I，Scampavia LD，Beeson C and Ruzicka J.“通过珠注射分光镜检测人工培养的粘附细胞的氧消耗”(Detection of OxygenConsumption of Cultured Adherent Cells by Bead InjectionSpectroscopy)Anal.Chem.1999；71：5248-5252)，再到具有悬浮荧光化合物的微滴定盘(O’Riordan TC，Buckley D.，Ogurtsov V，O’Connor R，Papkovsky DB.“通过用光学氧气传感器对呼吸进行监视执行的细胞生存能力化验”(A cell viability assay based on monitoring respirationby optical oxygen sensor)Anal.Biochem.2000；278(2)：221-227)，或具有沉积在池内的荧光化合物的微滴定盘(Woodnicka M，Guarino RD，Hemperly JJ，Timmins MR，Stitt D，Pitner JB.“用于高通量化验细胞毒性和增殖的新型荧光技术平台”(Novel fluorescent technologyplatform for high throughput cytotoxicity and proliferation assays)Journal of Biomolecular Screening.2000；5：141-152)。
一些专利描述了一种利用氧淬灭荧光化合物监视细胞的装置，其中荧光化合物被布置成与含有细菌或哺乳细胞的培养基流体(broth)相接触。经过药物或毒素处理的细胞的荧光测量结果可以和参照物进行比较，据称可以确定化合物对细胞呼吸的影响。在一个实施例中，细胞盛放在一个暴露于周围空气的微平板内。细胞保持低密度以便保持其生存能力，因为高的细胞密度可能会导致缺氧症、培养基酸化和接触抑制。因此，典型的测量时间可以是几十小时或几十天。此外，周围氧气的流入和如果对样品的体积缺乏控制，则可能只允许进行与控制组的相对测量。在另一实施例中，为了限制周围氧气流入，在细胞培养基上添置矿物油。因为细胞密度通常都非常低，所以常常需要很长的测量时间。
许多专利和出版物都对具有含有高密度细胞的小而封闭的样品室的氧通量测量系统进行了说明。在这些装置中，使用一种自主灌注系统间歇地恢复溶解氧、pH和营养物质的正常水平。这些系统的设计或配置都不能够使用户容易地培养细胞，保持其生存能力，高通量地进行试验，或者在不分离或移动细胞的情况下进行其它类型的化验。
还有一些方法能够测量细胞的酸化速率。活细胞产生质子(H+离子)作为各种代谢过程的副产物，包括有氧呼吸和无氧呼吸。当配体与跨膜受体或离子通道相结合从而激活真核细胞表面上的离子交换泵时，也会产生质子。在固定体积的胞外培养基中，该质子通量导致的逐步酸化能够用pH传感器加以测量。因此，能够通过精确地测量细胞外酸化速率确定代谢速率和/或受体活性的指征。
许多pH传感器都能够用于对细胞培养基进行测量。除了与前面描述的相似的荧光和ISFET传感器之外，装置内还可以安装一种可光寻址的电位传感器，用于快速测量质子通量(Parce W，Owicki J，Kercso K，Sigal G，Wada H，Muir V，Bousse L，Ross K，Sikic B andMcConnell H.1989.“利用硅生物传感器检测对细胞有影响的作用物”(Detection of Cell-Affecting Agents with a Silicon Biosensor)Science.1989；246(4927)：243-247)。
一篇专利描述了这样一种装置，其采用某种方法测量细胞外酸化(pH)作为细胞代谢的指征。在这种装置中，一个含有高密度细胞的小样品室间歇地用培养基加以灌注然后再封闭，以便测量由于细胞质子的释放造成的pH变化。一系列重复的停止/流动循环可以提供动力学代谢速率数据。因为一旦装配起来，样品室的尺寸就是固定的并且含有高密度的细胞，所以需要自主灌注，以防止细胞因培养基的快速酸化和氧气耗竭而死亡。给装置添加灌注系统需要相对复杂的管路系统、泵和其它部件，这给用户带来了清洁和灭菌的问题。此外，当用这种装置对细胞进行药物处理时，药物需要灌注细胞相对更长的时间，因此会消耗大量的通常稀有而昂贵的化合物。
其它的细胞外分析物也可以用非侵入式技术加以测量。通过用各种荧光传感器测量培养基中的二氧化碳分压能够确定二氧化碳的变化情况(Pattison R，Swamy J，Mendenhall B，Hwang C and Frohlich B.“在哺乳动物细胞培养过程中使用原位光纤光化学传感器测量和控制溶解的二氧化碳”(Measurement and Control of Dissolved CarbonDioxide in Mammalian Cell culture Processes Using an in Situ FiberOptic Chemical Sensor)2000.Biotechnology Prog.16：769-774)(Ge X，Kostov Y and G Rao.高稳定性的非侵入式、耐高压加热的裸露光学CO2传感器(High Stability non-invasive autoclavable naked opticalCO2 sensors).2003.Biosensor and Bioelectronics 18：pp.857-865)。
其它的离子和化学组分能够用基于光学或半导体传感器的非侵入式技术加以测量。此外，大分子，如蛋白质，可以用对大分子与抗体的结合敏感的非侵入式技术加以测量，其中抗体附着在暴露于细胞外培养基中的传感器上(Flora K and J Brennan.“利用溶胶-凝胶衍生化材料捕获荧光标记的蛋白质开发光纤生物传感器的各种格式的比较”(Comparison of Formats for the Development of Fiber-OpticBiosensors Utilizing Sol-Gel Derived Materials EntrappingFluorescently-Labeled Proteins)Analyst，1999，124，1455-146)。
其它支持这种传感器的物理现象包括表面等离子体激元共振(Jordan & Corn.“表面等离子体激元共振成像测量生物高聚物在化学修饰的金表面上的静电吸附”(Surface Plasmon Resonance ImagingMeasurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption ontoChemically Modified Gold Surface)Anal.Chem.，69：1449-1456，1997)，光栅耦合器(Morhard et al.，“将抗体固定在微图案内用于通过光衍射检测细胞”(Immobilization of antibodies in micropatterns for celldetection by optical diffraction)Sensors and Actuators B，70，p.232-242，2000)，椭圆偏光法(Jin et al.，“一种基于成像椭圆偏光法的用于将生物分子间的相互作用可视化的生物传感器概念”(A biosensorconcept based on imaging ellipsometry for visualization ofbiomolecular interactions)Analytical Biochemistry，232，p.69-72，1995)，渐消失波装置(Hubet et al.，“直接光学免疫传感(灵敏度和选择性)”(Direct optical immunosensing(sensitivity and selectivity))Sensors and Actuators B，6，p.122-126，1992)，反射计(Brecht &Gauglitz，“光学探针和传感器”(Optical probes and transducers)Biosensors and Bioelectronics，10，p.923-936，1995)和伍德异常(Wood’s anomaly)(B.Cunningham，P.Li，B.Lin，J.Pepper.“比色共振反射，一种生物化学化验技术”(Colorimetric resonant reflection as adirect biochemical assay technique)Sensors and Actuators B，Volume81，p.316-328，Jan.5，2002)
