CN1863915A - 植物中λ整合酶介导的重组 - Google Patents
植物中λ整合酶介导的重组 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1863915A CN1863915A CNA038111748A CN03811174A CN1863915A CN 1863915 A CN1863915 A CN 1863915A CN A038111748 A CNA038111748 A CN A038111748A CN 03811174 A CN03811174 A CN 03811174A CN 1863915 A CN1863915 A CN 1863915A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- recognition site
- intergrase
- int
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了利用重组酶获得DNA分子定向整合到宿主细胞基因组中的方法。这里所公开的方法可以与各种宿主细胞，包括例如双子叶和单子叶植物细胞一起使用。本发明提供了实现植物细胞中DNA位点特异性重组的方法，该方法包括向植物细胞中引入包含第一Int识别位点的靶核苷酸序列；向该植物细胞中引入包含第二Int识别位点的供体核苷酸序列；和向该植物细胞中引入整合酶或整合酶复合物。
Description
本申请要求2002年3月29日提交的美国临时申请序列号60/369,041和2002年11月12日提交的美国临时申请序列号60/425,512的利益。这里通过引用将这两个申请整体并入。
技术领域
一般地，本发明涉及利用整合酶的植物转化的方法，并且更特别地，涉及在植物基因组中预先选定的位点整合外源DNA的方法。本发明也涉及利用整合酶的植物细胞中DNA序列的切除或倒位。本发明也涉及通过这种方法获得的转基因植物。
背景技术
最近几年，基因工程技术的发展已经明显地涉及了作物改良领域。利用这些技术，有益的性状可以被引入几乎所有的作物中，并且可以很快地获得改良的作物。基因工程的应用排除了通过常规育种方法引入期望性状的漫长过程的需要。
一般地，目前的植物转化方法引起宿主基因组中转基因的随机整合。因为各种原因，包括例如由不同整合基因座引起的潜在变化的转基因表达，所谓的“位置效应”，和在转基因整合期间突变宿主基因组的风险，所以该随机整合是有问题的。由于这些潜在的问题，必需筛选和检测大量的转化事件以获得显示期望水平转基因表达的转基因植物，同时该转基因植物没有由植物基因组中重要基因座非有意序列间断所引起的伴随异常。而且，如果转基因植物将要被随后的一种或多种转基因的添加修饰，那么添加转基因的随机整合使得含有这些多种转基因的植物育种程序的实现烦琐和困难，特别对于原种植物系更是如此。
定向转基因整合的一种方法是利用位点特异性重组酶。已经在几种原核生物和低级真核生物的生物体中鉴定了位点特异性重组酶系统。通常地，这种系统包含一种或多种蛋白质，该蛋白质识别2个拷贝特异性核苷酸序列，切割和连接这些核苷酸序列，因此提供了精确的，位点特异性的遗传信息的交换。几种位点特异性重组酶是本领域已知的。这些重组酶包括，但不限于例如噬菌体P1 Cre/lox系统(Austin等.(1981)Cell 25：729-736)，来源于酵母Zygosaccharomyces rouxii pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki等.(1985)J.Mol.Biol.182：191-203)，噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230：170-176)，来源于酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2μm质粒的FLP/FRT重组酶系统(Broach等.(1982)Cell 29：227-234)，和来源于噬菌体λ的Int重组酶(Landy(1989)Annu.Rev.Biochem.58：912-949；Landy(1993)Curr.Opin.Genet.Dev.3：699-707；Lorbach等.(2000)J.Mol.Biol.296：1175-1181；和WO 01/16345)。
附图说明
附图形成了本发明申请文件的一部分，并且本申请文件包括附图以进一步说明这里所公开方法的一些方面。
图1表示单交换重组事件。第一Int识别位点存在于靶分子上，第二Int识别位点存在于供体分子上。分别用细和粗线表示位于靶和供体分子识别位点侧翼的核苷酸序列。供体分子可以是环形DNA分子或线型DNA分子。向靶和供体分子引入整合酶或整合酶复合物，并且形成Int介导的重组产物。该重组过程称为“单交换”，因为在每个靶和供体分子上的一个Int识别位点参与了整合酶介导的重组。
图2表示双交换重组事件。第一和第三Int重组位点存在于靶分子上，第二和第四Int重组位点存在于供体分子上。向靶和供体分子引入整合酶或整合酶复合物，并且形成Int介导的重组产物。该重组过程称为“双交换”，因为在每个靶和供体分子上的两个Int识别位点参与了整合酶介导的重组。
图3表示双交换重组事件，其中每个靶和供体分子上Int识别位点之一存在于内含子一部分中，该内含子包埋在编码序列一部分中。向靶和供体分子引入整合酶或整合酶复合物，并且形成Int介导的重组产物。重组产物含有完整的内含子，该完整内含子是通过靶分子中内含子5’部分和供体分子中内含子3’部分中存在的Int识别位点之间的交换形成的。该完整内含子位于完整核苷酸序列中，该完整核苷酸序列也是通过靶和供体分子中存在的Int识别位点之间的交换形成的。
图4表示一种示例性质粒LPsgAttP的结构，其包含具有单一attP位点的单子叶植物靶序列。
图5表示一种示例性质粒vDONsgAttB的结构，其包含具有单一attB位点的单子叶植物供体序列。
图6表示重组事件，其中利用Int和IHF切除位于靶分子上attP识别位点和attB识别位点之间的核苷酸序列。
图7表示重组事件，其中利用Int，IHF和Xis切除位于靶分子上attL识别位点和attR识别位点之间的核苷酸序列。
图8表示一种示例性质粒LPdbAttL.HYG的结构，其包含具有反向方向的两个attL位点的单子叶植物靶序列。
图9表示一种示例性质粒DONdbAttR的结构，其包含具有反向方向的两个attR位点的单子叶植物供体序列。
图10表示一种包含在农杆菌属(Agrobacterium)中的示例性质粒LPAttR.BY2的结构，其包含具有单一attR位点的双子叶植物靶序列。
图11表示一种包含在农杆菌属(Agrobacterium)中的示例性质粒DonAttL.BY2的结构，其包含具有单一attL位点的双子叶植物供体序列。
图12表示一种包含在农杆菌属(Agrobacterium)中的示例性质粒LPdblAttR.BY2的结构，其包含具有反向方向的两个attR位点的双子叶植物靶序列。
图13表示一种包含在农杆菌属(Agrobacterium)中的示例性质粒DondblAttL.BY2的结构，其包含具有反向方向的两个attL位点的双子叶植物供体序列。
图14表示一种包含在农杆菌属(Agrobacterium)中的示例性质粒pAdF59的结构，其包含具有反向方向的两个attL位点的双子叶植物靶序列。
图15表示一种用于生物弹击法递送(biolistic delivery)的示例性质粒pAdF72的结构，其包含具有反向方向的两个attR位点的双子叶植物供体序列。
概述
本发明的公开提供了利用重组酶实现DNA分子在宿主细胞基因组中定向整合的方法。这里所公开的方法可以与各种宿主细胞，包括，例如双子叶植物和单子叶植物细胞一起使用。本发明的公开提供了实现植物细胞中DNA的位点特异性重组的方法，该方法包括：向植物细胞中引入包含第一Int识别位点的靶核苷酸序列；向该植物细胞中引入包含第二Int识别位点的供体核苷酸序列；和向该植物细胞中引入整合酶或整合酶复合物。
详细描述
定义
“attB/attP反应”或“B/P反应”是Int介导的attB识别位点和attP识别位点之间的重组反应。
“attL/attR反应”或“L/R反应”是Int介导的attL识别位点和attR识别位点之间的重组反应。
“att位点”是DNA分子上整合酶或整合酶复合物的附着位点。一般地可交换地使用这里所用的“att位点”与“重组位点”，下文将更详细地描述。一般地，“att位点”用于指特定类型的重组位点，例如attB，attP，attL或attR位点。
“染色体整合”或“整合”指外源基因或核苷酸序列通过与宿主DNA形成的共价键整合到宿主基因组中。
可相互交换地使用“缺失反应”和“切除反应”，它们指在相同DNA分子上并且相互同向的两个识别位点之间的重组反应。该反应引起位于两个识别位点之间的核苷酸序列的移除。
“同向”指两个或多个识别位点的方向，使得识别位点的15个碱基对核心区域以相同的5’到3’方向定向。这里所用的“同向重复”指两个或多个相互同向的识别位点。
可相互交换地使用“供体”，“供体分子”，“供体序列”和“供体DNA”，指已经被选定利用位点定向重组与靶DNA序列进行重组的核苷酸序列。供体核苷酸序列可以是任何核苷酸序列，诸如，例如基因、表达盒、启动子、分子标记、选择性标记、可观察的标记、它们中任何一种的一部分等。供体DNA序列包含至少一个重组酶识别位点。
这里所用“内源的”指“相同来源的”，即来源于宿主细胞。
这里所用“表达盒”包含能指导或驱动另外核苷酸序列在适合宿主细胞中表达的核苷酸序列。表达盒通常包含可操作地与核苷酸序列，诸如目的核苷酸序列(例如，其可操作地连接终止子)连接的启动子。表达盒通常也包含核苷酸序列正确翻译所需序列。目的核苷酸序列通常编码目的蛋白质，但是其也可以编码功能性目的RNA，例如反义RNA或非翻译RNA，它们在有义或反义方向抑制特定基因，例如反义RNA的表达。包含核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其组分之一相对于至少它的其它组分之一是异源的。表达盒可以包含以重组方式获得并且用于异源表达的内源DNA。然而，通常地，表达盒相对于宿主是异源的；即，表达盒的特定DNA序列不天然出现在宿主细胞中，并且必需通过转化事件将其引入到宿主细胞或宿主细胞祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以受任何适合启动子诸如，例如组成型启动子或诱导型启动子控制，仅仅当该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。在多细胞生物体，诸如植物的情况下，启动子也可以是对特定组织或器官或发育阶段特异的。
“外源”基因或DNA指在宿主生物体中正常地不能发现，但是可以通过基因转移引入的基因或核苷酸序列。不整合到宿主细胞基因组中的外源基因和DNA称为“染色体外的”。
术语“基因”广义地用于包含与生物功能相关的任何核苷酸序列片段。因此，基因可以包含编码序列，该编码序列有或没有其表达所需的调节序列。而且，基因可以包含外显子和内含子序列或者可以仅包含外显子序列。基因也可以包含例如形成其它蛋白质识别序列的不表达的DNA片段。这里所用“基因部分”或“不完整基因”指无功能的基因部分，因为它不含有功能所需的所有序列。该部分可以是基因的5’部分(即，基因3’末端的序列不存在)或者该部分可以是基因的3’部分(即，基因5’末端的序列不存在)。单独的5’和3’部分可以是无功能的，但是当可操作地连接5’和3’部分时，基因是“有功能的”或“完整的”。
可以相互交换地使用“目的基因”，“目的序列”和“目的DNA”，并且其包含任何核苷酸序列，当将该核苷酸序列转移给植物时，该核苷酸序列赋予了植物期望的特征诸如，例如病毒抗性、昆虫抗性、非生物胁迫抗性、疾病抗性、对其它害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值，工业生产过程中改进的性能或改变的生殖能力。目的序列也可以是转移给植物用于在植物中产生商业价值酶或代谢物的序列。
“基因组”指生物体完整的遗传物质。
这里所用“异源的”指“不同天然来源的”，即表示非天然状态。例如，如果用来源于另一种生物体，特别是来源于另一种物种的基因转化宿主细胞，那么该基因相对于宿主细胞和带有该基因的宿主细胞后代是异源的。类似地，“异源的”指来源于天然或原始细胞类型并且插入到相同的天然或原始细胞类型的核苷酸序列，但是该核苷酸序列以非天然状态，例如在不同调节元件控制下，以不同拷贝数存在，等等。
“鉴定”重组产物意指检测重组产物和将其与靶和供体序列相区分。有许多鉴定重组产物的方法。例如，可以利用选择性标记基因，由此，位点特异性整合仅在重组产物中使选择性标记基因变成与启动子可操作地连接。做为可替代方案，可以使用可观察的标记基因(visible markergene)，由标记基因表达的获得或损失鉴定重组产物。做为可替代的方案，可以利用负选择标记基因，由标记基因表达的损失或缺乏鉴定重组产物。此外，可以利用具有靶序列和/或供体序列特征的分子标记，这样分子标记模式对于重组产物是唯一的。
这里所用“整合酶”指噬菌体λ来源的整合酶，包括野生型整合酶和各种突变体或修饰的整合酶中的任何一种。这里所用“整合酶复合物”指包含整合酶和整合宿主因子(IHF)的复合物。这里所用“整合酶复合物”也可以指包含整合酶、整合宿主因子和噬菌体λ来源的切除酶(Xis)的复合物。而且，这里所用“Int”指“整合酶”和“整合酶复合物”。
“整合酶介导的重组产物”是在整合酶或整合酶复合物存在的情况下，在靶和供体序列之间形成的重组产物。整合酶介导的重组在靶上至少一种重组酶识别位点和供体上至少一种重组酶识别位点之间产生了链交换，由此形成重组产物。与上述定义的使用一致，“Int介导的重组”或“Int介导的重组产物”指整合酶或整合酶复合物介导的重组或重组产物。
“分子内重组”指单一核酸分子上识别位点之间的重组。不同分子上识别位点之间的重组称为“分子间重组”。
“染色体内重组”指单一染色体上识别位点之间的重组。不同染色体上识别位点之间的重组称为“染色体间重组”。
“倒位反应”指相互反向方向的两个att位点之间的分子内重组反应。例如，通过反向方向的attB位点和attP位点或反向方向的attL位点和attR位点之间的分子内反应可以实现倒位反应。
“反向方向”指两个识别位点的方向，使得识别位点15个碱基对核心区域以相反的5’到3’方向定向。
“可操作地连接”或“操作地连接”指物理或功能地相互作用的两个或多个核苷酸序列的关系。例如，如果启动子或调节核苷酸序列与编码RNA或蛋白质的核苷酸序列的位置使调节核苷酸序列将影响编码或结构核苷酸序列表达水平，那么称这两个序列可操作地连接。如果基因的5’部分和基因的3’部分位于形成功能性基因的位置，那么这两个部分就是操作地或可操作地连接。
这里所用术语“植物”非限制地指整株植物、植物器官(例如，叶、茎、根、果实等)、种子、植物细胞和植物细胞的后代，植物组织、植物细胞或组织培养物、原生质体、愈伤组织和组织成为结构和/或功能单位的任何植物细胞组。从植物细胞“再生”的植物指植物的所有细胞来源于该植物细胞。一般地，可以与公开的方法一起使用的植物类别如可以利用转化技术的高等植物类别一样广泛，包括单子叶和双子叶植物。优选的植物非限制性地包括金合欢、苜蓿、aneth、苹果、杏、洋蓟、拟南芥(Arabidopsis)、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、越桔、花茎甘蓝、芽甘蓝、甘蓝、芸苔、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、三叶草、芫荽叶、柑橘、克莱门小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、苣荬菜、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、瓠瓜、葡萄、葡萄柚、大麻、蜜露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭葱、柠檬、酸橙、芒果、玉米、瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、黄秋葵、洋葱、桔子、观赏植物、蕃木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、西葫芦、温柏、菊苣、萝卜、树莓、水稻、黑麦、红花、高梁、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、苏合香、红桔、茶、烟草、番茄、黑小麦、草皮草、芜箐、藤本植物、西瓜、小麦、山药、夏南瓜和木本植物诸如针叶树和落叶树。一旦目的序列被转化到特定植物物种中，该目的序列就可以在该物种中繁殖，或者可以利用传统的育种技术，将该目的序列转移到相同物种的其它品种，包括商业品种中。
“植物细胞”指植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁，并且非限制性地包括种子悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物细胞形式可以是分离的单细胞、培养的细胞或者是高等组织单位，诸如，例如植物组织、植物器官或整株植物的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单位诸如，例如原生质体、细胞培养的细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子、和在各个发育阶段的胚等的培养物。
“植物材料”指叶、茎、根、花或花部分，果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物，或者植物任何其它部分或产物。
“植物器官”是植物明显和可见的结构化和分化部分，诸如根、茎、叶、花蕾或胚。
这里所用的“植物组织”意指组织成为结构和功能单位的一组植物细胞，包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成为结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语连同上述的或该定义所包含的另外的任何特定类型植物组织一起使用，或者单独使用时不意指排除任何其它类型的植物组织。
“识别位点”或“重组位点”指重组酶蛋白质可以识别的核苷酸序列。该识别位点是重组酶和任何相关辅助蛋白质在此处进行结合、切割和链交换的核苷酸序列。整合酶或整合酶复合物识别包含attB、attL、attR、attP和/或这种位点的适合突变的识别位点。attB位点可以是约25-30bps，并且包含2个9bp的核心序列和7bp的重叠(或间隔)区，而attP位点可以是约240bps，并且包含整合酶和一种或多种辅助蛋白质的结合位点。attB和attP位点可以通过Int一起重组，或者做为替代方案，attL和attR位点可以通过Int一起重组。
“重组酶”指能进行DNA位点特异性重组的酶。重组酶具有内切核酸酶和连接酶活性。重组酶可以做为单个蛋白质或者做为蛋白质复合物的一部分起作用。这里所用的整合酶和整合酶复合物是重组酶。
一般地，如果重组酶介导的重组发生在相同分子上两个重组酶识别位点之间，那么重组反应引起两侧为这两个识别位点的序列缺失或倒位。如果重组酶介导的重组发生在不同分子上两个重组酶识别位点之间(例如，靶序列上重组酶识别位点和供体序列上重组酶识别位点之间)，那么重组反应会引起一个分子的序列插入到另一个分子中(例如，供体序列插入到靶分子中)。当在靶和供体上都存在具有重组能力的特定识别位点(例如，靶上的attB位点和供体上的attP位点，或者靶上的attL位点和供体上的attR位点)时，重组产物代表两个位点之间核苷酸序列的交换，产生了两个新的位点。这些新位点中每个位点都含有来源于供体和靶分子的原始识别位点的一部分。例如，当在靶上attB位点和供体上attP位点之间发生重组时，重组产物上产生attL和attR位点。此外，新形成的attL和attR位点一侧是从供体分子所获得的序列和另一侧是从靶分子所获得的序列。
利用供体分子上的一个识别位点和靶分子上的一个识别位点，可以获得重组产物，由此产生“单交换”重组产物(图1)。做为可替代方案，可以利用靶分子上的两个识别位点和供体分子上的两个识别位点。供体上两个位点和靶上两个位点之间的重组产生了“双交换”重组产物。如果供体分子上重组位点位于想要与靶分子交换的目的序列的侧翼，那么与靶分子的双交换重组产生重组产物，其中目的序列置换最初是靶分子中识别位点之间的核苷酸序列。通过重组，靶和供体分子之间的核苷酸序列交换称为“序列交换”，“序列置换”或“盒交换”(图2)。
“调节元件”包含参与赋予宿主细胞另一种核苷酸序列诸如，例如目的序列表达的核苷酸序列。调节元件可以包含可操作地与目的核苷酸序列和终止信号连接的启动子。通常，调节元件还包含用于目的核苷酸序列正确翻译的序列。
“选择性标记”或“选择性标记基因”指核苷酸序列，其在植物细胞中的表达给细胞提供了在特定条件下的选择性优势。与非转化的细胞能力比较，用选择性标记基因转化的细胞具有的选择性优势可以是在不利选择剂诸如，例如抗生素或除草剂存在的情况下，改进的生长能力。做为可替代的方案，与非转化的细胞比较，转化细胞具有的选择性优势可以是利用特定化合物做为营养物，生长因子或能源的增强的能力。做为可替代方案，转化细胞具有的选择性优势可以是以前具有的性状或特征的丧失，实现所谓的“负选择”。在最后这种情况下，宿主细胞暴露于化合物或者与化合物接触，该化合物仅对没有失去表达亲本细胞中存在的特定性状或特征能力的细胞有毒性(诸如，例如负选择性标记(negativeselectable marker)基因)，所述细胞典型地是转基因亲本细胞。
这里所用的“定点重组”指两个核苷酸序列之间的重组，其中每个核苷酸序列都含有至少一个识别位点。
“位点特异性的”意指在特定的核苷酸序列，其可以是在宿主细胞基因组中的特定位置。核苷酸序列相对于宿主细胞可以是内源性的，或者在宿主基因组中其天然位置中，或者在基因组中某其它位置，或者它可以是通过各种已知方法以前已经插入宿主细胞基因组中的异源核苷酸序列。
“稳定转化的”指含有已经稳定地整合到宿主细胞基因组中的目的核苷酸序列的宿主细胞。
可相互交换地使用“靶”，“靶分子”，“靶序列”和“靶DNA”，表示含有至少一个重组酶识别位点的核苷酸序列。靶核苷酸序列可以是基因，表达盒，启动子，分子标记，所述这些中任一个的一部分等等。靶序列可以稳定地转化到植物细胞中以产生“靶系”，该“靶系”含有整合到植物基因组中染色体位置的靶序列。
“定向整合事件”或“靶事件”指在整合酶或整合酶复合物存在的情况下，在靶和供体序列之间形成的重组产物。特别地，它指当靶序列稳定地转化到植物细胞中时，做为Int介导的重组结果，供体序列整合到靶序列中。
基因或核苷酸序列的“瞬时表达”或“瞬时表达的”指不整合到宿主染色体中，但是可以单独地(例如，通过做为自主复制的质粒或表达盒的一部分)或者做为另一种生物系统，诸如，例如病毒的一部分起作用的基因或核苷酸序列的表达。
“瞬时转化的”或宿主细胞的“瞬时转化”指(例如，通过诸如农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化或生物弹击法)将外源DNA或目的核苷酸序列引入宿主细胞，而外源DNA或目的核苷酸序列不整合到宿主细胞染色体中，由此阻止了外源DNA或目的核苷酸序列在宿主细胞后代中的稳定维持。
“病毒复制子”或“病毒载体”指在植物细胞中能进行复制的DNA或RNA病毒载体或其部分。复制子或载体包含顺式作用的病毒序列，诸如，例如复制必需的复制起点。复制子或载体可以包含或不包含反式作用的病毒序列，诸如，例如病毒复制基因(例如，分别在ACMV和TGMV双粒病毒组中的AC1和AL1基因)。复制子或载体可以包含或不包含用于在宿主植物细胞中表达的靶序列。通过增加植物细胞中供体DNA的拷贝数，供体DNA在病毒复制子上的引入可以增加打靶的频率。
“可观察的标记(visible marker)基因”指在转化细胞中的表达不能赋予细胞优势，但是可以被检测到或变得可见的基因或核苷酸序列。可观察的标记的例子包括但不限于β葡糖醛酸酶(GUS)，萤光素酶(LUC)和荧光蛋白质(诸如，例如绿色荧光蛋白质(GFP)或青色荧光蛋白质(CFP))。
在一方面，本发明提供了修饰的在植物中增强表达的新核苷酸序列。该核苷酸序列编码在植物中提供功能性整合酶活性的Int。
在另一方面，包含具有侧翼识别位点的靶序列的植物细胞中整合酶或整合酶复合物的表达指导了靶序列的有效切除和/或倒位。因此，提供了从植物基因组除去不想要序列和/或用于植物基因组中期望靶序列倒位的方法。倒位可以用作例如目的序列的开闭开关(on-off switch)。
在另一方面，本发明提供了实现植物中定向重组的方法。
这里所公开的方法利用了带有或不带有其它辅助因子的重组酶进行重组。可以由两个整合酶识别位点的配对和相互作用产生重组，所述整合酶识别位点诸如，例如是attB识别位点(SEQ ID NO：172)，其含有短的约25-30bp识别位点，和attP识别位点(SEQ ID NO：173)，其明显更大，约240-250bp，并且不仅包含整合酶的结合位点，还包含辅助因子的结合位点(Landy(1989)Annu Rev.Biochem.58：913-949)。attB(SEQ ID NO：172)和attP(SEQ ID NO：173)位点之间的反应在交叉中交换了序列以在重组产物中产生两个新位点，attL(SEQ IDNO：174)和attR(SEQ ID NO：175)。也可以由attL和attR识别位点的配对和相互作用产生重组。L/R反应可以用于反转B/P反应，因为L/R反应的重组产物再次产生了attB(SEQ ID NO：172)和attP(SEQID NO：173)识别位点。
在一个实施方式中，宿主细胞包含靶序列，该靶序列包含整合酶或整合酶复合物的单一识别位点(“第一Int识别位点”)。该识别位点可以是Int的任何识别位点，包含，例如attB(SEQ ID NO：172)，attP(SEQ ID NO：173)，attL(SEQ ID NO：174)，attR(SEQ ID NO：175)或者这里所述的任何突变体识别位点，或者本领域已知的在Int介导的B/P或L/R反应中起作用的其它识别位点。
构建具有第二识别位点的相应的供体序列，该第二识别位点能与靶的第一识别位点重组。例如，当选择attB(SEQ ID NO：172)做为靶序列的第一识别位点时，选择attP(SEQ ID NO：173)做为供体序列的第二识别位点。相似地，当选择attR(SEQ ID NO：175)做为靶序列的第一识别位点时，选择attL(SEQ ID NO：174)做为供体序列的第二识别位点。
通过利用突变或修饰的Int识别位点，可以赋予这里所公开的重组方法另外的特异性和灵活性。可以突变或修饰识别位点以改变对一种或多种辅助蛋白质诸如，例如整合宿主因子或切除酶的位点结合亲和性。而且，突变或修饰可以增加形成重组产物的效率；它们可以增加重组反应的特异性；或者诸如，例如通过有利于L/R反应而不是有利于B/P反应，它们可以增加重组反应的方向性。在美国专利号5,888,732中已经描述了大量这些识别位点。用与上述说明相似的方法，配对相应的识别位点，使得靶序列中的突变体attL位点与供体序列中突变体attR位点配对，靶序列中的突变体attB位点与供体序列中突变体attP位点配对，靶序列中的突变体attR位点与供体序列中突变体attL位点配对，或者靶序列中的突变体attP位点与供体序列中突变体attB位点配对。例如，下列成对的识别位点可以用在靶和供体序列中：attB1(SEQ IDNO：176)和attP1(SEQ ID NO：177)，attB2(SEQ ID NO：178)和attP2，P3(这里称为attP2)(SEQ ID NO：179)，attL1(SEQ IDNO：180)和attR1(SEQ ID NO：182)，attL2(SEQ ID NO：181)和attR2(SEQ ID NO：183)，attB3和attP2，P3(SEQ ID NO：179)，及attL3和attR3。(参见美国专利号5,888,732)。
在另一个实施方式中，靶序列包含另外的Int识别位点，以下称为第三识别位点。第一和第三识别位点可以相同的或不同。在一个实施方式中，第一和第三识别位点相同，并且两个位点相互是反向方向的。在另一个实施方式中，第一和第三识别位点不同，并且两个位点相互可以是反向或同向方向。在一个实施方式中，选择第一和第三位点使得它们不能相互重组。例如，靶可以包含两个attB位点，两个attL位点，两个attP位点或者两个attR位点。在一个实施方式中，可以定位靶识别位点使它们相互邻近。在另一个实施方式中，可以定位靶识别位点使得它们相互紧接。在另一个实施方式中，第一和第三识别位点可以定位在靶序列中，这样预先选定的核苷酸序列(这里也称为“第一核苷酸序列”)位于第一和第三识别位点之间。预先选定的核苷酸序列可以包含分子标记、目的序列、选择性标记、可观察的标记、启动子、表达盒，所述这些中任一个的一部分等等。
预先选定的核苷酸序列可以包含一个或多个表达盒。在一个实施方式中，预先选定的核苷酸序列包含含有选择性标记基因的表达盒，该选择性标记基因是诸如这里所述的任何选择性标记基因或本领域已知的其它选择性标记基因。选择性标记允许筛选包含靶序列的宿主细胞，包括筛选包含已经整合到宿主细胞基因组中的靶序列的宿主细胞。在示例性实施方式中，选择性标记基因是原卟啉原加氧酶(PPO)基因，该基因赋予了对protox抑制性除草剂(美国专利号6,084,155)的抗性。在另一个实施方式中，选择性标记基因是磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)，该基因赋予植物利用甘露糖做为营养碳源的能力。
在另一个实施方式中，预先选定的核苷酸序列包含含有目的序列和任选的可观察的标记基因的表达盒，该可观察的标记基因诸如，例如是GUS基因，萤光素酶基因，荧光蛋白质基因(诸如，例如GFP)，或者这里所述的任何其它选择性标记基因或本领域已知的其它选择性标记基因。
在进一步实施方式中，预先选定的核苷酸序列包含含有负选择性标记基因的表达盒，该负选择性标记基因是诸如，例如胞嘧啶脱氨酶基因(Perera等.(1993)PMB 23：793-799)，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(Czako和Marton(1994)Plant Physiol.104：1067-1071)，T-DNA基因2(Depicker等，(1988)Plant Cell Reports 7：63-66)，或者这里所述任何其它负选择性标记基因或者本领域已知的其它负选择性标记基因。
在另一个实施方式中，供体序列也含有两个Int识别位点：如上所述第二识别位点，和以下称为第四识别位点的另外的位点。第二和第四识别位点可以相同或不同。在一个实施方式中，第二和第四识别位点相同，并且两个位点相互是反向方向。在另一个实施方式中，第二和第四识别位点不同，并且两个位点相互是反向或同向方向。
在一个实施方式中，选择第四识别位点的序列，使第四识别位点不能与第二识别位点重组。此外，选择供体的两个识别位点(第二和第四识别位点)，使它们能与靶的两个识别位点(分别是第一和第三识别位点)重组。例如，如果靶序列包含两个attB位点(或者，可替代地两个attL位点)，那么构建供体序列包含两个attP位点(或者，可替代地两个attR位点)。
在另一个实施方式中，供体序列在第二和第四识别位点之间包含一个或多个预先选定的核苷酸序列。该预先选定的核苷酸序列可以包含任何启动子、目的核苷酸序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、表达盒，所述这些的任何一个的一部分等等。
在另一个实施方式中，供体序列包含至少一个目的核苷酸序列。目的核苷酸序列可以包含在表达盒中，并且目的序列的表达可以受这里所述任何一种启动子或受本领域已知的任何其它植物可表达启动子的控制。这里所用的“植物可表达”意指启动子在植物细胞中是可操作的，因此能驱动植物细胞中启动子可操作连接的核苷酸序列的表达。含有目的核苷酸序列的表达盒所可以包含控制或驱动目的核苷酸序列表达的启动子，或者该启动子可以另外地与目的核苷酸序列可操作地连接。示例性目的核苷酸序列包含但不限于编码与任何下列期望特征相关的性状的序列：糯性淀粉；除草剂耐受性；对细菌、真菌或病毒疾病的抗性；昆虫抗性；非生物胁迫耐受性；增强的营养状况；工业过程中改进的性能；改变的生殖能力，诸如雄性不育性或雄性能育性；产量稳定性；产量增加；和植物中有商业价值的酶或代谢物的产生。
在另一个实施方式中，供体序列包含选择性或可观察的标记基因。这种选择性或可观察的标记基因可以是这里所述的任何选择性或可观察的标记基因或者本领域已知的其它选择性或可观察的标记基因，但是所述选择性或可观察的标记基因通常不同于靶系或靶DNA所包含的选择性或可观察的标记基因。在一个实施方式中，终止信号融合到选择性或可观察的标记基因编码区的3’末端。
根据本发明的方法，将靶和供体核苷酸序列引入到植物细胞中。在一个实施方式中，靶DNA序列稳定整合到植物基因组中。通过这里所述的转化方法或通过本领域已知的另外方法获得用靶序列转化的植物或植物细胞以形成靶系。这种靶系可以包含整合到其基因组中的单拷贝靶DNA。一旦获得和鉴定这种靶系，就可以进一步表征它。例如，通过本领域公知的遗传学方法或通过利用分子标记，诸如限制性片段长度多态性(RFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)，简单序列重复(SSR)等等可以精确地测定转基因插入的位置。此外，测序位于插入位点侧翼的宿主植物DNA以确保没有由于转基因的插入突变或者以其它方式破坏必需基因。一旦获得了很好表征的靶系，它就可以用做一个或多个随后引入的核苷酸序列或转基因的受体。这种另外的序列或转基因可以包含在供体序列中，并且可以通过这里所述任何适合的转化方法或本领域已知的转化方法将其引入到靶系中，所述转化方法包括但不限于农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，生物弹击法，电穿孔，PEG介导的转化和用须(whisker)或玻璃珠的摩擦。
在另一个实施方式中，供体序列稳定地整合到植物基因组中。通过这里所述的转化方法或者通过本领域已知的其它方法获得用供体DNA转化的植物或植物细胞以形成供体系。这种供体系可以包含整合到其基因组中的单拷贝靶DNA。如前一段落所述，一旦获得和鉴定了这种供体系，就可以进一步表征它。
在一个实施方式中，通过本领域已知的有性繁殖方法，诸如，例如通过用供体系花粉给靶系授粉并且获得包含靶和供体序列的种子，将靶系与供体系杂交。一旦将这里所述整合酶或整合酶复合物引入到植物细胞中，就可以形成Int介导的重组产物，其中所述植物细胞来源于通过杂交靶系和供体系产生的植物。Int介导的重组产物由靶序列座位和供体序列座位之间的核苷酸序列交换产生。当在靶和供体序列每个中存在唯一识别位点时，靶和供体的重组在植物细胞基因组中产生染色体重排。当在靶和供体序列每个中存在两个识别位点时，靶和供体的重组在植物细胞基因组中不产生染色体重排。
在另一个实施方式中，可以通过病毒复制子将供体序列引入植物细胞中。病毒复制子上供体序列的引入可以使供体序列通过病毒复制子的复制在植物细胞中扩增。在一个实施方式中，在病毒复制子上，将供体序列引入到宿主植物细胞中，该病毒复制子能在植物细胞中自主复制。示例性的病毒复制子包括，但不限于来源于植物病毒的复制子(例如，病毒，诸如玉米条斑病毒(Shen和Hohn(1995)J Gen Virol 76：965-969)；小麦矮化病毒(美国专利号6,051,409和Matzeit等.(1991)Plant Cell 3：247-258)；烟草双粒病毒组、诸如，例如烟草金色花叶病毒或烟草黄矮病病毒；甜菜曲顶病病毒；非洲木薯花叶病毒；番茄金色花叶病毒；苘麻花叶病毒；菜豆矮花病毒；菜豆金色花叶病毒；虎尾草属条纹花叶病毒；洋地黄属(digitaria)条斑病毒；芒属条斑病毒；黍属条斑病毒；马铃薯黄色花叶病毒；南瓜曲叶病毒；甘蔗条斑病毒；番茄曲叶病毒；番茄斑驳病毒；番茄黄色卷叶病毒；或其它已知的病毒(Timmermans等.(1994)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45：79-112))。可以用各种已知转化方法的任一种方法将包含供体序列的病毒复制子引入到宿主植物细胞中。示例性的转化方法包括如这里所述的农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(Grimsley等.(1989)Mol GenGenet 217：309-316)，微粒轰击(即，“生物弹击法”或“粒子轰击”)，PEG介导的转化，电穿孔，显微注射等等或本领域已知的其它转化方法。
如这里所提供的，靶和供体序列的重组由整合酶或整合酶复合物介导。Int识别整合酶识别位点，诸如，例如attB，attP，attL，attR和这里所述的突变体识别位点，并且介导这些识别位点之间的重组。在一个实施方式中，该反应由整合酶介导，该整合酶可以伴随有称为整合宿主因子(IHF)的辅助蛋白质。IHF包含两种细菌蛋白质亚基α和β。IHF可以在DNA转折中起作用，因此有利于通过整合酶进行的重组反应。在一个实施方式中，整合酶和IHF用于介导靶和供体序列之间的重组。在另一个实施方式中，重组反应由整合酶、IHF和切除酶(Xis)介导。Xis蛋白质可以来源于噬菌体λ。整合酶，整合酶和IHF的联合，或整合酶，IHF和Xis的联合可以用于介导靶和供体序列之间的重组。而且，通过选定的用以介导重组反应的特定整合酶属性确定选定的Int的成分(即，无论是Int包含整合酶，整合酶和IHF还是整合酶与IHF和Xis)。如果使用野生型λ整合酶，它要与IHF一起使用，并且在L/R反应的情况下，它要与Xis一起使用。如果使用突变体整合酶(例如，Int-h或Int-h/218)，那么它可选地与IHF和/或Xis一起使用。
在另一个实施方式中，Iht包含突变体整合酶。实现特定氨基酸改变和使整合酶有利于在辅助蛋白质诸如IHF缺乏的情况下重组的噬菌体λ整合酶编码序列中的突变是已知的(Lorbach等.(2000)J.Mol.Biol.296：1175-1181)。任何适当突变的整合酶都可以与这里所提供的方法一起使用，并且包括，例如Int-h和Int-h/218。整合酶突变体Int-h包含在整合酶多肽中氨基酸174位置的谷氨酸到赖氨酸的改变。在IHF和/或Xis缺乏的情况下，Int-h能介导哺乳动物细胞中的重组。重组突变体Int-h/218包含在氨基酸174位置的谷氨酸到赖氨酸的改变和在氨基酸218位置的谷氨酸到赖氨酸的改变。在IHF缺乏的情况下，Int-h/218能介导哺乳动物细胞中的重组(Lorbach等.(2000)J.Mol.Biol.296：1175-1181)。
在另一个实施方式中，将Int做为一个或多个核酸分子(DNA和/或RNA)引入宿主细胞，所述核酸分子包含Int每个组成蛋白质的编码序列。可以将Int做为一个或多个表达盒引入，该表达盒包含Int每个蛋白质的编码区，其中每个编码区可操作地连接能在植物细胞中表达的启动子。可以选择每个表达盒的启动子，以便可以通过任何期望的方式空间或时间调节表达。例如，可以选择启动子使Int表达是组成型的，发育调节的，组织特异的，组织优选的，细胞特异的，对特定细胞区室特异(即，细胞器特异的)等等。此外，可以选择启动子使Int表达在植物中可以是化学诱导的，其仅仅应答用化学配体处理植物细胞或组织产生Int表达。通过赋予特异性表达的启动子元件和赋予化学诱导表达的启动子元件的联合，Int可以应答化学施用在植物的特异性细胞或组织中表达或激活。各种植物可表达启动子的任何一种启动子都可以用于驱动Int表达。这里描述了这种启动子中的几种启动子，其它的这种启动子是本领域已知的。
在另一个实施方式中，通过稳定地将整合酶或整合酶复合物转化到植物细胞基因组中，将该整合酶或整合酶复合物引入到植物细胞中。例如，Int可以包含在含有Int编码序列的一个或多个表达盒中，由此Int每个蛋白质组分的编码序列可操作地连接能在植物组织和细胞中表达的启动子。本领域已知并且在本文中描述了稳定地转化植物细胞的适合方法。在一个实施方式中，也用供体序列稳定地转化用Int稳定转化的植物细胞。
如本领域技术人员所将要理解的，整株植物可以从已经用选定的核苷酸序列稳定转化的植物细胞或植物细胞组再生。然后，该再生的整株植物也称为是用选定的核苷酸序列转化的。因此，根据这里所公开的方法，可以用包含Int和供体序列的一个或多个表达盒稳定地转化第一种植物，然后该第一种植物可以与用靶序列稳定地转化的第二种植物杂交。因此，F1植物或种子中Int的表达可以介导靶和供体序列之间的重组，以在F1植物或种子中形成Int介导的重组产物。然后通过育种，编码Int的核苷酸序列和供体序列未重组部分可以与包含重组产物序列的核苷酸序列分离。
在另一个实施方式中，可以将Int引入植物细胞中以使植物细胞瞬时表达Int。例如，通过例如农杆菌属(Agrobacterium)或微粒轰击，可以将包含Int，IHF和Xis的一个或多个核苷酸序列引入到植物细胞中。大多数引入的核苷酸序列不整合到基因组中，但是可以转录为mRNA。在另一个示例性实施方式中，利用病毒表达系统，可以将Int引入植物细胞中并且表达。可以从能感染植物的RNA或DNA病毒构建病毒表达系统。在一个实施方式中，Int蛋白质的编码序列包含在病毒复制子中，该病毒复制子能在植物细胞中自主复制。这里描述了示例性的病毒复制子。
在另一个实施方式中，以信使RNAs(mRNA)的形式将Int编码序列提供给宿主细胞。以该方法，仅仅瞬时将Int提供给宿主细胞。使用例如在Lebel等.(1995)Theor.Appl.Genet.91：899-906和美国专利号6.051,409中所述的方法，可以将Int每个蛋白质的编码序列插入到载体中用于RNA的体外转录。然后可以将RNA转化到宿主细胞，诸如，例如来源于供体系或靶系的细胞中。例如，在一个实施方式中，RNA与供体序列共转化到宿主细胞中。在示例性实施方式中，如美国专利号6,051,409中所述，利用微粒轰击将RNA转移到宿主细胞。在另一个实施方式中，通过例如，如在Lebel等.(1995)Theor.Appl.Genet.91：899-906中所述的PEG介导的转化或通过电穿孔将RNA引入到宿主细胞的原生质体中。在另一个实施方式中，利用其它转化技术诸如RNA显微注射将RNA引入到宿主细胞中。
在进一步实施方式中，将活性Int做为一个或多个蛋白质，诸如，例如一个或多个纯化的蛋白质引入宿主细胞中。可以通过本领域已知的任何适合方法，诸如，例如微注射或电穿孔将Int蛋白质引入细胞中。在另一个实施方式中，通过微注射将Int和供体DNA序列一起引入宿主细胞中(参见，例如Neuhaus等.(1993)Cell 73：937-952)。在另一个实施方式中，通过用包含VirE2或VirF融合蛋白质的农杆菌属(Agrobacterium)感染(参见，例如Vergunst等.(2000)Science 290：979-82)将Int蛋白质引入宿主细胞中。
在一个实施方式中，优化Int蛋白质的编码序列以在特定植物宿主中表达。通过根据宿主植物密码子偏爱优化蛋白质编码序列可以增加异源蛋白质在植物中的表达，这是本领域已知的。植物中偏爱的密码子使用不同于一些微生物中偏爱的密码子使用。克隆的微生物ORF(开放读框)中密码子使用和植物基因(并且特别是来源于选定宿主植物的基因)中密码子使用的比较能够鉴定ORF中这样的密码子，其中为了优化用于宿主植物中表达的编码序列，可以改变该密码子。
本领域技术人员将认识到这里所公开的方法产生的Int介导的重组产物可以随着选定的靶和供体序列及这些序列相对于重组酶识别位点的定位而变化。
在一个实施方式中，靶包含不完整的核苷酸序列，诸如，例如不完整的目的序列，不完整的基因，不完整的选择性标记，不完整的可观察标记，不完整的负选择性标记，不完整的启动子序列，不完整的表达盒等等，并且构建供体以包含补全序列(completion sequence)，使得靶和供体之间的重组产生了完整的核苷酸序列。以该方法，只有包含重组产物的宿主细胞包含(即，来源于完整的核苷酸序列的)适合的表达产物。例如，在一个实施方式中，靶包含两个识别位点，目的序列，诸如，例如，选择性标记或可观察的标记基因和在目的序列3’末端融合的终止信号。目的序列位于靶序列中，使得它不位于两个识别位点之间，但是目的序列的5’末端邻近识别位点之一。供体序列包含启动子和两个识别位点。启动子位于供体序列中，使得它邻近识别位点之一，并且还位于两个识别位点之间；而且，启动子的方向性是这样的，即启动子能跨过邻近的识别位点驱动转录，并且远离位于两个识别位点之间序列的剩余部分。当将靶和供体序列引入到宿主细胞中，并且暴露于在宿主细胞中的Int或与Int接触时，所得到的重组产物包含可操作地连接目的序列和靶3’终止信号的启动子。因此，目的序列能在宿主细胞中被表达。
在另一个实施方式中，靶序列可以包含至少一个插入到基因部分，诸如基因3’部分的5’的识别位点。然后构建供体序列以包含该基因相应的5’部分，优选地包含靶序列中不存在的基因编码区部分。在该实施方式中，供体序列包含至少一个插入到包含在供体序列中的基因部分3’的识别位点。一旦发生Int介导的靶和供体序列的重组，重组产物就包含相互可操作地连接的基因5’和3’部分，因此形成完整基因。在该实施方式中，可操作地连接该基因5’部分的该基因启动子可以包含在供体序列中。因此，一旦靶和供体序列重组，Int介导的重组产物就包含可操作地连接完整基因的启动子，该完整基因由基因的5’和3’部分可操作地连接而形成。
在进一步实施方式中，靶序列可以包含至少一个插入到基因部分，诸如基因5’部分的3’的识别位点。然后构建供体序列以包含该基因相应的3’部分，优选地包含靶序列中不存在的基因编码区部分。在该实施方式中，供体序列包含至少一个插入到包含在供体序列中的基因部分5’的识别位点。一旦发生Int介导的靶和供体序列的重组，重组产物就包含相互可操作地连接的基因5’和3’部分，因此形成完整基因。在该实施方式中，该基因启动子可以包含在靶序列中，由此它可操作地连接该基因的5’部分。因此，一旦靶和供体序列重组，Int介导的重组产物就包含可操作地连接完整基因的启动子，该完整基因由基因的5’和3’部分可操作地连接而形成。
在一个实施方式中，内含子或其部分可以可操作地连接包含在靶序列中的目的序列(例如，基因，选择性或可观察的标记基因等等)或其部分的3’末端。在该实施方式中，识别位点位于内含子序列5’末端附近或其中。然后构建供体序列以使启动子可操作地连接目的序列的5’末端。在另一个实施方式中，内含子或其部分可操作地连接包含在供体中的目的序列一部分的3’末端。此外，可以构建供体以使启动子可操作地连接目的序列和内含子的5’部分，并且识别位点置于内含子序列3’末端附近或其中。一旦发生靶和供体序列的Int介导的重组，那么重组产物就含有来源于供体构建体的启动子，该启动子可操作地连接靶构建体的目的序列及完整内含子。重组产物也将含有功能性目的序列，其是由目的序列5’部分(来源于供体)和目的序列3’部分(来源于靶)可操作的连接而形成(图3)。
在另一个实施方式中，使用另外的识别位点以有利于在基因组中一个基因座的多个目的核苷酸序列的整合。(如这里所述)大量突变体attB，attP，attL和attR识别位点的可用性增加了可以利用的识别位点的数量，因为每个识别位点仅能与其相应的识别位点重组。供体序列可以贡献给重组产物另外的识别位点，该识别位点不用于与最初的靶序列重组，而是用在随后的重组循环中以重组第二个不同的供体序列和第一个重组产物。在一个实施方式中，供体序列包含一个或多个不同于第二和第四识别位点的另外识别位点。另外识别位点之一可以邻近目的序列，诸如，例如选择性标记基因的5’末端。在目的序列是选择性标记基因的情况下，尽管可以使用这里所述的任何选择性标记基因或本领域已知的选择性标记基因，但是优选地，这种选择性标记基因不同于可以包含在靶系或靶序列中的任何选择性标记基因。在另一个实施方式中，终止信号融合到目的序列3’末端。另外的识别位点和目的序列位于供体两个识别位点之间(即，上述第二和第四识别位点之间)。在一个实施方式中，两个表达盒位于另外的识别位点侧翼。第一轮循环Int介导的重组后，第三识别位点能够进行随后轮循环的Int介导的重组，利用另外的识别位点和最初两个识别位点的任一个识别位点产生了另外的转基因或目的序列的整合。
在另一个实施方式中，利用Int在靶序列中产生特异性缺失。靶序列包含相互同向的第一识别位点和第二识别位点。此外，靶序列包含第一和第二识别位点之间的第一核苷酸序列。第一核苷酸序列可以包含这里所述或本领域已知的选择性标记，负选择性标记，可观察的标记，目的序列等等。选择第一和第二识别位点以使它们能互相重组。例如，当第一识别位点是attB或attL时，第二识别位点分别是attP或attR。将整合酶或整合酶复合物引入到包含靶序列的宿主细胞中，并且整合酶或整合酶复合物介导第一和第二识别位点之间的重组。第一和第二重组位点在同向方向的重组缺失靶DNA的第一核苷酸序列，因此形成改变的靶序列。
在进一步实施方式中，靶DNA整合到植物基因组中。通过这里所述的任何适合的转化方法或本领域已知的其它转化方法，获得用靶序列转化的植物或植物细胞以形成靶系。在一个实施方式中，这种靶系包含整合到其基因组中的单拷贝靶DNA。一旦鉴定了该系，如上文所述进一步表征它。然后，通过这里所述方法或本领域已知的其它方法，将整合酶或整合酶复合物做为核酸分子或蛋白质引入到靶系中。可以通过本领域已知的方法学鉴定Int介导的重组产物，所述方法学包括但不限于可观察标记，选择性标记或目的序列的表达或不表达；缺失的PCR鉴定(聚合酶链式反应)；和负选择性标记的缺少。