一般而言，这些出于测量细胞分泌蛋白的目的结合了上述传感技术的装置，其应用受到检测灵敏度的限制。通常，通过增加传感器表面附近区域内的细胞密度可以提高灵敏度。但是，由于缺氧症、培养基酸化和接触抑制，随着细胞密度的增加，细胞的健康度下降。虽然有可能将细胞直接粘着于传感器表面，但是通常是不理想的。
需要为分析物的测量提供高密度的细胞，同时为保持细胞的健康和生长提供低密度的细胞。尽管人们已经开发出了许多种用于测量细胞外分析物通量速率的装置，但是仍然有一些要求需要满足，以便能够在生物学研究、药物发现和临床诊断领域具有广泛的应用。需要有一些具有高通量并且容易使用的装置。平行布局是理想的。优选地，可以不必再在化验次数与样品制备时间之间进行折中。缺乏这些属性会导致样品通量降低，因此与现代的药物发现和诊断行为不相容。
此外，还需要有这样一种装置，其能够在与其它高通量化验共用的容器内以非侵入式的方式测量细胞的细胞外通量速率，借此可以使用通量速率测量结果作为现有化验的质量控制或补充测量。
总而言之，需要有这样一种装置能满足如下的目的：数据质量，与现有实验活动兼容，容易使用，从而成为能够广泛采用的新技术。
发明内容
本发明构思并开发出了新方法和装置，其能够为分析物的测量提供高密度的细胞，同时为保持细胞的健康和生长提供低密度的细胞。目前本发明能够在几分钟之内确定各种细胞外分析物的通量速率，能够提供定量的而不是相对的读数，其使用不会对测试细胞的生理状态造成负面影响，并且不需要自主灌注或搅拌系统。
本发明的一个特征是，在含有低密度细胞和培养基混合物的容器内暂时形成一个基本上封闭的样品室，和一个或多个用于测量分析物的传感器。因为在一个较大的容器内产生了一个暂时的样品室，所以能够在进行测量之前和执行完测量之后，立即提供含有高水平溶解态氧气和其它分析物并具有标准pH的培养基。利用这一特征，在对细胞生存能力和呼吸速率反复进行化验的同时，细胞能够生长，维持更长的时间，用药物化合物加以处理，和用任何一种方法进行化验，而不会对细胞造成危害。
进一步，含有细胞的培养基不需要从容器中移出；它只是暂时被替换。因此，只需要极少量的药物化合物。
此外，通过精确控制暂时样品室的尺寸，能够容易地确定细胞外分析物的量化通量速率。因此，不需要外标；能够通过对一个容器进行多次读数确定该容器内细胞通量速率的变化。
本发明一个实施例的要素包括：
1.在较大的充满培养基的容器内暂时形成小而相对不可透过的样品室(含有一个或多个细胞，一个或多个传感器，和少量的细胞培养基)。
这种配置有助于：
>>提高培养基内分析物的变化速率，从而能够在相当短的时间内进行灵敏的测量，也就是，在几分钟内可以执行某些现有技术方法需要数小时才能完成的测量；
>>通过克服现有技术的如下限制，不再需要参照物：
a.灵敏度低(被测培养基流体内的细胞密度低，因此需要测量的信号小)；
b.样品体积未知(不同用户填充每个池的水平和蒸发程度不同)；和
c.O2从周围环境流入(除非像现有技术建议的那样用例如矿物油涂层密封整个池，但这会导致实验终止)；
>>不再需要对流动细胞进行间歇灌注的复杂流体系统，因为根据本发明，高比例的细胞/培养基只是暂时地产生；和
>>为其它类型的传感器，包括SPR，SRU等，开发了一种高灵敏度的基于细胞的化验系统，其中在SPR，SRU等内，受细胞影响的分析物的变化速率低，因此难以测量；
2.专门设计了一种可实现上述目的的装置，包括一个台阶式池和倒置的、在底表面上具有光学传感器的蘑菇形探针；和
3.将上述传感器暂时插入到多个含有细胞的容器内(包括底部透明的微平板)。
>>这能够进行基本上所有的常规化验，而不需要移动细胞或干扰它们与容器表面的粘着；且
>>传感器能够在几分钟内被清理干净并重新使用。
本发明的一个目的是，提供一种用于确定活细胞各种生理特性的、快速的、非侵入式的、且容易使用的方法。特别地，本发明描述了一种装置和方法，其能够测量整体细胞代谢和呼吸速率、需氧与厌氧呼吸的相对比例、各种代谢底物的相对消耗速率、刺激某种跨膜和其它细胞受体的效果、各种分泌因子的产生速率和细胞生存能力。
本装置和方法能够用于多种领域，包括生物学研究，药物发现和临床诊断。本装置能够用作独立的设备，或者与现有化验方法联合使用。例如，作为一种药物发现工具，本装置能够用于根据细胞代谢、蛋白质分泌或内/外细胞离子交换对各种化合物进行筛选。此外，为了确定化合物对细胞或组织样品的毒性作用，可以使用本装置代替更复杂的、侵入式的且耗时的方法。出于这个目的，本装置不再需要添加染料和对细胞进行培养。本装置还能够用于在执行常规化验之前和之后确定细胞或组织的健康程度，借此提高这种化验的性能。
在一个方面中，本发明包括一种用于分析置于容器内培养基中的细胞的方法。该方法包括：提供原始体积的包围细胞的培养基，减少该原始体积的包围至少一部分细胞的培养基，从而限定一个减少了体积的培养基，并对与该减少了体积的培养基内的细胞有关的组分进行分析。
可以包括一个或多个下述特征。可以将减少了体积的包围细胞的培养基增加到基本上与原始体积相等。可以确定组分的第一浓度，在确定了第一浓度之后，可以以预定的时间间隔确定组分的第二浓度。根据第一浓度与第二浓度确定组分的通量速率。
减小了的体积可以是，例如原始体积的大约5-50％，优选地为原始体积的大约5-20％。在一些实施例中，减小了的体积可以小于原始体积的大约5％。
细胞可以包括细菌、真菌、酵母、原核细胞、真核细胞、动物细胞、人细胞和/或永生细胞。至少一部分细胞可以附着在容器的表面。至少一部分细胞可以悬浮在培养基中。至少一部分细胞可以包括活组织。
被分析的组分可以包括溶解的气体(例如，O2、CO2、NH3)、离子(例如，H+、Na+、K+、Ca2+)、蛋白质(例如，细胞因子、胰岛素、化学因子、激素、抗体)、底物(例如，葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、谷氨酸盐、糖原、丙酮酸盐)、盐和/或矿物质。该组分可以被至少一部分细胞从培养基中获取。该组分可以由至少一部分细胞分泌到培养基中。
组分分析可以包括感测组分的存在和/或浓度。组分分析可以包括感测第一组分的第一浓度，感测第二组分的第二浓度和确定第一浓度与第二浓度之间的关系。组分分析可以包括感测组分浓度的变化速率。
可以使用与减少了体积的培养基相接触的传感器。该传感器可以是荧光传感器、发光传感器、ISFET传感器、表面等离子体激元共振传感器、基于光衍射原理的传感器、基于伍德异常的传感器、声学传感器或微波传感器。
组分分析可以包括确定一个参数，例如细胞生存能力、细胞数目、细胞生长速率、对药物、毒物或化学剂中至少一种的响应、实体检测和内在化。
本方法可以包括，灌注额外的培养基通过容器和/或补充容器内的培养基。
减少培养基的体积可以包括，在容器内设置一个隔挡件，其典型地不会导致培养基移出容器外。该隔挡件的至少一部分可以包括一个传感器。选择地或者附加地，减少了体积的培养基可以包括一个传感器，例如荧光团。容器的至少一部分可以包括一个传感器。
在减少培养基的原始体积之前，可以改变至少一部分细胞的环境。该环境的改变可以通过，例如将至少一部分细胞暴露在药物、化学剂或毒物的至少一种内。
在减少培养基的原始体积之后，可以改变至少一部分细胞的环境。
本方法可以包括盖上容器、密封容器和/或搅拌容器内原始体积的培养基的至少一部分。
在另一个方面中，本发明的特征是一个用于分析细胞的装置。该装置包括一个平台，其适合于接收一个装有细胞和一定体积培养基的容器，一个柱塞，其适合于接收一个隔挡件，从而在含有至少一部分细胞的容器形成一个减小了体积的培养基，该隔挡件适合于通过与平台和柱塞进行相对运动插入到容器内，和一个传感器，其与该减小了体积的培养基感测相通，其中该传感器用于分析该减小了体积内的组分。
该装置可以包括下述特征的一个或多个。该传感器可以在不干扰细胞的情况下对组分进行分析。该容器可以包括一个布置在微平板内的池。该池可以包括一个台阶。该隔挡件可以用于在分析组分之前搅拌培养基。
该传感器可以是，例如荧光传感器、发光传感器、ISFET传感器、表面等离子体共振传感器、基于光学衍射原理的传感器、基于伍德异常的传感器、声学传感器或者微波传感器。容器的至少一部分可以包括该传感器，减少了体积的培养基可以包括该传感器，和/或隔挡件的至少一部分可以包括该传感器。
该装置可以包括一个自动的光电子测量系统。该装置还可以包括一个计算机，并具有与该计算电通信的自动光电测量系统。
该隔挡件可以相对于该柱塞偏置。
另一个方面，本发明的特征是用于分析细胞的装置。该装置包括一个用于容纳细胞和一定体积培养基的容器；一个适合于接收一个隔挡件的柱塞，从而在包含至少一部分细胞的容器内产生一个减少了体积的培养基，该隔挡件适于通过与平台和柱塞进行相对运动，在不干扰细胞的情况下插入到容器内，从而使减少了的体积小于培养基体积的大约50％；和一个与该减少了体积的培养基感测相通的传感器，其中该传感器用于分析减少了体积内的组分。
另一方面，本发明的特征是一个平板，其包括多个用于容纳培养基和细胞的池。每个池的至少一部分都包括一个用于接收隔挡件的支座表面(seating surface)，从而产生减少了的体积。
该平板可以包括下述特征的一个或多个。感测表面的形状可以大体上为平面、弓形、锥形、圆锥形、台阶或互锁形。每个池内减少了的体积可以有小于平均池体积大约10％的偏差，优选地小于平均池体积大约5％的偏差，更优选地小于平均池体积大约1％的偏差。每个池的支座表面可以包括一个围绕各自池的内周布置的台阶。该台阶可以位于一个台阶平面上，该台阶平面高于由各个池的底部限定的底平面。台阶平面和底平面可以是平行的平面。台阶平面的高度可以比底平面高大约1毫米(mm)，优选地比底平面高小于大约200μm，更优选地比底平面高小于大约50μm。
在至少一个池内可以设置一个荧光传感器。至少有一个池可以包括一个透明的底。至少有一个池可以包括一个不透明的壁。
在另一方面中，本发明的特征是一个用于分析置于容器内培养基中的细胞的隔挡件。该隔挡件包括一个用于插入到容器内的体部分，该体部分具有一个与容器的第一表面相匹配的隔挡件表面，以产生一个减少了的体积。
可以包括下述特征的一个或多个。隔挡件表面的形状可以大体上为平面、弓形、轮廓截面(contoured)、锥形、圆锥形、台阶或互锁形。该隔挡件可以包括一个与容器的第二表面相匹配的盖子。
在该隔挡件表面上可以设置一个传感器，用于分析位于至少一部分细胞周围的培养基的组分。该传感器可以是光学传感器。该光学传感器可以用于感测荧光团。
一个导体可以和该传感器耦连并从该传感器传导信号。该导体可以是光学纤维，并至少部分地位于该体部分内。该隔挡件可以包括一个读出器，用于从传感器发送信号。该读出器可以是位于立柱上的可视光纤电子器件，和/或由底部进行阅读的平板阅读器。
该隔挡件可以包括多个布置成被微平板内的多个池内接收的隔挡件。
附图说明
图1是本发明一个实施例的部分剖面图，其中容器由具有多个池的微平板内的单个池形成，盖子和传感器组件显示处于测量之前的位置；
图2是图1的盖子和传感器组件处于测量位置时的部分剖面图；
图3示意性图解了根据本发明一个实施例的整个测量系统；
图4a和4b是具有不同支座表面的池的示意性剖面图；
图5a-5c是同时具有传感器组件和读出器的隔挡件的示意性部分剖面图；
图6显示了典型哺乳动物细胞的氧消耗和细胞外酸化速率的研究结果，图中显示的是用本发明的一个实施例进行的8次独立测量的平均值和标准偏差；
图7显示了用本发明的一个实施例对不同数目典型哺乳动物细胞的氧消耗和二氧化碳产生速率进行研究的结果；
图8显示了用本发明的一个实施例根据典型哺乳动物细胞的氧消耗、二氧化碳产生和细胞外酸化的速率研究化合物2，4，DNP作用的结果；
图9显示了利用本发明的一个实施例根据典型哺乳动物细胞的氧消耗、二氧化碳产生和细胞外酸化的速率研究化合物鱼藤酮的作用的结果；
图10显示了利用本发明的一个实施例研究细胞增殖对氧消耗和细胞外酸化的影响的结果；
图11显示了利用本发明的一个实施例研究化合物碳酰胆碱对典型哺乳动物细胞的细胞外酸化速率的影响的结果；和
图12显示了在使用和没有使用本发明的一个实施例形成一个小密封样品室的情况下，测得的容器内典型哺乳动物细胞氧消耗速率的比较结果。
具体实施方式
本发明能够在较大体积的细胞培养基内暂时产生一定体积的高度浓缩的细胞，从而允许对由于细胞的生理活动导致的培养基组分改变进行灵敏的测量。通过暂时地而不是永久地减少培养基体积(从而浓缩细胞/培养基混合物)，细胞只是在短时间内暴露于不正常的环境中，因此不会受到测量处理的不良影响。
在本发明的一个实施例中，细胞生长或布置在含有足够物质种类和体积的培养基的容器的底部，从而能够长时间地进行生长。在容器的底部形成一个样品室，其由容器的底部和垂直侧壁构成，使得所包围的体积足以容纳细胞和减少了体积的培养基。
一个直径略小于容器内壁的隔挡件布置在位于可移动驱动装置上的样品室的上方。一旦驱动，隔挡件便可以被提升高出容器内液体的平面，或者降低到液体内并到达容器侧壁上，形成一个相对密封的样品室，避免样品室内的分析物与位于盖子上方的主体溶液之间进行扩散。
图1显示了典型实施例的剖面图。简图详细描述了容器100，其通常是多池微平板内的一个池110。该单个池110的侧壁形成了容纳活细胞120和细胞生长培养基130的容器100。细胞可以附着在容器的底表面132上，也可以不附着在底表面上，并且底表面可以经过处理或者涂层以利于粘着。选择地，细胞可以悬浮在培养基中，并可以用重力或离心力强迫它达到容器的底部。
用直径略小于容器100内径的隔挡件140形成一个盖子，从而在容器内限定一个样品室150。隔挡件140的直径d1可以是例如6mm，容器100的内径d2可以是例如7mm。在图1中，容器内的隔挡件140显示处于测量前的位置。为了进行测量，可以通过用手动的或者机动的柱塞(致动器)降低隔挡件140或者提高池110，对隔挡件140进行重置略高于容器132底表面，如图2所示。在测量之前将隔挡件定位在如图2所示的位置，从而限定该具有减少了体积的培养基的样品室150，借此提高测量的灵敏度。
可以制造出具有几乎任何尺寸的单个容器，或者可以将多个容器制造成一个一维或二维的排列。在一个实施例中，可以制造出一个与微平板的图形和尺寸相应二维容器图式，正如分子生物学筛选标准协会对微平板描述的那样(“SBS-1占用面积”和”SBS-4池位置”，它们均是于2003年5月20更新的完全推荐标准)，并且含有总共12、24、96、384、1536或者任何其它数目的单池。