在另一个实施方式中，整合酶或整合酶复合物介导位于核苷酸序列中两个识别位点之间核苷酸序列的倒位，形成改变的核苷酸序列。倒位可以用做选定核苷酸序列，诸如，例如这里所述或本领域已知其它的目的序列，可观察或选择性标记基因等等的开闭开关。在一个实施方式中，靶序列包含相互反向的第一识别位点和第二识别位点。此外，靶序列包含位于第一和第二识别位点之间的第一核苷酸序列。第一核苷酸序列可以含有任何选定的核苷酸序列，诸如，例如选择性标记，负选择标记，可观察的标记，目的序列，所述这些中任何一个的一部分等等。第一和第二识别位点相互反向方向。而且，选择第一和第二识别位点以使它们能相互重组。例如，当第一识别位点是attB或attL时，第二识别位点分别是attP或attR。将整合酶或整合酶复合物引入含有靶序列的宿主细胞中，并且该整合酶或整合酶复合物介导第一和第二识别位点之间的重组。当反向方向的第一和第二重组位点重组时，第一核苷酸序列相对于第一和第二识别位点之间其原始方向发生颠倒，因此形成改变的靶序列。
在一个实施方式中，靶序列整合到植物基因组中。如上文所述获得和表征靶系。通过这里所述方法或本领域已知的其它方法，将整合酶或整合酶复合物做为核酸或蛋白质引入。如上文所述，用已知的方法，诸如通过包含在第一核苷酸序列中的可观察的标记，目的序列，选择性标记，负选择标记等等的表达或不表达表征Int介导的重组产物。
在另一个实施方式中，靶序列包含不位于第一和第二识别位点之间的第二核苷酸序列。一旦第一和第二识别位点重组，就产生了Int介导的重组产物，由此颠倒靶的第一核苷酸序列，并且靶的第二核苷酸序列保持在其原始方向。第二核苷酸序列可以是这里所述或本领域已知其它的任何适合的核苷酸序列，诸如，例如启动子，表达盒，目的序列，选择性标记，可观察的标记，负选择标记，所述这些中任一个的一部分等等。在一个实施方式中，第二核苷酸序列包含选择性标记基因，诸如，例如编码磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)的核苷酸序列，编码β葡糖醛酸酶(GUS)的序列，编码原卟啉原氧化酶(PPO)的核苷酸序列，编码萤光素酶(LUC)的核苷酸序列等等。
在另一个实施方式中，第二核苷酸序列包含不完整的核苷酸序列，诸如，例如不完整的基因，不完整的目的序列，不完整的启动子，不完整的表达盒等等，并且构建靶序列以使第一和第二识别位点之间的重组产生完整的核苷酸序列。在这种构建体中，不完整的核苷酸序列除非且直到该序列完整了，才有功能。例如，因为靶中缺少引导目的序列表达的完整启动子，或者因为靶中不存在完整的目的序列，所以目的核苷酸序列不可能被转录。
在另一实施方案中，例如，可以将目的序列，如具有与标记基因3’端融合的终止信号的选择性或可观察的标记基因，放置在靶的第二核苷酸序列中。靶序列包含位于靶序列中的启动子，以使它邻近识别位点之一并且还位于两个识别位点之间；而且，启动子的方向性是这样的，即启动子能跨过邻近的识别位点驱动转录，并且远离位于两个识别位点之间序列的剩余部分。在靶序列中，定向第一核苷酸序列，以使启动子不是可操作地连接第二核苷酸序列。一旦第一和第二识别位点重组，并且第一核苷酸序列倒位，那么重组产物就包含可操作地连接目的序列和第二核苷酸序列的3’终止信号的第一核苷酸序列的启动子。
一般的成分和方法
I.表达盒
在表达盒中首先将要在转基因植物中表达的编码序列装配到植物中可表达的适合启动子的3’。表达盒还可以包含所需或选定用于转基因表达的另外序列。这种序列包含，但不限于转录终止子，增强表达的外部序列诸如内含子，病毒序列，和要用于将基因产物靶向特异性细胞器和细胞区室的序列。这些表达盒然后可以转移到这里所述的植物转化载体。
下面是典型表达盒子的各种成分的描述。
A.启动子
用在表达盒中启动子的选择将决定转基因植物中转基因的空间和时间表达模式。选定的启动子将在特异性细胞类型(诸如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)中或特异性组织或器官(例如，根、叶或花)中表达转基因，并且该选择应该反映基因产物期望的积累位置。做为可替代的方案，选定的启动子可以在各种诱导条件下驱动基因表达。启动子在它们强度方面，即促进转录能力方面不同。根据所用宿主细胞系统，可以利用大量适合启动子中任何一种启动子，包括基因天然的启动子。下面是可在本发明中所用表达盒中使用的非限制性启动子的例子。
1.组成型启动子
a.泛素启动子
泛素是已知在许多细胞类型中积累的基因产物，并且已经从几种物种克隆了它的启动子，用在转基因植物中(例如，向日葵-Binet等.PlantScience 79：87-94(1991)；玉米-Christensen等.Plant Molec.Biol.12：619-632(1989)；和拟南芥(Arabidopsis)-Norris等，Plant Mol.Biol.21：895-906(1993))。在转基因单子叶植物系统中已经发展了玉米泛素启动子，并且在专利申请EP 0 342 926(申请人Lubrizol)中公开了用于单子叶植物转化所构建的其序列和载体，这里将这篇文献并入为参考文献。Taylor等.(Plant Cell Rep.12：491-495(1993))描述了包含玉米泛素启动子和第一内含子的载体(pAHC25)和当通过微粒轰击将其引入时，其在大量单子叶植物细胞悬浮液中的高度活性。拟南芥(Arabidopsis)泛素启动子与本发明核苷酸序列一起使用是理想的。泛素启动子适于转基因植物，包括单子叶植物和双子叶植物中的基因表达。适合的载体包括pAHC25衍生物或该申请中所述的任何转化载体。可以通过适合泛素启动子和/或内含子序列的引入修饰载体。
b.CaMV 35S启动子
在公开的专利申请EP 0 392 225(在1991年9月25日公开；CibaGeigy；实施例23)中描述了质粒pCGN1761的构建，这里将这篇文献并为参考文献。该质粒含有“双”CaMV 35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子之间具有唯一EcoRI位点，并且该质粒具有pUC类型骨架。构建具有修饰的多接头的pCGN1761衍生物，该修饰多接头除了存在的EcoRI位点外，还包含NotI和XhoI位点。命名为pCGN1761ENX的该衍生物用于在其多接头中克隆cDNA序列或编码序列(包含微生物ORF序列)，目的是在转基因植物中，35S启动子控制下表达它们。可以通过启动子5’的HindIII，SphI，SalI和XbaI位点和终止子3’的XbaI，BamHI和BglI位点切除这种构建体的完整35S启动子-编码序列-tml终止子盒以转移到转化载体如下文所述的载体。而且，可以通过用HindIII，SphI，SalI，XbaI或Pstl的5’切除和用任何多接头限制位点(EcoRI，NotI，或XhoI)的3’切除移除双35S启动子片段以用另一种启动子置换。如果期望，可以通过引入可以增强翻译的序列进行克隆位点周围的修饰。当期望超表达时，这特别有用。例如，如美国专利号5,639,949(在1997年6月17日授权给Ciba Geigy)实施例37中所述，可以通过翻译起始位点的优化修饰pCGN1761ENX，该篇文献并入参考文献。
c.肌动蛋白启动子
已知几种同工型肌动蛋白在大多数细胞类型中表达，因此肌动蛋白启动子是组成型启动子好的选择。特别地，已经克隆和表征了来源于水稻ActI基因的启动子(McElroy等.Plant Ceu 2：163-171(1990))。发现该启动子的1.3kb片段包含水稻原生质体中表达所需的所有调节元件。而且，根据ActI启动子已经构建了专门用于单子叶植物中的大量表达载体(McElroy等.Mol.Gen.Genet.231：150-160(1991))。这些表达载体包含了ActI内含子1，AdhI 5’侧翼序列和AdhI-内含子1(来源于玉米醇脱氢酶基因)和来源于CaMV 35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和ActI内含子或AdhI 5’侧翼序列和ActI内含子的融合。(GUS报道基因的)起始ATG周围序列的优化也增强了表达。可以容易地修饰McElroy等(Mol.Gen.Genet.231：150-160(1991))描述的启动子表达盒以用于基因表达，并且该启动子表达盒特别适于用在单子叶植物宿主中。例如，可以从McElroy构建体移除含有启动子的片段，用于置换pCGN1761ENX中双35S启动子，然后其可用于特定基因序列的插入。然后，可以将构建的融合基因转移到适合的转化载体。在分开的报道中，还发现水稻ActI启动子和其第一内含子在培养的大麦细胞中引导高效表达(Chibbar等.Plant Cell Rep.12：506-509(1993))。
2.诱导型表达
a.PR-1启动子
可以用将引起适合高效表达水平的任何其它启动子置换pCGN1761ENX中双35S启动子。举例说明，美国专利号5,614,395 (1997年3月2日授权给Ciba Geigy)中所述化学调节型启动子之一，诸如烟草PR-1a启动子可以置换双35S启动子。做为可替代方案，可以使用Lebel等，Plant J.16：223-233(1998)中所述的拟南介(Arabidopsis)PR-1启动子。可以通过限制酶从选择的启动子来源切除该启动子；做为可替代的方案，可以利用带有适合末端限制位点的引物PCR扩增它。如果采用PCR扩增，那么可以重新测序启动子以检查靶载体中扩增启动子克隆后的扩增错误。从质粒pCIB1004(关于其构建，参见EP 0 332 104实施例21(1991年3月20日公开；Ciba Geigy)，由此并入其为参考文献)切割化学/病原体调节型烟草PR-1a启动子，并且将其转移到质粒pCGN1761ENX(Uknes等，Plant Cell 4：645-656(1992))。用NcoI切割质粒pCIB1004，通过用T4 DNA聚合酶处理使所得线型片段的3’突出端平端化。然后用HindIII切割该片段，凝较纯化所得含有PR-1a启动子的片段，并且将其克隆到已经移除双35S启动子的pCGN1761ENX中。这是通过用XhoI切割，T4聚合酶平端化，接着用HindIII切割，分离其中克隆有pCIB1004启动子片段的含有较大载体-终止子的片段来完成的。这产生了具有PR-1a启动子和tml终止子及间插多接头的pCGN1761ENX衍生物，该间插多接头具有唯一EcoRI和NotI位点。可以将选定的编码序列插入到该载体中，随后可以将融合产物(即，启动子-基因-终止子)转移到任何选定的转化载体，包括下文所述的转化载体。在根据本发明所转化的植物中，可以使用各种化学调节剂诱导选定编码序列的表达，所述化学调节剂包括美国专利号5,523,311和5,614,395中公开的苯并噻二唑、异烟酸和水杨酸化合物。
b.乙醇诱导型启动子
一些醇或酮，诸如乙醇的诱导型启动子也可以用于给本发明编码序列提供诱导型表达。这种启动子是，例如来源于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的alcA基因启动子(Caddick等.(1998)Nat.Biotechnol 16：177-180)。在构巢曲霉(A.nidulans)中，alcA基因编码醇脱氢酶I，在化学诱导物存在的情况下，其表达受AlcR转录因子调节。对于本发明目的而言，包含与最小35S启动子融合的alcA基因启动子序列的质粒palcA：CAT中CAT编码序列(Caddick等.(1998)Mat.Biotechnol 16：177-180)被本发明编码序列置换以形成表达盒，该表达盒具有alcA基因启动子控制的编码序列。这是利用本领域已知的方法进行的。
c.糖皮质激素诱导型启动子
也考虑了利用基于甾类激素的系统的本发明核酸序列的表达诱导。例如，利用糖皮质激素介导的诱导系统(Aoyama和Chua(1997)ThePlant Journal 11：605-612)，并且通过糖皮质激素诸如合成的糖皮质激素(例如，地塞米松)的施用诱导基因表达。在一个实施方式中，糖皮质激素存在的浓度范围是约0.1mM到约1mM。在另一个实施方式中，糖皮质激素存在的浓度范围是约10mM到约100mM。对于本公开的目的而言，可以用目的序列置换萤光素酶基因序列以形成具有目的序列的表达盒，该目的序列受与35S最小启动子融合的6拷贝GAL4上游激活序列控制。这是通过本领域公知的方法完成的。反式作用因子包含GAL4DNA结合结构域(Keegan等.(1986)Science 231：699-704)，该结合结构域融合疱疹病毒蛋白质VP16的反式激活结构域(Triezenberg等.(1988)Genes Devel.2：718-729)，该反式激活结构域融合大鼠糖皮质激素受体激素结合结构域(Picard等.(1988)Cell 54：1073-1080)。如本领域所知或这里所述，融合蛋白质的表达可以受适于在植物中表达的任何启动子控制。该表达盒也可以包含融合6xGAL4/最小启动子的目的序列。因此，可以获得融合蛋白质的组织或器官特异性，产生表达盒的诱导型组织或器官特异性。
d.创伤诱导型启动子
创伤诱导型启动子也适于基因表达。已经描述了大量这种启动子(例如，Xu等.Plant Molec.Biol.22：573-588(1993)，Logemann等.Plant Cell 1：151-158(1989)，Rohrmeier & Lehle，Plant Molec.Biol.22：783-792(1993)，Firek等.Plant Molec.Biol.22：129-142(1993)，Warner等.Plant J.
3：191-201(1993))，并且所有这些启动子都适于与本发明一起使用。Logemann等描述了双子叶马铃薯wmI基因5’上游序列。Xu等表明来源于双子叶植物马铃薯(pin2)的创伤诱导型启动子在单子叶植物水稻中是活性的。而且，Rohrmeier & Lehle描述了玉米WipIcDNA的克隆，该玉米WipI cDNA是创伤诱导的并且利用标准技术，其可以用于分离相关启动子。相似地，Firek等和Warner等描述了来源于单子叶植物芦笋(Asparagus officinalis)的创伤诱导型基因，该基因在局部创伤和病原体侵染位点表达。利用本领域公知的克隆技术，可以将这些启动子转移给适合的载体，与本发明相关基因融合，并且用于在植物创伤位点表达这些基因。
3.组织特异性或组织偏爱性表达
a.根偏爱性表达
基因表达的另一种模式是根表达。用于本发明构建体和方法的适合根启动子是Framond(FEBS 290：103-106(1991))和美国专利号5,466,785(1995年11月11日签发给Ciba Geigy)所述的玉米金属硫蛋白样(MTL)基因启动子，这里并入这些文献为参考文献。将该“MTL”启动子转移给适合的载体诸如pCGN1761ENX，用于插入选定的基因和随后将完整启动子-基因-终止子盒转移给目的转化载体。
b.木髓偏爱性表达
专利申请WO 93/07278(1993年4月15日公开；Ciba Geigy)描述了玉米trpA基因的分离，该基因优先在髓细胞中表达，这里将这篇文献并为参考文献。提供了从转录开始延伸一直到-1726bp的基因序列和启动子。利用标准分子生物学技术，可以将该启动子或其部分转移给载体诸如pCGN1761，在该载体中其可以置换35S启动子，并且用于以木髓偏爱方式驱动外源基因的表达。事实上，可以将含有木髓偏爱启动子或其部分的片段转移给任何载体，并且对它进行修饰以在转基因植物中使用。
c.叶特异性表达
Hudspeth & Grula(Plant Molec Biol 12：579-589(1989))已经描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。利用标准分子生物学技术，该基因的启动子可以用于以叶特异性方式驱动转基因植物中任何基因的表达。
d.花粉特异性表达
WO 93/07278(1993年4月15日公开；Ciba Geigy)描述了花粉细胞中表达的玉米钙依赖型蛋白激酶(CDPK)基因的分离。从转录开始，该基因序列和启动子延伸直到1400bp。利用标准分子生物学技术，可以将该启动子或其部分转移给载体诸如pCGN1761，在该载体中其可以置换35S启动子，并且用于以花粉特异性方式驱动目的序列的表达。
B.转录终止子
各种转录终止子可用在本发明表达盒中。这些转录终止子负责转基因的转录终止和正确mRNA聚腺苷酸化。适合的转录终止子是已知在植物中起作用的转录终止子，其包括但不限于CaMV35S终止子，tml终止子，胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。这些转录终止子可以用在单子叶和双子叶植物中。此外，可以利用基因天然的转录终止子。
C.增强或调节表达的序列
已经发现了从转录单位中增强基因表达的大量序列，并且这些序列可以与各种基因联合使用以增强它们在转基因植物中的表达。
各种内含子序列已经表明特别是在单子叶植物细胞中增强表达。例如，发现当将玉米AdhI基因内含子引入玉米细胞中时，其显著地增强了其关联启动子控制下的野生型基因的表达。发现内含子1在具有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中特别有效并且具有增强的表达(Callis等，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在相同的试验系统中，来源于玉米bronzel基因的内含子在增强表达方面具有相同的作用。通常在非翻译的引导序列中，已经常规地将内含子序列掺入到植物转化载体中。
也已知增强表达的来源于病毒的大量非翻译前导序列，并且这些前导序列在双子叶植物细胞中特别有效。具体地，已经表明来源于烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)，玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面有效(例如，Gallie等.Nucl.AcidsRes.15：8693-8711(1987)；Skuzeski等.Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域已知的其它前导序列包括但不限于小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.PNAS USA 86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Allison等，1986)；MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)；Virology 154：9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP)前导序列，(Macejak，D.G.，和Sarnow，P.，Nature 353：90-94(1991)；来源于苜蓿花叶病毒外被蛋白质mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)，(Jobling，S.A.，和Gehrke，L.，Nature 325：622-625(1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，(Gallie，D.R.等，Molecular Biology of RNA，237-256页(1989)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等，Virology 81：382-385(1991).也参见Della-Cioppa等，Plant Physiology 84：965-968(1987)。
D.合成的基因
在本发明优选的实施方式中，优化整合酶复合物蛋白质的编码序列以在特定植物宿主中表达。通过优化基因编码区为宿主偏爱的密码子可以增强植物中蛋白质表达的优化，这在本领域是已知的。相应地，植物中偏爱的密码子使用不同于一些微生物中偏爱的密码子使用。克隆的微生物ORF中密码子使用与植物基因中密码子使用的比较能够鉴定可以改变的ORF中密码子。通常，植物进化趋向在单子叶植物第三碱基位置具有核苷酸C和G的强烈偏爱性，而双子叶植物在该位置常常使用核苷酸A或T。通过修饰基因以掺入特定靶转基因物种偏爱的密码子使用，将克服下述GC/AT含量和非常规剪切的许多问题。
植物基因通常具有高于30％的GC含量。植物中，A和T核苷酸丰富的ORF序列可能引起许多问题。首先，认为ATTTA基序引起信息的去稳定作用，而且在许多短寿mRNAs 3’末端发现这种基序。其次，认为在信息中不适当位置出现多聚腺苷酸化信号诸如AATAAA引起转录提前截短。此外，单子叶植物可能将富含AT的序列认为是内含子，并且可能鉴定侧翼剪切位点(参见下文)。
植物不同于微生物之处在于它们的信息不具有确定的核糖体结合位点。相反，认为核糖体吸附信息的5’末端，并且扫描起始翻译的第一个可用的ATG。然而，认为存在对邻近ATG的一些核苷酸的偏爱性，并且通过在ATG包含真核生物共有序列翻译起始子可以获得微生物基因的表达。Clontech(1993/1994目录，210页，这里并入其为参考文献)已经建议了一种序列做为植物中大肠杆菌(E.coli)uidA基因表达的共有序列翻译起始子。而且，Joshi(NAR 15：6643-6653(1987)，这里并入这篇文献为参考文献)已经比较了邻近ATG的植物序列，并且建议了另一种共有序列。在植物中微生物ORFs的表达遇到困难的情况下，在起始ATG包含这些序列之一可以改进翻译。在这些情况下，由于第二AA残基的修饰，共有序列最后三个核苷酸可能不适于包含在修饰的序列中。在不同植物物种之间，邻近起始甲硫氨酸的优选序列可能不同。位于GenBank数据库中14个玉米基因的调查提供了下面的结果：
14个玉米基因中起始ATG前的位置
| -10 | -9 | -8 | -7 | -6 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | |
| CTAG | 3326 | 8033 | 4316 | 6440 | 2336 | 5225 | 6134 | 0176 | 10121 | 7035 |
可以对掺入核苷酸序列的期望植物物种进行这种分析和修饰邻近ATG的序列以掺入优选核苷酸。
从非植物来源克隆并且未优化用于植物中表达的基因也可以包含在植物中做为5’或3’剪切位点被识别的基序，并且可以切割该基因，因此产生截短或缺失的信息。可以利用本领域公知的技术移除这些位点。
编码序列和邻近序列修饰的技术是本领域公知的。在微生物ORF起始表达低，并且认为对序列进行上述改变是适合的的情况下，则根据本领域公知的方法进行合成基因的构建。例如，在公布的专利公开文献EP 0 385 962(1990年9月5日公开，申请人Monsanto)，EP 0 359 472(1995年12月27日签发给Lubrizol)和WO 93/07278(1993年4月15日公开，申请人Ciba-Geigy)中描述了上述这些，这里将所有这些文献并入作为参考文献。在大多数情况下，在转移给转基因植物以前，优选利用(本领域已知的)瞬时测定方法测定基因构建体的表达。
II.植物转化载体和选择性标记
植物转化可用的大量转化载体是植物转化领域普通技术人员已知的，并且与该发明有关的基因可以与任何这种载体联合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和转化的靶物种。对于一些靶物种，可以优选不同抗生素或除草剂筛选标记。通常在转化中使用的筛选标记包括nptII基因，其赋予了对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing & Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan等，Nature 304：184-187(1983))，bar基因，其赋予了对除草剂膦丝菌素的抗性(White等，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer等.Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))，hpt基因，其赋予了对抗生物潮霉素的抗性(Blochinger & Diggelmann，MolCell Biol 4：2929-2931)，和dhfr基因，其赋予了对氨甲蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))，EPSPS基因，其赋予了对草甘膦的抗性(美国专利号4,940,835和5,188,642，分别在1990年7月10日和1993年2月23日签发给Monsanto)，和甘露糖-6-磷酸异构酶基因(这里也称为磷酸甘露糖异构酶基因)，其提供了代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629，分别在1998年6月16日和1999年11月30日签发给Novartis)。
A.适于农杆菌属(Agrobacterium)转化的载体
许多载体可用于利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。这些载体通常带有至少一个T-DNA边界序列，并且包括载体诸如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。下面描述了适于农杆菌属(Agrobacterium)转化的两种通常载体的构建。
1.pCIB200和pCIB2001
双元载体pCIB200和pCIB2001用于构建与农杆菌属(Agrobacterium)一起使用的重组载体，并且按照下面方法构建该双元载体pCIB200和pCIB2001。通过允许切除四环素抗性基因的pTJS75的NarI消化(Schmidhauser & Helinski，J.Bacteriol.164：446-455(1985))，接着插入来源于pUC4K带有NPTII的AccI片段(Messing &Vierra，Gene 19：259-268(1982)：Bevan等，Nature 304：184-187(1983)：McBride等，Plant Molecular Biology 14：266-276(1990))产生pTJS75kan。XhoI接头与含有左和右T-DNA边界、植物选择性nos/nptII嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等，Gene 53：153-161(1987))的PCIB7的EcoRV片段连接，将XhoI消化的片段克隆到SalI消化的pTJS75kan中以产生pCIB200(也参见1991年3月20日公开的EP 0 332104，实施例19；Ciba Geigy)。pCIB200含有下面唯一多接头限制位点：EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，通过插入另外限制位点的多接头而产生。pCIB2001多接头中唯一限制位点是EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。pCIB2001除了包含这些唯一限制位点外，还有植物和细菌卡那霉素筛选，用于农杆菌属(Agrobacterium)介导转化的左和右T-DNA边界，用于在大肠杆菌(E.coli)和其它宿主之间移动的来源于RK2的trfA功能，和同样来源于RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适于包含自身调节信号的植物表达盒的克隆。
2.pCIB10和其潮霉素筛选衍生物
双元载体pCIB10含有用于植物中筛选的编码潮霉素抗性的基因和T-DNA右和左边界序列。pCIB10掺入了使其在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属(Agrobacterium)中复制的来源于宽宿主范围质粒pRK252的序列。Rothstein等(Gene 53：153-161(1987))描述了它的构建。Gritz等(Gene 25：179-188(1983))描述了掺入潮霉素B磷酸转移酶基因的各种pCIB10衍生物。这些衍生物使得转基因植物细胞筛选在仅潮霉素(pCIB743)，或潮霉素和卡那霉素(pCIB715，pCIB717)上进行。
B.适于非农杆菌属(Agrobacteriutm)转化的载体
不使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化避免了在选定转化载体中对T-DNA序列的需要，因此除了包含T-DNA序列的载体，诸如上述的载体外，可以利用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌属(Agrobacterium)的转化技术包括通过粒子轰击，原生质体摄取(例如，PEG和电穿孔)和微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于被转化物种的优选筛选。下面描述了适于非农杆菌属(Agrobacterium)转化的通常载体的构建。
1.pCIB3064
pCIB3064是pUC来源载体，其适于直接基因转移技术联合用除草剂basta(或膦丝菌素)筛选。质粒pCIB246包含与大肠杆菌(E.coli)GUS基因和CaMV 35S转录终止子可操作融合的CaMV 35S启动子，并且在PCT公开申请WO 93/07278(1993年4月15日公开；Ciba Geigy)中描述了该质粒。该载体的35S启动子包含起始位点5’的两个ATG序列。利用标准PCR技术突变这些位点，以移除该ATGs，并且产生限制位点SspI和PvuII。新限制位点距离唯一SaII位点96和37bp，距离实际起始位点101和42bp。由此得到的pCIB246衍生物命名为pCIB3025。然后通过用SaII和SacI消化从pCIB3025切除GUS基因，使得末端平端化，再次连接产生质粒pCIB3060。可以从John InnesCentre，Norwich获得质粒pJIT82，切除含有绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp SmaI片段，并且插入到pCIB3060的HpaI位点(Thompson等.EMBO J 6：2519-2523(1987))。这样产生了pCIB3064，其包含用于除草剂筛选的CaMV 35S启动子和终止子控制下的bar基因，用于氨苄青霉素抗性的基因(用于大肠杆菌(E.coli)中筛选)和具有唯一位点SphI，PstI，HindIII和BamHI的多接头。该载体适于包含自身调节信号的植物表达盒的克隆。
2.pSOG19和pSOG35
质粒pSOG35是利用大肠杆菌(E.coli)基因二氢叶酸还原酶(DFR)做为选择性标记的转化载体，该基因赋予了对氨甲蝶呤的抗性。利用PCR从pSOG10扩增35S启动子(-800bp)，来源于玉米Adh1基因的内含子6(-550bp)和18bp GUS非翻译前导序列。也通过PCR扩增编码大肠杆菌(E.coli)二氢叶酸还原酶类型II基因的250bp片段，并且将这两个PCR片段与来源于pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段组装在一起，该pB1221片段含有pUC19骨架和胭脂氨酸合酶终止子。这些片段的组装产生了pSOG19，其含有与内含子6序列融合的35S启动子，GUS前导序列，DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子。用来源于玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)的前导序列置换pSOG19中的GUS前导序列产生了载体pSOG35。pSOG19和pSOG35带有用于氨苄青霉素抗性的pUC基因，和具有可用于外源物质克隆的HindIII，SphI，PstI和EcoRI位点。
C.适于叶绿体转化的载体
为了在植物质体中表达本发明核苷酸序列，利用质体转化载体pPH143(1997年9月4日公开的WO 97/32011，实施例36；Novartis)。将核苷酸序列插入pPH143，由此置换了PROTOX编码序列。然后，该载体用于质体转化和壮观霉素抗性转化体的筛选。做为可替代方案，在pPH143中插入核苷酸序列，以使它置换aadH基因。在这种情况下，筛选转化体对PROTOX抑制剂的抗性。
III.转化方法
可以通过大量本领域认可的方法，将本发明靶和供体DNA序列盒引入植物细胞中。再生植物的方法也是本领域公知的。例如，已经利用Ti质粒来源于的载体用于外源DNA的递送，还有直接DNA摄取，脂质体，电穿孔，微注射和微粒轰击方法。此外，也可以利用来源于农杆菌属(Agrobacterium)的细菌转化植物细胞。
本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏、瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、蕃木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、菜籽油菜、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和木本植物诸如针叶树和落叶树，特别是玉米、小麦和甜菜。
一旦将期望的DNA序列转化到特定植物物种中，利用常规育种技术，它就可以在该物种中繁殖或者移动到相同物种的其它品种，特别地包括商业品种中。
下面是转化双子叶和单子叶植物的代表性技术及代表性质体转化技术的说明。
A.双子叶植物的转化
双子叶植物的转化技术是本领域已知的，包括基于农杆菌属(Agrobacterium)的技术和不需要农杆菌属(Agrobacterium)的技术。非农杆菌属(Agrobacterium)技术包括原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄取，粒子轰击介导的递送或显微注射来完成。Paszkowski等，EMBO J 3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich等，Biotechnology 4：1001-1004(1986)，和Klein等，Nature 327：70-73(1987)描述了这些技术的例子。在每种情况下，都是利用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植物。
因为农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化的高转化效率及与许多不同物种的广泛可用性，所以它是双子叶植物转化优选的技术。农杆菌属(Agrobacterium)转化通常包括将带有目的外源DNA的双元载体(例如，pCIB200或pCIB2001)转移到适合的农杆菌属(Agrobacterium)株系，其可以依赖于宿主农杆菌属(Agrobacterium)株系共存Ti质粒上或染色体上带有的vir基因的互补性(例如，对于pCIB200和pCIB2001是CIB542(Uknes等.Plant Cell 5：159-169(1993))。利用带有重组双元载体的大肠杆菌(E.coli)，带有质粒诸如pRK2013并且能使重组双元载体运动到靶农杆菌属(Agrobacterium)株系的辅助大肠杆菌(E.coli)株系，通过三亲交配方法完整重组双元载体向农杆菌属(Agrobacterium)的转移。做为可替代方案，可以通过DNA转化将重组双元载体转移给农杆菌属(Agrobacterium)。
利用重组农杆菌属(Agrobacterium)的靶植物转化通常包括农杆菌属(Agrobacterium)和来源于植物的外植体的共培养，并且按照本领域公知的方法。在带有双元质粒T-DNA边界之间存在的抗生素或除草剂抗性基因的选择性培养基上再生转化的组织。
用基因转化植物细胞的另一种方法包括向植物组织和细胞推进惰性或生物活性颗粒。在属于Sanford等的美国专利号4,945,050，5,036,006和5,100,792中公开了该技术(分别在1990年7月31日，1991年7月30日和1992年3月31日签发)。一般地，该方法包括在有效穿透细胞外表面和提供在其内部掺入的条件下，向细胞推进惰性或生物活性颗粒。当利用惰性颗粒时，通过用含有期望基因的载体包被颗粒可以将载体引入到细胞中。做为可替代方案，靶细胞可以被载体包围，以使载体尾随颗粒被带进细胞中。也可以将生物活性颗粒(例如干酵母细胞，干细菌或噬菌体，每种都含有想要引入的DNA)推进植物细胞组织中。
B.单子叶植物的转化
大多数单子叶植物物种的转化现在已经变成了常规的转化方法。优选的技术包括利用PEG(聚乙二醇)或电穿孔技术，向原生质体中的直接基因转移，颗粒轰击进入愈伤组织和农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化。转化可以用于单个DNA种类或多个DNA种类(即共转化)，并且这些技术都适于与本发明一起使用。共转化可能具有的优点是：避免完整载体构建，对于目的基因和选择性标记产生具有非连锁基因座的转基因植物，能够在随后世代中移除选择性标记，如果需要这样的话。然而，使用共转化的缺点是：分开的DNA种类整合到基因组中具有小于100％的频率(Schocher等.Biotechnology 4：1093-1096(1986))。
专利申请EP 0 292 435(1995年7月26日签发给Ciba Geigy)，EP 0392 225(1991年9月25日公开；Ciba Geigy)和WO 93/07278(1993年4月15日公开；Ciba Geigy)描述了来源于玉米原种近交系的愈伤组织和原生质体的制备、利用PEG或电穿孔的原生质体转化和从转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等.(Plant Cell 2：603-618(1990))和Fromm等.(Biotechnology 8：833-839(1990))公开了利用粒子轰击的A188来源玉米系的转化技术。而且，WO 93/07278(1993年4月15日公开；Ciba Geigy)和Koziel等.(Biotechnology 11：194-200(1993))描述了用粒子轰击的玉米原种近交系转化技术。该技术利用了从授粉后14-15天玉米穗切除的1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚和用于轰击的PDS-1000He生物弹击法装置。
利用原生质体或粒子轰击，通过直接基因转移技术也可以进行水稻转化。已经描述了Japonica-类型和Indica-类型的原生质体介导的转化(Zhang等.Plant Cell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto等.Nature 338：274-277(1989)；Datta等.Biotechnology 8：736-740(1990))。利用粒子轰击也可以常规转化这两种类型(Christou等.Biotechnology 9：957-962(1991))。而且，WO 93/21335(1993年11月28日；Plant Genetic Systems)描述了通过电穿孔的水稻转化技术。专利申请EP 0 332 581(1996年12月11日签发给Ciba Geigy)描述了早熟禾亚科(Pooideae)原生质体的产生、转化和再生技术。这些技术允许鸭矛属和小麦的转化。
而且，Vasil等(Biotechnology 10：667-674(1992))描述了利用进入C类型长期可再生愈伤组织细胞中的粒子轰击的小麦转化和Vasil等(Biotechnology 11：1553-1558(1993))和Weeks等(Plant Physiol.102：1077-1084(1993))描述了利用未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织的粒子轰击的小麦转化。
然而，小麦转化优选的技术包括通过未成熟胚粒子轰击的小麦转化和包括在基因递送前高蔗糖或高麦芽糖步骤。在粒子轰击前，将任何方便数量的胚(0.75-1mm长度)放置在具有3％蔗糖(Murashiga & Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))和用于诱导体细胞胚的3mg/l 2，4-D的MS培养基上，使其在黑暗中进行该步骤。在选定轰击的当天，从诱导培养基移出胚，并且置放在渗压剂上(即，具有以期望的浓度，通常是15％添加的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。使胚质壁分离2-3小时，然后轰击。每个靶平板20个胚是通常的，而不是至关重要的。利用标准方法，在微米大小金粒上沉淀适合的携带基因的质粒(诸如pCIB3064或pSG35)。利用标准80筛目，利用约1000psi的破裂压力，用DuPont Biolistics氦装置射击每个平板的胚。轰击后，将胚放回到黑暗中恢复约24小时(还是在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂移出胚，并放回到诱导培养基上，再生前，在诱导培养基上停留约1个月。大约1个月后，将具有正在发育的胚发生愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基(MS+1mg/l NAA，5mg/l GA)，该再生培养基还包含适合的筛选试剂(在pCIB3064情况下是10mg/l basta，在pSOG35情况下是2mg/l氨甲蝶呤)。大约1个月后，将发育的幼芽转移到称为“GA7s”的更大无菌容器中，该无菌容器含有一半浓度的MS，2％蔗糖，和相同浓度的筛选试剂。
也已经描述了利用农杆菌属(Agrobacterium)的单子叶植物转化，参见，WO 94/00977(1994年1月20日公开；Japan Tobacco)和美国专利号：5,591,616(1997年1月7日签发给Japan Tobacco)，这里将这两篇文献并为参考文献。
C.质体的转化
基本如(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)所述，在T琼脂培养基上1英寸圆形阵列中，发芽每平板7个种子的Nicotianatabacum c.v.“Xanthi nc”种子，播种后12-14天，用1μm钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轰击，其中用来源于质粒pPH143和pPH145的DNA包被该钨颗粒。在T培养基上温育轰击的幼苗2天，这以后切除叶片，将其背轴侧向上放置在含有500μg/ml二氢氯化壮观霉素(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培养基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewiez，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)明亮光线中(350-500μmol光量子/m2/s)。在轰击后3到8周，在相同选择性培养基上亚克隆出现在漂白叶片下的抗性幼苗，以形成愈伤组织，分离和亚克隆第二期幼苗。通过Southern印迹标准技术估测单独亚克隆中转化质体基因组拷贝的完全分离(同质性(homoplasmicity))(Sambrook等.(1989)
Molecular Cloning：
A
Laboratory
Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor)。在1％Tris-硼酸盐(TBE)琼脂糖凝胶上分离BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)Plant Mol BiolReporter 5，346-349)，转移到尼龙膜(Amersham)，用对应于pC8的0.7kbBamHI/HindIII DNA片段的32P标记的随机引发DNA序列探测，该pC8片段包含rps7/12质体导向序列一部分。在含有壮观霉素的MS/IBA培养基上(McBride，K.E.等.(1994)PNAS 91，7301-7305)，无菌地使同质幼苗生根，并且将该幼苗转移到温室。
上文描述了本发明的各种实施方式，不是要限制如所附权利要求所定义的本发明的范围。下面包含的实施例仅仅是举例说明选定实施方式的实施，应该将其看作是示例性的，而非限制性的方式。
实施例
I.玉米细胞中λInt活性的证明
A.用于玉米细胞中重组试验的一般方法
1.分子间和分子内重组测试底物
设计这里所述质粒以证明Int的功能性表达。构建分子间测试底物以使萤光素酶表达盒一部分在底物之一上，并且表达盒其余部分在其它底物上。质粒之间单一位点重组事件重建了完整的功能性萤光素酶表达盒。构建分子内测试底物以使萤光素酶表达盒两部分都在单一质粒上，但是盒子的3’部分相对于盒子5’部分处于反向方向。反向的3’部分侧翼是匹配att位点，该位点也是反向方向。att位点之间分子内重组事件产生了3’部分的倒位，产生了功能性萤光素酶表达盒。进行萤光素酶测定以证明Int的分子间和分子内重组活性。
2.细胞培养物
在含有4.3g/l MS盐(Murashige和Skoog，Plant Physiol.15：473-439，(1962))，10mg/l硫胺素-HCl，100mg/l肌醇，30g/l蔗糖，1.16g/l脯氨酸，3mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，pH 5.8的液体悬浮培养基中培养BMS(黑色墨西哥甜(Black Mexican Sweet)玉米基因型)细胞。在将培养基调节到pH 5.8后，高压灭菌前，以1g/l添加酪蛋白水解产物。在黑暗中，在28℃，在旋转平台振荡器上以大约100rpm，在BMS液体培养基中温育细胞。通过将10ml悬浮液细胞转移到40ml新鲜BMS培养基中，每7天传代培养细胞进行维持。
3.DNA粒子轰击
如上所述，在轰击前两天，在新鲜BMS培养基中重悬浮细胞，并且温育。在轰击的当天，用移液管将2ml细胞移取到无菌磁过滤漏斗仪器(VWR cat#28143-550)平台上的薄膜滤器(Millipore cat.#GVWP04700)上，并且利用真空轻轻地移走液体培养基。将带有细胞的膜放置在渗压剂，具有12％蔗糖和0.8％phytager的BMS半固体培养基上。在28℃，黑暗中温育细胞3-5小时，然后将其用做轰击的靶。
对于粒子轰击，利用标准CaCl2-sperimidine。化学(Klein等.Nature327：70-73(1987))，在＜1μm金颗粒(Crescent Chem.Co.，Inc.，NY)上沉淀质粒DNA。利用DuPont Helium Gun和1100psi破裂膜片(rupturediscs)(Biorad)，轰击每个靶一次。
4.萤光素酶测定
轰击后，在28℃，黑暗中温育所有平板2到5天，然后制备粗提取物，并且测定萤光素酶活性。收集细胞，通过机械破坏裂解。通过在4℃，约20,000g离心10分钟除去细胞残渣。利用Promega萤光素酶试剂盒(Promega Cat#E1500)和利用Turner Designs TD Monolight 2010发光计测定细胞裂解物的萤光素酶表达水平。萤光素酶表达是Int介导的重组活性的量度。
B.用于在玉米中重组测定的构建体
实施例1：构建具有玉米偏爱密码子的合成λ整合酶基因(SynInt)
利用玉米偏爱的密码子(美国专利号6,121,014)，将噬菌体λ整合酶蛋白质的氨基酸序列(Hoess等.(1980)PNAS USA 77(5)：2482-2486)反向翻译(back translate)为SynInt的核苷酸序列。鉴定该DNA序列中单一限制性内切核酸酶切割位点，在240的AvaII，在560的BglII和在870的BssHII，这些位点允许以连接在一起形成该基因的4个250-300bp片段的形式构建它。从65到83个碱基的寡核苷酸构建此4个亚片段的每一个，所述寡核苷酸代表双螺旋交替的链，并且与前和/或后寡核苷酸重叠20bp。SynInt片段1由直到AvaII位点的头240bp组成，并且从寡核苷酸1A(BamHI位点+Kozak序列+上面链碱基1-73)(SEQ ID NO：1)；1B(下面链碱基53-128)(SEQ ID NO：2)；1C(上面链碱基108-183)(SEQ ID NO：3)；和1D(下面链碱基163-244+5′GG)(SEQ ID NO：4)构建该片段。
分两步构建片段1，Klenow补平反应以形成二聚体，接着PCR连接二聚体以形成四聚体。
在67℃，加热50μl含有1x DNA聚合酶盐和20μM 1A和1B或1C和1D溶液各1μl的两种溶液5分钟，然后允许缓慢冷却到22℃。向每个反应添加4种脱氧核苷酸三磷酸混合物(每种浓度10mM)1μl，加入2μl(10单位)Klenow DNA聚合酶片段(New England Biolabs)。在22℃温育反应15分钟，产生SynInt片段1的AB和CD前体。