容器和样品室通常可以用塑料材料形成，例如聚苯乙烯或聚丙烯，底部透明，侧壁染成黑色，以降低壁与壁之间的光学干扰。
可以采用各种类型的隔挡件暂时减小细胞周围的培养基体积，而并不将培养基排出到容器外部，例如垂直下降的单平面盖板、水平延伸的滑动盖板或者一对盘具有能够旋转的作为阀的切出体。理想的是，隔挡件不扰动(移动)细胞或者细胞附近的培养基，以便减少测量之前所需的稳定时间。
使用图3所示的部件能够组装成一个完整的测量系统。在输送平台310上设置一个容器300，例如一个平板，如一个具有多个池302的微平板。微平板置于隔挡件阵列320下方，其中隔挡件布置在适合于接收隔挡件和吸移管管理器阵列330的柱塞(plunger)322上。每个池的至少一部分包括一个适合于接收其中一个隔挡件的支座表面(见例如图4a和4b)。隔挡件320可以包括传感器。在池内布置原始体积的培养基。通过手动的或机动的驱动，将隔挡件和吸移管管理器降低到微平板内，从而在容器内产生减少了体积的培养基。减少了的体积可以小于例如原始培养基体积的50％。隔挡件适合于通过与平台310和柱塞322的相对运动插入到容器内，也就是插入到池内。隔挡件和吸移管管理器还可以降低到多个含有清洗缓冲液和校准剂(calibrant)的流体存储器340的其中一个内。当隔挡件在容器内产生减少了体积的培养基时，传感器可以和该减少了体积的培养基感测联系，并用于分析该减少了体积内的一种或多种组分。传感器可以用光学接口加以询问，该光学接口由照射光源(例如发光二极管)和光检测器(例如光电二级管)构成，在光学元件之间布置合适的波段限制光纤。用计算机和软件350执行驱动、校准和测量功能。
样品室内培养基的温度变化会通过至少两个方面导致不良的测量误差。第一，培养基保持溶解气体的能力随温度而变化，因此在培养基与周围环境之间进行平衡期间，温度的改变会使得溶解气体的浓度发生显著变化。第二，许多类型的传感器的测量性能会随温度而改变。
为了保证测量的精度和可重复性，要对容器内减少了体积的培养基的温度加以控制，或者对测量结果应用一个校准因子。因为蒸发可导致液体培养基冷却，所以控制蒸发可以理想地降低热漂变、热梯度和气体交换。
对样品室进行环境和温度控制可以减小对测量过程的不良冲击。例如，细胞周围培养基温度的失控变化会直接影响表观氧气消耗的速率。随着温度增加，氧气会自然地从培养基中逸出，从而导致表观的细胞呼吸改变，因为实际上，所观察到的速率变化本质上是试图与温度增加保持平衡的溶解气体的函数。类似地，由于其它失控的环境条件，例如湿度或者暴露于气流当中，导致的培养基蒸发会人为地对多种传感器的测量产生影响，包括测量溶解气体、离子和温度的传感器。
使用本测量系统，化验周期开始于通过使传感器/隔挡件与容器壁相匹配，从而形成具有减少了体积的含有细胞的培养基的封闭样品室。可以对驱动隔挡件的速率和方式进行编程，以防止培养基的快速运动对细胞产生干扰，也就是，使细胞移动，或者对细胞产生剪切应力，同时可以对驱动隔挡件的速率和方式进行改变，以便按照期望产生搅动培养基的流体运动。
此外，可以通过，例如弹簧或其它施力元件将隔挡件独立地加以偏置，以保证盖子同时正确地布置在全部的池内。
然后用光电接口和计算机测量由于细胞外分析物浓度的变化导致的传感器响应的变化。通过在数分钟内进行多次读数，然后计算所选测量点之间的斜率，可以确定分析物的消耗和产生速率。一旦完成测量序列，将传感器/盖子缩回，从而将细胞暴露于每个容器内全部体积的培养基。
该测量系统可以对分析物传感器进行单点或多点校准。例如，可以合并两个含有已知液体的，但pH、氧、CO2或其它分析物水平不同的容器，并反复地执行二点(增益和偏移)校准。选择地，可以使用传感器的“工厂”预校准，而不再需要现场校准，或者将校准减少到单点(偏移)校准。
参考图4a，在一个实施例中，使用微平板提供具有标准化图形的多个测量容器。通过在每个池中设置一个支座表面400，在测量期间能够使细胞周围保持精确的减少了体积的培养基。平板内的每个池中减少了的体积可以有小于平均池体积10％的偏差。在一些实施例中，减少了的体积可以有小于平均池体积5％的偏差，而在一些实施例中，减少了的体积可以有小于平均池体积1％的偏差。支座表面400或台阶可以位于台阶平面410内，该台阶平面位于由各自池的底430限定的底平面420的上方，其中台阶平面410和底平面420是平行的平面。台阶平面的高度一般高于底平面小于大约1mm，典型地高于底平面小于大约50μm-200μm。
参考图4b，在另一个实施例中，引入倾斜表面435，以防止细胞粘着在支座表面440上。可以采用多种可替换的匹配盖子和支座表面，可以组成各种组合并可相互替换，包括大体上呈平面、弓形、轮廓截面、锥形、圆锥形、台阶、互锁形等形状的表面。总体而言，理想的是，匹配装置能够可靠地、可重复地将减少了的体积与原始体积隔离，从而使减少了的体积具有大体上预定的或已知的容积。根据期望，盖子上或池内可以采用附加的支座部件，例如O形环或者弹性或顺应性密封圈、口盖(flap)或其它元件，以提高密封。
隔挡件能够制造成包括一个传感器组件和一个用于从传感器组件发出信号的读出器。图5显示了通过组合管状固体支架500和可移动盖子510或外罩形成的隔挡件的剖面图，其具有一个放大的顶端，形成了一个在上面附着有一个或多个光耦合传感器520的结构。在一个实施例中，外罩用一次性的或者可消毒的材料制成，以防止被细胞培养基污染。读出器530呈光纤的形式，布置在管形支架内，用于在传感器和光电测量系统540之间进行通讯。光电测量系统540可以具有照射源、光学探测器、滤谱器和信号处理部件。光电测量系统540可以是自动的。在一些实施例中，光电测量系统540可以和计算机350电通信(见图3)。
图5b显示了一种可选择的布局，其中传感器用外部光源550加以照射。光电测量系统540可以包括分离的部件，也就是，光学测量系统560和照射系统570。光学测量系统560和照射系统570可以是自动的。在一些实施例中，光学测量和照射系统560、570可以和计算机350电通信。参考图5c，在可选择实施例中，光电测量系统540包括位于管形支架500内的光学和测量部件580和外部电子测量系统585。光学和测量部件可以通过电缆590与外部电子测量系统585联系。
按照期望，可以采用任何形式的信号通讯。信号通讯的形式可以包括：信号变化的简单可视询问，例如颜色变化；来自容器任何一侧的光纤信号通讯；从透明容器的底部询问信号的激光或基于CCD的平板阅读器。
实际上，可以采用多种不同的容器、隔挡件和传感器配置。总的容器体积可以从许多升到几分之一毫升(ml)，但一般小于1ml。暂时样品室中封闭的减少了体积的培养基与容器内提供的原始体积的培养基的比例可以从50％到小于大约5％，甚至低至小于大约1％，但典型的范围是5-20％。
能够对许多不同类型和数目的细胞进行分析，包括细菌、真菌、酵母、原核和真核细胞、动物或人细胞等。细胞能够附着在容器壁上，或者可以悬浮在培养基中。可以对永生细胞、天然和原代细胞、匀质或切片组织进行分析。可以使用离心将容器样品室区域内的细胞浓集。
可以对任意数目的培养基组分进行分析，包括溶解气体、离子、蛋白质、代谢物、盐和矿物质。这些组分可以被细胞利用(例如O2)，或者可以由细胞作为副产物产生(例如CO2和NH3)，或者作为分泌因子(例如胰岛素、细胞因子、化学因子、激素或抗体)。还可以对离子，例如细胞在各种细胞代谢过程中分泌或获取的H+、Na+、K+和Ca++加以分析。可以分析细胞消耗或产生的底物，例如葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、谷氨酸盐、糖原和丙酮酸盐。可以使用专门的培养基提高测量的灵敏度。例如，通过使用缓冲能力较低的培养基，例如无碳酸氢盐的培养基，增加由于细胞外酸化作用导致的pH变化。
用本方法执行的分析可以简单地检测培养基中某种组分的存在，或者可以量化分析某种组分的浓度、体积或分压的数值和变化。通过集成大量的传感器，可以对组分的一种或多种比率进行分析。例如，细胞进行厌氧和需氧呼吸的比率可以通过计算氧气消耗速率和细胞外酸化速率的比率加以确定，其是通过测量细胞外培养基中的氧分压和pH实现的。分析可以包括感测第一种组分的第一浓度，感测第二种组分的第二浓度，并确定第一浓度与第二浓度之间的关系。
可以使用的传感器的类型包括氧传感器，例如氧淬灭荧光传感器、酶耦连ISFET传感器、微型Clark电极或者其它氧传感器；pH传感器，包括荧光传感器、ISFET传感器、pH敏感的染料传感器、LAP传感器或者其它pH传感器；CO2传感器，包括碳酸氢盐缓冲液耦连和铵染料耦连荧光传感器以及其它的CO2传感器；各种离子和小分子传感器；大分子传感器，包括表面等离子体激元共振传感器和采用伍德异常原理的传感器；声学传感器；和微波传感器。
本发明可以用于测量任意数目的细胞特性和细胞功能。例如，通过测量氧消耗速率和细胞外酸化速率或者其它代谢分析物的通量，可以确定细胞生存能力和代谢速率。通过将一种或多种分析物的通量速率与每个细胞的已知速率进行比较，可以确定细胞的数目，从而能够监视生长速率。
可使用的传感器的数目可以从一个到成百上千个。溶解气体传感器可以布置在样品室内，但不与培养基直接接触。然而，其它的传感器应当与培养基直接接触，并且非常贴近于细胞。这可以通过将指示剂化合物，例如荧光团，与细胞培养基混合加以实现，或者通过将指示剂包埋在能够透过待测量分析物的化合物中实现。然后，包埋的指示剂可以附着在容器样品室区域的任何表面上。
在一个实施例中，可以在隔挡件的下表面附着一个或多个传感器，从而在降低隔挡件时，传感器能够暴露于细胞外培养基中。用于这种目的的传感器的一个实例是荧光指示器，例如包埋在氧可透过物质内的氧淬灭荧光团，氧可透过物质例如硅树脂橡胶。
然后，可以以预定的时间间隔对单组细胞进行连续测量，以分析细胞外环境改变对其功能的影响，例如检验暴露于药物、化学剂或毒物的效果。正如先前所描述的那样，在本方法中，首先减少包围细胞的培养基的体积，测量培养基的组分，然后使体积恢复到原始值。接着通过例如添加一种可促进某种跨膜受体的化学剂，改变氧气的溶解水平或添加营养组分，改变包围细胞的环境。然后用暂时减少体积的方法进行一个或多个额外的测量循环，从而分析改变了的细胞外环境的作用。
在连续测量的任意时刻，都可以对细胞培养基进行补充。这样，可以进行数分钟、数小时或者数天的连续测量。可以遵循任何一种不同的方法对培养基进行补充。可以通过用标准手动或自动吸管装置基本上除去整个容器体积内的一部分或全部培养基来补充培养基。选择地，当隔挡件降低到合适位置时，可以只补充容器中减少了的体积内的培养基。在后面一个方法中，可以通过柱塞机构内的入口或通过位于容器侧壁或底部任何一个上的入口从容器的顶侧进行流体抽提和输送，对培养基进行补充。
可以引入环境改变组分，例如化学剂、溶解气体或营养物质，可以如上所述地施加给整个容器体积，或者选择地只施加给容器减少了的体积。在后面一个实施例中，如前所述，首先减小包围细胞的培养基的体积，测量培养基的组分，然后将体积恢复到其原始值。接着再次减小体积，然后通过柱塞内的或者容器内的入口添加某种组分，只改变直接包围减少了体积内的细胞的环境，其中柱塞和容器限定了该减少了的体积。对该组分的存在进行一次或多次测量。在该测量循环之后，对该减少了体积内的培养基进行一次或多次交换，以便在将细胞再次暴露于整个原始体积之前将组分冲洗干净。这种方法具有一个优点，即减小了化合物的需要量。同时还有可能研究各个单独的效果而不会污染整个体积，借此，实际上，模拟了池平板模式中的流动系统。
实例
下面的实例说明了当前本发明的某些代表性的和优选的实施例和应用，但是并不解释为本发明所有的实施例和应用。
实例1
重复测量C2C12成肌细胞的基础呼吸和酸化速率：
制造了一种原型装置用于评估本发明的各种性能和潜在应用。
该装置包括一个圆柱形容器，用聚碳酸酯材料制成，并设计成接收直径12mm的、具有大约3μm孔的聚碳酸酯膜组件(CorningSnapwellTM P/N 3802)。圆柱形聚碳酸酯盖子能够暂时插入到容器内，用以形成一个较小的样品室，该样品室的高度大约为1.5mm，体积为大约160微升(μl)。一系列围绕容器外周分布的孔允许插入3个直径500μm的光学纤维。每个光学纤维的远端用荧光感测材料进行涂布，从而形成一个生物传感器。
这三个生物传感器设计用于测量容器内所含培养基的O2和CO2的分压以及pH。一个光纤顶端涂布有钌染料基质，被包封在氧可透过的硅树脂橡胶内，用于溶解的氧浓度读出器，第二个光线顶端涂布有荧光染料络合物被包封在硅树脂橡胶内，用于提供一个H+(pH)离子浓度读出器。第三个生物传感器用CO2可透过的膜制造，用以产生一个包围羟基芘三钠盐(HydroxyPyrene Trisodium Salt)(HPTS)pH敏感染料的NaHCO3小型贮液器。然后，细胞培养基中CO2的浓度变化导致该包封试剂的pH改变，从而使pH敏感染料的荧光性能发生可测量的变化，并且对该变化进行校准从而提供量化的CO2浓度数据。
用发光二极管以不同的波长(以纳米为单位)对三个光学传感器进行照射，如表1所示。表1还显示了用于感测每个传感器的荧光发射的波长。在每个实例中，同时测量染料对分析物敏感的(“传感”)和对分析物不敏感的(“参考”)荧光性质，以便使不良漂变和干扰最小化。使用二色分光器将各个光纤/染料组件与一对光电二极管/光纤组件(O2传感器)或一对LED/光纤组件(pH和CO2)耦连。
表1分析物传感器的激励和发射波长
| 传感激励 | 参考激励 | 传感发射 | 参考发射 | |
| 氧 | 488nm | 488nm | 610nm | 535nm |
| pH | 464nm | 435nm | 530nm | 530nm |
| CO2 | 460nm | 415nm | 530nm | 530nm |
用多个测量点和多项式回归方法对每个传感器校准一次，从而建立非线性的校准曲线。
然后用两点校准方法对传感器进行每日重新校准。pH传感器的校准是通过浸没在pH6.0的缓冲溶液中2分钟，然后浸没在pH8的溶液中2分钟，并对光学响应进行采样，从而加以校准。氧和CO2传感器的校准是通过将两种传感器浸没在用室内空气洗涤的盐浴中2分钟，然后浸没在用10％ CO2/90％ N2洗涤的浴中，同时获取数据点，从而加以校准。
在典型的化验中，大约1.5×105个细胞与500μl液体培养基一起置于容器内，产生3×105个细胞/ml的细胞密度。为了进行测量，将圆柱形盖子暂时插入到容器内。盖子移除液体培养基但不移除细胞，从而形成体积为160μl的小样品室，因此获得大约1×106个细胞/ml的细胞密度。这使得生物传感器附近培养基内的分析物的变化速率提高超过6倍。
为了评估原型设备可重复测量细胞外分析物通量速率的能力，在8个彼此分离的直径12mm的多聚碳酸酯膜的每一个上面接种1.5×105个未分化的C2C12鼠科动物骨骼肌细胞(从ATCC，Manassas，VA获得)，然后在37℃下培养12小时。
在后续测试中，将池从培养箱中移出，目测地加以检查，并放置到测量装置内。然后添加160μl无碳酸氢盐(NaHCO3)的DMEM培养基(从Specialty Media，Phillipsburg，NJ获得)，将该装置组装成一个封闭的样品室。然后在20分钟内每8秒钟对每种分析物的浓度(O2和CO2的分压和作为质子浓度指示器的pH)测量一次，计算每种分析物在4分钟内(从t＝12分钟到t＝16分钟)的平均变化速率。