通过5-20轮循环PCR，片段AB连接重叠的CD。向Ready-to-GoPCR珠(Amersham Pharmacia Biotech Inc)添加含有13μl水，AB和CDKlenow反应物各5μl和20μM做为引物的寡聚物1A和1D溶液各1μl的PCR反应混合物。PCR反应是：95℃，5分钟；(95℃，1分钟，56℃，30秒，72℃，1分钟)5-20个循环；72℃，10分钟。从琼脂糖微型凝胶(2％Seaplaque琼脂糖)切除四聚体大小的PCR产物，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAgen)纯化DNA。利用TOPO-TA克隆试剂盒(InVitrogen)，克隆DNA片段，测序确保扩增的忠实性，用HindIII和AvaII从TOPO载体切除用于进一步组装。
片段2分三步构建：Klenow补平反应以形成二聚体EF，GH，和IJ；PCR连接二聚体EF和GH形成四聚体EFGH；第二次PCR连接EFGH和IJ形成六聚体EFGHIJ。按照上述片段1描述的步骤，由寡核苷酸2E(SEQ ID NO：5)，2F(SEQ ID NO：6)，2G(SEQ ID NO：7)，2H(SEQ ID NO：8)，2I(SEQ ID NO：9)和2J(SEQ ID NO：10)构建片段2的二聚体，四聚体和六聚体。
利用TOPO-TA克隆试剂盒(In Vitrogen)克隆DNA片段EFGHIJ，测序以确保扩增的忠实性，用AvaII和BglII从TOPO载体切除用于进一步组装。
利用下面的寡核苷酸3K(SEQ ID NO：11)，3L(SEQ ID NO：12)，3M(SEQ ID NO：13)，3N(SEQ ID NO：14)，3O(SEQ ID NO：15)，3P(SEQ BD NO：16)，4Q(SEQ ID NO：17)，4R(SEQ ID NO：18)，4S(SEQ ID NO：19)和4T(SEQ ID NO：20)，用相似的方法，分别从六聚体KLMNOP和四聚体QRST构建片段3和4。
KLMNOP和QRST分别做为SpeI/BssHII和BssHII/ApaI片段从它们的TOPO载体切除，通过3方连接，连接到用SpeI/ApaI切割的pBluescript KS+(Stratagene)中以形成pBS-KLMNOPQRST。通过第二次3方连接，将片段HindIII-ABCD-AvaII和AvaII-EFGHIJ-BglII连接到HindIII/BglII消化的pBS-KLMNOPQRST以形成完整的SynInt基因。在SEQ ID NO：21中描述了SynInt完整的玉米优化的DNA序列。SEQ ID NO：22中描述了相应的氨基酸序列。
实施例2：构建具有SynInt编码区的单子叶植物表达盒
在启动子和终止子之间的多接头位点，用BamHI/SacI消化含有玉米泛素启动子(Christensen等.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)和胭脂氨酸合酶终止子(Bevan等.(1982)J.Mol.Applied Genetics 1：561-573)的表达载体pBH16。从pBSSynInt切除做为BamHI/SacI片段的如实施例1中所述构建的SynInt基因，将其连接到上述表达载体中这些位点中以形成MUSynInt。
实施例3：构建具有玉米偏爱密码子的合成大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子，α亚基(SynHFα)基因
利用玉米偏爱的密码子，将大肠杆菌(E.coli)IHFα亚基氨基酸序列(Blattner等.(1997)Science 277(5331)：1453-1474；GenBank记录号AE000266)反向翻译成SynHFα核苷酸序列。如上实施例1中对于SynInt所述，设计用于构建SynHFα的寡核苷酸，该寡核苷酸包括A’(SEQ IDNO：23)，B’(SEQ ID NO：24)，C’(SEQ ID NO：25)，D’(SEQ ID NO：26)，E’(SEQ ID NO：27)和F’(SEQ ID NO：28)。
编码区5’末端侧翼有两个G残基(有利于克隆)和BamHI位点，3’末端侧翼具有BglII位点和两个G残基。
如上实施例1中对SynInt六聚体EFGHIJ所述，进行六聚体A’B’C’D’E’F’的构建。在SEQ ID NO：29中描述了SynHFα完整的玉米优化的DNA序列。SEQ ID NO：30中描述了相应的氨基酸序列。
实施例4：构建具有SynHFα编码区的单子叶植物表达盒
SynHFα基因序列(实施例3)做为BamHI/BalII片段，从其TOPO载体切除，插入到实施例2中所述含有玉米泛素启动子和胭脂氨酸合酶终止子的pBH16表达载体的BamHI位点中形成MUSynHFα。
实施例5：构建具有玉米偏爱密码子的合成大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子，β亚基(SynHFβ)基因。
利用玉米偏爱的密码子，将大肠杆菌(E.coli)IHFβ亚基氨基酸序列(Blattner等.(1997)Science 277(5331)：1453-1474；GenBank记录号AE000193)反向翻译成SynHFβ核苷酸序列。如上实施例1中对于SynInt所述，设计用于构建SynHFβ的寡核苷酸，该寡核苷酸包括α(SEQ IDNO：31)，β(SEQ ID NO：32)，γ(SEQ ID NO：33)，δ(SEQ ID NO：34)，ε(SEQ ID NO：35)和ζ(SEQ ID NO：36)。
编码区5’末端侧翼有两个G残基(有利于克隆)和BamHI位点，3’末端侧翼具有BglII位点和两个G残基。
如上实施例1中对SynInt六聚体EFGHIJ所述，进行六聚体αβγδεζ的构建。在SEQ ID NO：37中描述了SynHFβ完整的玉米优化的DNA序列。SEQ ID NO：38中描述了相应的氨基酸序列。
实施例6：构建具有SynHFβ编码区的单子叶植物表达盒
(来源于实施例5的)SynHFβ基因序列做为BamHI/BalII片段，从其TOPO载体切除，插入到实施例2中所述含有玉米泛素启动子和胭脂氨酸合酶终止子的pBH16表达载体的BamHI位点中形成MUSynHFβ。
实施例7：构建具有玉米偏爱密码子的合成λ切除酶基因(SynXis)
利用玉米偏爱的密码子，将噬菌体λ切除酶蛋白质的氨基酸序列(Hoess等.(1980)PNAS USA 77(5)：2482-2486)反向翻译为SynXis的核苷酸序列。如实施例1中对SynInt所述，设计用于构建SynXis的寡核苷酸，并且该寡核苷酸包括I.(SEQ ID NO：39)，II.(SEQ ID NO：40)，III.(SEQ ID NO：41)，和IV.(SEQ ID NO：42)。
编码区5’末端侧翼有BamHI位点和Kozak序列，3’末端侧翼具有SacI位点和另外的C残基，以有利于克隆。
如实施例1中对SynInt的四聚体ABCD所述，进行四聚体I II IIIIV的构建。在SEQ ID NO：43中描述了SynXis完整的玉米优化的DNA序列。SEQ ID NO：44中描述了相应的氨基酸序列。
实施例8：构建具有SynXis编码区的单子叶植物表达盒
(来源于实施例7的)SynXis基因序列做为BamHI/SacI片段从其TOPO载体切除，并且将其插入表达载体CMSynHFβ的BamHI/SacI位点以形成2994SynXis。将含有CMPS启动子的404bp CMSynHFβ片段插入到2994SynXis BamHI位点中以形成pAdF61。将pAdF61的945bp EcoRI片段连接到用EcoRI消化的VSInt-h/218的5763bp双元载体部分中形成pAdF62。在该非定向克隆中获得了该构建体的两个定向。在pAdF62A中，CMPS-SynXis 5’末端紧邻双元载体右边界，在pAdF62B中，其紧邻双元载体左边界。
实施例9：构建具有合成λ整合酶基因突变体(SynInt-h)的单子叶植物表达盒
向pBSSynInt的SynInt基因编码区引入单碱基对突变(Lange-Gustafson等，J.Biol.Chem.259(20)：12724-12732(1984))，将碱基对520从“G”突变为“A”。利用QuikChange定位诱变试剂盒(Stratagene)和下面寡核苷酸：5’-CCC GCG CCG CCA AGA GCA AGGTGC GCC GCA GCC GC-3’(SEQ ID NO：45)和5’-GCG GCT GCGGCG CAC CTT GCT CTT GGC GGC GCG GG-3’(SEQ ID NO：46)引入该突变。“G”到“A”突变将pBSSynInt的氨基酸174从Glu改变为Lys，形成pBSSynIntE174K。
为了将E174K突变体整合酶基因克隆到表达盒中，首先利用改变位点的寡核苷酸5’-GAT CAC TAG T-3’(SEQ ID NO：47)，将MUSynInt BamHI位点转化为SpeI位点。然后，将含有E174K突变的pBSSynIntE174K的SpeI/BglII片段做为3方连接的一部分和MUSynInt的BglII/SacI片段一起克隆到MUSynInt载体的SpeI/SacI位点中，形成MUSynInt-h。
实施例10：构建具有合成λ整合酶基因双突变体(SynInt-h/218)的单子叶植物表达盒
向pBSSynInt的SynInt基因编码区引入双碱基对突变(Christ，N.和Droge，P.J.Mol.Biol.288：825-836(1998))，将碱基对520从“G”突变为“A”，碱基对652从“G”突变为“A”。上文描述了碱基对突变520。利用QuikChange定位诱变试剂盒(Stratagene)和下面寡核苷酸：5’-GCG TGG GCG ACC TGT GCA AGA TGA AGT GGA GCG AC-3’(SEQ ID NO：48)和5’-GTC GCT CCA CTT CAT CTT GCA CAGGTC GCC CAC GC-3’(SEQ ID NO：49)引入碱基对突变652。从“G”到“A”的突变将pBSSynInt的氨基酸218从Glu改变为Lys，形成pBSSynIntE218K。
为了将E174K突变和E218K突变克隆到表达盒中，首先利用改变位点的核苷酸5’-GATCACTAGT-3’(SEQ ID NO：47)，将MUSynIntBamHI位点转化为SpeI位点。然后，将含有E174K突变的pBSSynIntE174K的SpeI/BglII片段做为3方连接的一部分和含有E218K突变的pBSSynIntE218K的BglII/SacI片段一起克隆到MUSynInt载体的SpeI/SacI位点中，在载体MUSynInt-h/218中形成双突变体基因。
实施例11：构建pAttB和pAttP，一对单子叶植物分子间重组底物
构建两个质粒，以使质粒之间单一位点的分子间重组事件从表达盒的两个不完整部分重建完整萤光素酶表达盒。分子间的attB测试底物含有萤光素酶表达盒的5’部分(5’Luc-5’Intron-attB)，attP测试底物含有盒子的3’部分(attP-3’Intron-3’Luc)。Int复合物介导的attB和attP位点之间的分子间重组产生了具有产生萤光素酶活性能力的完整萤光素酶表达盒的重建。重组产物包含MzUbi-5’Luc-5’Intron-attL-3’Intron-3’Luc-Nos。
实施例11A：含有attB位点的萤光素酶表达盒5’部分，pAttB
将从SphI到XbaI位点的萤光素酶3’末端从pGL3-Basic(Promega)亚克隆到pUC18中，以分离它的HincII以插入内含子。利用寡核苷酸引物对：5’-GGG TAC GTA AGT TTC TGC TTC TAC CTT TG-3’(SEQ ID NO：50)和5’-CCC CAG CTG CAC ATC AAC AAA TTTTGG TC-3’(SEQ ID NO：51)，从pBISN1(Naasimhulu，S.B.，等.PlantCell 8：873-886(1996))PCR扩增内含子，在两个末端分别形成SnaB1和PvuII位点。利用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)，克隆PCR产物，通过测序鉴定正确的拷贝。切除内含子做为SnaB1/PvuII片段，并且将其连接到3’-Luc克隆的HindcII位点中以形成3’Luc Intron。通过用不对称的ApoI位点作图检测正确方向的内含子，通过测序进行证明。切割内含子中心附近唯一的MunI位点，插入用XhoI位点置换MunI的寡核苷酸以形成3’Luc-Int-X。
通过用SacI和Asp718消化以移除nos终止子的(如实施例2中所述)表达载体pBH16和Luc编码序列5’末端两部分(BamHI到SphI[插入片段A]和包含attB的SphI到Asp718[插入片段B])的3方连接构建P-U5’Luc Intron AttB(pAttB)，以形成P-ULucIntronAttB。插入片段A来源于亚克隆到pUC18中的pGL3basic(Promega)萤光素酶基因，所述基因通过向NcoI位点中插入下面添加有SacI位点和5个碱基Kozak序列的寡核苷酸对在起始密码子上游被修饰：所述寡核苷酸对是5’-CAT GAG CTC GC CAC-3’(SEQ ID NO：52)和5’-CAT GGT GGCGAG CT-3’(SEQ ID NO：53)。
从所得质粒pAT134S，切除做为SacI到SphI片段的5’末端Luc编码区，形成插入片段A。插入片段B来源于通过用XhoI和Asp718消化和插入下面含有具有适合5’延伸的attB位点的寡核苷酸对修饰的3’LucIntronX，所述寡核苷酸对是：5’-TCG ATG AAG CCT GCT TTTTTA TAC TAA CTT GAG CG-3’(SEQ ID NO：54)和5’-GTA CCGCTC AAG TTA GTA TAA AAA AGC AGG CTT CA-3’(SEQ ID NO：55)。
实施例11B：含有attP位点的萤光素酶表达盒3’部分，pAttP
通过pBH16表达载体与attP片段[插入片段C]和来源于XhoI到Asp718的LucIntron基因3’端[插入片段D]的3方连接形成P-AttPIntronLuc(pAttP)，其中用HindIII和BamHI消化该载体以移除启动子。为了产生插入片段C，用下面引物对：HattP(5’-GGA AGCTTC TGT TAC AGG TCA CTA ATA C-3’)(SEQ ID NO：56)和XattP(5’-CCT CGA GAA ATC AAA TAA TGA TTT TAT-3’)(SEQ ID NO：57)，从噬菌体λDNA(New England Biolabs)PCR扩增attP序列。
通过Seaplaque琼脂糖凝胶电泳纯化该产物，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAgen)，从琼脂糖提取该产物，并且利用TOPO-A克隆试剂盒(Invitrogen)克隆该产物，形成TOPOAttP。鉴定正确序列的克隆，并且用HindIII和XhoI消化从它切除插入片段C。通过用XhoI和BamHI消化，从3’LucIntronX切除插入片段D。将pBH16载体与插入片段C和D连接以形成质粒pAttPIntronLuc。
用前缀“p”命名该对分子间重组测试底物使它们不同于下述病毒复制子上的相似构建体(前缀“v”)。
实施例12：构建pAttL，单子叶植物重组产物质粒
构建p-UlucIntronAttL(pAttL)以检测分子间重组测试底物之间整合酶重组的预测产物是否产生了功能性萤光素酶基因。利用下面引物对：X5AttL(5’-CCT CGA GTG AAG CCT GCT TTT TTA TAC TAAGTT GGC ATT A-3’)(SEQ ID NO：58)和XattP(5’-CCT CGA GAAATC AAA TAA TGA TTT TAT-3’(SEQ ID NO：57)，通过8轮循环PCR扩增将上述切除的attP DNA片段转化为attL片段。凝胶纯化和Topo-TA克隆PCR产物，通过测序鉴定正确attL克隆，TOPOAttL。用XhoI切除attL片段，并且连接到3’LucIntronX的XhoI位点以形成3’LucIntronAttL。用SphI和BamHI从该中间体切除插入物。用SalI/SphI，从质粒p-U5’IntronAttB切除具有玉米泛素启动子部分的Luc 5’末端。用SalI/BamHI消化载体pHB16(弃掉玉米泛素启动子不需要的部分)，并且三方连接这些片段产生质粒p-UlucIntronAttL。
实施例13：在WDV复制子上构建vAttB/P，单子叶植物分子内重组测试底物
分子内attB/attP测试底物含有萤光素酶表达盒5’部分(5’Luc-5’Intron-attB)和萤光素酶表达盒3’部分(attP-3’Intron-3’Luc)，其中3’部分相对于5’部分反向，并且attB和attP位点反向。Int所介导的attB和attP位点之间的分子内重组引起了萤光素酶表达盒3’部分的倒位，产生了完整盒子和萤光素酶活性。
能在大肠杆菌(E.coli)和单子叶植物细胞中复制的穿梭质粒用于该底物和其它底物。通过用在SalI和BamHI位点之间引入的下面寡核苷酸对：5’-TCG ACG GTA CCA GAT CTA CTA GTT GCG GCCGCG CTA GCG-3’(SEQ ID NO：59)和5’-GAT CCG CTA GCG CGGCCG CAA CTA GTA GAT CTG GTA CCG-3’(SEQ ID NO：60)，添加唯一克隆位点(产生Asp718，BglII，SpeI，NotI和NheI位点)修饰具有小麦矮化病毒(WDV复制子)和质粒p15A复制起点的质粒pWI-11(Ugaki等，Nucl.Acids Res.19：371(1991))。
用NotI和BglII消化由此得到的载体pWI-11M以形成vAttB/P骨架。用寡核苷酸5’-AGC TGC GGC CGC-3’(SEQ ID NO：61)改变pAttB的HindIII位点为NotI位点后，插入片段E来源于pAttB。用NotI和Asp718切除含有UbiLucIntronAttB的插入片段。用寡核苷酸5’-AGCTAG ATC T-3’(SEQ ID NO：62)改变pAttP的HindIII位点为BglII位点后，插入片段F来源于pAttP。用BglII和Asp718切除含有AttPIntron3’LucNos的插入片段。用插入片段E和F及pWI-11M进行3方连接产生质粒，其中基因3’末端相对于5’末端反向，并且侧翼为相反方向的attB和attP位点，称为vAttB/P。
实施例14：构建WDV复制子上vAttB和vAttP单子叶植物分子间重组测试底物
将实施例13中制备的含有UbiLucIntronAttB的NotI/Asp718片段连接到用NotI和Asp718消化的pWI-11M，以形成vAttB。也将上述实施例13中制备的含有AttPInt3’LucNos的BglII/Asp718片段连接到用BglII和Asp718消化的pWI-11M中以形成质粒vAttP。
实施例15：构建带有MUSynInt的vMUSynInt，WDV复制子
用寡核苷酸5’-AGC TAC TAG T-3’(SEQ ID NO：63)，将MUSynInt 5’末端的HindIII位点转化为SpeI位点。用SpeI和Asp718切除表达盒，并且连接到SpeI/Asp718消化的pWI-11M中以形成质粒vMUSynInt。
C.玉米细胞中的重组测定
实施例16：玉米细胞中SynInt和SynIHFα/β介导的分子内和分子间重组
分别以0.25μg/质粒/射击的浓度，将分子间重组底物vAttB和vAttP，和分子内重组底物vAttB/P轰击到BMS细胞中，以检测在SynInt，SynIHFα和SynIHFβ表达不存在的情况下萤光素酶瞬时表达的背景水平。然后，共轰击相同的底物与vMUSynInt(0.25μg/射击)或MUSynInt(0.25μg/射击)，和MUSynIHFα(0.5μg/射击)及MUSynIHFβ(0.5μg/射击)。在黑暗中，在28℃，温育轰击的BMS细胞约2天或约5天。温育后，测定细胞的萤光素酶表达水平。萤光素酶表达是Int介导的重组活性量度。结果列在下面表1中。
如表1中所证明的，质粒(pSynInt)或小麦双粒病毒组复制子(vSynInt)上的MUSynInt表达介导了BMS细胞中分子内和分子间重组。pSynHFα，β表示两个质粒MUSynIHFα和MUSynIHFβ的共轰击。
表1
| 轰击后约2天 | 轰击后约5天 | |||
| 共轰击的质粒 | 萤光素酶 | 增加的倍数 | 萤光素酶 | 增加的倍数 |
| vAttB+vAttP | 7,773 | 4,559 | ||
| vAttB+vAttPpSynInt+pSynHFα，β | 34,285 | 4 | 12,108 | 3 |
| vAttB+vAttPvSynInt+pSynHFα，β | 100,188 | 13 | 28,317 | 6 |
| vAttB/P | 2,601 | 373 | ||
| vAttB/vAttPpSynInt+pS ynHFα，β | 152,731 | 59 | 19564±3,702 | 52 |
| vAttB/vAttPvSynInt+pSynHFα，β | 152,976 | 59 | 76,506±16,553 | 205 |
| pAttL | 5,150,847 | 544,311 | ||
实施例17：玉米细胞中质粒和病毒复制子底物上attB和attP位点之间的分子间重组
以0.25μg/质粒/射击的浓度，分别将分子间重组质粒和病毒复制子对pAttB+pAttP，pAttB+vAttP，vAttB+pAttP和vAttB+vAttP共轰击到BMS细胞，以检测萤光素酶瞬时表达的背景水平。然后共轰击相同分子间重组底物对和MUSynInt(0.25μg/射击)，MUSynIHFα(0.5μg/射击)和MUSynIHFβ(0.5μg/射击)。在28℃，黑暗中温育轰击的BMS细胞约48小时。温育后，测定细胞的萤光素酶表达水平。结果列在下面表2中。
表2
| 共轰击的质粒 | 萤光素酶(LU±标准偏差) | 增加的倍数 |
| pAttB+pAttP | 359 | |
| pAttB+pAttP+pSynInt+pSynHFα，β | 395±184 | 1 |
| vAttB+pAttP | 1,006 | |
| vAttB+pAttP+pSynInt+pSynHFα，β | 1019±325 | 1 |
| pAttB+vAttP | 494 | |
| pAttB+vAttP+pSynInt+pSynHFα，β | 314±11 | ＜1 |
| vAttB+vAttP | 2,448 | |
| vAttB+vAttP+pSynInt+pSynHFα，β | 6,617±479 | 3 |
BMS细胞中MUSynInt，MUSynHFα和MUSynHFβ的共表达介导了小麦双粒病毒组复制子底物上attB和attP位点之间的分子间重组。
实施例18：玉米细胞中具有或没有MUSynHFα和MUSynHFβ共表达情况下，突变体SynInt-h和SynInt-h/218介导的分子间重组
分别将分子间重组质粒对pAttB+pAttP，pAttB+vAttP，vAttB+pAttP和vAttB+vAttP共轰击到BMS细胞中以测定萤光素酶瞬时表达的背景水平。然后，同时共轰击相同分子间重组质粒对和下面的表达载体组合：
A)MUSynInt-h(0.25μg/射击)
B)MUSynInt-h(0.25μg/射击)，MUSynHFα(0.5μg/射击)和MUSynHFβ(0.5μg/射击)
C)MUSynInt-h/218(0.25μg/射击)
D)MUSynInt-h/218(0.25μg/射击)，MUSynHFα(0.5μg/射击)和MUSynHFβ(0.5μg/射击)。
在28℃，黑暗中温育轰击的BMS细胞约48小时。温育后，测定细胞的萤光素酶表达水平。结果列在下面表3中。
表3
| 共轰击的质粒 | 萤光素酶(LU±标准偏差) | 增加的倍数 |
| pAttB+pAttP | 269±20 | |
| pAttB+pAttP+pSynInt-h | 1,970±1,143 | 7 |
| pAttB+pAttP+pSynInt-h+pSynHFα，β | 5,453±4,402 | 20 |
| pAttB+pAttP+pSynInt-h.218 | 3,708±482 | 14 |
| pAttB+pAttP+pSynInt-h/218+pSynHFα，β | 8,479±5,677 | 32 |
| vAttB+pAttP | 349±192 | |
| vAttB+pAttP+pSynInt-h | 2,650±511 | 8 |
| vAttB+pAttP+pSynInt-h+pSynHFα，β | 10,246±682 | 29 |
| vAttB+pAttP+pSynInt-h/218 | 1,846±239 | 5 |
| vAttB+pAttP+pSynInt-h/218+pSynHFα，β | 9,560±845 | 27 |
| pAttB+vAttP | 1,217±907 | |
| pAttB+vAttP+pSynInt-h | 1,137±334 | ＜1 |
| pAttB+vAttP+pSynInt-h+pSynHFα，β | 7,721±2,721 | 6 |
| pAttB+vAttP+pSynInt-h/218 | 1,867±808 | 2 |
| pAttB+vAttP+pSynInt-h/218+pSynHFα，β | 3,882±389 | 3 |
BMS细胞中没有大肠杆菌(E.coli)IHF(即，MUSynHFα和MUSynHFβ)的表达情况下，突变体λ整合酶MUSynInt-h(pSynInt-h)的表达介导了质粒和病毒复制子对pAttB+pAttP和vAttB+pAttP之间的重组。BMS细胞中，MUSynInt-h与MUSynHFα和MUSynHFβ的共表达介导了质粒和病毒复制子对pAttB+pAttP，vAttB+pAttP和pAttB+vAttP之间的重组。BMS细胞中，在MUSynHFα和MUSynHFβ表达或不表达的情况下，突变体λ整合酶MUSynInt-h/218(pSynInt-h/218)的表达介导了质粒和病毒复制子对pAttB+pAttP，vAttB+pAttP和pAttB+vAttP之间的重组。
实施例19：玉米细胞中具有和不具有SynIHFP共表达情况下，SynInt，SynInt-h和SynInt-h/218介导的分子内重组
以0.25μg/射击的浓度，将分子内重组质粒vAttB/P共轰击到BMS细胞中以检测萤光素酶瞬时表达的背景水平。然后，同时共轰击相同的分子内重组质粒和下面的表达载体组合：
A)MUSynInt(0.25μg/射击)
B)MUSynInt(0.25μg/射击)，MUSynHFα(0.5μg/射击)和MUSyn HFβ(0.5μg/射击)
C)MUSynInt-h(0.25μg/射击)
D)MUSynInt-h(0.25μg/射击)，MUSynHFα(0.5μg/射击)和MUSynHFβ(0.5μg/射击)
E)MUSynInt-h/218
F)MUSynInt-h/218(0.25μg/射击)，MUSynHFα(0.5μg/射击)和MUSynHFβ(0.5μg/射击)
在28℃，黑暗中温育轰击的BMS细胞约28小时。温育后，测定细胞的萤光素酶表达水平。结果列在下面表4中。
表4
| 共轰击的质粒 | 萤光素酶(LU±标准偏差) | 增加的倍数 |
| vattB/P | 751 | |
| vattB/P+pSynInt | 996±16 | 1.3 |
| vattB/P+pSynInt+pSynHFα，β | 121,532±86,904 | 162 |
| vattB/P+pSynInt-h | 11,378±5,420 | 15 |
| vattB/P+pSynInt-h+pSynHFα，β | 128,307±49,322 | 171 |
| vattB/P+pSynInt-h/218 | 36,771±6,032 | 49 |
| vattB/P+pSynInt-h/218+pSynIHFα，β | 46,842±10,980 | 62 |
野生型(pSynInt)，单突变体(pSynInt-h)和双突变体(pSynInt-h/218)λ整合酶都介导玉米细胞中attB和attP位点之间的分子内重组。野生型λ整合酶通常需要大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子蛋白质共表达以介导分子内重组，但是单和双突变体λ整合酶在表达和不表达大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子蛋白质情况下，都介导分子内重组。
II.利用B/P反应的玉米中定向整合(targeted integration)
A.构建靶序列
一般地，将靶序列构建体引入到植物基因组中以做为Int催化的相应供体序列位点特异性插入的座位。选择性和筛选标记做为靶(“LP”构建体)和供体(“don”构建体)之间分开的部分表达盒掺入，因此，当发生定向插入时，这两部分重建为完整的功能性盒子。测定筛选标记可以鉴定含有定向插入事件的细胞。施用选择性压力提供了富集含有定向插入事件的细胞的方法。
在这里所述示例性构建体中，用于向玉米中插入靶序列的质粒包含用于突变体原卟啉原氧化酶(PPO)基因编码区的表达盒(美国专利号6,288,306)，以帮助鉴定含有靶序列的植物克隆。此外，靶序列质粒含有在内含子中截短和被单一att位点或成对相同att位点(其都可以是野生型或突变体)打断的部分表达盒，β-葡糖醛酸酶(GUS)(5’GUS-5’Intron)和磷酸甘露糖异构酶(PMI)(3’Intron-3’PMI)。因此，单一att位点靶序列包含5’GUS-5’Intron-Att位点-3’Intron-3’PMI形式的分开的标记基因。双att位点靶序列具有5’GUS-5’Intron-Att位点-PPO-Att位点-3’Intron-3’PMI形式。靶序列中5’和3’内含子部分对应于不同的内含子。
单一att位点相对于靶序列基因编码区可以是5’-3’或3’-5’方向。可以相互背离定向(反向方向)或相对会聚定向(也是反向方向)成对att位点。当相互远离地定向成对att位点的3’末端时，称相互背离定向该位点。当相互面对地定向成对att位点3’末端时，称相对会聚定向该位点。无论选择哪种方向，相应靶和供体序列中的att位点或成对att位点具有匹配的方向。此外，靶和供体中的att位点是重组兼容的，即，如这里所述attB靶与att供体匹配等。
实施例20：具有反向attB位点的单子叶植物靶序列
构建体pNOV2790含有pNOV117的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等.(2000)Plant Cell Reports 19：798-803)，通过向编码区引入4个内含子，所述基因被分成5个外显子，如SEQ ID NO：64中所述。利用一系列重叠引物对，将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β-1微管蛋白内含子“A”(Oppenheimer等.(1988)Gene 63：87-102)引入到基因编码区的外显子3和4之间。引入内含子，并且命名该内含子为PMI内含子。该pNOV2790部分用于进一步克隆。
构建寡核苷酸对(5’-AAT TGG TAC CTG AAG CCT GCT TTTTTA TAC TAA CTT GAG CGC CTA GG-3’(SEQ ID NO：65)和5’-AAT TCC TAG GCG CTC AAG TTA GTA TAA AAA AGC AGGCTT CAG GTA CC-3’(SEQ ID NO：66))，其带有两侧为具有MfeI粘性末端的5’Asp718I位点和具有EcoRI粘性末端的3’AvrII位点的attB位点。退火该寡核苷酸对，并且将其连接到pNOV2790 PMI内含子3的MfeI位点中，形成载体pNOV2790AttB。
pNOV2117是具有pVS1和ColE1复制起点的双元载体。该载体包含来源于pAD1289的组成型VirG基因(Hansen等.(1994)PNAS USA91：7603-7607)和来源于Tn7的壮观霉素抗性基因。克隆到右和左边界之间多接头中的是玉米泛素启动子，PMI编码区和pNOV117的胭脂氨酸合酶终止子(Negrotto等.(2000)Plant Cell Reports 19：798-803)。
从pNOV2790AttB切除做为BstBI/PshAI片段的PMI编码区部分和含有attB位点的PMI内含子3，并且将其连接到用BstBI/PshAI消化，从其移除了相应区域的双元载体pNOV2117中。这形成了完整的PMI表达盒，称为MUPMIAttB，其在内含子中含有attB位点。
pNOV5013是Bluescript载体，其含有从内含子移除了BamHI位点的水稻肌动蛋白1启动子(McEloy等.(1991)Mol.Gen.Genet.231(1)：150-60)，突变体原卟啉原氧化酶(PPO)基因编码区(US专利申请序列号09/015,683)，和CaMV 35S终止子。做为Asp718I片段切除pNOV5013的PPO表达盒，并且将其连接到MUPMIAttB的Asp718I位点中，形成PPO.PMIAttB。
pNOV5003含有利用一系列重叠引物对引入到pBI121(Clonetech)β-葡糖醛酸酶(GUS)基因编码序列中的拟南芥(Arabidopsis)内含子(GenBank记录号.AB007650)，称为AT BAF60。
为了构建具有来源于AtBAF60基因的拟南芥(Arabidopsis)内含子的GUS基因，利用两个引物GUSBAFFW1(5’-TTG ACT GGC AGGTAC CAA GCT GCG AAT CTT CG-3’)(SEQ ID NO：67)和GUSBAFRV1(5’-ATT GGC CAC CAC CTG AAA AAT TCA GAAACA AA-3’)(SEQ ID NO：68)，从拟南芥(Arabidopsis)基因组扩增AtBAF60内含子(420bp)。AtBAF60(CHC1)是与哺乳动物核小体重塑因子BAF60共有同源性的基因(http：//www.chromdb.org/)。利用两个引物GU SBAMHI(5’-GGA TCC AAC CAT GTT ACG TCC TGTAGA AA-3’)(SEQ ID NO：69)和BAFGUSRV1(5’-CAG CTT GGTACC TGC CAG TCA ACA GAC GCG AC-3’)(SEQ ID NO：70)，从pBI121(Clonetech)扩增GUS外显子1(645bps)。利用两个引物BAFGUSFW1(5’-TTG ACT GGC AGG TAC CAA GCT GCG AATCTT CG-3’)(SEQ ID NO：71)和GUSSALI(5’-GTC GAC TCA TTGTTT GCC TCC CTG CTG CGG-3’)(SEQ ID NO：72)，从pBI121扩增GUS外显子2(1200bps)。通过利用凝胶纯化的GUS外显子1(645bps)和AtBAF60内含子(420bp)片段做为模板，利用两个引物GUSBAMHI(5’-GGA TCC AAC CAT GTT ACG TCC TGT AGA AA-3’)(SEQ IDNO：69)和GUSBAFRV1(5’-ATT GGC CAC CAC CTG AAA AATTCA GAA ACA AA-3’)(SEQ ID NO：68)，通过PCR形成GUS内含子1-AtBAF60内含子片段(1049bp)。将GUS外显子1-AtBAF60内含子片段(1049bp)克隆到pCR2.1-TOPO载体中，以形成pNOV5001。利用AtBAF60内含子(420bp)和GUS外显子2(1200bp)片段做为模板，GUSBAFFW1(5’-3’)和GUSSALI(5’-3’)做为引物，通过PCR形成AtBAF60内含子-GUS外显子2片段(1620bp)。将AtBAF60内含子-GUS外显子2片段(1620bp)克隆到pCR2.1-TOPO中，以形成pNOV5002。在XhoI/BamHI消化的pBluescript KS(+)和两个插入片段，pNOV5001 BamHI/HindIII片段(961bp)和pNOV5002XhoI/HindIII片段(1312BPS)的三方连接中形成pNOV5003。
寡核苷酸对5’-GAT CTC GCT CAA GTT AGT ATA AAAAAG CAG GCT TCA GCT AGC-3’(SEQ ID NO：73)和5’-GAT CGCTAG CTG AAG CCT GCT TTT TTA TAC TAA CTT GAGCGA-3’(SEQ ID NO：74)的合成attB位点，以和pNOV2790AttB的attB位点相反的方向，连接到pNOV5003的AT BAF60内含子的BglII位点中，形成载体GUSIntAttBrev。
pNOV4211含有用引物从夜香树属(Cestrum)花叶病毒PCR扩增的启动子，该引物位于PCR产物侧翼，带有BamHI位点。将如SEQ IDNO：75中所述扩增的CMPS启动子做为BamHI片段，以与LacZ基因相反的方向克隆到pBluescript KS+中。WO 0173087A1中描述了该启动子，因此将这篇文献并入为参考文献。
从pNOV4211，切除做为BamHI片段的夜香树属花叶病毒启动子，并且将其连接到GUSIntAttBrev的BamHI位点，形成载体CMPSGUSAttBrev。
利用改变位点的寡核苷酸5’-ACT AGT GGC C-3’(SEQ ID NO：76)，首先将PPO.PMIAttB的ApaI位点转化为SpeI位点，形成PPO.PMIAttB.Spe，然后，将含有attB位点的CMPSGUSAttBrev 5’SpeI/NheI片段连接到PPO.PMIAttB.Spe的SpeI位点中，形成含有两个反向attB位点的靶序列(称为LPdbAttB)。
实施例21：具有反向attP位点的单子叶植物靶序列
利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitogen)，用寡核苷酸引物对5’-GGAAGC TTC TGT TAC AGG TCA CTA ATA C-3’(SEQ ID NO：77)和5’-CCT CGA GAA ATC AAA TAA TGA TTT TAT-3’(SEQ ID NO：78)，从噬菌体λ基因组DNA(New England Biolabs)PCR克隆attP位点。利用改变位点的寡核苷酸：5’-AGC TGG TAC CCA ATT GGG TACC-3’(SEQ ID NO：79)，将attP位点5’末端上HindIII位点转化为3个新位点Asp718I/MfeI/Asp718I。利用改变位点的寡核苷酸：5’-TCG ACCTAG GCA ATT GCC TAG G-3’(SEQ ID NO：80)，将attP位点3’末端上XhoI位点转化为3个新位点AvrII/MfeI/AvrII。然后，从TOP载体，切除做为MfeI片段的attP片段，并且将其连接到pNOV2790 PMI内含子3的MfeI位点，形成载体pNOV2790AttP。
从pNOV2790AttP切除做为BstBI，PshAI片段，含有attP位点的PMI内含子3，并且将其连接到用BstBI，PshAI切割的双元载体pNOV2117中，形成PMI表达盒，其含有具有attP位点的PMI内含子3，称为MUPMIAttP。
切除做为Asp718I片段的pNOV5013的PPO表达盒，并且将其连接到MUPMIAttP的Asp718I位点中，形成PPO.PMIAttP。
利用改变位点的寡核苷酸：5’-AGC TGC TAG CGG ATC CGCTAG C-3’(SEQ ID NO：81)，将上述TOPO克隆中attP位点5’末端上HindIII位点转化为3个新位点NheI/BamHI/NheL。然后，利用改变位点的寡核苷酸：5’-TCG AAG ATC TCG GCC GAG ATC T-3’(SEQ IDNO：82)，将该克隆中attP位点3’末端上XhoI位点转化为3个新位点BglII/EagI/BglII。然后，切除做为BamHI/BglII片段的attP位点，并且以与pNOV2790AttP的attP位点相反的方向，将其连接到pNOV5003AT BAF60内含子的BglII位点中，形成载体GUSIntAttPrev。
从pNOV4211切除做为BamHI片段的夜香树属花叶病毒启动子，并且将其连接到GUSIntAttPrev的BamHI位点中，形成载体CMPSGUSAttPrev。
利用改变位点的寡核苷酸5’-ACT AGT GGC C-3’(SEQ ID NO：83)，首先将PPO.PMIAttP的ApaI位点转化为SpeI位点，形成PPO.PMIAttP.Spe，然后，将包含attP位点的CMPSGUSAttPrev的5’SpeI，NheI片段连接到PPO.PMIAttP.Spe的SpeI位点中，形成靶序列(称为LPdbAttP)，其含有两个反向attP位点。
实施例22：具有反向attP1和attP2位点的单子叶植物靶序列
通过SalI消化，移除pDON 201(Life Technologies)“attP1”和“attP2”位点之间的间插SalI片段，随后，通过连接形成AttP1SalIAttP2。
利用TOPO TA克隆试剂盒，用寡核苷酸引物对：5’-GGG CAATTG GGT ACC TAC AGG TCA CTA ATA CCA TCT-3’(SEQ ID NO：84)和5’-GGG CAA TTG CCT AGG CAA ATA ATG ATT TTA TTTTGA-3’(SEQ ID NO：85)，从AttP1SalIAttP2的ApaI，SalI片段PCR克隆attP2位点。从TOPO载体切除做为MfeI片段的attP2a，并且将其连接到pNOV2790的PMI内含子3的MfeI位点，形成载体pNOV2790AttP2。
从pNOV2790AttP2切除做为BstBI，PshAI片段的含有attP2位点的PMI内含子3，并且将其连接到用BstBI，PshAI切割的双元载体pNOV2117中，形成PMI表达盒，称为MUPMIAttP2，其包含具有attP2位点的PMI内含子3。
切除做为Asp718I片段的pNOV5013的PPO表达盒，并且将其连接到MUPMIAttP2的Asp718I位点中，形成PPO.PMIAttP2。
利用TOPO TA克隆试剂盒，用寡核苷酸引物对：5’-GGA TCCGCT AGC TAC AGG TCA CTA ATA CCA TCT-3’(SEQ ID NO：86)和5’-GGG AGA TCT CAA ATA ATG ATT TTA TTT TGA-3’(SEQ IDNO：87)，从AttP1SalIAttP2的PstI，SalI片段PCR克隆attP1位点。从TOPO载体切除做为BamHI/BglII片段的attP1位点，并且以与pNOV2790AttP2的attP2位点相反的方向，将其连接到pNOV5003的AT BAF60内含子BglII位点中，形成载体GUSIntronAttP1rev。
从pNOV4211切除做为BamHI片段的夜香树属花叶病毒启动子，并且将其连接到GUSIntronAttP1rev的BamHI位点中，形成载体CMPSGUSAttP1rev。
利用改变位点的寡核苷酸5’-ACT AGT GGC C-3’(SEQ ID NO：83)，首先将PPO.PMIAttP2的ApaI位点转化为SpeI位点，形成PPO.PMIAttP2.Spe，然后，将包含attP1位点的CMPSGUSAttP1rev的5’SpeI，NheI片段连接到PPO.PMIAttP2·Spe的SpeI位点中，形成靶序列(称为LPAttP1.P2)，其含有反向attP1和attP2位点。
实施例23：具有attB位点的单子叶植物靶序列
pNOV2114是具有pVS1和ColEl复制起点的双元载体。该载体含有来源于pAD1289的组成型VirG基因(Hansen等.(1994)PNAS USA91：7603-7607)，来源于Tn7的壮观霉素抗性基因及右和左边界之间的多接头。
以三方连接的方法，将MUPMIAttB的attB位点3’的PMI表达盒，做为Asp718I，SbfI片段和pNOV5013的PstI，HindIII PPO表达盒片段一起引入pNOV2114的Asp718I，HindIII多接头位点中，形成双元载体AttBPMI.PPO。
利用改变位点的寡核苷酸5’-CGC GAC TAG T-3’(SEQ ID NO：88)，首先将AttBPMI.PPO的AscI位点转化为SpeI位点，形成AttBPMI.PPO.Spe。然后，将CMPSGUSAttBrev的5’BglII(klenow补平)，SpeI片段，不包含attB位点，连接到AttBPMI.PPO.Spe的Asp718I(klenow补平)，SpeI片段中，形成具有单一attB位点的靶序列(称为LPsgAttB)。
实施例24：具有attP位点的单子叶植物靶序列
以三方连接的方法，将MUPMIAttP的PMI表达盒3’一半，包括attP位点，做为Asp718I，SbfI片段与含有完整PPO表达盒的pNOV5013的PstI，HindIII片段一起引入到用Asp718I，HindIII切割的pNOV2114中，形成双元载体AttPPMI.PPO。
利用改变位点的寡核苷酸(SEQ ID NO：88)5’-CGC GAC TAGT-3’，首先将AttPPMI。PPO的AscI位点转化为SpeI位点。然后，将CMPSGUSAttBrev的5’BglII(klenow补平)，SpeI片段，不包含attB位点，连接到AttBPMI.PPO.Spe的Asp718I(klenow补平)，SpeI片段中，形成具有单一attP位点的靶序列(称为LPsgAttP)(图4)。
B.产生玉米靶细胞系
实施例25：农杆菌属(Agrobacterium)介导的玉米转化以引入靶序列构建体
基本如Negrotto等.(2000)Plant Cen Reports 19：798-803中所述，进行未成熟玉米胚的转化。
实施例25A：转化质粒和选择性标记
靶序列LPdbAttB，LPdbAttP，LPAttP 1.P2，LPsgAttB和LPsgAttP(图4)在适于玉米转化的双元载体中，并且含有突变体原卟啉原氧化酶(PPO)基因(美国专利号6,288,306)，该基因允许用氟丙嘧草酯(butafenacil)补充的培养基筛选玉米转基因细胞。
实施例25B：制备根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
在28℃，在YP(酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L)，NaCl(5g/L)，15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上培养含有靶序列双元载体的农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404(pSB1)(Ishida等，(1996)NatureBiotechnology 14：745-750)2-4天。在100μM AS补充的LS-inf培养基(Negrotto等.(2000)Plant Cell Rep 19：798-803)中悬浮大约0.8×109农杆菌。在该培养基中预先诱导细菌30-60分钟。
实施例25C：培养基制备
1.JMS母液
主要盐10×。制成1L：NH4NO3，16.9g；KNO3，18.2g；CaCl2·2H2O，2.1g；MgSO4·7H2O，4.0g；KH2PO4，3.5g
微量盐100×。制成1L：KI，0.1g；H3BO3，0.5g；MnSO4·4H2O，1.0g；ZnSO4·7H2O，0.1g；NaMoO4·2H2O，0.010g；CuSO4·5H2O，0.020g；CoCl2·6H2O，0.010g
G5添加物100×。制成1L：酪蛋白水解物，10g；硫胺素HCl，0.5g；吡哆醇HCl，0.05g；烟酸，0.05g；肌醇，10g；脯氨酸，10g过滤器除菌。
麦草畏。0.1M HCl中1mg/ml
替卡西林。100mg/ml蒸馏水；过滤器除菌
硝酸银。AgNO3 10mg/ml；过滤器除菌
甘露糖。1g/1ml蒸馏水；加热到溶解，并且过滤器灭菌
2.JMS配方
2JMSTi200Ag。制成1L：JMS主要盐，100ml；SH微量盐，10ml；FeSO4·7H2O，27.8mg；麦草畏，5ml；蔗糖，20g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：G5添加物，10ml；替卡西林，2ml；AgNO3，0.5ml。
2JMSTi200。制成1L：JMS主要盐，100ml；SH微量盐，10ml；FeSO4·7H2O，27.8mg；麦草畏，5ml；蔗糖，20g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：G5添加物，10ml；替卡西林，2ml。
2JMSAg。制成1L：JMS主要盐，100ml；SH微量盐，10ml；FeSO4·7H2O，27.8mg；麦草畏，5ml；蔗糖，20g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：G5添加物，10ml；AgNO3，0.5ml。