为了确定O2和CO2的细胞外通量速率，分压的变化速率除以培养基中可获得的每种分析物的体积(摩尔)，从而产生用nmol/min表示的数值。酸化速率用mpH单位/min表示(在图表中放大了20倍)，但是也能够通过计算已知样品体积的培养基缓冲液内可获得的质子的数目容易地显示为每分钟的质子数。
图6中显示了8次测试系列中溶解的氧和pH的衰减速率的平均值和标准偏差。如图所示，在原型装置中，这些通量速率高度可重复。
实例2
各种细胞密度的基础呼吸和酸化速率的测量
使用实例1所述的试验装置检查细胞数目与氧和CO2通量速率之间的关系。在直径12mm的聚碳酸酯膜(Corning SnapwellTM)上接种不同数目(1.0×105-4.0×105)的C2C12成肌细胞，然后在37℃下培养12小时。
然后将池从培养箱中移出，目测地进行检查，并放置在测量装置内。然后添加150μl无NaHCO3的DMEM培养基(从Specialty Media，Phillipsburg，NJ获得)，将该装置组装成一个封闭的样品室。然后在20分钟内每5秒钟对每种分析物的浓度测量一次，计算从开始后t＝10分钟到t＝20分钟内的平均变化速率。最终的通量速率如表2所示，并绘制成图7的曲线。
表2
通过对C2C12成肌细胞进行变动滴定(varing titration)测量代谢分析物
| 细胞#(000) | O2速率 | CO2速率 | pH速率 | CO2/O2 | O2/pH |
| 400 | 0.77 | 1.22 | 0.023 | 0.88 | 0.33 |
| 300 | 1.06 | 1.22 | 0.021 | 1.15 | 0.50 |
| 200 | 0.70 | 1.08 | 0.019 | 0.93 | 0.35 |
| 150 | 0.57 | 0.90 | 0.021 | 1.63 | 0.26 |
| 100 | 0.29 | 0.68 | 0.013 | 2.36 | 0.22 |
正如所预期的，表2的数据显示，对于大多数细胞密度，细胞密度的增加以近似线性的方式使分析物通量速率增加。当细胞密度超过3×105时，可能由于接触抑制和拥挤效应，氧通量不再快速增加。
因此，本装置能够用于评估高细胞密度对代谢速率的影响。
实例3
2，4-DNP对C2C12成肌细胞的影响
化合物2，4-DNP能够通过使呼吸链和磷酸化系统失去联系，从而使线粒体呼吸与ATP合成解耦。已知当存在该化合物时，氧消耗会显著增加，而质子通量保持相对恒定。
在本实验中，将C2C12成肌细胞接种在直径12mm的聚碳酸酯膜上并培养12小时。然后将池从培养箱中移出，目测地进行检查，并放置到测量装置内。然后添加160μl无NaHCO3的DMEM培养基，将该装置组装成一个封闭的样品室。
然后在20分钟内每5秒钟对培养基中的O2和CO2溶解浓度和pH测量一次，以便确定每种分析物通量的控制基线。一旦建立控制基线，便执行连续的测量，向池培养基中添加不同剂量的2，4-DNP(从Signa，St.Louis MO获得)，并对分析物通量速率测量20分钟。同时用最高剂量的2，4-DNP，但没有细胞，进行控制实验。剂量响应数据如表3和图8所示。
表3
2，4-DNP对C2C12成肌细胞的影响
| 2，4-DNP剂量(μM) | O2速率(nM/min) | CO2速率(nM/min) | pH速率(pH/min) | CO2/O2 | O2/pH |
| 0 | 0.38 | 2.22 | 0.024 | 5.83 | 0.16 |
| 10 | 1.26 | 2.78 | 0.028 | 2.18 | 0.46 |
| 50 | 1.99 | 4.24 | 0.031 | 2.13 | 0.64 |
| 100 | 2.30 | 4.59 | 0.032 | 2.00 | 0.73 |
| 100，无细胞 | -0.18 | 0.15 | 0.001 | -0.84 | -1.30 |
正如所预期的，表3的数据显示，用2，4-DNP进行处理，导致O2消耗呈剂量依赖地增加，而对细胞外酸化作用几乎没有影响。
实例4
鱼藤酮对C2C12成肌细胞的影响
已知鱼藤酮能够通过阻断呼吸链中的NADH脱氢酶而抑制细胞呼吸。使用C2C12成肌细胞显示这一效果。在膜上接种1.5×105个C2C12成肌细胞，培养并与150μl无NaHCO3的DMEM培养基一起放置在装置系统内，如实例3所述。
然后在20分钟内每5秒钟对培养基中的O2和CO2溶解浓度和pH测量一次，以便确定每种分析物通量的控制基线。一旦建立控制基线，便执行连续的测量，向池培养基中添加不同剂量的鱼藤酮(从Signa，St.Louis MO获得)，并对分析物通量速率测量20分钟。同时用最高剂量的鱼藤酮，但没有细胞，进行控制实验。剂量响应数据如表4和图9所示。
表4
鱼藤酮对C2C12成肌细胞的影响
| 鱼藤酮剂量 | O2速率 | CO2速率 | pH速率 | CO2/O2 | O2/pH |
| 0 | 0.58 | 1.50 | 0.027 | 2.56 | 0.22 |
| 25 | 0.44 | 1.76 | 0.026 | 4.00 | 0.17 |
| 50 | 0.26 | 2.08 | 0.031 | 8.02 | 0.08 |
| 100 | 0.19 | 2.34 | 0.023 | 12.18 | 0.09 |
| 200 | 0.04 | 2.24 | 0.027 | 69.84 | 0.02 |
| 200，无细胞 | -0.07 | 0.14 | 0.001 | 7.51 | -0.51 |
正如所预期的，表4的数据显示，用鱼藤酮进行处理，导致这些细胞中的O2消耗速率剂量依赖地增加。
实例5
测量由于细胞增殖导致的呼吸和酸化速率的改变
使用实例1中说明的实验装置用于研究细胞增殖与氧、CO2和质子通量速率之间的关系。将5.0×104的C2C12成肌细胞接种在直径12mm的聚碳酸酯膜上，在接种后，在37℃下培养12小时，然后将细胞置于无血清培养基的DMEM中(Gibco，Carlsbad，CA)抑制增殖。24小时后，将一半细胞转移到含有血清培养基的DMEM中刺激增殖，而另一半保持在无血清培养基内。
然后将池从培养箱中移出，目测地进行检查，并放置到测量装置内。然后添加57μl无NaHCO3的DMEM培养基(从Specialty Media，Phillipsburg，NJ获得)，将该装置组装成一个封闭的样品室。然后在20分钟内每8秒钟对每一种分析物的浓度测量一次，并计算开始后t＝10分钟到t＝20分钟衰退的平均速率。最终的通量速率如表5和图10的曲线图所示。
表5
细胞增殖对细胞外分析物通量的影响
| O2速率(nMole/min) | pH速率*10(PHU/min) | |
| 50K刺激 | 0.311+/-0.091 | 0.188+/-0.020 |
| 50K饥饿 | 0.082+/-0.019 | 0.102+/-0.050 |
正如所预期的，表5中的数据表明，细胞增殖导致耗氧量和细胞外酸化速率增加。
实例6
测量CHO-M3细胞中G蛋白耦连受体的激活
先前的研究显示，刺激跨膜受体通常导致细胞外酸化速率快速增加，这主要是由于离子交换泵的剧烈激活。在本实验中，使用原型装置检测用受体兴奋剂处理细胞之后，细胞外酸化速率的变化。
对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染，从而过表达蝇蕈碱受体亚单位m3。然后在用众所周知的普通乙酰胆碱受体兴奋剂——碳酰胆碱处理之后，用实例1所述的原型装置监视O2消耗、CO2生成和细胞外酸化速率。