12JMS。制成1L：JMS主要盐，100ml；SH微量盐，10ml；FeSO4·7H2O，27.8mg；麦草畏，5ml；蔗糖，120g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：G5添加物，10ml。
JMS 1M/0.5S。制成1L：JMS主要盐，100ml；SH微量盐，10ml；FeSO4·7H2O，27.8mg；麦草畏，5ml；蔗糖，5g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：G5添加物，10ml；替卡西林，2ml；甘露糖，10ml。
3.MS配方
MSAK3SPO4200Ti。制成1L：MS盐，4.3g；MS维生素(100×)，10ml；ancimidol，0.25mg；kinitin，0.5mg；KH2PO4，0.17g；蔗糖，30g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：替卡西林，2ml。
MSAKPO4200Ti2S/0.5M。制成1L：MS盐，4.3g；MS维生素(100×)，10ml；ancimidol，0.25mg；kinitin，0.5mg；KH2PO4，0.17g；蔗糖，20g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：替卡西林，2ml；甘露糖，10ml。
MS200Ti2S/0.5M。制成1L：MS盐，4.3g；MS维生素(100×)，10ml；蔗糖，20g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：替卡西林，2ml；甘露糖，10ml。
0.75MS3S10PPM。制成1L：MS盐，4.3g；MS维生素(100×)，10ml：蔗糖，30g。将pH调节到5.8：加入2.4g/L Gelrite。高压灭菌。高压灭菌后添加物：植物防腐剂混合物(植物细胞技术)，10ml/L。
实施例25D：接种
从8-12天龄穗切除来源于A188XhiII或其它适合基因型的未成熟胚，放入液体LS-inf+100μM As(乙酰丁香酮)中。用新鲜感染培养基漂洗胚1次，并且在45热激处理。然后添加农杆菌溶液，涡旋胚30秒，使其与细菌共存5分钟。然后将胚的盾片侧朝上转移到含有500Mm As的LSAs培养基上(Negrotto等.(2000)Plant Cell Rep 19：798-803)，并且在黑暗中培养2到3天。随后，将每个培养皿的20到25个之间的胚转移到添加5nM氟丙嘧草酯的2JMSTi200Ag培养基上，并且在28℃，在黑暗中培养9-14天。
实施例25E：筛选转化的玉米细胞
产生胚发生愈伤组织的未成熟胚被转移到补充750nM氟丙嘧草酯的2JMSTi200培养基上。在黑暗中，在这个培养基上筛选培养物2-3周，然后在补充750nM氟丙嘧草酯的2JMSTi200培养基培养基上继代培养，在黑暗中继代培养另外2-3周。
实施例25F：再生转化的玉米植物
将筛选存活的愈伤组织转移到MSAK3SPO4200Ti培养基进行再生，并且放置在黑暗中10-14天。存活的愈伤组织被转移到MSAK3SPO4200Ti培养基，并且在光亮中放置7-10天。将再生的幼芽转移到含有0.75MS3S10PPM培养基的Magenta GA-7盒子(MagentaCorp，ChicagoI11.)中，并且在光亮中培养，直到长出足以转移到土壤中的根。
实施例25G：分析转化的玉米植物
在GA7盒子中2-3周后，通过PCR检测植物PPO基因和其它目的基因的存在。利用TaqMan(Applied Biosystems)，通过定量实时PCR测定法检测PCR测定为阳性的植物，并且将单或低拷贝数插入候选者送到温室。对候选者进行Southern分析以进一步确认玉米转化的植物中存在完整的靶序列插入。
C.Int构建体在植物中的表达
实施例26：用于介导单子叶和双子叶植物中重组的玉米优化的λ整合酶，Int-h，Int-h/218，切除酶和大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子表达载体的构建
实施例26A：构建CMSynInt，双子叶和单子叶植物表达载体
用PmlI消化MUSynInt以向整合酶编码区中引入内含子，用以防止整合酶在细菌宿主中的表达。将PvuII/SnaBI切除的内含子片段(其从pBISN1克隆如实施例11A中所述)连接到MUSynInt编码区中唯一PmII位点中以形成MUSynInt’。
通过用Asp718I消化并且在下面寡核苷酸：5’-GTA CGG CTCGAG CC-3’(SEQ ID NO：89)中连接，在MUSynInt’表达盒3’末端产生XhoI位点。用HindIII/BamHI消化由此得到的质粒MUSynInt’X以切除玉米泛素启动子。
用SpeI消化含有CMPS启动子的pNOV4212，并且通过与寡核苷酸5’-CTA GGA GAT CTC-3’(SEQ ID NO：90)连接，将该位点转化为BglII位点，形成4212Bg。通过用HindIII和BglII消化，从4212Bg切除CMPS启动子片段，并且将其连接到HindIII/BamHI消化的MUSynInt’X质粒形成CMSynInt。
实施例26B：构建CMSynInt-h和CMSynInt-h/218，都是双子叶和单子叶植物表达载体
如实施例26A中所述，分别从MUSynInt-h和MUSynInt-h/218形成MUSynInt-h’和MUSynInt-h/218’。分别利用MUSynInt-h’和MUSynInt-h/218’，制备CMSynInt-h和CMSynInt-h/218与实施例26A中所述制备CMSynInt的方法完全相同。
实施例26C：构建CMSynHFα，双子叶和单子叶植物表达载体
用HindIII消化MUSynHFα，并且通过连接到下面寡核苷酸：5’-AGC TAC TAG T-3’(SEQ ID NO：91)将该位点转化为SpeI位点。用SpeI/BamHI消化由此得到的质粒MUSynHFαSp以切除泛素启动子。用PstI消化含有CMPS的pNOV4211，并且通过在下面寡核苷酸：5’-CCAGATCTGGTGCA-3’(SEQ ID NO：92)中连接，将该位点转化为BglII位点，形成4211Bg。用SpeI和BglII从4211Bg切除CMPS启动子，并且连接到SpeI/BamHI消化的MUSynHFαSp以形成CMSynHFα。
实施例26D：构建CMSynIHFβ，双子叶和单子叶植物表达载体
用Asp718I消化MUSynHFβ，并且通过连接到下面寡核苷酸：5’-GTA CGG ACT AGT CC-3’(SEQ ID NO：93)将位点转化为SpeI位点。用HindIII/BamHI消化由此得到的质粒MUSynHFβSp以切除泛素启动子。用HindIII/BglII消化4211Bg，并且将由此获得的CMPS启动子片段连接到MUSynHFβSp载体形成CMSynHFβ。
实施例26E：联合CMSynInt，CMSynHFα，CMSynHFβ为单个质粒
1.pBluescript中pBSIntHF的构建
用HindIII和XhoI消化CMSynInt，并且通过制备型凝胶电泳分离插入片段。用SpeI和Asp718I消化CMSynHFα，并且同样纯化其插入片段。用HindIII消化CMSynHFβ，并且用下面寡核苷酸：5’-AGC TCTCGA G-3’(SEQ ID NO：94)将位点转化为XhoI位点。用XhoI和SpeI消化由此得到的质粒CMSynHFβH，并且以相同的方法纯化其插入片段。用HindIII/Asp718I消化pBluescript质粒，并用碱性磷酸酶处理。凝胶纯化后，在4方连接中，该载体与3个插入片段连接以形成pBSIntHF。
2.RKIntHF双元载体的构建
用HindIII/Asp718I消化双元载体pNOV2122，并且用碱性磷酸酶处理。凝胶纯化后，通过4方连接，连接该载体和上述3个片段以形成RKIntHF。
3.VSIntHF双元载体的构建
用HindIII和Asp718I消化RKIntHF，并且纯化4099bp的片段。在碱性磷酸酶存在的情况下，用HindIII和Asp718I消化pNOV2114，纯化该载体。连接载体和插入片段产生VSIntHF。
实施例26F：联合CMSynInt-h，CMSynHFα，CMSynHFβ为单个质粒
1.pBluescript中pBSInt-hHF的构建
利用来源于CMSynInt-h的HindIII/XhoI消化的插入片段替换来源于CMSynInt的HindIII/XhoI消化的插入片段，同样地进行上述形成pBSIntHF的4方连接，形成pBSInt-hHF。
2.RKInt-hHF双元载体的构建
利用来源于CMSynInt-h的HindIII/XhoI消化的插入片段替换来源于CMSynInt的HindIII/XhoI消化的插入片段，同样地进行上述形成RKIntHF的4方连接，形成RKInt-hHF。
3.VSInt-hHF双元载体的构建
用HindIII和Asp718I消化RKInt-hHF，并且纯化4099bp的片段。在碱性磷酸酶存在的情况下，用HindIII和Asp718I消化pNOV2114，纯化该载体。连接载体和插入片段产生VSInt-hHF。
实施例26G：联合CMSynInt-h/218，CMSynHFα，CMSynHFβ为单个质粒
1.pBluescript中pBSInt-h/218HF的构建
利用来源于CMSynInt-h/218的HindIII/XhoI消化的插入片段替换来源于CMSynInt的HindIII/XhoI消化的插入片段，同样地进行上述形成pBSIntHF的4方连接，形成pBSInt-h/218HF。
2.RKInt-h/218HF双元载体的构建
利用来源于CMSynInt-h/218的HindIII/XhoI消化的插入片段替换来源于CMSynInt的HindIII/XhoI消化的插入片段，同样地进行上述形成RKIntHF的4方连接，形成RKInt-h/218HF。
3.VSInt-h/218HF双元载体的构建
用HindIII和Asp718I消化RKInt-h/218HF，并且纯化4099bp的片段。在碱性磷酸酶存在的情况下，用HindIII和Asp718I消化pNOV2114，纯化该载体。连接载体和插入片段产生VSInt-h/218HF。
实施例26H：RKInt双元载体的构建
切除做为EcoRI片段的CMSynInt表达盒，并且将其连接到用EcoRI消化和用碱性磷酸酶处理的基于RK2的双元载体pNOV2122中，以形成质粒RKInt。
实施例26I：RKInt-h双元载体的构建
切除做为EcoRI片段的CMSynInt-h表达盒，并且将其连接到用EcoRI消化和用碱性磷酸酶处理的基于RK2的双元载体pNOV2122中，以形成质粒RKInt-h。
实施例26J：RKInt-h/218双元载体的构建
切除做为EcoRI片段的CMSynInt-h/218表达盒，并且将其连接到用EcoRI消化和用碱性磷酸酶处理的基于RK2的双元载体pNOV2122中，以形成质粒RKInt-h/218。
实施例26K：VSInt-h/218双元载体的构建
用EcoRI消化CMSynInt-h/218，并且纯化2012bp的插入片段。在碱性磷酸酶存在的情况下，用EcoRI消化pNOV2114，并纯化。将该载体与含有CMSynInt-h/218的EcoRI片段连接，形成的两种产物命名为VSInt-h/218A和VSInt-h/218B。
实施例26L：含有切除酶表达盒的双元载体的构建
(来源于实施例7的)SynXis基因序列从其TOPO载体做为BamHI/SacI片段切除，并且将其插入到表达载体CMSynHFβ的BamHI/SacI位点中，以形成2994SynXis。将含有CMPS启动子的404bpCMSynHFβ片段插入到2994SynXis的BamHI位点中以形成CMSynXis。将CMSynXis的945bp EcoRI片段连接到用EcoRI消化的VSInt-h/218A双元载体部分中，形成VSXis。
实施例26M：vIntHF的构建：具有CMSynInt，CMSynIHFα，CMSynIHFβ的小麦双粒病毒组复制子
用SpeI和XhoI消化pBSIntHF，并纯化含有CMPSInt基因的2047bp片段。用XhoI和Asp718I消化相同的质粒提供含有IHF基因的2088bp片段。通过3方连接，将这两个插入片段与用SpeI和Asp718I消化的纯化的病毒载体pWI-11M连接。产物命名为vIntHF。
实施例26N：构建vInt-h/218HF：具有CMSynInt-h/218，CMSynHFα，和CMSynHFβ的小麦双粒病毒组复制子
用SpeI和XhoI消化pBSInt-h/218HF，并纯化含有CMSynInt-h/218基因的2047bp片段。这里再一次利用上述的2088bp的IHF基因片段通过3方连接，将这两个插入片段与SpeI和Asp718I消化的病毒载体pWI-11M连接。产物命名为vInt-h/218HF。
实施例26O：vInt-h/218的构建：具有CMSynInt-h/218的小麦双粒病毒组复制子
连接上述pBSInt-h/218HF的2047bp SpeI/XhoI片段和用SpeI和SalI消化的pWI-11M。由此得到的质粒命名为vInt-h/218。
实施例26P：向农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404(pSB1)中侧翼是小麦矮化双粒病毒DNA复制子同向重复的双元载体(pNOV2114)中引入CMPSIntHF，CMPSInt-h/218HF和CMPSInt-h/218
具有重复拷贝病毒复制子的T-DNA载体允许切除病毒基因组和插入在重复之间的DNA。这种切除事件可以在T-DNA插入植物基因组之前或之后。这种方法使插入的DNA能够在适合宿主植物细胞中复制成高拷贝数。分两倍制备构建体。首先，构建在T-DNA边界之间具有一部分病毒基因组的双元载体(不包含NPTII基因和不匹配的大肠杆菌复制起点)，并且转化到农杆菌属(Agrobacterium)辅助质粒，诸如LBA4404中。
下一步，用将要插入到T-DNA中的病毒质粒再次转化该农杆菌属(Agrobacterium)株系，筛选KmR。因为病毒载体不能在农杆菌属(Agrobacterium)中复制，KmR筛选鉴定病毒已经共整合到T-DNA中的克隆。用SphI消化质粒vCMLucB/P(下面，实施例67A中)，并且将寡核苷酸(5’-CCG GAT CCG GCA TG-3’(SEQ ID NO：95))连接到由此得到的载体中以转化SphI位点为BamHI。
用BamHI消化所得质粒vCMLucB/P-BamHI提供了含有病毒载体(pWI-11M)减去637bp p15Q复制起点区的3149bp片段。在碱性磷酸酶存在的情况下，用BglII消化双元载体pNOV2114，并且连接纯化的载体片段和3149bp的pWI-11M片段。鉴定插入片段方向是NPTII基因在T-DNA RB附近的质粒，并命名为2114WI-11B。用XbaI消化它，并且再次连接以除去大部分NPTII基因，产物命名为2114WI-ΔXB。将该质粒转化到农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404(pSB1)中，筛选pNOV2114的壮观霉素抗性。由此得到的农杆菌属(Agrobacterium)株系是LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)。从该株系制备电感受态细胞用于病毒构建体的导入。
实施例26Q：农杆菌属(Agrobacterium)中VexCMIntHF的构建
将质粒vIntHF转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在YP琼脂上，用Km50，Spec100和Tc5筛选转化体。通过分析从农杆菌属(Agrobacterium)分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的CMIntHF构建体的DNA结构。
实施例26R：农杆菌属(Agrobacterium)中VexCMInt-h/218HF的构建
将质粒vInt-H/218HF电转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在YP琼脂上，用Km50，Spec100和Tc5筛选转化体。通过分析从农杆菌属(Agrobacterium)分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的CMInt-h/218HF构建体的DNA结构。
实施例26S：农杆菌属(Agrobacterium)中VexCMInt-h/218的构建
将质粒vInt-H/218转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在YP琼脂上，用Km50，Spec100和Tc5筛选转化体。通过分析从农杆菌属(Agrobacterium)分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的CMInt-h/218构建体的DNA结构。
D.用于在玉米中与靶序列重组的供体序列的构建
一般地，这里构建的示例性供体序列包含PMI表达盒的5’部分和GUS表达盒的3’部分；即，靶序列中缺少的每个部分。用att位点插入每个基因中内含子的分断点。
供体序列可以含有采用5’PMI-5’Intorn-Att位点-3’intron-3’GUS形式的单一att位点。做为可替代的方案，供体构建体可以含有采用Att位点-3’Intron-3’GUS-5’PMI-5’Intron-Att位点形式的两个att位点。供体中内含子3’部分对应于相匹配靶序列中相同内含子的5’部分。供体中内含子5’部分对应于相匹配靶序列中相同内含子的3’部分。供体中att位点能与相应靶序列中att位点重组。此外，供体和靶序列中att位点相对于截短的基因的方向是相同的。
实施例27：具有反向attB位点的单子叶植物供体
用引物PAct2BH(5’-CTA AGG ATC CAA GAT CAA AGG CTTAAA AAG C-3’)(SEQ ID NO：96)和PAct2XbaI(5’-GGA ATC TAGATG TAT AAA CCA AAT GAG CAG-3’)(SEQ ID NO：97)从哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)扩增拟南芥(Arabidopsis)Act23’-UTR(An；Y.Q.等，(1996)Plant J.10：107-121)。用BamHI和XbaI消化PCR产物，并且将其连接到pBluescript II KS(+)，形成pNOV2713。
从pNOV2713切除做为BamHI(klenow)，NotI终止子片段的拟南芥(Arabidopsis thaliana)肌动蛋白-2 3’非翻译区，并且将其连接到CMPSGUSAttBrev的GUS外显子2的3’末端AvaI(klenow)，PspOMI位点，形成完整的GUS表达盒，命名为CMGUSAttBrTact。
在(1)从CMGUSAttBrTact切除的做为XbaI(klenow)/BglII片段的包含attB位点的GUS表达盒3’部分；(2)从MUPMIAttB切除的做为SphI(klenow)/AvrII片段的包含attB位点的PMI表达盒5’部分；和(3)用BamHI/XbaI消化的pNOV2114之间，通过3方连接形成具有反向attB位点的供体。3方连接形成了命名为DONdbAttB的供体。
pNOV5013的PPO表达盒可以做为PstI片段连接到DONdbAttB的唯一SbfI位点中，形成DONdbAttB.PPO，可以如实施例48中所述使用它。
实施例28：具有反向attP位点的单子叶植物供体
从pNOV2713切除做为BamHI(klenow)，NotI终止子片段的拟南芥(Arabidopsis thaliana)肌动蛋白-2 3’非翻译区，并且将其连接到CMPSGUSAttPrev的GUS外显子2的3’末端AvaI(klenow)，PspOMI位点，形成完整的GUS表达盒，命名为CMGUSAttPrTact。
在(1)从CMGUSAttPrTact切除的做为XbaI(klenow)/BglII片段的包含attP位点的GUS表达盒3’部分；(2)从MUPMIAttP切除的做为SphI(klenow)/AvrII片段的包含attP位点的PMI表达盒5’部分；和(3)用BamHI/XbaI消化的pNOV2114之间，通过3方连接形成具有反向attP位点的供体。3方连接形成了命名为DONdbAttP的供体。
pNOV5013的PPO表达盒可以做为PstI片段连接到DONdbAttP的唯一SbfI位点中，形成DONdbAttP.PPO，可以如实施例48中所述使用它。
实施例29：具有反向attB1和attB2位点的单子叶植物供体
利用寡核苷酸引物对5’-GAT CTG GGG ACA AGT TTG TACAAA AAA GCA GGC TIC AGC TAG C-3’(SEQ ID NO：98)和5’-GAT CGC TAG CTG AAG CCT GCT TTT TTG TAC AAA CTTGTC CCC A-3’(SEQ ID NO：99)，将attB1位点引入到pNOV5003的GUS基因AT BAF60内含子的BglII位点中。利用T4多核苷酸激酶磷酸化这些寡核苷酸，然后在连接反应中，它们与用BglII消化和碱性磷酸酶处理的pNOV5003联合。测序由此得到的质粒GUSAttB1rev，以确定attB1位点相对于GUS编码区的方向是3’到5’方向的。
通过3方连接，在GUSAttB1rev的3’末端添加从pNOV2713切除的拟南芥(Arabidopsis thaliana)肌动蛋白-2的3’非翻译区(Tact)。连接用EcoRI，XbaI消化的载体pUC18，用MfeI/XhoI消化的GUSAttBlrev和用XhoI，XbaI消化的pNOV2713以产生GUSAttBlrevTact。
利用寡核苷酸对：5’-AAT TGG TAC CTG AAC CCA GCT TTCTTG TAC AAA GTG GTC CCC TAG G-3’(SEQ ID NO：100)和5’-AAT TCC TAG GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGGTTC AGG TAC C-3’(SEQ ID NO：101)，将attB2位点引入pNOV2790的PMI内含子3的MfeI位点。利用T4多核苷酸激酶磷酸化这些寡核苷酸，然后在连接反应中，它们与用MfeI消化和用碱性磷酸酶处理的pNOV2790联合。测定由此得到的质粒pNOV2790AttB2的序列，以确定attB2位点相对于PMI内含子3的方向是3’到5’方向的。
从pNOV2790AttB2切除做为BstBI，PshAI片段的含有attB2位点的PMI内含子3，并且将其连接到用BstBI，PshAI切割的双元载体PNOV2117中，形成PMI表达盒，称为MUPMIAttB2，其含有具有attB2位点的PMI内含子3。
在(1)从GUSAttB1rTact做为BglII，SphI片段切除的含有attB1位点的GUS表达盒3’部分；(2)从MUPMIAttB2做为SphI，AvrII片段切除的，含有attB2位点的PMI表达盒5’部分；和(3)用BamHI/XabI消化的pNOV2114之间，通过3方连接形成具有反向attB1位点和attB2位点的供体。3方连接形成命名为DONAttB1.B2的供体。
pNOV5013的PPO表达盒可以做为PstI片段连接到DONAttB1.B2的唯一SbfI位点中，形成DONAttB1.B2.PPO，可以如实施例48中所述使用它。
实施例30：具有单一attB位点的单子叶植物供体
通过寡核苷酸5’-TCG AAG CAT GCT-3’(SEQ ID NO：102)的插入，转化多接头中XhoI位点为SphI位点修饰Bluescript克隆载体pBS-Skminus，形成pBS.XSph。利用下面片段：用HindIII和SphI消化的pBS.XSpH；用HindIII和AvrII消化的MUPMIAttB(切除5’UbiPMI/AttB)和用NheI和SphI消化的CMGusAttBrevTact(切除3’Gus.Act2utr但不是AttBrev)进行3方连接形成pBSDONsgAttB。
实施例31：具有单一attP位点的单子叶植物供体
利用下面片段：用HindIII和SphI消化的pBS.XSpH；用HindIII和AvrII消化的MUPMIAttP(切除5’UbiPMI/AttP)和用NheI和SphI消化的CMGusAttBrevTact(切除3’Gus.Act2utr但不是AttBrev)进行3方连接形成pBSDONsgAttP。
实施例32：具有单一attB位点的T-DNA单子叶植物供体
用AscI和SbfI消化pBSDONsgAttB，并将约6kb的插入片段连接到用AscI和SbfI消化的双元载体pNOV2114中，形成DONsgAttB。
实施例33：具有单一attP位点的T-DNA单子叶植物供体
用AscI和SbfI消化pBSDONsgAttP，并将约6kb的插入片段连接到用AscI和SbfI消化的双元载体pNOV2114中，形成DONsgAttP。
实施例34：具有单一attB位点的单子叶植物病毒复制子供体
利用下面的寡核苷酸5’-GAT CAC GCG T-3’(SEQ ID NO：103)，将pWI-11M的BamHI位点转化为MluI位点，形成pWI-11M.Mlu。用SbfI消化pBSDONsgAttB，用3’-5’外切核酸酶进行平端化，并再用AscI消化形成约6kb的片段。将该片段连接到用Asp718I消化，用Klenow平端化，并且再用MluI消化的pWI-11M.Mlu中以形成vDONsgAttB(图5)。
实施例35：具有单一attP位点的单子叶植物病毒复制子供体
用SbfI消化pBSDONsgAttP，用3’-5’外切核酸酶进行平端化，并再用AscI消化形成约6kb的片段。将该片段连接到用Asp718I消化，用Klenow平端化，并且再用MluI消化的pWI-11M.Mlu中以形成vDONsgAttP。
实施例36：具有反向attB位点的单子叶植物病毒复制子供体
用AgeI消化DONdbAttB，用klenow平端化，并且再用AscI消化以形成约6kb的片段。将该片段连接到用Asp718I消化，用Klenow平端化，并且再用MluI消化的pWI-11M.Mlu中以形成vDONdbAttB。
实施例37：具有反向attP位点的单子叶植物病毒复制子供体
用AgeI消化DONdbAttP，用klenow平端化，并且再用AscI消化以形成约6kb的片段。将该片段连接到用Asp718I消化，用Klenow平端化，并且再用MluI消化的pWI-11M.Mlu中以形成vDONdbAttP。
实施例38：具有反向attB1和attB2位点的单子叶植物病毒复制子供体
用AgeI消化DONAttB1.B2，用klenow平端化，并且再用AscI消化以形成约6kb的片段。将该片段连接到用Asp718I消化，用Klenow平端化，并且再用MluI消化的pWI-11M.Mlu中以形成vDONAttB1.B2。
实施例39：农杆菌属(Agrobacterium)中VexDONsgAttB：带有单子叶植物病毒复制子侧翼的DONsgAttB的构建
在这个和下面几个实施例中，构建了一系列双元病毒切除(Vex)载体，它们的T-DNA具有位于目的基因侧翼的小麦矮化病毒复制子的几乎完整的拷贝。这些病毒切除载体允许在递送给植物细胞后，从T-DNA切除带有目的基因，并且能够倍增目的基因，使其达到高拷贝数的环形病毒复制子。一般的方法是构建受体双元载体2114-PWI-ΔX，其T-DNA含有一个来源于pWI-11M的几乎完整病毒拷贝，但是缺少它的KmR基因。将2114-PWI-ΔX电转化到农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404(pSB1)中以产生LBA4404(pSB1)(2114-pWI-ΔX)。随后，将任何供体或其它目的构建体克隆到在农杆菌属(Agrobacterium)中不能复制的质粒pWI-11M(带有其完整的KmR基因)中。将后一质粒电转化到LBA4404(2114-PWI-ΔX)中，并且在含有卡那霉素的琼脂上涂布细菌，以筛选通过病毒DNA同源性，供体DNA和受体双元载体共整合，产生在目的基因侧翼具有病毒拷贝的T-DNA的克隆。
为了2114-pWI-ΔX的构建，用SacII消化质粒vCMLucB/P(下面实施例67A中)，并且用改变位点的寡核苷酸5’-CCG GAT CCGGGC-3’(SEQ ID NO：104)，将位点转化为BamHI(粗体)，产生CMPSVLucB/P.BamHI。用BamHI消化该产物，并且凝胶纯化含有完整病毒复制子但是缺少大部分P15Q起点的3145bp片段。用BalII和碱性磷酸酶消化双元载体pNOV2114，并且凝胶纯化。将它们两个连接到一起形成2114WI-11A和2114WI-11B。后者具有靠右边界更近的NPPII标记基因，并且用在下一步中。通过用XbaI消化和再连接，将它转化为缺少大部分NPTII基因的2114WI-ΔXB。通过壮观霉素抗性筛选，将该质粒转化到LBA4404(pSBI)中，产生受体株系LBA4404(pSBI)(2114WI-ΔXB)，在这里和实施例40-43中使用它。
将质粒vDONsgAttB(图5)转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在具有Km50，Spec100和Tc5的YP琼脂上筛选转化体。通过分析从农杆菌分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的DONsgAttB构建体的T-DNA的结构。
实施例40：农杆菌属(Agrobacterium)中VexDONsgAttP：带有单子叶植物病毒复制子侧翼的DONsgAttP的构建
将质粒vDONsgAttP转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在具有Km50，Spec100和Tc5的YP琼脂上筛选转化体。通过分析从农杆菌分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的DONsgAttP构建体的T-DNA的结构。
实施例41：农杆菌属(Agrobacterium)中VexDONdbAttB：带有单子叶植物病毒复制子侧翼的DONdbAttB的构建
将质粒vDONdbAttB转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在具有Km50，Spec100和Tc5的YP琼脂上筛选转化体。通过分析从农杆菌分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的DONdbAttB构建体的T-DNA的结构。
实施例42：农杆菌属(Agrobacterium)中VexDONdbAttP：带有单子叶植物病毒复制子侧翼的DONdbAttP的构建
将质粒vDONdbAttP转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在具有Km50，Spec100和Tc5的YP琼脂上筛选转化体。通过分析从农杆菌分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的DONdbAttP构建体的T-DNA的结构。
实施例43：农杆菌属(Agrobacterium)中VexDONAttB1.B2：带有单子叶植物病毒复制子侧翼的DONAttB1.B2的构建
将质粒vDON AttB1.B2转化到LBA4404(pSB1)(2114WI-ΔXB)中，并且在具有Km50，Spec100和Tc5的YP琼脂上筛选转化体。通过分析从农杆菌分离的小量制备DNA证实具有病毒侧翼的DONAttB1.B2构建体的T-DNA的结构。
E.供体序列定向整合到玉米靶系中
实施例44：通过轰击，供体构建体定向整合到转化的玉米胚发生愈伤组织中
实施例44A：用于定向整合试验的玉米愈伤组织的产生
在温室中，自交或回交含有单拷贝靶序列T-DNA插入的转化的玉米植物，并且产生种子。基本如Negrotto等.(2000)Plant Cell Reports 19：798-803所述，从穗切除未成熟胚。通过将未成熟胚放置在不含氟丙嘧草酯或含有用于筛选阳性分离体的100nM氟丙嘧草酯的2JMSAg上起始转化的胚发生愈伤组织。愈伤组织起始后9-12天直接从合子胚分离或者来源于繁殖培养物的转化的胚发生愈伤组织用于定向整合。
实施例44B：在用于轰击的金珠上质粒DNA的共沉淀
用于每个处理的质粒联合包含适合的和与靶序列T-DNA重组相容的供体DNA和整合酶表达盒，有或没有大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子蛋白质的共表达。将这些质粒中每种质粒等分成1-10μg，放到50μl具有3mg＜1μm金颗粒(Crescent Chem.Co.，Inc.，NY)的50％的甘油中。利用标准CaCl2 sperimidine化学(Klein等.(1987)Nature 327：70-73)，在金颗粒上沉淀质粒DNA。
实施例44C：轰击玉米愈伤组织用于定向整合
在含有12％蔗糖的12JMS培养基上放置的2cm直径的环中排列转基因玉米愈伤组织，在轰击前，其给愈伤组织提供了至少3小时的渗透压处理。利用具有650psi破裂膜片的DuPont氦枪(Biorad)轰击每个靶板，然后置于黑暗中。
实施例44D：计数GUS阳性打靶事件
λ整合酶介导的轰击的供体DNA到靶序列T-DNA位点中的插入产生了完整的β-葡糖醛酸酶(GUS)表达盒。在黑暗中温育轰击的玉米愈伤组织2-10天。利用GUS组织化学测定法(Jefferson等.(1987)EMBOJ.6：3901-3907)测定一小批打靶愈伤组织的定向整合。一个阳性的染蓝色的细胞(GUS斑)被记为一个稳定的定向插入事件。
实施例44E：玉米把靶事件的筛选
λ整合酶介导的轰击的供体DNA到靶序列T-DNA位点中的插入也产生了完整的磷酸甘露糖异构酶(PMI)表达盒(Negrotto.(2000)PlantCell Reports 19：798-803)，并且可以用于把靶事件的筛选。在轰击后1-2周，将没有牺牲用于GUS测定的愈伤组织置放在筛选培养基，JMS 1M/0.5S上。在黑暗中，在筛选培养基上温育玉米愈伤组织，一直到甘露糖上微小愈伤组织(microcalli)的生长是明显的为止。将甘露糖上生长的愈伤组织继代到新的筛选培养基上，并且形成大块愈伤组织用于再生。
实施例44F：玉米把靶事件的PCR分析
在黑暗中，在MSAKPO4200Ti2S/0.5M培养基上再生选定的组织10-14天(Negrotto等.(2000)Plant Cell Reports 19：798-803)。然后，将组织转移到新的MSAKPO4200Ti2S/0.5M培养基上，在光亮中培养(16小时光/8小时黑暗的方案)。1周后，将绿色组织转移到MS200Ti2S/0.5M培养基，并且在光亮中培养。将小植株转移到含有0.75MS3S10PPM培养基的Magenta GA-7盒子，并且在根生长到足以转移到土壤之前，一直在光亮中培养。利用PCR测定法分析再生的玉米植物。引物对中一个引物与靶DNA同源，另一个引物与供体DNA同源，由此，只有供体DNA已经进行了与靶DNA附着位点的λ整合酶介导的重组，才可形成可预测大小的PCR产物。通过PCR证实含有定向整合事件的这些植物被送到温室。对PCR阳性候选者进行Southern分析以进一步证实定向整合事件的分子结构。
实施例44G：GUS阳性把靶事件
在下面表5中命名插入到玉米基因组中不同位置的靶序列T-DNA’s为系1，2等。
表5
| 靶序列 | 供体 | 整合酶和HF蛋白质 | 平均GUS斑/靶 |
| 实验1 | |||
| LPsgAttP系1 | vDONsgAttB | 1 | |
| LPsgAttP系1 | vDONsgAttB | pBSInt-h/218HF | 200 |
| 实验2 | |||
| LPsgAttP系2 | vDONsgAttB | 0.5 | |
| LPsgAttP系2 | vDONsgAttB | pBSInt-h/218HF | 35 |
| LPsgAttP系2 | vDONsgAttB | pBSIntHF | 2.5 |
| LPsgAttP系2 | pBSDONsgAttB | pBSInt-h/218HF | 2.0 |
| 实验3 | |||
| LPsgAttP系3 | vDONsgAttB | pBSInt-h/218HF | 160 |
| 实验4 | |||
| LPsgAttP系1 | vDONsgAttB | pBSInt-h/218HF | 116 |
| 实验5 | |||
| LPdbAttP系1 | vDONdbAttB | pBSInt-h/218HF | 12 |
| LPdbAttP系1 | vDONdbAttB | vInt-h/218HF | 6 |
| LPdbAttP系1 | DONdbAttB | vInt-h/218HF | 10 |
| 实验6 | |||
| LPdbAttP系2 | vDONdbAttB | pBSInt-h/218HF | 148 |
| LPdbAttP系2 | vDONdbAttB | vInt-h/218HF | 20 |
| LPdbAttP系2 | DONdbAttB | vInt-h/218HF | 8 |
| 实验7 | |||
| LPAttP1.P2系1 | vDONAttB1.B2 | 0 | |
| LPAttP1.P2系1 | vDONAttB1.B2 | pBSInt-h/218HF | 7 |
这些结果表明被大肠杆菌(E.coli)整合宿主因子蛋白质的表达增强的λ整合酶基因的表达介导了供体识别位点和玉米靶系中识别位点之间的分子间重组。
实施例45：通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，供体构建体定向整合到玉米靶序列胚中
实施例45A：用于转化的双元载体
供体双元载体DonsgAttB，DonsgAttP，DondbAttB，DondbAttP，DonAttP1.P2，VexDonsgAttB，VexDonsgAttP，VexDondbAttB，VexDondbAttP和VexDonAttB1.B2和λ整合酶双元载体VSIntHF，VSInt-h/218，VSInt-h/218HF，VexIntHFαβ，VexInt-h/218和VexInt-h/218HFαβ适于玉米转化。
实施例45B：根瘤农杆菌(Agrobacterillm tumefaciens)的制备
如实施例25中所述，培养含有供体双元载体之一的农杆菌属(Agrobacterim)株系LBA4404(pSB1)和含有λ整合酶双元载体之一的第二农杆菌属(Agrobacterim)株系LBA4404(pSB1)，并且预先诱导以用于转化试验。做为可替代方案，如实施例25中所述，培养含有供体双元载体之一和相容的λ整合酶双元载体的农杆菌属(Agrobacterim)株系LBA4404，并进行预诱导以用于转化实验。
实施例45C：接种和共培养
以1∶1比例混合含有供体双元载体的农杆菌属(Agrobacterim)株系和含有λ整合酶双元载体的农杆菌属(Agrobacterim)株系用于接种。做为可替代的方案，利用含有供体和λ整合酶双元载体的单一农杆菌属(Agrobacterim)株系用于接种。供体双元载体和与用于接种的玉米未成熟胚中靶序列T-DNA插入物的重组相容。如实施例25中所述进行接种和共培养。
实施例45D：玉米把靶事件的预筛选和筛选
共培养后，将愈伤组织转移到预筛选培养基2JMSTi200Ag，黑暗中培养10-14天。将胚发生的愈伤组织转移到JMS1M0.5S培养基，并且以间隔2-3周的传代步骤，在该培养基上筛选6-10周。将存活的愈伤组织转移到MSAKPO4200Ti2S/0.5M培养基，并且在黑暗中保持10-14天。将该组织转移到MSAKPO4200Ti2S/0.5M培养基，并且放置在光亮中(16小时光/8小时黑暗的方案)。1周后，将绿色组织转移到MS200Ti2S/0.5M培养基，并且温育1-2周。将小植株转移到含有0.75MS3S10PPM培养基的Magenta GA-7盒子(Magenta Corp.，Chicago，III.)中，并且在光亮中培养。2-3周后，检测植物的定向插入事件(参见下文)，将检测为阳性的植物转移到温室的土壤中。
实施例45E：玉米把靶事件的GUS和PCR测定
供体DNA向靶序列T-DNA位点中的λ整合酶介导的插入产生了完整的β-葡糖醛酸酶(GUS)表达盒。在37℃将玉米组织浸没在GUS组织化学混合物(Jefferson，R.A.等(1987)EMBO J.6：3901-3907)中约24-72小时。将蓝色区域的外观计数为λ整合酶把靶事件。利用引物对，通过PCR测试玉米组织，该引物对产生跨过新形成的attL，attR，attL1和attL2重组位点的DNA片段的扩增。引物对一个引物与靶序列DNA同源，另一个引物与供体DNA同源，因此，只有供体DNA已经进行了与靶序列T-DNA附着位点的λ整合酶介导的重组，才形成可预测大小的PCR产物。将可预测大小的PCR产物的扩增计数为λ整合酶打靶的事件。
实施例46：通过靶序列转基因的玉米植物和供体序列转基因的玉米植物之间杂交的定向整合
实施例46A：农杆菌属(Agrobacterim)介导的玉米转化以引入靶序列构建体
如实施例25中所述，用含有靶序列双元载体之一的农杆菌属(Agrobacterim)株系LBA4404(pSB1)进行未成熟玉米胚的转化。
实施例46B：用靶序列T-DNA转化的玉米植物的筛选和再生
如实施例25中所述，筛选和再生氟丙嘧草酯抗性的玉米愈伤组织。如实施例25中所述，利用PCR和Southern分析筛选单或低拷贝数靶序列插入的氟丙嘧草酯抗性玉米植物。
实施例46C：用靶序列T-DNA转化的玉米植物的产生
在温室中自交含有单或低拷贝数靶序列的转化的玉米植物，并且产生种子。如Hill等.(1995)Euphytica 85：119-123中所述，从种子切下胚，并且置放在具有2％蔗糖和50nM氟丙嘧草酯的B5培养基上，以筛选含有靶序列T-DNA的转化体。将萌发的小苗转移到GA7 Magenta盒子中，并在生根培养基上生根。对这些植物进行Taqman PCR以区分对靶序列T-DNA是纯合的转化体和杂合的转化体。当根在纯合转化体上发育时，将它们转移到温室的土壤中。这些植物用做杂交中的一个亲本。
实施例46D：农杆菌属(Agrobacterim)介导的玉米转化以引入供体：PPO和λ整合酶表达盒
如上述用于玉米中所述，用含有供体：PPO双元载体之一和“RK”λ整合酶表达盒双元载体之一的农杆菌属(Agrobacterim)株系LBA4404进行未成熟玉米胚的转化。
实施例46E：用供体：PPO和整合酶表达盒转化的玉米植物的筛选和再生
如上所述，筛选和再生氟丙嘧草酯抗性玉米愈伤组织。如上所述，利用PCR和Southern分析筛选单或低拷贝数供体：PPO T-DNA和λ整合酶表达盒T-DNA插入的氟丙嘧草酯抗性玉米植物。
实施例46F：用供体：PPO和λ整合酶表达盒T-DNA转化的玉米植物的产生
在温室中自交含有单或低拷贝数供体：PPO和λ整合酶表达盒T-DNA插入的转化的玉米植物，并且产生种子。如Hill等(1995)Euphytica 85：119-123中所述，从种子取出胚，并且置放在具有2％蔗糖和50nM氟丙嘧草酯的B5培养基上萌发，以筛选阳性分离体。将萌发的小苗转移到GA7 Magenta盒子中，并在生根培养基上生根。对这些植物进行Taqman PCR以区分对插入的T-DNA是纯合的转化体和杂合的转化体。也通过Northern分析和/或ELISA测定植物，以检测整合酶的表达水平。具有最好整合酶表达水平的纯合分离体用作杂交中另一个亲本。
实施例46G：通过靶序列亲本和供体：PPO/λ整合酶表达亲本之间的杂交的定向整合。
对靶序列纯合的玉米植物和对相容的供体：PPO纯合和表达λ整合酶的玉米植物杂交。如Hill等.(1995)Euphytica 85：119-123中所述，从种子取出胚，并且在具有甘露糖的B5培养基上萌发以筛选含有完整PMI基因表达盒和由此含有定向插入事件的转化体。
实施例46H：测定玉米把靶事件
按照上述用于玉米的方法，在甘露糖上生长的玉米愈伤组织再生为植物。通过GUS和PCR分析测定玉米植物以证实它们含有定向整合事件。含有定向整合事件的植物被送到温室。对PCR阳性候选者进行Southern分析以进一步证实定向整合事件的分子结构。
实施例46I：定向整合体与供体和λ整合酶T-DNA分离
在温室中回交含有定向插入的玉米植物，并且产生种子。如上所述，从穗取出胚，并且在含有甘露糖的B5培养基上萌发。筛选萌发小苗氟丙嘧草酯抗性的缺少。通过PCR，测定氟丙嘧草酯敏感性植物定向插入结构的存在和供体：PPO和λ整合酶T-DNA的不存在。该PCR测定用于筛选仅含有定向插入的分离体。
III.玉米中染色体内核苷酸序列的切除
实施例47：用于染色体内核苷酸序列切除的，含有attB和attP重组位点的单子叶植物载体的构建
如下文所述，构建含有CMPS：GUSintron：Tact2和ZmUbi：PMIintron：Tnos盒子的双元载体pQD203A11。在pQD203A11中，attB位点插入在PMIintron基因(即，包含在PMI编码序列中插入4个内含子的PMI基因)的第一内含子中，并且attP位点插入在ZmUbi启动子的上游(参见，图6)。AttB和attP序列同向。该载体允许利用噬菌体λ整合酶切除间插DNA序列，因此通过移除整个玉米Ubi启动子(ZmUbi)和attB序列上游PMIintron部分，失活选择性标记。为完成上述目的，退火互补的寡核苷酸ATTB1(5’-GAT CCG CTC AAGTTA GTA TAA AAA AGC AGG CTT CAT GA-3’)(SEQ ID NO：105)和ATTB2(5’-GAT CTC ATG AAG CCT GCT TTT TTA TAC TAACTT GAG CG-3’)(SEQ ID NO：106)，并且插入到BglII消化的pNOV2790中以形成pQD187A8。通过向BamHI消化的pNOV041插入pQD187A8的3551bp片段构建含有具有attB序列的阳性对照PMIIntron基因的双元载体(pNOV5099)，pNOV041是在其T-DNA区含有ZmUbi：PMIintron：Tnos表达盒的双元载体。
用两个引物：ATTPSPOMI(5’-GGG CCC TCT GTT ACA GGTCAC TAA TAC CAT CTA AG-3’)(SEQ ID NO：107)和ATTPSPEI(5’-ACT AGT GAA ATC AAA TAA TGA TTT TAT TTT G-3’)(SEQID NO：108)，通过PCR从噬菌体DNA扩增attP序列，并且将PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体中，以形成pNOV5088。用XbaI消化pQD189A12，用Klenow补平，然后用NotI切割。pQD189A12是含有CMPS：GUS：Tact2表达盒的pBluescrpt KS(+)克隆载体。然后，连接上述pQD189A12的XbaI/NotI片段和pNOV5088的ApaI/NotI片段以形成pQD194A1。pQD110A5是含有RS序列的pBluescrpt KS(+)载体。通过NotI和SacI消化，从pQD110A5切除RS序列，并且将其插入到SacI/NotI消化的pQD194A1(6370bps)以形成pQD198A1。将pQD198A1的NcoI(平端)/PspOMI片段(3.6kb)插入到pNOV5099的(PacI)平端/PspOMI片段(11535 bps)中以形成双元载体pQD203A11，其含有同向的attB和attP位点(图6)。
实施例48：用于染色体内核苷酸序列切除的，含有attL和attR重组位点的单子叶植物载体的构建
如下文所述，构建含有CMPS-GUSIntron-Tact2和ZmUbi-PMIintron-Tnos盒子的双元载体pQD346A。在pQD346A中，attR位点插入在PMIIntron的第一内含子中，attL位点插入在CMPS启动子的上游(图7)。AttL和attR序列同向。该载体允许利用噬菌体λ整合酶切除带有attL和attR位点侧翼的DNA序列，移除整个GUS表达盒，玉米Ubi启动子(ZmUbi)，和attR序列上游PMIIntron的一部分(图7)。利用两个引物：attLApaI(5’-AGG GCC CAG CCT GCT TTTTTA TAC TAA GTT GGC ATT A-3’)(SEQ ID NO：109)和attLSpeI(5’-TAC TAG TCA AAT AAT GAT TTT ATT TTG ACT GAT AG-3’)(SEQ ID NO：110)，从噬菌体DNA扩增噬菌体λ的attL序列。用ApaI和SpeI消化attL PCR产物，并且将其插入到ApaI/SpeI消化的pQD189A12中，以形成pQD340B5。来源于退火的两个寡核苷酸，RSKpnI(5’-CTT GAT GAA AGA ATA ACG TAT TCT TTC ATCAAG GGC C-3’)(SEQ ID NO：111)和RSApaI(5’-CTT GAT GAAAGA ATA CGT TAT TCT TTC ATC AAG GTA C-3’)(SEQ ID NO：112)的RS序列被插入到pQD340B5的attL位点上游以形成pQD342B。用两个引物：ATTRBGLII(5’-TAG ATC TGT TAC AGG TCA CTAATA CCA TCT AAG T-3’)(SEQ ID NO：113)和ATTRMSCI(5’-ATGGCC ACG CTC AAG TTA GTA TAA AAA AGC TGA AC-3’)(SEQ IDNO：114)，从噬菌体DNA扩增噬菌体λattR序列。用BglII和MscI消化attR PCR产物，并且将其插入到BglII/MscI消化的pNOV2790中，以形成pQD341C7。然后，通过BamHI消化，从pQD341C7切除整个PMI基因，并且将其插入BamHI消化的pNOV041中，以置换它的PMI基因，形成pQD344A1。pNOV041是含有ZmUbi-PMIintron-Tnos表达盒的双元载体。用KpnI和NotI消化pQD342B以释放含有RS-AttL-CMPS启动子-GUSintron-Act2终止子盒的片段。用NotI和AscI消化pQD344A以切除含有ZmUbi-PMIIntron-NOS终止子盒的片段。将上述两个片段与KpnI/AscI消化的基础双元载体pNOV2114连接以形成pQD346A，其含有相同方向的attL和attR位点(图7)。
实施例49：从含有attB和attP或attL和attR重组位点的双元载体产生转基因玉米
分别将双元载体pQD203A11和pQD346A电穿孔到农杆菌属(Agrobacterium)株系LAB4404(pSB1)中。然后，利用甘露糖筛选，农杆菌属(Agrobacterium)株系的各培养物用于与未成熟玉米胚共培养(如Negrotto等.(2000)Plant Cell Rep 19：798-803中所述)。转基因玉米植物直接与整合酶表达株系杂交，或者自体授粉，以产生种子，其用于产生另外的植物材料以与其它植物杂交。
实施例50：用于整合酶，整合酶突变体和整合宿主因子表达的双元载体的构建
通过HindIII消化，从VSIntHF(实施例26E.3中所述)切除含有Int和IHF表达盒的(HindIII)平端/AscI片段(4122bp)，用Klenow处理补平，用HindIII再一次切割，并且与pWC057的(BamHI)平端/AscI片段(9541bps)连接，以形成pQD208B12。pWC057是含有ZmUbi启动子-AtPPO(dm)-T35S表达盒的双元载体(参见美国专利号6,282,837，其名称为：“控制具有改变的原卟啉原氧化酶活性的除草剂耐受性植物或植物种子不期望营养体生长的方法”)。pQD208B12是含有CMPS启动子-Int-Tnos，CMPS启动子-IHFα-Tnos，和CMPS启动子-IHFβ-Tnos表达盒及ZmUbi启动子-AtPPOdm-T35S选择性标记盒的双元转化载体。通过HindIII消化，从VSInt-h/218HF(实施例26G.3中所述)移除含有Int-h/218和IHF表达盒的(HindIII)平端/AscI片段(4122bp)，用Klenow处理补平，用HindIII再次切割，并且与pWC057的(BamHI)平端/AscI片段(9541bps)连接，以形成pQD209B16。pQD209B16是含有CMPS启动子-IntH218-Tnos，CMPS启动子-IHFα-Tnos，和CMPS启动子-IHFβ-Tnos表达盒及ZmUbi启动子-AtPPOdm-T35S选择性标记盒的双元转化载体。
实施例51：用于整合酶，整合酶突变体，整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)表达的双元载体的构建
用SpeI切割质粒载体pAdF62A(如实施例8中所述)，用Klenow补平，然后用AscI再次切割以分离含有CMPS-Xis-Tnos表达盒的SpeI(平端)/AscI片段。将该片段插入到AscI/SwaI消化的pQD208B12中以形成pQD350A或者插入到pQD209B16中以形成pQD351A。
实施例52：表达IntIHFs和IntH/218IHFs的转基因玉米株系的产生
分别将双元载体pQD208B12，pQD209B16，pQD349A和pQD350A每个转化到农杆菌属(Agrobacterium)株系LAB4404(pSB1)中。然后，农杆菌属(Agrobacterium)株系的各培养物用于与未成熟玉米胚共培养。将共培养的胚置放在含有氟丙嘧草酯(CGA 854,276)的筛选培养基上以产生转基因植物。转基因植物直接与靶植物杂交或者它们自体授粉以产生种子，该种子用于产生与其它植物杂交的另外植物材料。含有来源于pQD208B12或pQD209B16的T-DNA区的转基因株系形态学正常，并且具有优良的种子形成。
实施例53：带有attB和attP或attL和attR侧翼的染色体内核苷酸序列的切除
attB和attP或attL和attR位点之间的重组可以用于切除这些位点之间的序列(图6和7)。通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化获得表达合成的整合酶，或它的突变体Iht-h/218，及整合宿主因子和切除因子(Xis)的转基因玉米株系。整合酶表达株系与期望的底物株系杂交以缺失attB/attP或attL/attR位点之间的序列。通过PCR筛选后代的缺失。具有缺失的株系与非转基因亲本系回交以产生种子。然后发芽这些种子，通过PCR筛选幼苗以回收具有期望缺失但是没有整合酶基因座的株系。
IV.水稻中利用L/R反应的定向整合
A.靶序列的构建
实施例54：具有单一attL位点和原卟啉原氧化酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过将LPsgAttP(图4)的attP位点转化为attL位点，构建含有单一attL位点的单子叶植物靶序列。用Asp718I和AvrII消化LPsgAttP，其移除了attP位点和一段AT BAF60内含子以形成载体。利用寡核苷酸对：5’-GGA GAT CTT GAA GCC TGC TTT TTT ATACT-3’(SEQ ID NO：115)和5’-CCC CTA GGA AAT CAA ATA ATGATT TTA TTT TG-3’(SEQ ID NO：116)和以CMPSGUSAttPrev做为模板，及利用TOPO TA克隆试剂盒通过PCR克隆attL位点。由此得到的TOPO克隆含有attL位点，命名为TOPOBAttLAv，并且用BglII和AvrII消化该克隆以形成3方连接的片段之一。利用寡核苷酸对5’-GGT ACC AAG CTG CGA ATC TTC GTT TTT-3’(SEQ ID NO：117)和5’-GGC CAT AGA AAG ATC TGG AAT TTA CAA-3’(SEQ IDNO：118)，和以CMPSGUSAttPrev做为模板，通过PCR克隆从该载体移除的一段AT BAF60内含子。用Asp718I和BglII消化由此得到的TOPO克隆以形成另一片段。将两个片段和载体连接到一起以形成具有单一attL位点的靶序列(LPsgAttL)。
实施例55：具有单一attR位点和原卟啉原氧化酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过将LPsgAttP的attP位点转化为attR位点，构建含有单一attR位点的单子叶植物靶序列。用Asp718I和AvrII消化LPsgAttP(图4)，其移除了attP位点和一段AT BAF60内含子以形成载体。利用寡核苷酸对5’-AGA TCT GTT ACA GGT CAC TAA TAC-3’(SEQ ID NO：119)和5’-CCT AGG CGC TCA AGT TAG TAT AAA AAA GCT GAACG-3’(SEQ ID NO：120)和以CMPSGUSAttPrev做为模板，及利用TOPO TA克隆试剂盒，通过PCR克隆attR位点。由此得到的TOPO克隆含有attR位点，命名为TOPOBAttRAv，并且用BglII和AvrII消化克隆以形成3方连接的片段之一。如实施例54中所述，通过PCR克隆一段AT BAF60内含子，并且用Asp718I和BglII消化由此得到的TOPO克隆以形成另一片段。将两个片段和载体连接在一起以形成单一attR的靶序列(LPsgAttR)。
实施例56：具有反向attL位点和原卟啉原氧化酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过将LPdbAttP的attP位点转化为attL位点，构建含有反向attL位点的单子叶植物靶序列。首先，将CMPSGUSAttPrev的HindIII/SpeI片段亚克隆到pBluescript KS+中，并且通过用NheI和BglII消化移除attP位点。利用寡核苷酸对：5’-CCG CTA GCT GAA GCC TGC TTTTTT ATA C-3’(SEQ ID NO：121)和5’-GGA GAT CTG AAA TCAAAT AAT GAT TTT ATT-3’(SEQ ID NO：122)和以CMPSGUSAttPrev做为模板，通过PCR克隆attL位点。由此得到的TOPO克隆含有attL位点，命名为TOPONAttRBg，并且将其做为NheI/BglII片段连接，置换亚克隆的attP位点，并且形成5’GUSAttLrev。通过用XbaI和AvrII消化移除PPO.PMIAttP.Spe的attP位点。利用寡核苷酸对：5’-GGT CTA GAT GAA GCC TGC TTT TTT ATACT-3’(SEQ ID NO：123)和SEQ ID NO：116，通过PCR，从CMPSGUSAttPrev克隆attL位点。由此得到的TOPO克隆含有attL位点，命名为TOPOXAttLAv，并且将其做为XbaI/AvrII片段连接，置换PPO.PMIAttP.Spe的attP位点，形成PPOPMIAttLf.Spe。用NheI/SpeI消化5’GUSAttLrev，并且将由此得到的片段连接到PPOPMIAttLf.Spe的SpeI位点中，形成双attL的靶序列(LPdbAttL)。
实施例57：具有反向attR位点和原卟啉原氧化酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过将LPdbAttP的attP位点转化为attR位点，构建含有反向attR位点的单子叶植物靶序列。首先，将CMPSGUSAttPrev的HindIII/SpeI片段亚克隆到pBluescript KS+中，并且通过用NheI和BglII消化移除attP位点。利用寡核苷酸对：5’-GCT AGC TCT GTT ACA GGT CACTAA TAC-3’(SEQ ID NO：124)和5’-AGA TCT CGC TCA AGT TAGTAT AAA AAA GCT GAA CG-3’(SEQ ID NO：125)和以CMPSGUSAttPrev做为模板，通过PCR克隆attR位点。由此得到的TOPO克隆含有attR位点，命名为TOPOXAttRBg，并且将其做为NheI/BglII片段连接，置换亚克隆的attP位点并且形成5’GUSAttRrev。通过XbaI和AvrII消化移除PPO.PMIAttP.Spe的attP位点。利用寡核苷酸对：5’-TCT AGA TCT GTT ACA GGT CAC TAA TAC-3’(SEQID NO：126)和SEQ ID NO：120，通过PCR从CMPSGUSAttPrev克隆attR位点。由此得到的TOPO克隆含有attR位点，命名为TOPOXAttRAv，并且做为XbaI/AvrII片段连接，置换PPO.PMIAttP.Spe的attP位点，形成PPOPMIAttRfwd。用NheI/SpeI消化5’GUSAttRrev，并且将由此得到的片段连接到PPOPMIAttRfwd的SpeI位点中，形成具有两个attR位点的靶序列(LPdbAttR)。
实施例58：具有单一attL位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过用潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)和35S终止子置换LPsgAttL的原卟啉原氧化酶(PPO)基因和35S终止子，构建含有单一attL位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的单子叶植物靶序列。用NcoI消化LPsgAttL，随后用绿豆内切核酸酶处理，然后用HindIII进一步消化以形成载体。pAdF55含有水稻肌动蛋白1启动子(如实施例20中所述)，潮霉素磷酸转移酶基因和35S终止子(如实施例20中所述)。利用寡核苷酸对：5’-CGA GCT CAG CTG ATG AAA AAG CCT GAA CTC-3’(SEQ ID NO：127)和5’-TGC AGC AAG CTT CAC TGG ATT TTGGTT TTA-3’(SEQ ID NO：128)，从pAdF55克隆做为PCR片段的潮霉素磷酸转移酶基因和35S终止子。用PvuII/HindIII消化该PCR片段，并且连接到载体中形成LPsgAttL.HYG。
实施例59：具有单一attR位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过用潮霉素磷酸转移酶基因和35S终止子置换LPsgAttR的原卟啉原氧化酶(PPO)基因和35S终止子，构建含有单一attR位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的单子叶植物靶序列。用NcoI消化LPsgAttR，随后用Mung Bean内切核酸酶处理，然后用HindIII进一步消化以形成载体。如实施例58中所述PCR克隆潮霉素磷酸转移酶基因和35S终止子。用PvuII/HindIII消化该PCR片段，并且连接到载体中形成LPsgAttR.HYG。
实施例60：具有反向attR位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的单子叶植物靶序列
通过用潮霉素磷酸转移酶基因和35S终止子置换LPdbAttR的原卟啉原氧化酶(PPO)基因和35S终止子，构建含有反向attR位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的单子叶植物靶序列。用NcoI消化LPdbAttR，随后用Mung Bean内切核酸酶处理，然后用碱性磷酸酶进一步处理以形成载体。利用寡核苷酸对SEQ ID NO：127和5’-TGC AGC TCT AGACAC TGG ATT TTG GTT TTA-3’(SEQ ID NO：129)，从pAdF55克隆做为PCR片段的潮霉素磷酸转移酶基因和35S终止子。用PvuII/XbaI消化该PCR片段，然后进行Klenow补平反应，最后连接到载体中，形成LPdbAttR.HYG。
实施例61：具有反向attL位点和潮霉素磷酸转移酶表达盒的LPdbAttL.HYG，单子叶植物靶序列的构建
通过将LPdbAttR.HYG的2940bp XbaI-BbsI片段连接到构建体LPdbAttL的8285bp XbaI-BbsI载体中构建LPdbAttL.HYG(图8)。
B.水稻靶细胞系的产生
实施例62：水稻的农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化以引入靶序列构建体
分别将双元载体LPsgAttL，LPsgAttR，LPdbAttL，LPdbAttR，LPsgAttL.HYG，LPsgAttR.HYG，LPdbAttL.HYG(图8)和LPdbAttR.HYG每个转化到农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404中。然后，农杆菌属(Agrobacterium)株系的每个培养物用于共培养，如下文所述，以产生各自的靶系。水稻(Oryza sativa var.javonica)栽培品种“Kaybonnet”用于产生靶系。也可以使用其它水稻栽培品种(Hiei等.(1994)Plant Journal 6：271-282；Dong等，(1996)Molecular Breeding 2：267-276；Hiei等.(1997)Plant Molecular Biology 35：205-218)。并且，下述各种培养基组分可以被置换。
通过在MSB培养基(MS基本盐，4.3g/l；B5维生素(200x)，5ml/l；蔗糖，30g/l；脯氨酸，500mg/l；谷氨酰胺，500mg/l；酪蛋白水解物，300mg/l；2，4-D(1mg/ml)，2ml/l；用1N KOH将pH调整到5.8；Phytagel，3g/l)上培养，从成熟胚建立胚发生培养物。用含有期望靶序列构建体的农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404接种和共培养已建立的培养系。在28℃，在固体YP培养基(100mg/L壮观霉素)中培养农杆菌3天。在液体MSB培养基中重悬浮农杆菌。将农杆菌培养物稀释到0.2-0.3OD600，并且加入乙酰丁香酮，使其最终浓度达到200μM。在混合溶液和水稻培养物之前，用乙酰丁香酮诱导农杆菌至少30分钟。为了接种，将培养物浸入到细菌悬浮液中30分钟。用真空抽吸器除去液体悬浮液，并且将接种的培养物置放在共培养培养基MSB-As(具有200μM乙酰丁香酮的MSB)上的Whatman纸滤纸上，在22℃温育两天。然后，将培养物转移到具有替门汀(timentin)(400mg/l)的MSB培养基以抑制农杆菌的生长。
利用protox抑制除草剂(例如，氟丙嘧草酯)(美国专利号：6,282,837)筛选含有LPsgAttL，LPsgAttR，LPdbAttL或LPdbAttR的转化细胞。14天后，将培养物转移到含有氟丙嘧草酯的筛选培养基(即，具有1000nM氟丙嘧草酯，200mg/l替门汀的MS诱导培养基)，并且在黑暗中培养28天。然后，将抗性菌落转移到再生诱导培养基(没有2，4-D，具有0.5mg/l IAA，1mg/l玉米素，200mg/l替门汀和3％山梨醇的MS)，并且移到光生长室中。将再生的芽转移到含有氟丙嘧草酯的生根培养基(没有激素和含有2％山梨醇的MS)3周，然后送到温室种植在土壤中。
除了在整合转化过程使用潮霉素(50mg/L)做为筛选试剂外，对含有LPsgAttL.HYG，LPsgAttR.HYG，LPdbAttL.HYG(图8)或LPdbAttR.HYG的转化细胞进行相似的筛选过程，并且共培养后立即将培养物转移到筛选培养基。
通过Taqman鉴定带有单拷贝靶序列插入的转基因事件，并且将其移植到土壤中，在温室中生长到成熟。
C.供体序列的构建
实施例63：具有单一attL位点或单一attR位点的单子叶植物供体
通过3方连接，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)肌动蛋白-2 3’非翻译区做为终止子添加到CMPSGUSAttPrev的GUS基因3’部分。通过用EcoRI和XbaI消化pUC18形成载体。用MfeI和XhoI消化CMPSGUSAttPrev以产生含有部分GUS的片段，并且用XbaI和XhoI消化pNOV2713以产生含有拟南芥(Arabidopsis thaliana)肌动蛋白-2 3’非翻译区的片段。这些元件之间的3方连接形成了3’GUSAttPrTact。利用两个克隆步骤，用attL或attR位点置换MUPMIAttP2的attP2位点。
在第一步中，用SbfI和PshAI消化MUPMIAttP2产生载体，保存该载体用于将来使用。通过该消化产生的片段含有attP2位点，并且将其亚克隆到通过用SbfI和PshAI消化3’GUSAttPrTact形成的载体中，产生PMIAttP2i。利用LPsgAttL做为模板，和利用产生attL的寡核苷酸对：5’-GGC TGA GGT ACC TGA AGC CTG CTT TTT TAT-3’(SEQID NO：130)和5’-CGT AGC CCT AGG GAA ATC AAA TAA TGATTT-3’(SEQ ID NO：131)，及利用LPsgAttR做为模板和利用产生attR的寡核苷酸对：5’-GGC TGA GGT ACC TCT GTT ACA GGT CACTAA-3’(SEQ ID NO：132)和5’-CGT AGC CCT AGG CGC TCAAGT TAG TAT AAA-3’(SEQ ID NO：133)，做为PCR片段形成用于置换PMIAttP2i attP2位点的attL或attR位点。
在第二步中，用AvrII和Kpn消化PMIAttP2i。通过用AvrII和Kpn消化的attL或attR PCR片段置换切除的attP位点，分别形成PMIAttLi和PMIAttRi。用SbfI和PshAI消化这两个构建体。将由此得到的含有attL或attR的片段分别连接到上述保存的载体中，分别形成MUPMIAttL和MUPMIAttR。用SphI和HindIII消化双元载体pNOV2114，然后，在3方连接中使用其与3’GUSAttPrTact的NheI/SphI消化和MUPMIAttL或MUPMIAttR的AvrII/HindIII消化形成的片段，以分别形成DONsgAttL或DONsgAttR。
实施例64：具有反向attL位点或反向attR位点的单子叶植物供体
用KpnI和SacI消化单子叶植物供体序列DONdbAttP以移除attP位点。利用LPsgAttL做为模板，利用产生attL的寡核苷酸对：5’-GGCTGA GGT ACC TGA AGC CTG CTT TTT TAT-3’(SEQ ID NO：134)和5’-CGT AGC GAG CTC GAA ATC AAA TAA TGA TTT-3’(SEQ IDNO：135)，及利用LPsgAttR做为模板，利用产生attR的寡核苷酸对：5’-GGC TGA GGT ACC TCT GTT ACA GGT CAC TAA-3’(SEQ IDNO：136)和5’-CGT AGC GAG CTC CGC TCA AGT TAG TATAAA-3’(SEQ ID NO：137)，做为PCR片段形成用于置换attP位点的attL或attR位点。用KpnI和SacI消化的attL或attR PCR片段置换DONdbAttP的切除的attP位点，分别形成DONAttLi和DONAttRi。
利用BglII和SphI消化切除含有DONdbAttP attP位点的部分GUS基因。将该GUSAttP片段亚克隆到pNOV2790AttB中，并用BglII和SphI消化以移除它的attP位点，形成GUSAttPi。通过用NheI和BglII消化移除和用TOPONAttLBg的attL位点或TOPONAttRBg的attR位点置换GUSAttPi的attP位点，分别形成GUSAttLi和GUSAttRi，其中用NheI和BglII消化所述TOPONAttLBg和TOPONAttRBg。用BglII/SacI消化双元载体DONdbAttP，并且在3方连接中，使用其与GUSAttLi的BglII/SphI消化和DONAttLi的SacI/SphI消化形成的片段，以形成DONdbAttL。
同样地，用BglII和SacI消化双元载体DONdbAttP，并且在3方连接中使用其与GUSAttri的BglII/SphI消化和DONAttRi的SacI/SphI消化形成的片段，以形成DONdbAttR(图9)。
D.供体序列向到水稻靶细胞系中的定向整合
实施例65：利用生物弹击法将供体序列定向整合到水稻靶系中
自体授粉初级靶系以获得种子。来源于这些株系自交后代的种子用于建立用于打靶试验的胚发生培养物和悬浮液培养物。来源于幼种子的未成熟胚或来源干燥种子的成熟胚用于建立胚发生培养物(Hiei等.(1994)Plant Journal 6：271-282；Dong等.(1996)Molecular Breeding 2：267-276；Hiei等.(1997)Plant Molecular Biology 35：205-218)。如Chen等.(1998)Plant Cell Reports 18：25-31所述，利用2％甘露糖做为筛选试剂，这些培养物或悬浮细胞培养物用于利用生物弹击法递送的打靶试验。
用于每个处理的质粒联合包含适合的供体DNA(其与靶序列中识别位点相容)，有或没有整合宿主因子共表达的λ整合酶表达盒和切除酶。
轰击的供体序列和靶序列的λ整合酶介导的重组产生了完整的β-葡糖醛酸酶(GUS)表达盒。利用实施例44D中所述的GUS组织化学测定法，测定一小批打靶愈伤组织的定向整合。
轰击的供体序列和靶序列的λ整合酶介导的重组也产生了完整的磷酸甘露糖异构酶(PMI)表达盒，其允许把靶事件的筛选和回收。将不用于GUS测定的愈伤组织放置在甘露糖筛选培养基上，并且将在甘露糖上生长的愈伤组织继代培养到新鲜培养基上，并且形成大量愈伤组织用于再生。
然后，利用PCR测定分析这些愈伤组织。引物对中一个引物与靶序列同源，引物对中另一个引物对与供体序列同源，因此，只有供体已经进行了与靶序列的λ整合酶介导的重组，才可形成可预测大小的PCR产物。进行PCR产物测序以证明重组位点中预期att位点的存在。通过PCR证实含有定向整合事件的这些植物被送到温室。对PCR阳性候选者进行Southern分析以进一步证实定向整合事件的分子结构。
实施例66：利用农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，供体序列定向整合到水稻靶系中
自体授粉初级靶系以获得种子。来源于这些株系自交后代的种子用于建立用于打靶试验的胚发生培养物和悬浮液培养物。来源于幼种子的未成熟胚或来源干燥种子的成熟胚用于建立胚发生培养物(Hiei等.(1994)Plant Journal 6：271-282；Dong等.(1996)Molecular Breeding 2：267-276；Hiei等.(1997)Plant Molecular Biology 35：205-218)。然后，这些培养物或悬浮细胞群簇用于农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化。
分别将带有供体构建体或(有或没有整合宿主因子的)λ整合酶(野生型或Int-h或Int-h/218)表达盒和切除酶的双元载体转化到农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404中。
为了打靶，每个稻靶细胞系与3种LBA4404农杆菌属(Agrobacterium)株系共培养，一种含有相容的供体序列，一种含有(有或没有IHF的)整合酶，一种含有切除酶。做为可替代的方案，可以用含有(有或没有IHF的)整合酶的表达盒及含有切除酶的表达盒转化一种农杆菌属(Agrobacterium)株系。当使用单一农杆菌属(Agrobacterium)株系时，两种表达盒可以位于两个不同T-DNAs或单一T-DNA上。如实施例62中所述进行共培养，并且利用2％甘露糖做为筛选试剂筛选打靶事件。
如前面实施例所述进行甘露糖抗性事件的分子分析(PCR和基因组Southern)。
V.烟草细胞中λ整合酶活性的证明
A.用于烟草细胞中重组测定的构建体
实施例67：烟草细胞中T-DNA测试底物上λ整合酶，Int-h和Int-h/218介导的attB和attP之间的分子内重组
实施例67A：CMLucB/P，双元载体分子内重组测试底物的构建
用BamHI消化vAttB/P，并且纯化具有Luc基因5’部分的1783bp片段。用SpeI消化含有CMPS启动子的pNOV4211，并且通过与寡核苷酸5’-CTA GGA GAT CTC-3’(SEQ ID NO：138)连接，将位点转化为BglII位点，以形成4211Bg。在碱性磷酸酶存在的情况下，用BglII消化质粒4211Bg，并且纯化该载体，并且和上述1783bp BamHI片段连接，以形成CM5’LucIntAttB。用Asp718I和NotI消化该质粒，并且纯化1923bp的片段。用BglII/Asp718I消化vAttB/P，并且纯化含有AttPInt3’LucNos的1025bp片段。用NotI/BamHI消化病毒载体pWI-11M，并将其与以前的两个片段连接以产生vCMLucB/P。
通过用NheI和BglII消化vCMLucB/P，将CMLucB/P引入到双元载体中用于农杆菌递送。分离2955bp片段，并且将其连接到用XbaI和BamHI消化的双元载体pNOV2122中以形成RKLucB/P。通过电穿孔，将该质粒转化到感受态的农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404中，筛选卡那霉素抗性。通过从转化体小量制备DNA的分析证实了RKLucB/P质粒的存在。
实施例67B：分子内B/P重组测试底物阳性对照，RKLucAttL的构建
用SphI和Asp718I消化pAttL阳性对照质粒，并且纯化做为1641bp的片段的LucIntAttL基因3’末端。将其连接到已经用Asp718I和SphI消化的pNOV2122载体中。在碱性磷酸酶存在的情况下，接着用SphI消化由此得到的质粒，并且将含有CMPS启动子和萤光素酶基因5’-末端的RK2LucB/P的1298bp SphI消化片段连接到该载体中。由此得到的质粒命名为RKLucAttL。通过电穿孔将该质粒转化到感受态的农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404中，筛选卡那霉素抗性。通过从转化体小量制备DNA的分析证实RKLucAttL质粒的存在。
实施例68：pBS.CMPSLucL/R，分子内L/R重组测试底物的构建
如下所述，在3方连接中构建质粒pBS.CMPSLucL/R。首先，用BamHI和XbaI消化2952bp pBluescript II KS(-)载体；其次，用XhoI消化构建体CMPSVLucInAttL，用Klenow补平，然后用SpeI切割以释放带有CMPS启动子的1987bp片段，该启动子剪接到位于attL位点之前的萤光素酶基因5’末端，该attL位点(相对于萤光素酶开放可读框)正向插入内含子中；第三，用Asp718消化构建体AttR3’LucNos-A，用Klenow补平，然后用BglII切割以释放962bp的片段，该片段带有位于attR位点之前的萤光素酶基因3’末端，并且后面跟着3’nos终止子，该attR位点以相对于萤光素酶开放可读框正向方向位于内含子中。将上述3个DNA片段连接在一起以形成分子内L/R重组测试底物pBS.CMPSLucL/R，其中CMPS启动子剪接到萤光素酶基因5’末端，后面是反向的萤光素酶基因3’末端，并且侧翼是attR位点(在5’一侧上)和attL位点(在3’一侧上)。AttR和attL位点反向。并且一旦λ整合酶介导了L/R重组，萤光素酶3’末端就反向，结果就重建全长的萤光素酶开放可读框。检测到的萤光素酶量是λ整合酶介导的L/R重组量的量度。
B.利用农杆菌的烟草细胞中重组试验
1.分子内重组测试底物
设计用在这个研究中的双元载体检测底物以证明Int的功能性表达。分子内attB/attP测试底物含有萤光素酶表达盒5’部分(5’Luc-5’Intron-attB)和萤光素酶表达盒3’部分(attP-3’-Intron-3’Luc)，其中3’部分相对于5’部分反向，attB和attP位点为反向定向。Int复合物介导的attB和attP位点之间的分子内重组引起了萤光素酶表达盒3’部分的倒位，产生了完整表达盒和萤光素酶活性。
2.与农杆菌共培养
转移到新鲜BY2培养基后2-3天，使用BY2烟草悬浮液细胞(Narasimhulu等，The Plant Cell，8卷：873-886(1996))。在25℃，在具有适合抗生素的YP培养基(实施例25)中过夜培养该试验中使用的农杆菌属(Agrobacterium)株系。离心细菌，并且在BY2培养基中重悬浮，将它们的浓度调整到OD660＝0.5。对于每个共培养，用各种体积(通常15到60ml)说明的农杆菌属(Agrobacterium)株系接种无菌25×90mm培养皿中的3ml新鲜BY2培养基，并且彻底地混合。向细菌悬浮液中添加3ml BY2悬浮液，并且用力涡旋混合物以混合细菌和植物细胞。在25℃，在黑暗中温育共培养物2天，之后，用含有800mg/l替卡西林的3ml BY2培养基冲洗悬浮液，使其从培养皿进入到无菌的125ml三角瓶中。在25℃，在黑暗中，在旋转振荡器上培养悬浮液大约一周。
3.萤光素酶测定
为了进行萤光素酶测定，以大约2天的间隔移出植物细胞(1ml)，通过离心收集，利用手提式电池供电的匀浆器，用金刚砂研磨，离心(10′，10,000G)，并且通过Promega的萤光素酶测定系统，测定澄清上清液的萤光素酶活性。通过BioRad蛋白质测定试剂测定蛋白质浓度，并且利用该结果计算萤光素酶比活性，如下面表6，7和8中所记录。
4.分子内重组研究
在下面的研究中，含有分子内测试底物RKLucB/P(在下面表6，7和8中缩写为B/P)的农杆菌属(Agrobacterium)宿主株系LBA4404单独或者联合含有整合酶双元载体RKInt，RKInt-h，RKInt-h/218，RKIntHF，RKInt-hHF或RKInt-h/218HF(在下面表6，7和8中分别缩写为Int，Int-h，Int-h/218，IntHF，Int-hHF和Int-h/218HF)(如实施例26中所述)之一的农杆菌属(Agrobacterium)宿主株系LBA4404与BY2烟草细胞共培养。λ整合酶，Int-h或Int-h/218介导的分子内重组产生了萤光素酶表达。含有双元载体RKLucAttL(在下面表6，7和8中缩写缩写为LucAttL)的农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404株系与BY2细胞共培养，做为阳性对照。株系缩写后面的“#1”或“#2”表示对于该试验部分使用了两种农杆菌属(Agrobacterium)转化体菌落中的哪种农杆菌属(Agrobacterium)转化体菌落。在添加抗生素后第2、4天等进行萤光素酶活性测定。萤光素酶表达是Int介导的重组活性的量度。
表6
| 试验1 | ||||
| 添加的农杆菌株系(上面解释的缩写) | 萤光素酶活性(光单位/mg蛋白质) | |||
| 第2天 | 第4天 | 第6天 | 第8天 | |
| 无B/P#1B/P#2B/P#1+[IntHF]#1B/P#1+[IntHF]#2B/P#1+[Int-hHF]#1B/P#1+[Int-hHF]#2B/P#1+[Int-h/218HF]#1B/P#1+[Int-h/218HF]#2B/P#2+[IntHF]#1B/P#2+[Int-hHF]#1B/P#2+[Int-h/218HF]#1 | 0.7882.175.240.66.817073.29.533160.161.1424 | 0.961637.818552.3859189821881646.3140192 | 11.145214380.4193489137895966759423418327582 | 5.913135.510829876635012404668447763722 |
| LucAttL#1(120λ)LucAttL#2(120λ)LucAttL#1(240λ)LucAttL#2(240λ) | 226708593027500464 | 52650275601630005821 | 13860018413968005244 | 22300021210014560073400 |
表7
| 试验2 | ||
| 添加的农杆菌株系(上面解释的缩写) | 萤光素酶活性(光单位/mg蛋白质) | |
| 第2天 | 第5天 | |
| 无B/P#1(60λ)B/P#1(120λ)B/P#1(60λ)+[Int-h/218HF]#2(60λ)B/P#1(60λ)++[Int-h/218HF]#2(120λ)B/P#1(60λ)++[Int-h/218HF]#2(240λ)B/P#1(120λ)++[Int-h/218HF]#2(120λ)B/P#1(240λ)++[Int-h/218HF]#2(240λ) | 2.620251.211548893173607961410 | 4.212642110260116101436094905670 |
| LucAttL#1(60λ)LucAttL#1(120λ)LucAttL#1(240λ)LucAttL#1(480λ) | 212801029011901960 | 498600112100136400100000 |
表8
| 试验3 | |||
| 添加的农杆菌株系 | 萤光素酶活性(光单位/mg蛋白质) | ||
| 第2天 | 第4天 | 第7天 | |
| B/P#1(60λ)B/P#1(60λ)++[IntHF]#2(120λ)B/P#1(60λ)++[Int-hHF]#2(120λ)B/P#1(60λ)++[Int-h/218HF]#2(120λ)B/P#1(60λ)++Int#1(120λ)B/p#1(60λ)++Int-h#1(120λ)B/P#1(60λ)++Int-h/218#1(120λ)B/P#1(60λ)++Int-h/218#2(120λ) | 11467.7120664084.494.4310230 | 9521648720017200526134036302320 | 18327211001950163511634850 |
| LucAttL#1(30λ)LucAttL#1(60λ)LucAttL#1(90λ)LucAttL#1(120λ) | 568002590016400037700 | 33800429000475000234000 | 187000117000193000185000 |
上述表6，7和8中所示的结果表明被IHF基因增强的整合酶基因和其突变体的农杆菌递送产生了活性整合酶，该活性整合酶成功地介导了通过农杆菌递送到细胞中的LucB/P底物上attB和attP位点之间的重组。
C.利用微粒轰击的烟草细胞中重组试验
实施例69：利用生物弹击法，烟草细胞中分子内L/R重组的测试
pBS.CMPSLucL/R测试底物用于证明3种玉米优化整合酶(野生型整合酶，Int-h和Int-h/218突变体)联合IHF和Xis的功能性表达。PBS.CMPSLucL/R含有萤光素酶表达盒5’部分(5’Luc-5’Intron-attL)和萤光素酶表达盒3’部分(attR-3’Intron-3’Luc)，其中3’部分相对于5’部分反向，并且attL和attR位点反向。Int复合物所介导的attL和attR位点之间的分子内重组引起了萤光素酶表达盒3’部分的倒位，产生了完整盒子和萤光素酶活性。
在28℃，在黑暗中，在旋转振荡器上，以100-150rpm，在BY2液体培养基中培养野生型BY2悬浮细胞[每升：4.31g MS盐，370mgKH2PO4，1mg硫胺素，0.2mg 2，4-D，30g蔗糖，pH 5.7]。利用1∶50的稀释度，每周将它们继代培养到新鲜的BY2培养基中。为了进行瞬时表达测定，培养1∶5到1∶10稀释度的1周龄培养物2天。在轰击的当天，用移液管将2到5ml细胞移取到无菌磁过滤漏斗仪器(VWR cat#28143-550)平台上的薄膜滤器(Millipore cat.#GVWP04700)上，并且利用真空轻轻地移走液体培养基。将带有细胞的膜放置在具有12％蔗糖和0.8％phytager的渗压剂BY2培养基上。在轰击前，黑暗中温育细胞3-5小时。
对于粒子轰击，利用标准CaCl2-亚精胺化学，在＜1μm金颗粒上(Crescent Chem.Co.，Inc.，NY)共沉淀质粒DNAs。利用DuPont HeliumGun和1100psi破裂膜片(Biorad)，轰击每个靶2次。
首先，以0.666μg/射击的浓度，将分子内质粒重组测试底物pBS.CMPSLucL/R单独轰击到BY2细胞中以建立在整合酶，IHF或切除酶不存在的情况下的萤光素酶瞬时表达的背景水平。然后，共轰击该底物与每个整合酶和IHF构建体(0.166μg/射击)和切除酶构建体pAdF61(0.166μg/射击)。对于每个DNA混合物，轰击一式两份靶平板。轰击后，在28℃，在黑暗中温育平板2天，然后制备粗提取物，并且如上文I.A.4部分中所述测定萤光素酶活性。萤光素酶表达是Int介导的重组活性的量度值。下面表9中示出了该两份平板的平均相对光单位(RLU)
表9
| 共轰击的质粒 | 平均RLU | 增加的倍数 |
| pBS.CMPSLucL/R | 7,944 | |
| pBS.CMPSLucL/RpBSIntHFpAdF61 | 36,250 | 4.6 |
| pBS.CMPSLucL/RpBSInt-hHFpAdF61 | 24,249 | 3 |
| pBS.CMPSLucL/RpBSInt-h/218HFpAdF61 | 46,496 | 5.9 |
表9中的数据表明当3种整合酶中每种整合酶与IHF和Xis联合时，其介导了烟草BY2细胞中分子内L/R重组。
D.烟草细胞中染色体内重组
实施例70：Int介导的整合到烟草染色体DNA中的attB和attP位点之间的分子内重组
实施例70A：VSUbq3IntHyg，双子叶植物选择性标记的构建
用BamHI消化pCIB7613，其含有与玉米泛素启动子连接的潮霉素磷酸转移酶基因，并且作为1032bp片段切除HygR基因，将其纯化。用BamHI消化含有拟南芥(Arabidopsis)泛素-3启动子/内含子和nos终止子的表达载体pPEH30并且碱性磷酸酶处理。将该载体与HygR基因连接在一起，通过用SacII和XbaI消化鉴定在正确方向插入的克隆。产物质粒Ubq3IntHyg做为潮霉素抗性的双子叶植物可表达形式。
通过用XbaI消化pNOV2114和用碱性磷酸酶处理它，将Ubq3IntHyg插入到双元载体中。用XbaI消化质粒Ubq3IntHyg，其中用寡核苷酸：5’-GTA CGA ATT C-3’(SEQ ID NO：139)已经将该质粒的Asp718I位点转化为EcoRI位点，分离和纯化3089bp的Ubq3IntHyg表达盒。Ubq3IntHyg和pNOV2114的连接产生了具有两个方向插入片段的产物。选定具有位于T-DNA右边界附近的基因5’-末端的产物用于植物转化试验，并且命名为VSUbq3IntHyg。
实施例70B.分子内B/P重组测试底物和双子叶植物选择性标记共转化到农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404中
通过电穿孔，将1∶1的VSUbq3IntHyg和RKLucB/P(每种大约50ng)混合物转化到50ml感受态农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404中，3个小时的恢复期后，在用50mg/l卡那霉素和100mg/l壮观霉素补充的YP琼脂上涂平板该细菌以筛选两种双元载体的获得物。2-3天后出现了转化体，挑取一个转化体，并且通过在选择性琼脂上单菌落分离纯化该转化体。该株系命名为LBA4404(VSUbq3Int-Hyg)(RKLucB/P)。
实施例70C：测试底物稳定整合到烟草染色体DNA中
1.共培养和筛选
通过基本如上文V.B.2部分中所述相同的方法，用农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404(VSUbq3Int-Hyg)(RKLucB/P)接种在新鲜培养基中稀释10倍后2天的株系BY2的烟草悬浮液细胞。为了进行每个共培养，用移液管移取3ml新鲜BY2植物细胞培养基到深培养皿中，并且添加60μl重悬浮细菌，并且很好地混合。添加BY2悬浮液细胞(6ml)，并且涡旋培养皿以完全混合植物细胞和细菌。相似地制备未接种的BY2细胞对照。在25℃在黑暗中温育3天后，漂洗植物细胞到无菌过滤装置(white SCWP，47MM)中，该装置装配有8微米孔大小的过滤器，并且用15ml含有替卡西林(200mg/l)的BY2培养基洗3次。最后，在5ml添加有替卡西林(200mg/l)的BY2培养基中重悬浮植物细胞，并且在2-3个平板的补充有潮霉素(25mg/l)和替卡西林(400mg/l)的BY2培养基上涂铺悬浮液。在28℃，在黑暗中温育该平板3.5周，在这时，相对于死亡未转化的(潮霉素敏感性)细胞背景，可以观察到快速生长的潮霉素抗性细胞的小克隆。
2.用RKLucB/P T-DNA稳定转化的细胞系的鉴定
在涂平板后大约3.5周，从筛选平板挑取潮霉素抗性克隆。给每个克隆编号，并且将它们分成2部分，其中的一部分接种到5ml液体筛选培养基中，另一部分被再次涂平板到选择性琼脂上，两种培养基都含有替卡西林(400mg/l)和潮霉素(对于琼脂是25mg/l，对于液体培养基是50mg/l)。在28℃在黑暗中在旋转振荡器上(123rpm)温育1周后，在新鲜筛选培养基中将3ml等份的每种悬浮液培养物稀释10倍，并且离心细胞样品，用IsoQuick核酸分离试剂盒(Orca Research Inc.)从它分离DNA。利用对virG基因(以检测农杆菌污染)，HygR基因(阳性对照)和反向萤光素酶基因特异性的引物，通过PCR分析每个克隆的DNA。命名没有农杆菌和对于反向萤光素酶基因是PCR阳性的细胞系之一为B/P-6，并且如下文所述使用它。
实施例70D.测试烟草染色质中attB和attP位点之间重组的试验
1.与农杆菌属(Agrobacterium)共培养
在装配有6微米孔大小过滤器的过滤装置上冲洗转移后2天的株系B/P-6悬浮液细胞，并且用50ml等份，无筛选试剂的无菌BY2培养基连续冲洗6次。从过滤器漂洗冲洗过的B/P-6细胞到具有50ml新鲜BY2培养基的无菌烧瓶中，并且在用农杆菌接种前，在28℃，黑暗中，在旋转振荡器上温育所述细胞6小时。
2.attB和attP位点之间的染色体内重组研究
上文实施例45中描述了含有双元载体的农杆菌属(Agrobacterium)株系，该双元载体用于递送有或无整合宿主因子的野生型或突变体Int基因。λ整合酶，Int-h或Int-h/218介导的染色体attB和attP位点之间的分子内重组产生了萤光素酶表达。在YPKan50肉汤中培养所有的株系，在OD660＝0.5离心和在BY2培养基中重悬浮该株系。如上所述，将60μl细菌悬浮液接种到深培养皿中的3ml BY2培养基中，并且如上所述用力混合向该悬浮液添加6ml等份冲洗的B/P-6烟草悬浮液细胞。在25℃，黑暗中温育共培养物3天，这时将植物细胞转移到烧瓶和3ml新鲜的BY2培养中，其中向该培养基添加足够的替卡西林，使得其最终浓度是400mg/l。在旋转振荡器上温育该培养物2天，这时移出1.5ml等份的每种培养物用于萤光素酶测定和上文实施例34中所述的蛋白质测定。下面的表12中列出了这种测定的结果。
表12
| 添加的农杆菌株系 | 萤光素酶LU/mg蛋白质 | |
| RKIntHF | 5.8 | |
| RKInt-hHF | 34.4 | |
| RKInt-h/218HF | 266.1 | |
| RKInt | 1.3 | |
| RKInt-h | 2.9 | |
| RKInt-h/218 | 300.9 | |
| RKLucIntAttL | 14,285 | |
| 未接种的对照 | 19.2 |
表12中所示的结果表明被整合宿主因子蛋白质增强的Int-h和Int-h/218基因的农杆菌递送产生了活性整合酶，该活性整合酶成功地介导了稳定地整合到烟草染色体DNA的attB和attP位点之间的重组。不被IHF蛋白质增强的Int-h/218基因的农杆菌递送也产生了整合酶，该整合酶能够介导插入到烟草染色体DNA中的attB和attP之间的重组。
实施例71：λ整合酶介导的整合到烟草染色体DNA中的attL和attR位点之间的分子内重组
实施例71A：用于转化分子内L/R测试底物到烟草基因组中的双元载体的构建
用HindIII消化双元载体VSUbq3InHyg，用Klenow补平，然后用ApaI切割，并且与来源于pBS.CMPSLucL/R的3031bp MslI-ApaI片段连接以形成构建体pAdF66。然后，将构建体pAdF66电穿孔到农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404中，筛选壮观霉素抗性。
实施例71B：测试底物稳定整合到烟草染色体DNA中
如实施例45中所述，BY2悬浮液细胞与LBA4404(pAdF66)共培养。在25℃黑暗中温育3天后，在台式IEC离心机中，以1000rpm沉淀植物细胞1分钟，并且用新鲜BY2培养基漂洗。然后，在新鲜BY2培养基中重悬浮它们，并且将它们涂平板到补充有潮霉素(15mg/l或25mg/l)和替卡西林(400mg/l)的BY2琼脂上。在黑暗中，温育平板10天，这时挑取潮霉素抗性愈伤组织，并且将它们转移到新鲜筛选平板上。利用Taqman分析估算每个转化的愈伤组织中T-DNA插入片段的数量，并且选定具有低数量T-DNA插入片段的株系。然后，通过在补充有潮霉素(15mg/l)和替卡西林(400mg/l)的液体BY2培养基中培养小块转化的愈伤组织起始悬浮液细胞培养物。
实施例71C.测试烟草染色质中attL和attR位点之间重组的实验