材料和方法：细胞培养剂从Gibco BRL(Grand Island，NY)获得。碳酰胆碱购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。无碳酸氢盐的DMEM培养基从Secialty Media(Phillipsburg，NJ)。聚碳酸酯膜接种井(snapwell)(直径12mm，孔径3μm)从Corning(Corning，NY)获得。表达m3-蝇蕈碱受体的CHO细胞(CHO-M3细胞)从美国典型组织培养库(American Type Tisssue Culture)(ATCC；Manassas，VA)获得。细胞在含10％胎牛血清(Hyclone)、1％ GlutaMax和0.1％庆大霉素的Ham’s F-12培养基中培养，并保存在5％CO2培养箱中。当细胞达到80％融合(confluency)时进行次培养。在使用前24小时，CHO-M3细胞以2×105的密度接种到接种井上。即将进行测试时，将接种井上的细胞转移到无碳酸氢盐的DMEM培养基中，并结合3.7g/l的NaCl，以保持同渗容摩(培养基pH7.4-7.5)。
规程描述：在测试之前对探针进行校准。测试容器的底部充以无碳酸氢盐的培养基。将接种井从5％ CO2培养箱中移出，用无碳酸氢盐的DMEM培养基替换正常生长培养基(Ham’s F-12)。之后，将接种井置于测试容器内。无碳酸氢盐的培养基用细管吸取到接种井顶部，将测试容器的盖板轻轻地放置在接种井顶部并用螺丝旋进到正确位置，压缩该组件。开启探针软件，在随后的3.5个小时内对pH、CO2和O2分析物进行测量。在以78μl/min的速率进行灌注的最初1.5小时之后，开始一系列停止流动(每次10分钟)和重新灌注培养基(每次10分钟，78μl/min)的循环。在第五次重灌注培养基循环的最后2分钟内，灌注100μM碳酰胆碱通过接种井。在第六次重灌注期间，再次灌注无碳酸氢盐的DMEM培养基通过接种井。在每次停止流动循环期间，计算分析物的变化速率。
结果：用100μM碳酰胆碱处理之后获得的CHO-M3基线
在第5次灌注期间用碳酰胆碱进行处理之前，执行前4个系列的灌注/停止流动循环，以建立三种分析物的噪声带(noise band)。在第六次重灌注期间重新灌注无碳酸氢盐的培养基，并在停止流动期间计算速率，从而评估经过连续碳酰胆碱处理之后对分析物速率的潜在影响。最终数据如表6及图11所示。
表6
碳酰胆碱处理对耗氧量、二氧化碳生成和细胞外放出物的影响
| 速率概况 | O2(nM/min) | CO2(nM/min) | pH(PHU/min) | CO2/O2 | O2/pH比 |
| 停止流动1 | 0.23 | 0.15 | 0.01 | 1.53 | 0.23 |
| 停止流动2 | 0.24 | 0.12 | 0.01 | 1.93 | 0.25 |
| 停止流动3 | 0.30 | 0.10 | 0.01 | 3.04 | 0.36 |
| 停止流动4 | 0.27 | 0.11 | 0.01 | 2.45 | 0.38 |
| 停止流动5 | 0.40 | 0.20 | 0.02 | 1.99 | 0.26 |
| 停止流动6 | 0.33 | 0.10 | 0.01 | 3.34 | 0.29 |
平均基线值与处理值相比可以看出，将CHO-M3细胞暴露于碳酰胆碱2分钟，尽管O2和CO2速率还显示高于基线水平(见下)，但是却使得pH速率加倍(0.01PHU/min vs 0.02 PHU/min)。在第六次处理的停止流动期间生成的处理后速率，基本上返回到处理之前的数值。
实例7
在有和没有暂时形成样品室的情况下测得的分析物通量的比较
在较大的容器内暂时形成样品室并且含有显著高浓度的细胞，是目前本发明的一个特征。
为了说明这一原理，用聚碳酸酯材料制造一个直径大约12mm，高10mm的圆柱形容器。在容器的底部安装能够测量O2和CO2分压的荧光传感器和能够测量pH的传感器，并如前所述地加以校准。同时用聚碳酸酯材料制造一个圆柱形盖子，其直径适于插入到容器内，从而按要求提供一个气密的盖子并降低容器的封闭体积。还制造一个高0.5mm的圆柱形隔板，其直径适于插入到容器的底部，以便使盖子精确地停止在正确的位置。
如前所述地制备大约1×105个C2C12成肌细胞。将细胞与大约1ml细胞生长培养基一起放置在容器内。用经过校准的荧光探针连续测量细胞培养剂内的氧分压。然后由实验开始后第12分钟和第16分钟的pO2的差值计算pO2的变化速率。
接着，将圆柱形盖子放置在细胞培养基表面上以阻止周围空气中的氧气流入。同时还可以将暴露于细胞的培养基的体积减小到大约130μl。再次地，测量并记录从实验开始后第12分钟和第16分钟的pO2数值。
然后，将圆柱形盖子降低到容器内(停止在隔板上)，从而将暴露于细胞的培养基的体积减小到大约57μl。再次地，测量并记录从实验开始后第12分钟和第16分钟的pO2数值。
三种条件下细胞培养基中测得的pO2的变化速率如表7和图12所示。
表7
在形成和没有形成封闭样品室的情况下，4分钟间隔下氧的消耗速率
(n＝3)
| 体积 | ΔpO2 | s.d. | ％CV |
| 小(57μl | 0.38 | 0.04 | 10％ |
| 中(130μl) | 0.12 | 0.05 | 38％ |
| 开放 | -0.04 | 0.10 | n/a |
实验证明，形成与周围空气隔离并含有高密度细胞的封闭样品室，可产生足以提供具有高信噪比的快速测量结果的通量速率。
显然，在不背离本发明精神和范围的前提下可以对上文提出的本发明进行许多的修改和变化，上面的实例并不对本发明具有任何限制，而仅仅是举例。因此前面的各个实施例都应当仅视为例证，而不是对下文说明的本发明具有限制。
Claims (80)
1.一种分析置于容器内培养基中的细胞的方法，该方法包括如下步骤：
a)提供一个容器，其具有在细胞周围的原始体积的培养基；
b)减少至少在一部分细胞周围的该原始体积的培养基，以限定减少了体积的培养基；以及
c)分析与在该减少了体积的培养基内的细胞有关的组分。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：将细胞周围的减少了体积的培养基基本上增加到原始的体积。
3.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：
确定组分的第一浓度；和
从确定第一浓度起经过预定的时间间隔确定该组分的第二浓度。
4.根据权利要求3的方法，进一步包括如下步骤：根据第一浓度和第二浓度计算组分的通量速率。
5.根据权利要求1的方法，其中减少了的体积大约为原始体积的5-50％。
6.根据权利要求5的方法，其中减少了的体积大约为原始体积的5-20％。
7.根据权利要求1的方法，其中减少了的体积小于原始体积的大约5％。
8.根据权利要求1的方法，其中该细胞是从如下的组中选出的细胞：细菌、真菌、酵母菌、原核细胞、真核细胞、动物细胞、人细胞和永生细胞。
9.根据权利要求1的方法，其中至少有一部分细胞附着在容器的表面。
10.根据权利要求1的方法，其中至少有一部分细胞悬浮在培养基内。
11.根据权利要求1的方法，其中至少有一部分细胞包含活的组织。
12.根据权利要求1的方法，其中该组分是从如下的组中选出的物质：溶解气体、离子、蛋白质、底物、盐和矿物质。
13.根据权利要求12的方法，其中溶解气体从如下的组中选择：O2、CO2和NH3。
14.根据权利要求12的方法，其中离子从如下的组中选择：H+、Na+、K+和Ca++。
15.根据权利要求12的方法，其中蛋白质从如下的组中选择：细胞因子、胰岛素、化学因子、激素和抗体。
16.根据权利要求12的方法，其中底物从如下的组中选择：葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、谷氨酸盐、糖原和丙酮酸盐。
17.根据权利要求1的方法，其中该组分包含由至少一部分细胞从培养基中获取的物质。