在该试验中使用带有分子内L/R底物的3种独立的转基因pAdF66BY2悬浮液细胞系，并且如实施例69中所述制备用于轰击的细胞。将有或无IHF的整合酶(0.833μg/射击)和切除酶(0.166μg/射击)共轰击到pAdF66细胞中，并且在轰击后2天，在细胞提取物上测定瞬时萤光素酶表达。用每种DNA混合物轰击一式两份的平板，以1100psi射击每个平板1次。还对一个平板用对照质粒2122-CMPSLacInAttL射击一次，以表明每个细胞系显示瞬时表达的能力。如下表中所见，利用阳性对照质粒，不同的细胞系显示了各种程度的瞬时萤光素酶表达。下面表10中示出了一式两份平板的平均相对光单位(RLU)。从如表10中标记有“无质粒”的那排所示的带有分子内底物的细胞系没有检测到高于标准背景的萤光素酶活性。
表10
| 平均RLU | |||
| 共轰击的质粒 | 株系#7 | 株系#29 | 株系#33 |
| 无质粒 | 105 | 137 | 186 |
| 2122-CMPSLucInAttL | 39,766 | 74,456 | 49,435 |
| PBSIntHFpAdF61 | 3,516 | 3,844 | 8,667 |
| pBSInt-hHFpAdF61 | 2,291 | 4,171 | 7,843 |
| CMSynInt-h/218pAdF61 | 1,970 | 6,621 | 17,384 |
| pBSInt-h/218HFpAdF61 | 8,423 | 7,368 | 21,581 |
表10中的数据表明，当3种整合酶中的每种整合酶与IHF和切除酶递送时，它都介导植物染色质中的分子内L/R重组。
VI.烟草中的定向整合
A.利用农杆菌介导的转化递送的供体序列和Int
1.阳性对照双元载体的构建
实施例72：用整合酶体外处理质粒CMPSVLucB/P以形成CMPSVLucIntronAttL，一种含有具有attL位点的内含子的阳性对照萤光素酶构建体
利用来源于Gateway克隆试剂盒(Invitrogen)的酶和缓冲液，将约300ng质粒VCMLucB/P(2μl)与10μl水，4μl BP缓冲液和4μl BP克隆酶混合，并且在25℃温育1.5小时。用一半反应混合物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。通过用Asp718I和BglII消化小量制备物鉴定分子内反应产物CMPSVLucIntronAttL。
2.靶序列的构建
在这里所述的示例性构建体中，用于将靶序列插入到烟草中的质粒含有HPT(潮霉素抗性基因)表达盒以帮助鉴定含有靶序列的植物克隆。此外，靶序列质粒含有在内含子中被截短并被单一att位点或一对相同的att位点(其任何一个可以是野生型或突变体)打断的部分萤光素酶(5’-Luc-5’Intron-)和新霉素磷酸转移酶(NPTII)(3’Intron-3’NPTII)表达盒。因此，单一att位点靶序列包含5’Luc-5’Intron-Att位点-3’Intron-3’NPTII形式的分开的标记基因。双att位点靶序列具有5’Luc-5’Intron-Att位点-间隔区-Att位点-3’Intron-3’NPTII形式。5’和3’内含子部分对应于不同的内含子。包含在att位点之间的DNA间隔区可以是表达盒，基因或基因片段。一旦在供体和靶序列之间发生Int介导的双重组，那么间隔区DNA就可以被移除和置换为供体序列。
单一att位点相对于靶序列基因编码区可以是5’-3’或3’-5’方向。成对的att位点可以相互背离定向(反向方向)或相对会聚定向(也是反向方向)。当成对的att位点3’末端相互远离定向时，称相互背离定向该位点。当相互面对定向成对att位点3’末端时，称相对会聚定向该位点。无论选择哪种方向，相应靶和供体序列中的att位点或成对att位点具有匹配的方向。此外，靶和供体中的att位点是重组兼容的，即，如这里所述，attB靶与att供体匹配等。
实施例73：具有单一attR位点的靶序列的构建
用BglII完全消化质粒VLucIntronAttL(实施例72)，然后用SphI部分消化，并且分离4860bp的部分消化片段以形成载体1。用MfeI消化实施例11A中的中间体质粒3’LucIntron，并且与改变位点的寡核苷酸：5’-AAT TGT CTA GAC-3’(SEQ ID NO：140)连接以形成3’LucIntronXba。用SphI和XbaI消化质粒3’LucIntronXbaI以分离插入片段1，即，含有内含子5’部分和Luc中间部分的762bp片段。通过用BglII和AvrII消化及attR片段(169bp)的凝胶纯化，从TOPOBAttRAv(实施例55和56中LpsgAttR和LpdbAttR构建中的中间体)切下插入片段2。通过载体1，插入片段1和插入片段2的3方连接形成质粒V5’LucIntronAttRrev。
通过片段的4方连接构建靶序列质粒，其中所述片段制备如下：对于片段1，用PacI和XbaI和碱性磷酸酶消化双元载体pNOV2114，并且凝胶纯化它。对于片段2，用BglII(Klenow)/SpeI消化质粒V5’LucIntronAttRrev，并且凝胶纯化2047bp的片段。对于片段3，用MfeI消化pNOV2720，用Klenow聚合酶补平位点，用SacI再次消化质粒，并且凝胶纯化1291bp含有3’-NPTII的片段。通过用SacI和PacI消化和HygR盒子的凝胶纯化从2114Ubq3HygB切下3157bp的片段4。片段1，2，3和4的4方连接产生LPAttRrev.BY2。
实施例74：LPAttP1P2.BY2的构建
构建双子叶植物的着陆座垫(landing pad)以包含位于反向的attP1和attP2位点间的“填充”DNA序列，其分开了萤光素酶表达盒的5’部分和新霉素磷酸转移酶表达盒的3’部分。通过用NcoI(Klenow)，XhoI消化pAttL，并且将该片段连接到用EcoRI(klenow)，XhoI消化的载体pNOV4211中形成CM5’LucInt，使CMPS启动子与pAttL的萤光素酶基因5’部分和内含子连接。通过用BamHI(Klenow)，XhoI消化TOPOAttP1，并且将该片段与用PspOMI(klenow)，XhoI消化的CM5’LucInt载体连接形成CM5’LucP1，从而将attP1位点引入到CM5’LucInt内含子中。利用寡核苷酸对：5’-GCT AGC CTC CGT CCGACG ACT CAA TC-3’(SEQ ID NO：141)和5’-GGT ACC GGC GCGCCG CAA CAT GAG ATG GCA CCG T-3’(SEQ ID NO：142)和TOPO TA克隆试剂盒，从模板pNOV5013 PCR克隆DNA “填充”片段，形成TOPO.fPPO。通过将TOPO.fPPO的NheI，Asp718I片段连接到用NheI，Asp718I消化的CM5’LucPl载体中形成CMLucP1fPPO，从而将“填充”DNA添加至attP1位点的3’。利用寡核苷酸5’-CTA GGCGCG C-3’(SEQ ID NO：143)，将CMLucP1fPPO的唯一SpeI位点转化为AscI位点，形成CMLucP1fPPO.Asc。
利用下面的3方连接，将attP2位点插入到pNOV2720微管蛋白-1β内含子的3’区域。利用Mfel，SacI切下pNOV2720的NPTII表达盒3’区域，利用KpnI，MfeI从TOPOAttP2切下attP2位点，并且将两个片段连接到用KpnI，SacI消化的Bluescript KS+中以形成pBSAttP2Kan。利用寡核苷酸：5’-GTA CGG CGC GCC-3’(SEQ ID NO：144)将pBSAttP2Kan的唯一Asp718I位点转化为AscI位点，形成pBSAttP2Kan.Asc。从pBSAttP2Kan.Asc以AscI，SacI片段切下含有attP2位点的NPTII表达盒3’区域，并且将其连接到用AscI，SacI消化的双元载体VSUbq3IntHyg中以形成VSP2KanHYG。
从CMLucPlfPPO.Asc以AscI片段切下attP1位点和DNA“填充”区域以及萤光素酶表达盒5’区域，并且将其插入到VSP2KanHYG的唯一AscI位点中形成具有反向attP1和attP2位点的靶序列，命名为LPAttP1P2.BY2。
实施例75：具有反向attR位点的靶序列的构建
首先如下所述，用attR位点置换pAdF56的attP1位点：利用PCR引物NheAttRFOR (5’-GGG CTA GCT CTG TTA CAG GTC ACTAAT A-3’(SEQ ID NO：145))和XhoAttRREV(5’-CCC TCG AGCGCT CAA GTT AGT ATA AAA AAG-3’(SEQ ID NO：146))，从TOPOBAttRAv构建体扩增带有attR位点的PCR片段，该attR位点5’末端的侧翼为NheI位点和其3’末端的侧翼为XhoI位点。用NheI和XhoI再次切割attR PCR片段，并且将其克隆到用NheI和XhoI消化的载体构建体pAdF56中以形成pAdF58A。
其次，如下所述，用attR位点置换pAdF58A的attP2位点：利用PCR引物：AscAttRFOR(5’-GGG GCG CGC CTC TGT TAC AGGTCA CTA ATA-3’)(SEQ ID NO：147))和AvrAttrREV(5’-CCC CTAGGC GCT CAA GTT AGT ATA AAA AAG-3’)(SEQ ID NO：148))，从TOPOBAttRAv扩增其5’末端侧翼为AscI位点和其3’末端侧翼为AvrII位点的attR位点。用AscI和AvrII再次切割attR PCR产物，并将其克隆到用AscI和AvrII消化的载体构建体pAdF58A中以形成pAdF58。
最后，将pAdF58的4049bp SfoI-Acc65I片段连接到构建体LPAttP1P2.BY2的9326bp SfoI-Acc65I载体部分中，以形成双元载体pAdF60(即，LPdblAttR.BY2)(图12)。
3.供体序列的构建
一般地，这里构建的示例性供体序列包含NPTII表达盒的5’部分和Luc表达盒的3’部分，即，靶序列中缺少的各部分。用att位点插入每个基因中内含子的分断点。
供体构建体可以采用5’NPTII-5’Intron-Att位点-3’intron-3’Luc形式含有单一att位点。做为可替代的方案，供体构建体可以采用Att位点-3’Intron-3’Luc-5’NPTII-5’Intron-Att位点形式含有两个att位点。供体中内含子3’部分对应于相容靶序列中相同内含子的5’部分。供体中内含子5’部分对应于相容靶序列中相同内含子的3’部分。供体中att位点与相应靶序列中att位点是重组相容的。此外，供体和靶序列中att位点方向相对于截短的基因是相同的。
可以通过农杆菌属(Agrobacterium)T-DNA递送引入供体序列，为此，使用下面构建体。做为可替代方案，可以使用生物弹轰击(如下面VI.B部分中所述)或其它物理递送系统，对于此，容易从这里所述双元质粒衍生在高拷贝质粒诸如，例如pUC18或pBluescript上的其它形式供体构建体。
通过供体序列和相容靶序列之间单一位点或双位点重组导致的定向插入事件引起了功能性萤光素酶和NPTIII表达盒的重建。
实施例76：含有attL位点的供体序列的构建
通过3方连接构建该供体。片段1是pNOV2114载体加Nos终止子，通过PspOMI和SacI消化，从VSInt-h/218切下片段1，并且纯化此6063bp片段。片段2是用PspOMI和MfeI切下的pNOV2720的3203bp片段，并且含有Smas启动子和5’NPTII基因。
如下所述产生片段3：用SacI和XhoI消化实施例72中所述质粒VlucIntronAttL，并且凝胶纯化含有3’IntronLuc(无终止子)的491bp片段。用XhoI和SacI消化Bluescript载体pBSKS-，用碱性磷酸酶处理，并且凝胶纯化载体。将这两个片段连接在一起，并且转化到大肠杆菌(E.coli)中。通过用SacI/XhoI消化小量制备DNA分析克隆，并且命名显示期望491bp插入片段的克隆为pBS3’LucIntron。为插入attL，用XhoI消化pBS3’LucIntron，用碱性磷酸酶处理，并且凝胶纯化。用XhoI消化TOPOAttL(实施例12)，并且在2％琼脂糖上凝胶纯化113bpattL片段。attL位点与pBS3’LucIntron连接，形成pBS3’LucIntronAttL。通过用PsiI消化鉴定具有反向attL的克隆，并且通过DNA测序证实它。用Asp718I消化pBS3’LucIntronAttLrev，并且将其与改变位点的寡核苷酸：5’-GTA CGG CAA TTG CC-3’(SEQID NO：149)连接，以产生MfeI位点，形成pBS3’LucInAttLMfe。用MfeI和SacI消化该质粒，并且凝胶纯化618bp插入片段以产生片段3。将片段1，2和3连接在一起以形成DonAttL.BY2(图11)。
实施例77：DonAttB1.BY2的构建
通过4方连接构建该供体序列。通过用Asp718I和PspOMI消化双元载体pNOV2114，用碱性磷酸酶处理，并且凝胶纯化由此得到的5667bp片段获得片段1。通过用Asp718I/XhoI消化，并且凝胶纯化含有Intron3’LucNos的773bp片段，从vattPIntron3’LucNos(vAttP)(实施例14)切下片段2。通过退火寡核苷酸对：5’-TCG AGA GCC TGCTTT TTT GTA CAA ACT TGT CCC C-3’(SEQ ID NO：150)和5’-AAT TGG GGA CAA GTT TGT ACA AAA AAG CAG GCTC-3’(SEQ ID NO：151)形成片段3，其为位于XhoI和MfeI粘性末端之间的attB1位点。片段4是通过用PspOMI和MfeI消化pNOV2720并且凝胶纯化3203bp片段获得的Smas启动子/5’NPTII片段。4方连接和转化形成的菌落通过用XhoI/XbaI消化小量制备物分析。选定的克隆产生了正确的片段模式(4058，1744，1176，1142，598，445，312和93bp)。通过DNA测序分析这些克隆，并且这些克隆在所有连接处和整个attB1位点显示了预测的结构。
实施例78：DonAttB1AttB2.BY2的构建
采用两步构建该供体。第一步，用MfeI和Asp718I消化DonAttB1.BY2(实施例77)，并且凝胶纯化含有AttB1LucNos的807bp片段以形成插入片段#1。用EcoRI和Asp718I消化pNOV2114，凝胶纯化5751bp载体，并且连接到插入片段#1以产生2114AttB1.3’LucNos。用XhoI/XbaI消化从8个候选克隆小量制备的DNA，表明所有克隆都有预测模式的片段，3838，1744，445，297，95，和93bp。从该产物，通过3方连接产生DonAttB1AttB2.BY2。用PspOMI和SbfI消化2114AttB1.3’LucNos以产生用于第二步的载体。对于插入片段A，用MfeI和PspOMI消化pNOV2720，凝胶纯化含有Smas启动子/5’NPTII的3203bp片段。插入片段B是退火的寡核苷酸对(5’-AAT TGA CCC AGCTTT CTT GTA CAA AGT GGT CCC CTG CA-3’(SEQ ID NO：152)和5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC-3’(SEQ IDNO：153))，其代表侧翼为MfeI和SbfI粘性末端的attB2位点。连接混合物的转化提供了110个菌落。10个克隆小量制备的DNA用XhoI/XbaI消化鉴定了具有正确模式片段，即，3838，2901，1142，598，445，312，297，93和90bp.的2个克隆。DNA序列分析证实了在所有连接点处和整个AttB1和AttB2位点具有预测的结构。
实施例79：具有反向attL位点的pUC双子叶植物供体质粒的构建
第一个克隆步骤包括利用下面片段的4方连接：用BamHI和XbaI消化的载体pNEB193，来源于构建体DonAttBlAttB2.BY2的3194bpXhoI-MfeI片段，来源于LPdbAttL(实施例56)的128bp XhoI-BglIIattL片段和来源于PMIAttLi(实施例63)的120bp MfeI-AvrII attL片段。由此得到的质粒称为pAdF74。在第二步中，带有与3’nos终止子连接的萤光素酶基因3’末端的DonAttBlAttB2.BY2(实施例78)的878bp XhoI片段被连接到pAdF74的唯一XhoI位点中。利用标准限制消化检测载体中878bp XhoI插入片段期望的方向以产生构建体pAdF75。该基于pUC的供体构建体含有两个反向attL位点，并且含有在两个L/R重组事件后，在含有pAdF60的BY2靶系中，重构功能性萤光素酶和NPTII基因必需的基因片段。
实施例80：将供体构建体DondbAttL.BY2克隆到双元载体pNOV2114中以做为农杆菌属(Agrobacterium)T-DNA用于递送
用AscI和SbfI消化含有DondbAttL.BY2的pAdF75，并且凝胶纯化4352bp插入片段。在碱性磷酸酶存在的情况下，用AscI和SbfI消化双元载体pNOV2114，并且凝胶纯化5611bp的载体片段。供体片段和双元载体的连接提供了数以百计的转化体。通过用MfeI/SbfI消化小量制备物以分析5个转化体，表明所有5个(2114)DondblAttL.BY2(图13)都是正确的，其具有片段5604，4214，和145bp(attL-片段)。
3.烟草靶细胞系的产生
实施例81：将靶序列转化到烟草悬浮细胞中
将带有LPAttR.BY2(图10)的农杆菌属(Agrobacterium)LBA4404株系接种到具有壮观霉素(100mg/l)的YP肉汤中，并且允许在25℃生长直到晚期对数生长期(通常24小时)。离心细菌，并且以OD660＝0.5，在BY2液体培养基中重悬浮。除了通常每个培养皿使用120μl农杆菌，并且通常进行共培养约3天以外，基本如实施例45中所述进行烟草BY2细胞的转化。在该时间的末期，悬浮植物细胞，并且用移液管从培养皿移到15ml离心管中，用无菌BY2培养基漂洗培养皿一次，并且将漂洗液加入管中。在2000rpm离心植物细胞2分钟，并且倾析上清液。在3-5ml中悬浮BY2细胞，并且涂铺在具有15mg/l潮霉素，200mg/l替卡西林的BY2琼脂上(BY2Hygl5Tic200)(每个平板约0.5-1ml收集细胞)。在28℃，在黑暗中温育平板，并且大约2-3周后，选定做为靶序列克隆的愈伤组织。在22℃，在环境光线中培养选定的含有LPAttR.BY2(图10)的克隆，并且每隔2-3周，将其转移到新鲜BY2Hygl5Tic200的平板上。
4.供体序列定向整合到烟草靶细胞系中
实施例82：含有attR位点的烟草靶细胞系与含有具有attL位点的供体构建体的农杆菌共培养
培养含有LPAttR.BY2(图10)的靶植物细胞系的悬浮培养物，冲洗以除去抗生素，并且在立即共培养之前，在无筛选的BY2培养基中过夜培养。对靶系进行如下3种处理：(1)100μl LBA4404(DonAttL.BY2)+60μl LBA4404(RKInt-hHF)+20μl LBA4404(pAdF62A)；(2)180μlLBA4404(pNOV2731)(阳性对照)；和(3)无农杆菌(未处理的对照)。将LBA4404培养物调节到OD660＝0.5，向深培养皿中1.8ml液体BY2培养基中添加所示体积的农杆菌株系。如实施例8中所述，pAdF62A是具有Xis表达盒的双元载体。pNOV2731是阳性对照卡那霉素抗性表达盒。
准备3个深培养皿(每个处理用1个培养皿)，向每个培养皿添加下述物质：含有约1.5ml收集细胞的7ml植物细胞悬浮液和含有所示体积农杆菌培养物的2ml BY2培养基。剧烈地混合细菌和植物细胞，并且在黑暗中，在周围环境温度(约22℃)贮藏大约3天。离心，重悬浮细胞，并且用移液管将该细胞移取到选择性琼脂上。每个共培养物在具有100mg/l卡那霉素加200mg/l替卡西林的新鲜BY2培养基的2个筛选平板上分开。在层流罩超净台中使过量的湿气蒸发，并且在28℃，在黑暗中温育该平板。
大约2-3周后，在处理1和2的平板上观察到了菌落，而处理3平板没有显示生长。从处理1平板选定克隆，并且将其转移到新鲜选择性BY2培养基。利用Qiagen Dneasy试剂盒，从快速生长的克隆提取DNA。利用引物对，通过PCR分析DNA，其中该引物对于靶序列(以检测DNA制备物的质量)及新的各重组基因，NPTII和萤光素酶(跨att位点的连接处)是特异性的。针对靶序列的引物是InTuAfw(5’-GTA ATTAAG CTT TTC CAC CTC TCT TGT T-3’(SEQ ID NO：154))和InTuArV(5’-GAT CCT GCA GCA AG GAA AAA TAT TTC AATAC-3’(SEQ ID NO：155))。对于NPTII连接处的引物是Neo3132f(5’-GGC GGT AGT GTA TTA GTG TC-3’(SEQ ID NO：156))和Neo3637r(5’-GAT GCT CTT CGT CCA GAT CA-3’；(SEQ ID NO：157))。用于萤光素酶连接处的引物是Luc1876f(5’-GGA AGC GACCAA CGC CTT GA-3’(SEQ ID NO：158))和Luc2387r(5’-TGC GACACC TGC GTC GAA GA-3’(SEQ ID NO：159))。
选定的LPAttrR.BY2转化体用Luc和NPTII引物对产生了PCR产物，该PCR产物对于把靶事件具有正确大小：使用NPTII引物的581bp和使用Luc引物的420bp。对DNA片段进行测序以检测它们的结构。序列证实该克隆是供体DNA中attL位点和靶中attR位点之间Int催化反应的结果。因为单一位点供体T-DNA诸如DonAttL.BY2是线性结构，所以它与植物基因组中插入的LPAttR.BY2的重组在染色体中产生了断裂，对应于供体T-DNA的自由左和右边界末端。植物细胞可以通过左边界和右边界的非同源末端连接修复该断裂(Gorbunova和Levy(1999)Trends in Plant Science，4：263-269)。用位于每个边界附近和“向外”指向，即跨过边界序列的PCR引物扩增这些T-DNA边界，以扩增T-DNA末端和它们之间的任何序列。引物Luc1876f (SEQ ID NO：158)和Neo3637r(SEQ ID NO：157)扩增了约550bp的片段，并且它的序列表明供体DNA延伸向下超过了Lue基因末端直到右边界切口位点之前的8bp位置，并且向上超出了Smas启动子，精确到达T-DNA左边界切口位点。98bp填充DNA位于两者之间。填充DNA由来源于供体序列Smas启动子部分的51bp片段组成，该片段带有未知序列的16和31bp区侧翼。结论是选定的转化体含有通过Xis和IHF与Int-h所催化的完好单一位点把靶事件。
实施例83：含有反向attR位点的烟草靶细胞系与含有具有反向attL位点的供体构建体的农杆菌共培养
在选择性培养基中，培养含有pAdF60(即，LPdblAttR.BY2)(图12)的靶植物系悬浮液。共培养前，通过离心和重悬浮，用BY2培养基重复地冲洗细胞，以除去所有痕量的抗生素。在具有适合抗生素的YP肉汤中培养含有供体序列和Int，IHF和Xis表达盒的农杆菌属(Agrobacterium)株系和LBA4404(pNOV2731)阳性对照株系。对靶系进行如下3种处理：(1)100μl DondblAttL.BY2，100μl RKInt-h/218HF(Int-h/218+IHF)，和60μl Xis；(2)120μl pNOV2731(阳性对照)；和(3)无农杆菌(未处理的对照)。将LBA4404培养物调节到OD660＝0.5，向深培养皿中1.8ml液体BY2培养基中添加所示体积的农杆菌属(Agrobacterium)株系。
准备3个深培养皿(每个处理用1个培养皿)，向每个培养皿添加下述物质：含有约1.5ml收集细胞的7ml植物细胞悬浮液和含有所示体积农杆菌培养物的2ml BY2培养基。剧烈地混合细菌和植物细胞，并且在黑暗中，在22℃培养箱中贮藏约3天。离心，重悬浮细胞，并且用移液管将该细胞移取到选择性琼脂上。在具有100mg/l卡那霉素加200mg/l替卡西林的新鲜BY2培养基的2个筛选平板之间分开每个共培养物。在层流罩超净台中使过量的湿气蒸发，并且在28℃，在黑暗中温育该平板。
在BY2Kan100Tic200上涂平板后4周，出现了小白色球形克隆，并且将其转移到新鲜选择性培养基。选定和分析克隆。PCR分析表明选定的克隆显示了Luc和NPTII扩增产物，该产物对于在两侧均被打靶的转化体具有正确大小。PCR产物的DNA序列分析证明该转化体是两个Int催化的位点特异性重组的产物。
D.利用微粒轰击递送的供体序列和Int
1.靶序列的构建
实施例84：含有具有反向attL位点的靶序列的双子叶植物双元载体的构建
第一步包括将构建体LPAttP1P2.BY2的4196bp SfoI-Acc65I片段亚克隆到用SfoI和Acc65I消化的载体pUC18中，以形成质粒pAdF56。该靶序列LPAttP1P2.BY2构建体的4196bp片段含有反向方向的attP1位点和attP2位点：attP1位点位于CMPS启动子：萤光素酶5’末端基因片段的下游的内含子中，并且与萤光素酶编码区同向(即，正向)；attP2位点位于新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因片段3’末端上游的内含子中，并且相对于NPTII编码区反向。
在第二步中，如下所述，用attL位点置换pAdF56的attP1位点：利用PCR引物：NheAttLFOR (5’-GGG CTA GCT GAA GCC TGCTTT TTT ATA CTA-3’)(SEQ ID NO：160)和XhoAttLREV(5’-CCCTCG AGA AAT CAA ATA ATG ATT TTA TTT TG-3’)(SEQ ID NO：161)，从构建体DonAttL.BY2(实施例76)扩增带有attL位点的PCR片段，该attL位点5’末端侧翼为NheI位点和其3’末端侧翼为XhoI位点。用NheI和XhoI切割attL PCR片段，克隆到载体pAdF56中，然后用NheI和XhoI消化以形成pAdF57A。
在第三步中，如下所述，用attL位点置换pAdF57A的attP2位点：利用PCR引物：AscAttLFOR(5’-GGG GCG CGC CTG AAG CCTGCT TTT TTA TAC TA-3’)(SEQ ID NO：162)和AvrAttLREV(5’-CCC CTA GGA AAT CAA ATA ATG ATT TTA TTT TG-3’)(SEQID NO：163)，从DonAttL.BY2(实施例76)扩增其5’末端侧翼为AscI位点和其3’末端侧翼为AvrII位点的attL位点。用AscI和AvrII再次切割attL PCR产物，并且克隆到用AscI和AvrII消化的载体构建体pAdF57A中形成pAdF57。
在最后的克隆步骤中，将pAdF57A的3953bp SfoI-Acc65I片段连接到构建体LPAttP1P2.BY2的9326bp SfoI-Acc65I载体部分以形成双元载体pAdF59(图14)。
2.烟草靶细胞系的产生
实施例85：转基因烟草BY2靶系的产生
将双元载体pAdF59(图14)电穿孔到农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404中。如上文实施例71B中所述烟草BY2悬浮细胞与由此得到的菌株LBA4404(pAdF59)共培养。利用Taqman技术鉴定带有最低T-DNA插入数量的独立的转化细胞系。通过在补充有潮霉素(15mg/l)和替卡西林(400mg/l)的液体BY2培养基中重悬浮愈伤组织，起始所述细胞系的悬浮细胞培养。
3.供体序列的构建
实施例86：具有反向attR位点的基于pUC的双子叶植物供体质粒的构建
第一步克隆步骤包括利用下面片段的4方连接：(1)用BamHI和XbaI消化的载体pNEB193，(2)来源于构建体DonAttBlAttB2.BY2的3194bp XhoI-MfeI片段，(3)来源于LPdbAttR(实施例56)的186bpXhoI-BglII attR片段，和(4)来源于pBS.DonAttR(pBS.DonAttR是DonAttR.BY2的衍生物，其中将4182bp XhoI片段亚克隆到载体pBlueScript KS(-)的XhoI位点中；该非定向连接的产物中包含相对于载体氨苄青霉素抗性基因反向方向的NPTII和萤光素酶基因，命名这种产物为pBS.DonAttR)的188bp MfeI-AvrII attR片段。由此得到的质粒称为pAdF71。
在第二步中，带有与3’nos终止子连接的萤光素酶基因3’末端的DonAttB1AttB2.BY2的878bp XhoI片段被连接到pAdF71的唯一XhoI位点中。利用标准限制消化检测载体中878bp XhoI插入片段的期望方向，以产生构建体pAdF72(图15)。该基于pUC的供体构建体含有两个反向attR位点，并且含有在两个重组到含有pAdF59的BY2靶系中的L/R重组事件后，重构功能性萤光素酶和NPTII基因所必需的基因片段。
4.供体序列定向整合到烟草靶细胞系中
实施例87：利用生物轰击法，供体序列定向整合到烟草染色质中
如实施例69中所述，培养含有pAdF59(带有反向attL位点)的靶系悬浮液细胞培养物，并且制备细胞用于轰击。在金颗粒(0.833μg/射击)上共沉淀供体DNA，pAdF72(图15)与Int-h/218，和整合宿主因子(pBSInt-h/218HF)(0.833μg/射击)和切除酶(pAdF61)(0.166μg/射击)。以1100psi射击每个靶平板1次。然后，在高渗透培养基(具有12％蔗糖的BY2)上，在28℃，黑暗中温育该平板72小时。然后将顶上带有细胞的滤膜转移到含有BY2培养基的筛选平板，该培养基补充有卡那霉素(50mg/l)和替卡西林(400mg/l)。24小时后，利用补充有卡那霉素(50mg/l)的2ml液体BY2，轻轻从滤膜刮取细胞，并且涂铺到选择性琼脂上。2到3周后，将在筛选平板上生长的小愈伤组织转移到新鲜平板，在该新鲜平板上生长它们，直到有足够可用于萤光素酶测定和PCR分析的组织。
实施例88：将供体DNA轰击到靶细胞系中以后定向事件的鉴定
当在如上文I.A.3部分中所述萤光素酶测定中使用约20mg愈伤组织时，发现4个单独的卡那霉素抗性愈伤组织包含了功能性萤光素酶基因，如下面表11中所示。
表11
| 靶序列 | 事件 | RLU |
| pAdF59#5 | 59/5-1 | 40,000,000 |
| pAdF59#5 | 59/5-3 | 40,000,000 |
| pAdF59#24 | 59/24-1 | 4,000,000 |
| pAdF59#24 | 59/24-6 | 850 |
利用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒，从上述4个卡那霉素抗性愈伤组织提取基因组DNA，并且利用下述PCR引物进行PCR分析。预测在靶序列中，在每个L/R重组位点(一个位于NPTII基因中，另一个位于萤光素酶基因中)形成attP位点。利用Qiagen HotStartTaqDNA聚合酶和PCR引物InTuBFw (5’-CAG GTA TAT ATA TGAATC GAT TTC TCC CTT-3’(SEQ ID NO：184))和InTuBRv(5’-TCG TCC AGA TCA TCC TGT AAT ACA GAA ATG TT-3’(SEQID NO：185))进行包含卡那霉素连接位点的DNA片段的PCR扩增。用从事件59/5-1和59/24-1提取的DNA获得了预测大小(约1078bp)的PCR产物。测序这些PCR产物，其与通过L/R重组在供体序列中定向整合供体DNA所得到的预测DNA序列相符。
利用Roche Expand长模板PCR系统和PCR引物3’Luc448f(5′-GAA GCG AAG GTT GTG GAT CT-3’(SEQ ID NO：164))和InTuBRv(SEQ ID NO：185)进行第二套PCR扩增。用从事件59/5-1和59/24-6提取的DNA获得了预测大小(约5038bp)的PCR产物。包含两个L/R重组位点(即，attp位点)的来源于事件59/5-1的PCR产物末端序列匹配预测的序列。
实施例89：供体DNA的病毒扩增以改进打靶效率
通过增加植物细胞中供体DNA的浓度可以增加利用这里所述任何供体/靶联合的定向插入事件的频率。双子叶植物的双粒病毒组诸如，例如甜菜曲顶病毒(BCTV)的复制系统可用于该目的(一般地参见：Stanley等.(1986)EMBO J.5(8)：1761-1767)。这里描述了生物轰击递送系统，但是该方法同样可应用于农杆菌递送系统(Stenger等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8029-8033)。当农杆菌T-DNA中目的DNA序列(如供体序列)的侧翼为病毒ori拷贝时(见下述)，滚环复制引起了带有目的DNA的复制形成的形成。这可以在T-DNA整合到植物基因组中之前或之后出现。
对于生物轰击递送，该方法包括向供体DNA质粒中掺入核苷酸序列拷贝，该核苷酸序列是病毒基因组复制和转录的识别序列，病毒ori。该识别序列是双粒病毒组常见的含有中心位置核苷酸序列的回文序列。对于BCTV，(用粗体表示回文序列)识别序列是5’-GGG GCC ATCCGG TAA TAT TAA TGC GGA TGG CCC C-3’；(SEQ ID NO：165)。在BCTV上，该序列位于病毒正链开放可读框(ORFs)和负链ORFs之间的基因间区域中(Timmermans等.(1994)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45：79-112)。
在进一步构建步骤中，构建BCT病毒DNA的亚克隆，其中XhoI缺失和用EcoRV识别位点置换外被蛋白ORF。美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209)是质粒pCFH(ATCC保藏号PVMC-6，甜菜严重曲顶病毒株系CFH)的来源，其含有在EcoRI位点线性化，并且插入到pUC8载体EcoRI位点中的CFH株系甜菜曲顶病毒双链DNA。通过用Expand高度忠实性PCR系统(Roche)，利用下面的引物：BCTV-CP-V-Xho-RV(5’-GGC CTC GAGGAT ATC TTG GCA ATT GTA GAT GCT ATT T-3’)(SEQ ID NO：166)和BCTV-CP-C-Xho-RV(5’-GGC CTC GAG ATA TCA CAACGA ACA CTT CCT ATG A-3’)(SEQ ID NO：167)，通过PCR扩增(10轮循环)，从病毒DNA缺失外被蛋白基因。用XhoI消化约4.8kb的PCR片段，并且自连接。通过DNA测序鉴定了完整的克隆，并且称为CFH-ΔCP。用EcoRI和EcoRV消化该质粒，并且凝胶纯化1799bp和398bp的两个插入片段。这两个插入片段与用HindIII消化，通过Klenow聚合酶使其平端化和用碱性磷酸酶处理的pUC18载体的3方连接产生了pUC18DVR1和pUC18DVR2，这些克隆具有两个可能的病毒复制子方向。我们指定了克隆中ORFV1和ORFV2位于保留的pUC18多接头位点附近的克隆为pUC18DVR2。通过SphI消化鉴定pUC18DVR2，产生了4131bp和825bp的片段。
通过PCR，从pUC18DVR2扩增具有随后克隆步骤必需的侧翼AscI(粗体)和MluI(粗体)克隆位点的BCTV基因间区域。用于该目的的引物对是5’-GGC GCG CCT CAC ATC AAC ATC TTT AGCT-3’(SEQ ID NO：168)和5’-GGA CGC GTA TTG AAT CGG GCTCTC TTC A-3’(SEQ ID NO：169)。在TOPO载体中TA克隆该PCR产物，并且用AscI和MluI切下166bp插入片段。含有BCTV基因间区域的该片段连接到用AscI消化载体后生物轰击递送形式的双attR供体中(pAdF72)(图15)。通过用AscI/XhoI消化产物检测病毒ori插入片段的方向(正向或反向)。检测具有各ori取向的克隆在定向整合中的效率。命名由此得到的供体质粒为VfDonDbAttR.BY2和VrDonDbAttR.BY2。
为了病毒扩增植物细胞中的供体序列，将供体与含有复制所需遗传信息的病毒基因共递送到植物细胞中。期望该“辅助”病毒DNA不是DVR2，因为我们发现甚至DVR2*，一种缺失部分V2的DVR2衍生物，当与pNOV2720(NPTII表达盒)通过轰击共递送到BY2细胞时，也会干扰转化体的回收。因此，提供非复制形式，即，其中缺失上述回文区(复制起点)形式的整套病毒复制基因(即，C1-C4)。因为该起点侧翼的DNA也做为完整病毒中正和负链转录的“双启动子”，用定向以转录负链复制基因的拟南芥(Arabidopsis)泛素基因启动子/内含子构建体置换病毒完整的基因间区域。“辅助”构建体除了省略基因间区域外，还省略了对应于BCTV正或V链的所有3个基因：V2，外被蛋白基因；V3，将其除去可以增加双链DNA相对于单链(病毒颗粒)DNA的量(Hormuzdi，S.G. & Bisaro，D.M.，Virology 193：900-909(1993))；和V1，其能使病毒通过植物移动。
通过下面的3方连接构建辅助质粒：用碱性磷酸酶和SphI和AscI消化pUC18DVR2，并凝胶纯化具有部分插入片段的4068bp载体。为了形成插入片段，用HinfI消化pUC18DVR2，并凝胶纯化596bp片段。用Klenow补平末端，并且纯化和用SphI再次消化该片段。凝胶纯化173bp的产物，并且将其用作3方连接中的插入片段1。插入片段2，拟南芥(Arabidopsis)泛素启动子，其来源于Ubq3Hyg，一种潮霉素抗性表达盒。通过连接SnaB1(粗体)接头到下游末端(用改变位点的寡核苷酸5’-GAT CGG TAC GTA CC-3’(SEQ ID NO：170)置换BamHI位点)并将AscI(粗体)接头接到上游末端(用改变位点的寡核苷酸5’-AATTGG CGC GCC-3’(SEQ ID NO：171)置换EcoRI位点)，裁剪ubq3启动子与它的前导序列和内含子用于插入到辅助构建体中。通过用AscI/SnaBI消化切下ubq3启动子片段，并做为插入片段2。通过载体片段和插入片段1和插入片段2的3方连接装配新的复制基因辅助质粒Ubq3Rep。通过消化和DNA测序证实Ubq3Rep的结构。
VdonDblAttR.BY2和Ubq3Rep在如实施例87中所进行的定向整合中用作供体DNA系统(置换pAdF72)。
本说明书中所引用的所有出版物，公开的专利文献和专利申请表明了本发明领域的技术水平。因此，将这里所引用的所有出版物，公开的专利文献和专利申请并入为参考文献，就如同每篇单独的出版物，公开的专利文献和专利申请被具体和单独地表明并入为参考一样。
前面参考各种实施方式和实施例描述了本发明。不应将特定的实施方式，实施例或者特定实施方式或实施例的组成解释为任一或所有权利要求的至关重要的，必需的或必要的要素或特征。如这里所用的术语“包含”，“包括”，“含有”和其任何变化形式都意在覆盖非排他性的包含，因此包含，包括或含有要素或系列要素的过程，方法，方法定义的产品或物质的组合物不仅仅包含这些要素，还可以包含其它没有被明确列出的或固有属于这种过程，方法，方法定义的产品或物质的组合物的其它要素。而且，除非明确描述为“必需的”或“至关重要的”，这里所述要素均非本发明实际所必需的。
可以对公开的实施方式进行各种修饰和置换，而不背离如下面权利要求所述的本发明范围，这将是可以理解的。说明书，包括附图和实施例应被认为是示例性的，而不是限制性的，并且本发明范围中意欲包括所有这种修饰和置换。因此，应该由所附权利要求和它们的法律等同物，而不是由上述给出的实施例确定本发明的范围。例如，可以用任何可行的顺序，而不限于任何权利要求中所给出的顺序执行任何方法或工艺权利要求中所述的步骤。
序列表
<110>Syngenta Participations AG
<120>植物中λ整合酶介导的重组
<130>70005USPS
<160>185
<170>PatentIn Version 3.2
<210>1
<211>85
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸1A
<400>1
ggatccgcca ccatgggccg ccgccgcagc cacgagcgcc gcgacctgcc ccccaacctg 60
tacatccgca acaacggcta ctact 85
<210>2
<211>75
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸1B
<400>2
atgcggcggt cgcggcccag gccgaactcc ttgccggtgc gggggtcgcg gtagcagtag 60
tagccgttgt tgcgg 75
<210>3
<211>75
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸1C
<400>3
ctgggccgcg accgccgcat cgccatcacc gaggccatcc aggccaacat cgagctgttc 60
agcggccaca agcac 75
<210>4
<211>83
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸1D
<400>4
ccggtccagc cagctgtgca gggtcacgct gttgtcgctg ttgatgcggg cggtcagggg 60
cttgtgcttg tggccgctga aca 83
<210>5
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸2E
<400>5
ccggaccgct acgagaagat cctggccagc cgcggcatca agcagaagac cctgatcaac 60
tacatgagca 70
<210>6
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸2F
<400>6
gatgtcctcc aggggggcgt cgggcaggcc gcggcggatg gccttgatct tgctcatgta 60
gttgatcagg 70
<210>7
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸2G
<400>7
acgcccccct ggaggacatc accaccaagg agatcgccgc catgctgaac ggctacatcg 60
acgagggcaa 70
<210>8
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸2H
<400>8
cgcggaaggc gtcgctcagg gtgctgcgga tcagcttggc gctggcggcc ttgccctcgt 60
cgatgtagcc 70
<210>9
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸2I
<400>9
cctgagcgac gccttccgcg aggccatcgc cgagggccac atcaccacca accacgtggc 60
cgccacccgc 70
<210>10
<211>80
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸2J
<400>10
ggagatcttc aggtactcgt cggcggtcag gcggctgcgg cgcacctcgc tcttggcggc 60
gcgggtggcg gccacgtggt 80
<210>11
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸3K
<400>11
ccagatctac caggccgccg agagcagccc ctgctggctg cgcctggcca tggagctggc 60
cgtggtgacc 70
<210>12
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸3L
<400>12
tccacgatgt cgctccactt catctcgcac aggtcgccca cgcgctggcc ggtcaccacg 60
gccagctcca 70
<210>13
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸3M
<400>13
aagtggagcg acatcgtgga cggctacctg tacgtggagc agagcaagac cggcgtgaag 60
atcgccatcc 70
<210>14
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸3N
<400>14
cagggtctcc ttcatgctga tgcccagggc gtcgatgtgc agggcggtgg ggatggcgat 60
cttcacgccg 70
<210>15
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸30
<400>15
tcagcatgaa ggagaccctg gacaagtgca aggagatcct gggcggcgag accatcatcg 60
ccagcacccg 70
<210>16
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸3P
<400>16
gggcgcgcat gaagtagcgg ctcacggtgc cgctgctcag gggctcgcgg cgggtgctgg 60
cgatgatggt 70
<210>17
<211>65
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸4Q
<400>17
ccgcgcgccc gcaaggccag cggcctgagc ttcgagggcg acccccccac cttccacgag 60
ctgcg 65
<210>18
<211>65
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸4R
<400>18
aacttgtcgc tgatctgctt ctcgtacagg cgggcgctca ggctgcgcag ctcgtggaag 60
gtggg 65
<210>19
<211>65
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸4S
<400>19
aagcagatca gcgacaagtt cgcccagcac ctgctgggcc acaagagcga caccatggcc 60
agcca 65
<210>20
<211>76
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynInt的寡核苷酸4T
<400>20
ggagctctta cttgatctcg atcttgtccc actcgcggcc gcggtcgtcg cggtactggc 60
tggccatggt gtcgct 76
<210>21
<211>1071
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>对玉米优化的SynInt
<400>21
atgggccgcc gccgcagcca cgagcgccgc gacctgcccc ccaacctgta catccgcaac 60
aacggctact actgctaccg cgacccccgc accggcaagg agttcggcct gggccgcgac 120
cgccgcatcg ccatcaccga ggccatccag gccaacatcg agctgttcag cggccacaag 180
cacaagcccc tgaccgcccg catcaacagc gacaacagcg tgaccctgca cagctggctg 240
gaccgctacg agaagatcct ggccagccgc ggcatcaagc agaagaccct gatcaactac 300
atgagcaaga tcaaggccat ccgccgcggc ctgcccgacg cccccctgga ggacatcacc 360
accaaggaga tcgccgccat gctgaacggc tacatcgacg agggcaaggc cgccagcgcc 420
aagctgatcc gcagcaccct gagcgacgcc ttccgcgagg ccatcgccga gggccacatc 480
accaccaacc acgtggccgc cacccgcgcc gccaagagcg aggtgcgccg cagccgcctg 540
accgccgacg agtacctgaa gatctaccag gccgccgaga gcagcccctg ctggctgcgc 600
ctggccatgg agctggccgt ggtgaccggc cagcgcgtgg gcgacctgtg cgagatgaag 660
tggagcgaca tcgtggacgg ctacctgtac gtggagcaga gcaagaccgg cgtgaagatc 720
gccatcccca ccgccctgca catcgacgcc ctgggcatca gcatgaagga gaccctggac 780
aagtgcaagg agatcctggg cggcgagacc atcatcgcca gcacccgccg cgagcccctg 840
agcagcggca ccgtgagccg ctacttcatg cgcgcccgca aggccagcgg cctgagcttc 900
gagggcgacc cccccacctt ccacgagctg cgcagcctga gcgcccgcct gtacgagaag 960
cagatcagcg acaagttcgc ccagcacctg ctgggccaca agagcgacac catggccagc 1020
cagtaccgcg acgaccgcgg ccgcgagtgg gacaagatcg agatcaagta a 1071
<210>22
<211>356
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>SynInt的氨基酸序列
<400>22
Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly
20 25 30
Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala
35 40 45
Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu
50 55 60
Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu
65 70 75 80
Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr
85 90 95
Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro
100 105 110
Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu
115 120 125
Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg
130 135 140
Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile
145 150 155 160
Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg
165 170 175
Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala
180 185 190
Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val
195 200 205
Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile
210 215 220
Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile
225 230 235 240
Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys
245 250 255
Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile
260 265 270
Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr
275 280 285
Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro
290 295 300
Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys
305 310 315 320
Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp
325 330 335
Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys
340 345 350
Ile Glu Ile Lys
355
<210>23
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的寡核苷酸A’
<400>23
ggggatccat ggccctgacc aaggccgaga tgagcgagta cctgttcgac aagctgggcc 60
tgagcaagcg 70
<210>24
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的寡核苷酸B’
<400>24
gggcgcggcg gatctcctcg aagaacagct ccaccagctc cttggcgtcg cgcttgctca 60
ggcccagctt 70
<210>25
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的寡核苷酸C’
<400>25
cgaggagatc cgccgcgccc tggagaacgg cgagcaggtg aagctgagcg gcttcggcaa 60
cttcgacctg 70
<210>26
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的寡核苷酸D’
<400>26
atgtcctcgc cggtcttggg gttgcggccg gggcgctggt tcttgtcgcg caggtcgaag 60
ttgccgaagc 70
<210>27
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的寡核苷酸E’
<400>27
cccaagaccg gcgaggacat ccccatcacc gcccgccgcg tggtgacctt ccgccccggc 60
cagaagctga 70
<210>28
<211>67
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的寡核苷酸F’
<400>28
cccagatctc tactcgtcct tggggctggc gttctccacg cggctcttca gcttctggcc 60
ggggcgg 67
<210>29
<211>300
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>对玉米优化的SynHFa
<400>29
atggccctga ccaaggccga gatgagcgag tacctgttcg acaagctggg cctgagcaag 60
cgcgacgcca aggagctggt ggagctgttc ttcgaggaga tccgccgcgc cctggagaac 120
ggcgagcagg tgaagctgag cggcttcggc aacttcgacc tgcgcgacaa gaaccagcgc 180
cccggccgca accccaagac cggcgaggac atccccatca ccgcccgccg cgtggtgacc 240
ttccgccccg gccagaagct gaagagccgc gtggagaacg ccagccccaa ggacgagtag 300
<210>30
<211>99
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>SynHFa的氨基酸序列
<400>30
Met Ala Leu Thr Lys Ala Glu Met Ser Glu Tyr Leu Phe Asp Lys Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ser Lys Arg Asp Ala Lys Glu Leu Val Glu Leu Phe Phe Glu
20 25 30
Glu Ile Arg Arg Ala Leu Glu Asn Gly Glu Gln Val Lys Leu Ser Gly
35 40 45
Phe Gly Asn Phe Asp Leu Arg Asp Lys Asn Gln Arg Pro Gly Arg Asn
50 55 60
Pro Lys Thr Gly Glu Asp Ile Pro Ile Thr Ala Arg Arg Val Val Thr
65 70 75 80
Phe Arg Pro Gly Gln Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Asn Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Asp Glu
<210>31
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的寡核苷酸a
<400>31
ggggatccat gaccaagagc gagctgatcg agcgcctggc cacccagcag agccacatcc 60
ccgccaagac 70
<210>32
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的寡核苷酸b
<400>32
ccagggtgct ggccatgtgc tccagcatct ccttcacggc gtcctccacg gtcttggcgg 60
ggatgtggct 70
<210>33
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的寡核苷酸c
<400>33
gcacatggcc agcaccctgg cccagggcga gcgcatcgag atccgcggct tcggcagctt 60
cagcctgcac 70
<210>34
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的寡核苷酸d
<400>34
tccaccttgt cgccggtctt ggggttgcgg ccggtgcggg gggcgcggta gtgcaggctg 60
aagctgccga 70
<210>35
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的寡核苷酸e
<400>35
aagaccggcg acaaggtgga gctggagggc aagtacgtgc cccacttcaa gcccggcaag 60
<210>36
<211>62
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的寡核苷酸f
<400>36
cccagatctc tagccgtaga tgttggcgcg gtcgcgcagc tccttgccgg gcttgaagtg 60
gg 62
<210>37
<211>285
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>对玉米优化的SynHFb
<400>37
atgaccaaga gcgagctgat cgagcgcctg gccacccagc agagccacat ccccgccaag 60
accgtggagg acgccgtgaa ggagatgctg gagcacatgg ccagcaccct ggcccagggc 120
gagcgcatcg agatccgcgg cttcggcagc ttcagcctgc actaccgcgc cccccgcacc 180
ggccgcaacc ccaagaccgg cgacaaggtg gagctggagg gcaagtacgt gccccacttc 240
aagcccggca aggagctgcg cgaccgcgcc aacatctacg gctag 285
<210>38
<211>94
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>SynHFb的氨基酸序列
<400>38
Met Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr Gln Gln Ser His
1 5 10 15
Ile Pro Ala Lys Thr Val Glu Asp Ala Val Lys Glu Met Leu Glu His
20 25 30
Met Ala Ser Thr Leu Ala Gln Gly Glu Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe
35 40 45
Gly Ser Phe Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Thr Gly Arg Asn Pro
50 55 60
Lys Thr Gly Asp Lys Val Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Val Pro His Phe
65 70 75 80
Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Ala Asn Ile Tyr Gly
85 90
<210>39
<211>75
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynXis的寡核苷酸I
<400>39
ggatccgcca ccatgtacct gaccctgcag gagtggaacg cccgccagcg ccgcccccgc 60
agcctggaga ccgtg 75
<210>40
<211>75
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynXis的寡核苷酸II
<400>40
cgcggccgtc cttcacgggc ggcgggaaga tgcggcactc gcgcacccag cggcgcacgg 60
tctccaggct gcggg 75
<210>41
<211>75
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynXis的寡核苷酸III
<400>41
gcccgtgaag gacggccgcg agtacctgtt ccacgagagc gccgtgaagg tggacctgaa 60
ccgccccgtg accgg 75
<210>42
<211>73
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SynXis的寡核苷酸IV
<400>42
ggagctctca gctcttggcc ttcttgccgt tgcggatgcg cttcagcagg ccgccggtca 60
cggggcggtt cag 73
<210>43
<211>219
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>对玉米优化的SynXis
<400>43
atgtacctga ccctgcagga gtggaacgcc cgccagcgcc gcccccgcag cctggagacc 60
gtgcgccgct gggtgcgcga gtgccgcatc ttcccgccgc ccgtgaagga cggccgcgag 120
tacctgttcc acgagagcgc cgtgaaggtg gacctgaacc gccccgtgac cggcggcctg 180
ctgaagcgca tccgcaacgg caagaaggcc aagagctga 219
<210>44
<211>72
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>SynXis的氨基酸序列
<400>44
Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro
20 25 30
Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val
35 40 45
Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile
50 55 60
Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser
65 70
<210>45
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>45
cccgcgccgc caagagcaag gtgcgccgca gccgc 35
<210>46
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>46
gcggctgcgg cgcaccttgc tcttggcggc gcggg 35
<210>47
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>47
gatcactagt 10
<210>48
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>48
gcgtgggcga cctgtgcaag atgaagtgga gcgac 35
<210>49
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>49
gtcgctccac ttcatcttgc acaggtcgcc cacgc 35
<210>50
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>50
gggtacgtaa gtttctgctt ctacctttg 29
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>51
ccccagctgc acatcaacaa attttggtc 29
<210>52
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>52
catgagctcg ccac 14
<210>53
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>53
catggtggcg agct 14
<210>54
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>54
tcgatgaagc ctgctttttt atactaactt gagcg 35
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>55
gtaccgctca agttagtata aaaaagcagg cttca 35
<210>56
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>56
ggaagcttct gttacaggtc actaatac 28
<210>57
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>57
cctcgagaaa tcaaataatg attttat 27
<210>58
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>58
cctcgagtga agcctgcttt tttatactaa gttggcatta 40
<210>59
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>59
tcgacggtac cagatctact agttgcggcc gcgctagcg 39
<210>60
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>60
gatccgctag cgcggccgca actagtagat ctggtaccg 39
<210>61
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>61
agctgcggcc gc 12
<210>62
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>62
agctagatct 10
<210>63
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>63
agctactagt 10
<210>64
<211>3452
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>带内含子的PMI
<400>64
atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60
gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120
catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180
gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240
ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300
aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtac caagctgcga 360
atcttcgttt ttttaaggaa ttctcgatct ttatggtgta taggctctgg gttttctgtt 420
ttttgtatct cttaggattt tgtaaattcc gatccgcggt tgatgaaaga ataacgtatt 480
ctttcatcaa gatctgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg gatctttcta 540
tggccactta gtagtatatt tcaaaaattc tccaatcgag ttcttcattc gcattttcag 600
tcattttctc ttcgacgttg tttttaagcc tgggtattac tcctatttag ttgaactctg 660
cagcaatctt agaaaattag ggttttgagg tttcgatttc tctaggtaac cgatctattg 720
cattcatctg aatttctgca tatatgtctt agatttctga taagcttacg atacgttagg 780
tgtaattgaa gtttattttt caagagtgtt attttttgtt tctgaatttt tcaggtatcc 840
cgatggatgc cgccgagcgt aactataaag atcctaacca caagccggag ctggtttttg 900
cgctgacgcc tttccttgcg atgaacgcgt ttcgtgaatt ttccgagatt gtctccctac 960
tccagccggt cgcaggtatt agtactattc ttttgtttct ctaatcagaa acaattaaac 1020
ttttaaaatg ttagtatatt cttaggtaga atacgtggct gttattagtt ggatgcagta 1080
tacatatgga aataggaaaa aatgtacgga gttagtttgt ttaatatttt tcctttctag 1140
atttttttct ctaattgtga ttttttcttt atcatccaat taattgaatt tttcaaaatt 1200
attattcaaa aacgatggta aaaaaaaaca atgaatttta aagttattaa aatcacggaa 1260
aacaattcta taaaagttat gacgttgcat gggaaatata cgggttcggg tcaatttaag 1320
tggatcgggt catattttct tgagtaatta aaagttaatg atttaattta atgaaaaaat 1380
taataactaa tcaacacgaa atttgaatgt ttttgttcgt tacaggtgca catccggcga 1440
ttgctcactt tttacaacag cctgatgccg aacgtttaag cgaactgttc gccagcctgt 1500
tgaatatgca gggtgaagaa aaatcccgcg cgctggcgat tttaaaatcg gccctcgata 1560
gccagcaggg tgaaccgtgg caaacgattc gtttaatttc tgaattttac ccggaagaca 1620
gcggtctgtt ctccccgcta ttgctgaatg tggtgaaatt gaaccctggc gaagcgatgt 1680
tcctgttcgc tgaaacaccg cacgcttacc tgcaaggtat atatatgaat cgatttctcc 1740
cttttgattt atgaatctgc tggtgctttg atcatattat ctgattgatt tgtgaatcaa 1800
aactgcaatt atccgatggt ttcgatcatt taaatctcgt ctcgtgagtg ttaatgtagt 1860
tgcatattta gtaaccgatg atttcgattt cagtttgatt tttgatcatc ttcgcattgc 1920
actagtgaat ctctcacata tcgtgttttg atatttgatt aacgtttctc ttcattgatc 1980
tcttcatggt catggttcca attacagttt atgaattaca tgaacatgat ccgtcgatgt 2040
tcttgtgttt gatttgcgtt tttatggtgt ttctctcctg ttgattactg tttaagagtg 2100
agctgttaac acttaatgat tggctaggat ttagattttg tctattcttt atagtaaaaa 2160
gttaacatca ttgaaactaa ggacaatatc ctaatttggc ggtagtgtat tagtgtcccc 2220
taatgttttg ttccagattt gtgactgtgg atcaacaata tcacgtgaaa ccttaaaacc 2280
atatcgaatt ttataataag aactttaggg aatactcttg tgttgacact ttcgaggtga 2340
aacatatcac tttgtgggga tataattgaa taagcaagtg ggtcatgatt ggtttcagca 2400
attgttaaat aacatctcaa tactttttgg atctggttta ggtataaggg acttctttag 2460
ttttgtagta cattgtttca cacttgttct taacatttct gtattacagg tcgtggcgctg 2520
gaagtgatgg caaactccga taacgtgctg cgtgcgggtc tgacgcctaa atacattgat 2580
attccggaac tggttgccaa tgtgaaattc gaagccaaac cggctaacca gttgttgacc 2640
cagccggtga aacaaggtta ttaacgtttt ccacctctct tgttttttta tagtattctt 2700
cttagcctta ctagattgat ccaccttcag gggttaccga acattgccat tttaaactga 2760
aaacatatgt tccttcgttt tgttttacgg taactagcaa aacattggac attcttaagt 2820
atgtatgtct gagttttgag ttttgtacta gagagtctaa caaagctaag acaaaattta 2880
ataacgtaat tgtgtgagct ttaatgcaat tttattcggt tgttgtaaat tgtgtcatgt 2940
gttttcgtgg taataccggg tacttcatat ctagataact attcatgtat aagctaacaa 3000
gtagggtatc aatgtccaaa tgattgcttg ccattgtaac aaagaactct gtcttcttta 3060
tttgctttgc tcaaaatggc tctgtttcat ccattgctta tgacgagaaa cggcatattt 3120
aaccatgact ggttcatatg gtattgaaat attttttcat tgatgcaggt gcagaactgg 3180
acttcccgat tccagtggat gattttgcct tctcgctgca tgaccttagt gataaagaaa 3240
ccaccattag ccagcagagt gccgccattt tgttctgcgt cgaaggcgat gcaacgttgt 3300
ggaaaggttc tcagcagtta cagcttaaac cgggtgaatc agcgtttatt gccgccaacg 3360
aatcaccggt gactgtcaaa ggccacggcc gtttagcgcg tgtttacaac aagctgtaag 3420
agcttactga aaaaattaac atctcttgct aa 3452
<210>65
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>65
aattggtacc tgaagcctgc ttttttatac taacttgagc gcctagg 47
<210>66
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>66
aattcctagg cgctcaagtt agtataaaaa agcaggcttc aggtacc 47
<210>67
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>67
ttgactggca ggtaccaagc tgcgaatctt cg 32
<210>68
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>68
attggccacc acctgaaaaa ttcagaaaca aa 32
<210>69
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>69
ggatccaacc atgttacgtc ctgtagaaa 29
<210>70
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>70
cagcttggta cctgccagtc aacagacgcg ac 32
<210>71
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>71
ttgactggca ggtaccaagc tgcgaatctt cg 32
<210>72
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>72
gtcgactcat tgtttgcctc cctgctgcgg 30
<210>73
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>73
gatctcgctc aagttagtat aaaaaagcag gcttcagcta gc 42
<210>74
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>74
gatcgctagc tgaagcctgc ttttttatac taacttgagc ga 42
<210>75
<211>410
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>CMPS启动子片段
<400>75
ggatcctggc agacaaagtg gcagacatac tgtcccacaa atgaagatgg aatctgtaaa 60
agaaaacgcg tgaaataatg cgtctgacaa aggttaggtc ggctgccttt aatcaatacc 120
aaagtggtcc ctaccacgat ggaaaaactg tgcagtcggt ttggcttttt ctgacgaaca 180
aataagattc gtggccgaca ggtgggggtc caccatgtga aggcatcttc agactccaat 240
aatggagcaa tgacgtaagg gcttacgaaa taagtaaggg tagtttggga aatgtccact 300
cacccgtcag tctataaata cttagcccct ccctcattgt taagggagca aaatctcaga 360
gagatagtcc tagagagaga aagagagcaa gtagcctaga agtaggatcc 410
<210>76
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>76
actagtggcc 10
<210>77
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>77
ggaagcttct gttacaggtc a 21
<210>78
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>78
cctcgagaaa tcaaataatg attttat 27
<210>79
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>79
agctggtacc caattgggta cc 22
<210>80
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>80
tcgacctagg caattgccta gg 22
<210>81
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>81
agctgctagc ggatccgcta gc 22
<210>82
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>82
tcgaagatct cggccgagat ct 22
<210>83
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>83
actagtggcc 10
<210>84
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>84
gggcaattgg gtacctacag gtcactaata ccatct 36
<210>85
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>85
gggcaattgc ctaggcaaat aatgatttta ttttga 36
<210>86
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>86
ggatccgcta gctacaggtc actaatacca tct 33
<210>87
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>87
gggagatctc aaataatgat tttattttga 30
<210>88
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>88
cgcgactagt 10
<210>89
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>89
gtacggctcg agcc 14
<210>90
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>90
ctaggagatc tc 12
<210>91
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>91
agctactagt 10
<210>92
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>92
ccagatctgg tgca 14
<210>93
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>93
gtacggacta gtcc 14
<210>94
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>94
agctctcgag 10
<210>95
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>95
ccggatccgg catg 14
<210>96
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>96
ctaaggatcc aagatcaaag gcttaaaaag c 31
<210>97
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>97
ggaatctaga tgtataaacc aaatgagcag 30
<210>98
<211>43
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>98
gatctgggga caagtttgta caaaaaagca ggcttcagct agc 43
<210>99
<211>43
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>99
gatcgctagc tgaagcctgc ttttttgtac aaacttgtcc cca 43
<210>100
<211>46
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>100
aattggtacc tgaacccagc tttcttgtac aaagtggtcc cctagg 46
<210>101
<211>46
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>101
aattcctagg ggaccacttt gtacaagaaa gctgggttca ggtacc 46
<210>102
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>102
tcgaagcatg ct 12
<210>103
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>103
gatcacgcgt 10
<210>104
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>104
ccggatccgg gc 12
<210>105
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>105
gatccgctca agttagtata aaaaagcagg cttcatga 38
<210>106
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>106
gatctcatga agcctgcttt tttatactaa cttgagcg 38
<210>107
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>107
gggccctctg ttacaggtca ctaataccat ctaag 35
<210>108
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>108
actagtgaaa tcaaataatg attttatttt g 31
<210>109
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>109
agggcccagc ctgctttttt atactaagtt ggcatta 37
<210>110
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>110
tactagtcaa ataatgattt tattttgact gatag 35
<210>111
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>111
cttgatgaaa gaataacgta ttctttcatc aagggcc 37
<210>112
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>112
cttgatgaaa gaatacgtta ttctttcatc aaggtac 37
<210>113
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>113
tagatctgtt acaggtcact aataccatct aagt 34
<210>114
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>114
atggccacgc tcaagttagt ataaaaaagc tgaac 35
<210>115
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>115
ggagatcttg aagcctgctt ttttatact 29
<210>116
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>116
cccctaggaa atcaaataat gattttattt tg 32
<210>117
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>117
ggtaccaagc tgcgaatctt cgttttt 27
<210>118
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>118
ggccatagaa agatctggaa tttacaa 27
<210>119
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>119
agatctgtta caggtcacta atac 24
<210>120
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>120
cctaggcgct caagttagta taaaaaagct gaacg 35
<210>121
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>121
ccgctagctg aagcctgctt ttttatac 28
<210>122
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>122
ggagatctga aatcaaataa tgattttatt 30
<210>123
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>123
ggtctagatg aagcctgctt ttttatact 29
<210>124
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>124
gctagctctg ttacaggtca ctaatac 27
<210>125
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>125
agatctcgct caagttagta taaaaaagct gaacg 35
<210>126
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>126
tctagatctg ttacaggtca ctaatac 27
<210>127
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>127
cgagctcagc tgatgaaaaa gcctgaactc 30
<210>128
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>128
tgcagcaagc ttcactggat tttggtttta 30
<210>129
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>129
tgcagctcta gacactggat tttggtttta 30
<210>130
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>130
ggctgaggta cctgaagcct gcttttttat 30
<210>131
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>131
cgtagcccta gggaaatcaa ataatgattt 30
<210>132
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>132
ggctgaggta cctctgttac aggtcactaa 30
<210>133
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>133
cgtagcccta ggcgctcaag ttagtataaa 30
<210>134
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>134
ggctgaggta cctgaagcct gcttttttat 30
<210>135
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>135
cgtagcgagc tcgaaatcaa ataatgattt 30
<210>136
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>136
ggctgaggta cctctgttac aggtcactaa 30
<210>137
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>137
cgtagcgagc tccgctcaag ttagtataaa 30
<210>138
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>138
ctaggagatc tc 12
<210>139
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>139