18.根据权利要求1的方法，其中该组分包含由至少一部分细胞分泌到培养基中的物质。
19.根据权利要求1的方法，其中分析该组分包括感测该组分的存在。
20.根据权利要求1的方法，其中分析该组分包括感测该组分的浓度。
21.根据权利要求1的方法，其中分析该组分包括感测第一组分的第一浓度，感测第二组分的第二浓度以及确定第一浓度与第二浓度之间的关系。
22.根据权利要求1的方法，其中分析该组分包括感测该组分浓度的变化速率。
23.根据权利要求1的方法，其中分析该组分包括使用与减少了的体积中的培养基相接触的传感器。
24.根据权利要求23的方法，其中传感器包括从如下的组中选出的传感器：荧光传感器、发光传感器、ISFET传感器、表面等离子体激元共振传感器、基于光学衍射原理的传感器、基于伍德异常的传感器、声学传感器和微波传感器。
25.根据权利要求1的方法，其中分析该组分包括确定从如下的组中选出的参数：细胞生存能力，细胞数目，细胞生长速率，对药物、毒物和化学剂中至少一个的响应，实体检测和内化。
26.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：灌注附加的培养基通过容器。
27.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：填补容器内的培养基。
28.根据权利要求1的方法，其中减少培养基的体积包括在容器内放置隔挡件。
29.根据权利要求28的方法，其中隔挡件布置在容器内，但不会导致培养基移出容器。
30.根据权利要求28的方法，其中至少一部分隔挡件包括传感器。
31.根据权利要求28的方法，其中减少了体积的培养基包括传感器。
32.根据权利要求31的方法，其中传感器包括一个荧光团。
33.根据权利要求1的方法，其中至少一部分容器包括传感器。
34.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：在减少培养基的原始体积之前，改变至少一部分细胞的环境。
35.根据权利要求34的方法，其中改变环境包括将至少一部分细胞暴露于药物、化学剂和毒物中至少一种。
36.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：在减少培养基的原始体积之后，改变至少一部分细胞的环境。
37.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：覆盖该容器。
38.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：搅拌容器中原始体积培养基的至少一部分。
39.根据权利要求1的方法，进一步包括如下步骤：密封该容器。
40.一种用于分析细胞的装置，该装置包括：
a)平台，其适合于接收容纳细胞和一定体积培养基的容器；
b)柱塞，其适合于接收隔挡件，从而在含有至少一部分细胞的容器内产生减少了体积的培养基，该隔挡件适合于通过平台和柱塞的相对运动插入到容器内；
c)传感器，其与减少了体积的培养基感测相通，其中该传感器用于分析置于减少了的体积中的组分。
41.根据权利要求40的装置，其中该传感器用于在不干扰细胞的情况下对组分进行分析。
42.根据权利要求40的装置，其中该容器包括布置在微平板中的池。
43.根据权利要求42的装置，其中池包括一个台阶。
44.根据权利要求40的装置，其中该隔挡件适于在组分分析之前搅动培养基。
45.根据权利要求40的装置，其中该传感器从如下的组中选出：荧光传感器、发光传感器、ISFET传感器、表面等离子体激元共振传感器、基于光学衍射原理的传感器、基于伍德异常的传感器、声学传感器和微波传感器。
46.根据权利要求40的装置，其中容器的至少一部分包括该传感器。
47.根据权利要求40的装置，其中减少了体积的培养基包括该传感器。
48.根据权利要求40的装置，其中隔挡件的至少一部分包括该传感器。
49.根据权利要求40的装置，进一步包括一个自动的光电测量系统。
50.根据权利要求49的装置，进一步包括一个与自动光电测量系统电通信的计算机。
51.根据权利要求40的装置，其中该隔挡件相对于柱塞偏置。
52.根据权利要求40的装置，其中：
该容器包括一个具有多个池的微平板；且
该隔挡件包括多个布置成被多个池接收的隔挡件。
53.根据权利要求52的装置，其中多个隔挡件相对于柱塞独立地加以偏置。
54.一种用于分析细胞的装置，该装置包括：
a)平台，其适合于接收容纳细胞和一定体积培养基的容器；
b)柱塞，其适合于接收隔挡件，从而在含有至少一部分细胞的容器内产生减少了体积的培养基，该隔挡件适合于通过平台和柱塞的相对运动插入到容器内，而不会干扰细胞，使得减少了的体积小于培养基体积的大约50％；
c)传感器，其与减少了体积的培养基感测相通，其中该传感器用于分析置于减少了的体积中的组分。
55.一种平板，其包括多个适于容纳培养基和细胞的池，每个池的至少一部分包括支座表面，适于接收隔挡件，配置为限定减少了的体积。
56.根据权利要求55的平板，其中支座表面的形状从如下的组中选出：大体上为平面、弓形、轮廓截面、锥形、圆锥形、台阶和互锁形。
57.根据权利要求55的平板，其中每个池内减少了的体积可以有小于平均池体积10％的偏差。
58.根据权利要求57的平板，其中每个池内减少了的体积可以有小于平均池体积5％的偏差。
59.根据权利要求58的平板，其中每个池内减少了的体积可以有小于平均池体积1％的偏差。
60.根据权利要求55的平板，其中每个池的支座表面包括在各自池的内周周围布置的台阶。
61.根据权利要求60的平板，其中台阶位于台阶平面内，该台阶平面置于由各个池的底所限定的底平面之上。
62.根据权利要求60的平板，其中台阶平面和底平面是平行的平面。
63.根据权利要求60的平板，其中台阶平面高出底平面的高度小于大约1mm。
64.根据权利要求63的平板，其中台阶平面高出底平面的高度小于大约200μm。
65.根据权利要求64的平板，其中台阶平面高出底平面的高度小于大约50μm。
66.根据权利要求55的平板，进一步包括位于至少一个池内的荧光传感器。
67.根据权利要求55的平板，其中至少有一个池包括透明的底。
68.根据权利要求55的平板，其中至少有一个池包括不透明的壁。
69.一种用于分析置于容器内培养基中的细胞的隔挡件，该隔挡件包括：
体部分，用于插入到容器内，该体部分具有一个隔挡件表面用于与容器的第一表面相匹配，以产生一个减少了体积。
70.根据权利要求69的隔挡件，其中隔挡件表面的形状从如下的组中选出：大体上为平面、弓形、轮廓截面、锥形、圆锥形、台阶和互锁形。
71.根据权利要求69的隔挡件，进一步包括盖子，用于与容器的第二表面相匹配。
72.根据权利要求69的隔挡件，进一步包括传感器，其布置在隔挡件表面上，用于分析在至少一部分细胞周围的培养基的组分。
73.根据权利要求72的隔挡件，其中该传感器包括光学传感器。
74.根据权利要求73的隔挡件，其中该光学传感器适于感测荧光团。
75.根据权利要求73的隔挡件，进一步包括导体，其与传感器耦连，适于从传感器传导信号。
76.根据权利要求75的隔挡件，其中该导体包括光学纤维。
77.根据权利要求75的隔挡件，其中该导体至少部分地位于该体部分内。
78.根据权利要求72的隔挡件，进一步包括读出器，用于从传感器中传出信号。
79.根据权利要求78的隔挡件，其中该读出器从如下的组中选择：位于立柱上的可视光纤电子器件，和来自于底部的平板阅读器。
80.根据权利要求69的隔挡件，其中该隔挡件包括被布置成被微平板中的多个池所容纳的多个隔挡件。
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