gtacgaattc 10
<210>140
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>140
aattgtctag ac 12
<210>141
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>141
gctagcctcc gtccgacgac tcaatc 26
<210>142
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>142
ggtaccggcg cgccgcaaca tgagatggca ccgt 34
<210>143
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>143
ctaggcgcgc 10
<210>144
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>144
gtacggcgcg cc 12
<210>145
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>145
gggctagctc tgttacaggt cactaata 28
<210>146
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>146
ccctcgagcg ctcaagttag tataaaaaag 30
<210>147
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>147
ggggcgcgcc tctgttacag gtcactaata 30
<210>148
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>148
cccctaggcg ctcaagttag tataaaaaag 30
<210>149
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>149
gtacggcaat tgcc 14
<210>150
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>150
tcgagagcct gcttttttgt acaaacttgt cccc 34
<210>151
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>151
aattggggac aagtttgtac aaaaaagcag gctc 34
<210>152
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>152
aattgaccca gctttcttgt acaaagtggt cccctgca 38
<210>153
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>153
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc 30
<210>154
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>154
gtaattaagc ttttccacct ctcttgtt 28
<210>155
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>155
gatcctgcag caatggaaaa atatttcaat ac 32
<210>156
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>156
ggcggtagtg tattagtgtc 20
<210>157
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>157
gatgctcttc gtccagatca 20
<210>158
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>158
ggaagcgacc aacgccttga 20
<210>159
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>159
tgcgacacct gcgtcgaaga 20
<210>160
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>160
gggctagctg aagcctgctt ttttatacta 30
<210>161
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>161
ccctcgagaa atcaaataat gattttattt tg 32
<210>162
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>162
ggggcgcgcc tgaagcctgc ttttttatac ta 32
<210>163
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>163
cccctaggaa atcaaataat gattttattt tg 32
<210>164
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>164
gaagcgaagg ttgtggatct 20
<210>165
<211>34
<212>DNA
<213>甜菜曲顶病病毒
<400>165
ggggccatcc ggtaatatta atgcggatgg cccc 34
<210>166
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>166
ggcctcgagg atatcttggc aattgtagat gctattt 37
<210>167
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>167
ggcctcgaga tatcacaacg aacacttcct atga 34
<210>168
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>168
ggcgcgcctc acatcaacat ctttagct 28
<210>169
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>169
ggacgcgtat tgaatcgggc tctcttca 28
<210>170
<211>14
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>170
gatcggtacg tacc 14
<210>171
<211>12
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸
<400>171
aattggcgcg cc 12
<210>172
<211>31
<212>DNA
<213>噬菌体λ
<400>172
tgaagcctgc ttttttatac taacttgagc g 31
<210>173
<211>243
<212>DNA
<213>噬菌体λ
<400>173
tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60
ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120
tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180
gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240
ttc 243
<210>174
<211>108
<212>DNA
<213>噬菌体λ
<400>174
tgaagcctgc ttttttatac taagttggca ttataaaaaa gcattgctta tcaatttgtt 60
gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata aaatcattat ttgatttc 108
<210>175
<211>166
<212>DNA
<213>噬菌体λ
<400>175
tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60
ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120
tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tgagcg 166
<210>176
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttB1
<400>176
agcctgcttt tttgtacaaa cttgt 25
<210>177
<211>233
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttP1
<400>177
caaataatga ttttattttg actgatagtg acctgttcgt tgcaacaaat tgatgagcaa 60
tgctttttta taatgccaac tttgtacaaa aaagctgaac gagaaacgta aaatgatata 120
aatatcaata tattaaatta gattttgcat aaaaaacaga ctacataata ctgtaaaaca 180
caacatatcc agtcactatg aatcaactac ttagatggta ttagtgacct gta 233
<210>178
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttB2
<400>178
acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25
<210>179
<211>233
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttP2
<400>179
tacaggtcac taataccatc taagtagttg attcatagtg actggatatg ttgtgtttta 60
cagtattatg tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca 120
ttttacgttt ctcgttcagc tttcttgtac aaagttggca ttataagaaa gcattgctta 180
tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata aaatcattat ttg 233
<210>180
<211>100
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttL1
<400>180
agcctgcttt tttgtacaaa gttggcatta taaaaaagca ttgctcatca atttgttgca 60
acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa tcattatttg 100
<210>181
<211>158
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttR1
<400>181
tacaggtcac taataccatc taagtagttg attcatagtg actggatatg ttgtgtttta 60
cagtattatg tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca 120
ttttacgttt ctcgttcagc ttttttgtac aaacttgt 158
<210>182
<211>100
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttL2
<400>182
acccagcttt cttgtacaaa gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca 60
acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa tcattatttg 100
<210>183
<211>158
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>AttR2
<400>183
tacaggtcac taataccatc taagtagttg attcatagtg actggatatg ttgtgtttta 60
cagtattatg tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca 120
ttttacgttt ctcgttcagc tttcttgtac aaagtggt 158
<210>184
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>184
caggtatata tatgaatcga tttctccctt 30
<210>185
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>反向引物
<400>185
tcgtccagat catcctgtaa tacagaaatg tt 32
Claims (133)
1、一种获得植物细胞中位点特异性DNA重组的方法，该方法包括：
向植物细胞中引入包含第一Int识别位点的靶序列；
向所述植物细胞中引入包含第二Int识别位点的供体序列；和
向所述植物细胞中引入整合酶或整合酶复合物。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞。
3、如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞。
4、如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是小麦细胞，玉米细胞、稻细胞、大麦细胞、大豆细胞、棉花植物细胞、番茄细胞和烟草细胞之一。
5、如权利要求1所述的方法，其中通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，微粒轰击，电穿孔，PEG介导的转化和显微注射之一将所述靶序列引入到所述植物细胞中。
6、如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列稳定地整合到所述植物细胞基因组中。
7、如权利要求6所述的方法，其中所述植物细胞是含有单拷贝所述靶序列的靶系细胞。
8、如权利要求1所述的方法，其中所述第一Int识别位点是修饰的λ整合酶识别位点。
9、如权利要求1所述的方法，其中所述第一Int识别位点包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ IDNO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3之一。
10、如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列包含目的序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、负选择标记、启动子、表达盒、内含子和其任何一种的一部分中的至少一种。
11、如权利要求10所述的方法，其中所述靶序列包含PPO基因，LUC基因，NPTII基因，GUS基因，PMI基因，HPT基因和它们任何一种的一部分中的至少一种。
12、如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列还包含第三Int识别位点。
13、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点相同。
14、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点不相同。
15、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点不能相互重组。
16、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点至少之一是修饰的λ整合酶识别位点。
17、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点彼此相对同向。
18、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点彼此相对反向。
19、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点位于所述靶序列中，使得所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点相互邻近。
20、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点位于所述靶序列中，使得第一核苷酸序列位于所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点之间。
21、如权利要求20所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含目的序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、负选择标记、启动子、表达盒、内含子和其任何一种的一部分中的至少一种。
22、如权利要求21所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含PPO基因，LUC基因，NPTII基因，GUS基因，PMI基因，HPT基因和它们任何一种的一部分中的至少一种。
23、如权利要求12所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点每个被独立地选择和包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ IDNO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
24、如权利要求1所述的方法，其中通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，微粒轰击，电穿孔，PEG介导的转化和显微注射之一将所述供体序列引入到所述植物细胞中。
25、如权利要求1所述的方法，其中所述供体序列在病毒复制子上引入所述植物细胞。
26、如权利要求25所述的方法，其中所述病毒复制子能在所述植物细胞中自主复制。
27、如权利要求25所述的方法，其中所述病毒复制子来源于双粒病毒组。
28、如权利要求27所述的方法，其中所述双粒病毒组是玉米条斑病毒，小麦矮化病毒，烟草金色花叶病毒和甜菜曲顶病毒之一。
29、如权利要求25所述的方法，其中通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，微粒轰击，电穿孔，PEG介导的转化和显微注射之一将所述病毒复制子引入到所述植物细胞中。
30、如权利要求1所述的方法，其中所述第二Int识别位点是修饰的λ整合酶识别位点。
31、如权利要求1所述的方法，其中所述第二Int识别位点包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ IDNO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
32、如权利要求1的方法，所述其中所述供体序列包含目的序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、负选择标记、启动子、表达盒、内含子和其任何一种的一部分中的至少一种。
33、如权利要求32的方法，所述其中所述供体序列包含PPO基因，LUC基因，NPTII基因，GUS基因，PMI基因，HPT基因和它们任何一种的一部分中的至少一种。
34、如权利要求12所述的方法，其中所述供体序列还包含第四Int识别位点。
35、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点相同。
36、如权利要求35所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点彼此相对反向。
37、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点不相同。
38、如权利要求37所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点彼此相对同向。
39、如权利要求37所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点彼此相对反向。
40、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点不能相互重组。
41、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点中至少一个识别位点是修饰的λ整合酶识别位点。
42、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点位于所述供体序列中，使得所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点相互邻近。
43、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点位于所述供体序列中，使得预先选定的核苷酸序列位于所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点之间。
44、如权利要求43所述的方法，其中所述预先选定的核苷酸序列包含目的序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、负选择标记、启动子、表达盒、内含子和它们任何一种的一部分中的至少一种。
45、如权利要求44所述的方法，其中所述预先选定的核苷酸序列包含PPO基因，LUC基因，NPTII基因，GUS基因，PMI基因，HPT基因和它们任何一种的一部分中的至少一种。
46、如权利要求34所述的方法，其中所述第二Int识别位点能与所述第一Int识别位点重组，并且所述第四Int识别位点能与所述第三Int识别位点重组。
47、如权利要求46所述的方法，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点每个被独立地选择和包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ IDNO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
48、如权利要求47所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点每个被独立地选择和包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ IDNO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
49、如权利要求1所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物包含野生型λ整合酶和修饰的λ整合酶中的一种。
50、如权利要求49所述的方法，其中所述修饰的λ整合酶包含Int-h和Int-h/218中的一种。
51、如权利要求50所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含整合宿主因子。
52、如权利要求51所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含切除酶。
53、如权利要求51所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物作为一个或多个核苷酸序列引入到所述植物细胞中，该一个或多个核苷酸序列包含所述整合酶或整合酶每个组成蛋白质的编码区。
54、如权利要求53所述的方法，其中所述一个或多个核苷酸序列包含SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：43中至少一个。
55、如权利要求54所述的方法，其中SEQ ID NO：21被修饰以使碱基对520从“G”改变为“A”。
56、如权利要求55所述的方法，其中SEQ ID NO：21被进一步修饰以使碱基对652从“G”改变为“A”。
57、如权利要求53所述的方法，其中所述每个组成蛋白质的编码区可操作地连接植物可表达启动子。
58、如权利要求57所述的方法，其中植物可表达启动子是组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、组织偏爱性启动子、发育调节型启动子、细胞特异性启动子和细胞器特异性启动子之一。
59、如权利要求53所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物稳定地整合到所述植物细胞基因组中。
60、如权利要求53所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物在所述植物细胞中瞬时表达。
61、如权利要求60所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物在病毒复制子上引入所述植物细胞中。
62、如权利要求61所述的方法，其中所述病毒复制子能在所述植物细胞中自主复制。
63、如权利要求61所述的方法，其中所述病毒复制子来源于双粒病毒组。
64、如权利要求63所述的方法，其中所述双粒病毒组是玉米条斑病毒，小麦矮化病毒，烟草金色花叶病毒和甜菜曲顶病毒之一。
65、如权利要求61所述的方法，其中通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，微粒轰击，电穿孔，PEG介导的转化和显微注射中的一种将所述病毒复制子引入到所述植物细胞中。
66、如权利要求60所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物作为一个或多个RNA分子引入所述植物细胞。
67、如权利要求53所述的方法，其中优化所述每个组成蛋白质的编码序列用于在所述植物细胞中表达。
68、如权利要求1所述的方法，其中所述的整合酶或整合酶复合物作为一个或多个蛋白质引入到所述植物细胞中。
69、如权利要求68所述的方法，其中通过电穿孔和显微注射中的一种将所述一个或多个蛋白质引入到所述植物细胞中。
70、如权利要求68所述的方法，其中通过包含VirE或VirF融合蛋白质的农杆菌(Agrobacterium)将所述一个或多个蛋白质引入到所述植物细胞中。
71、如权利要求1所述的方法，其中同时进行引入所述供体序列和引入所述整合酶或整合酶复合物。
72、如权利要求1所述的方法，其中通过第一种方法将所述靶序列引入到所述植物细胞中，通过第二种方法引入所述供体序列，和通过第三种方法引入所述整合酶或整合酶复合物。
73、如权利要求72所述的方法，其中所述第一种方法，所述第二种方法和所述第三种方法的每种方法独立地选自农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，微粒轰击，电穿孔，PEG介导的转化和显微注射和有性繁殖，其中所述第一种方法，所述第二种方法和所述第三种方法中至少一种方法不是有性繁殖。
74、如权利要求73所述的方法，其中同时向所述植物细胞中引入所述供体序列和所述整合酶或整合酶复合物。
75、如权利要求73所述的方法，其中在所述供体序列和所述整合酶或整合酶复合物引入之前向所述植物细胞引入所述靶序列。
76、如权利要求73所述的方法，其中在所述靶序列和所述供体序列已经引入所述植物细胞中以后向所述植物细胞中引入所述整合酶或整合酶复合物。
77、如权利要求73所述的方法，其中所述供体序列在被引入所述植物细胞之前被稳定地整合到第二种植物细胞的基因组中。
78、如权利要求34所述的方法，其中所述靶序列含有不完整核苷酸序列，所述供体序列含有补全序列，使得所述靶序列和所述供体序列之间的重组产生完整核苷酸序列。
79、如权利要求78所述的方法，其中所述不完整核苷酸序列包含目的序列、基因、内含子、启动子、表达盒、选择性标记、可观察的标记和负选择标记中的至少一种。
80、如权利要求1所述的方法，其中所述供体序列包含不与所述靶序列的所述第一Int识别位点重组、并且能够在所述植物细胞中随后DNA重组中使用的第三Int识别位点。
81、如权利要求80所述的方法，其中所述第一Int识别位点，所述第二Int识别位点和所述第三Int识别位点的每个识别位点被独立地选择和包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ IDNO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
82、如权利要求34所述的方法，其中所述供体序列包含不与所述靶序列的所述第一Int识别位点或所述第三Int识别位点中任一个识别位点重组、并且能够在所述植物细胞中随后DNA重组中使用的第五Int识别位点。
83、如权利要求82所述的方法，其中所述第一Int识别位点、所述第二Int识别位点、所述第三Int识别位点、所述第四Int识别位点和所述第五Int识别位点中每个识别位点被独立地选择和包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ IDNO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
84、如权利要求1所述的方法，其进一步包括：
鉴定通过所述靶序列和所述供体序列之间的序列交换获得的重组产物。
85、如权利要求84所述的方法，其中所述重组产物包含至少一个新产生的Int识别位点，且其中所述新产生的Int识别位点在第一侧侧翼为从所述靶序列获得的序列，在第二侧侧翼为从所述供体序列获得的序列。
86、如权利要求34所述的方法，其进一步包括：
鉴定通过所述靶序列和所述供体序列之间的序列交换获得的重组产物。
87、如权利要求86所述的方法，其中所述重组产物包含至少一个新产生的Int识别位点，且其中所述新产生的Int识别位点在第一侧侧翼为从所述靶序列获得的序列，在第二侧侧翼为从所述供体序列获得的序列。
88、操作植物细胞中靶序列的方法，该方法包括：
向植物细胞引入靶序列，该靶序列含有(a)能相互重组的第一Int识别位点和第二Int识别位点和(b)位于所述第一Int识别位点和所述第二Int识别位点之间的第一核苷酸序列；
向所述植物细胞引入整合酶或整合酶复合物；和
鉴定包含改变的靶序列的重组产物。
89、如权利要求88所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第二Int识别位点同向，并且所述改变的靶序列不包含所述第一核苷酸序列。
90、如权利要求88所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第二Int识别位点反向，并且所述改变的靶序列包含相对于所述第一核苷酸序列原始方向反向的所述第一核苷酸序列。
91、如权利要求88所述的方法，其中所述第一Int识别位点和所述第二Int识别位点中每个识别位点被独立地选择和包含attB (SEQ IDNO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ IDNO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
92、如权利要求88所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含目的序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、负选择标记、启动子、表达盒、内含子和它们任何一种的一部分中的至少一种。
93、如权利要求88所述的方法，其中所述靶序列还包含不位于所述第一Int识别位点和所述第二Int识别位点之间的第二核苷酸序列。
94、如权利要求93所述的方法，其中所述第二核苷酸序列包含目的序列、分子标记、选择性标记、可观察的标记、负选择标记、启动子、表达盒、内含子和它们任何一种的一部分中的至少一种。
95、如权利要求93所述的方法，其中所述改变的靶序列包含相对于所述第一核苷酸序列原始方向而言反向方向的所述第一核苷酸序列和原始方向的所述第二核苷酸序列。
96、如权利要求88所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物包含野生型λ整合酶和修饰的λ整合酶中的一种。
97、如权利要求96所述的方法，其中所述修饰的λ整合酶包含Int-h和Int-h/218中的一种。
98、如权利要求97所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含整合宿主因子。
99、如权利要求98所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含切除酶。
100、一种用于获得植物细胞中位点特异性DNA重组的方法，该方法包括：
向植物细胞基因组中引入包含第一Int识别位点的靶序列，该第一Int识别位点包含attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attL3和attR3中的一种；
向所述植物细胞中引入含有第二Int识别位点的供体序列，该第二Int识别位点包含attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attL3和attR3中的一种；
向所述植物细胞中引入整合酶或整合酶复合物；和
鉴定通过所述靶序列和所述供体序列之间序列交换获得的所述植物细胞所述基因组中的重组产物。
101、如权利要求100所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物包含野生型λ整合酶和修饰的λ整合酶中的一种。
102、如权利要求101所述的方法，其中所述修饰的λ整合酶包含Int-h和Int-h/218中的一种。
103、如权利要求102所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含整合宿主因子。
104、如权利要求103所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含切除酶。
105、一种用于获得植物细胞中位点特异性DNA重组的方法，该方法包括
向植物细胞基因组中引入包含第一Int识别位点和第三Int识别位点的靶序列，其中所述第一Int识别位点和所述第三Int识别位点中的每个识别位点被独立地选择和包含attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attL3和attR3中的一种；
向所述植物细胞中引入包含第二Int识别位点和第四Int识别位点的供体序列，其中所述第二Int识别位点和所述第四Int识别位点中的每个识别位点被独立地选择和包含attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attL3和attR3中的一种；
向所述植物细胞中引入整合酶或整合酶复合物；和
鉴定通过所述靶序列和所述供体序列之间序列交换获得的所述植物细胞所述基因组中的重组产物。
106、如权利要求105所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物包含野生型λ整合酶和修饰的λ整合酶中的一种。
107、如权利要求106所述的方法，其中所述修饰的λ整合酶包含Int-h和Int-h/218中的一种。
108、如权利要求107所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含整合宿主因子。
109、如权利要求108所述的方法，其中所述整合酶或整合酶复合物还包含切除酶。
110、如权利要求1所述的方法，还包括鉴定包含通过所述靶序列和所述供体序列之间序列交换所获得的所述转基因植物细胞基因组中的重组产物的转基因植物细胞。
111、通过权利要求110所述方法获得的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞包含至少一个Int识别位点。
112、如权利要求111所述的植物细胞，其中所述Int识别位点包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQ ID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ IDNO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
113、包含权利要求111所述转基因植物细胞的转基因植物。
114、包含权利要求112所述转基因植物细胞的转基因植物。
115、如权利要求34所述的方法，还包括鉴定包含通过所述靶序列和所述供体序列之间序列交换所获得的所述转基因植物细胞基因组中的重组产物的转基因植物细胞。
116、通过权利要求115所述方法获得的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞包含至少一个Int识别位点。
117、如权利要求116所述的转基因植物细胞，其中所述Int识别位点包含attB(SEQ ID NO：172)，attB1(SEQ ID NO：176)，attB2(SEQID NO：178)，attP(SEQ ID NO：173)，attP1(SEQ ID NO：177)，attP2(SEQ ID NO：179)，attL(SEQ ID NO：174)，attL1(SEQ ID NO：180)，attL2(SEQ ID NO：182)，attR(SEQ ID NO：175)，attR1(SEQ ID NO：181)，attR2(SEQ ID NO：183)，attB3，attL3和attR3中的一种。
118、包含权利要求116所述转基因植物细胞的转基因植物。
119、包含权利要求117所述转基因植物细胞的转基因植物。
120、包含SEQ ID NO：21的分离的核苷酸序列。
121、如权利要求120所述分离的核苷酸序列，其中碱基对520从“G”改变为“A”。
122、如权利要求121所述分离的核苷酸序列，其中碱基对652从“G”改变为“A”。
123、如权利要求120所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37。
124、如权利要求120所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：43。
125、如权利要求120所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：43。
126、如权利要求121所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37。
127、如权利要求121所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：43。
128、如权利要求121所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：43。
129、如权利要求122所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37。
130、如权利要求122所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：43。
131、如权利要求122所述分离的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：43。
132、包含SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37的分离的核苷酸序列。
133、包含SEQ ID NO：43的分离的核苷酸序列。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36904102P | 2002-03-29 | 2002-03-29 | |
| US60/369,041 | 2002-03-29 | ||
| US42551202P | 2002-11-12 | 2002-11-12 | |
| US60/425,512 | 2002-11-12 | ||
| PCT/US2003/010124 WO2003083045A2 (en) | 2002-03-29 | 2003-03-28 | Lambda integrase mediated recombination in plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1863915A true CN1863915A (zh) | 2006-11-15 |
| CN1863915B CN1863915B (zh) | 2011-02-02 |
Family
ID=37390833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN038111748A Expired - Fee Related CN1863915B (zh) | 2002-03-29 | 2003-03-28 | 植物中λ整合酶介导的重组 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1863915B (zh) |
| ZA (1) | ZA200407769B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109415717A (zh) * | 2016-04-12 | 2019-03-01 | 辛普洛德生物技术有限责任公司 | 使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体 |
| CN113584069A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-02 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5227288A (en) * | 1990-10-01 | 1993-07-13 | Blattner Frederick R | DNA sequencing vector with reversible insert |
| DK0937098T3 (da) * | 1995-06-07 | 2002-12-02 | Invitrogen Corp | Rekombinatorisk kloning under anvendelse af gensplejsede rekombinationssites |
-
2003
- 2003-03-28 CN CN038111748A patent/CN1863915B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-27 ZA ZA200407769A patent/ZA200407769B/en unknown
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109415717A (zh) * | 2016-04-12 | 2019-03-01 | 辛普洛德生物技术有限责任公司 | 使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体 |
| CN109415717B (zh) * | 2016-04-12 | 2023-02-28 | 辛普洛德生物技术有限责任公司 | 使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体 |
| CN113584069A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-02 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用 |
| CN113584069B (zh) * | 2021-07-15 | 2023-12-15 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA200407769B (en) | 2006-12-27 |
| CN1863915B (zh) | 2011-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1193096C (zh) | 真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作 | |
| CN1155715C (zh) | 植物转化的改良方法 | |
| CN1175107C (zh) | 编码植物原卟啉原氧化酶及其抑制剂抗性突变体的dna分子 | |
| CN109652422B (zh) | 高效的单碱基编辑系统OsSpCas9-eCDA及其应用 | |
| CN107267524B (zh) | 用于基因打靶和性状堆叠的工程化转基因整合平台(etip) | |
| CN1155713C (zh) | 选择转基因植物细胞的方法 | |
| CN1628174A (zh) | 从真核生物基因组中去除核酸序列的重组系统和方法 | |
| CN1150320C (zh) | 植物转化方法 | |
| CN1455817A (zh) | 用于在真核基因组中置换、转移和富积dna的方法 | |
| CN101048508A (zh) | 植物发育和形态学的修饰 | |
| US20030226164A1 (en) | Lambda integrase mediated recombination in plants | |
| Yasumoto et al. | Targeted genome editing in tetraploid potato through transient TALEN expression by Agrobacterium infection | |
| CN1192110C (zh) | 用于植物转化的质粒和使用此质粒的方法 | |
| CN1193098C (zh) | 利用条件雌性不育性生产杂种种子的方法 | |
| CN1293711A (zh) | 编码mlo蛋白质并赋予植物抗真菌抗性的基因 | |
| CN1193097C (zh) | 向真核细胞运送的外源dna的改良整合方法 | |
| CN1341151A (zh) | 除草剂的靶基因和方法 | |
| CN101065490A (zh) | 用于植物的启动子分子 | |
| CN1185350C (zh) | 包含稻花药特异基因的dna及其转化的转基因植物 | |
| CN1809640A (zh) | 延迟植物中种子落粒的方法和手段 | |
| Miki et al. | Gene targeting facilitated by engineered sequence-specific nucleases: potential applications for crop improvement | |
| CN1351669A (zh) | 基于豌豆质体蓝素pete启动子的嵌合启动子 | |
| CN101037695A (zh) | 一种控制水稻花粉育性基因及应用 | |
| CN1216990C (zh) | 植物启动子及使用所说的启动子用于基因表达的方法 | |
| CN1610747A (zh) | 修饰高等植物基因组的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110202 Termination date: 20160328 |