CN1858247A - 一种预测达菲类药物用药安全性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种预测达菲类药物用药安全性的方法:通过测定受试者唾液酸酶蛋白家族Neu2蛋白基因Arg41Gln单核苷酸多态性位点的基因型,预测受试者对达菲类药物副作用的敏感性:对于该SNP位点的基因型为A/A的个体,达菲类药物会引起副作用;对于基因型为A/G的个体,使用达菲类药物存在一定的风险性;对于基因型为G/G的个体,使用达菲类药物是安全的。本发明还提供了一种简便易行的预测个体使用达菲类药物安全性的试剂盒。由于达菲的使用可能会导致严重的副作用,包括皮肤反应以及一些神经方面的疾病,在该SNP突变型出现概率近10%的亚洲地区,在使用达菲类抗流感药物前进行个体基因型的检测是必要的。
Description
技术领域
本发明涉及一种预测达菲类药物用药安全性的方法,特别涉及通过测定功能基因的单核苷酸多态性来预测个体对达菲类药物副作用的敏感性。
背景技术
达菲(Tamiflu)的活性成分为oseltamivir phosphate(磷酸奥司他为),进入体内后被代谢为oseltamivir carboxylate(奥司他为羧酸盐)。该药被认为是目前对人体最有效的抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的特效药(Butler,D.Wartime tactic doubles power of scarcebird-fu drug.Nature 2005;438:6.)。目前已有很多国家在大规模囤积Tamiflu,用来应对潜在的人群中的禽流感威胁。然而,据报道Tamiflu的使用可能会导致严重的副作用,包括皮肤反应以及一些神经方面的疾病。据日本官方报道(FDA),发生在日本的两起自杀事件和64例神经方面的不良反应(抽搐,精神狂乱等)可能是由Tamiflu的副作用引起的(http://www.fda.gov/cder/drug/infopage/tamiflu/QA20051117.htm),其它国家(如澳大利亚)也对Tamiflu可能存在的副作用进行了详细的报道。然而,Tamiflu为何会对某些人群(个体)引起严重的副作用,目前还没有详细的机制报道,达菲类药物的用药安全性则需要引起人们足够的重视。
发明内容
本发明的原理:
一、唾液酸酶结构分析
人体的唾液酸酶(sialidase)蛋白家族包括Neu1-Neu4四种蛋白,目前只有定位于胞浆的Neu2的晶体结构在2004年1月被解析出来(Chavas,L.M.et al.Crystal structure of thehuman cytosolic sialidase Neu2.Evidence for the dynamic nature of substrate recognition.J BiolChem 2005;280:469-75.)。Neu2的结构与病毒的唾液酸酶类似,并含有类似的活性中心。本发明的相关研究发现Neu2的217位亮氨酸距离活性中心较近,它可以为达菲的活性形式奥司他为羧酸盐(oseltamivir carboxylate)C6位的疏水基团提供一个较好的局部环境,从而促进oseltamivir carboxylate的结合。然而,Neu241位的精氨酸可以排斥oseltamivircarboxylate的C4基团,这种排斥作用大大减弱了oseltamivir carboxylate对Neu2的结合能力。总之,定位于胞浆的Neu2可以结合oseltamivir carboxylate,但结合作用并不强。通过多序列比对和同源建模分析,本发明相关研究发现人体所含另外三种唾液酸酶也具有类似的结构(如图1所示),推测oseltamivir carboxylate对它们也具有类似的抑制作用。目前已有多篇文献报道,对人体唾液酸酶微弱的抑制就会引发严重的疾病,包括癫痫和精神性疾病等(Seyrantepe,V.et al.Molecular pathology of NEU1 gene in sialidosis.Hum Mutat2003,22:343-52.;Boyzo,A.,Ayala,J.,Gutierrez,R.& Hernandez,R.J.Neuraminidaseactivity in different regions of the seizing epileptic and non-epileptic brain.Brain Res 2003,964:211-7.)。而这些疾病的若干症状恰好与目前报道的Tamiflu副作用相符,由此推断Tamiflu可能通过抑制人体唾液酸酶引发严重的副作用。
二、对Neu2的单核苷酸多态性分析
通过检索NCBI的单核苷酸多态性数据库(dbSNP),发现Neu2的41位精氨酸处存在着一个导致非同义突变的SNP(SNP ID:rs2233385)。该SNP导致这个位点的精氨酸突变为天冬酰胺,即R41Q。通过对蛋白活性位点的深入分析,本发明的相关研究发现,由于该突变位点紧靠Neu2的催化位点,这个突变会在较大程度上增强oseltamivir carboxylate与Neu2的结合能力。由此推测具有Gln41突变型的个体对Tamiflu的副作用表现得更为敏感。
三、Neu2的野生型和R41Q突变型对oseltamivir carboxylate结合能力的仿真分析
本发明的相关研究使用权威的分子模拟软件InsightII对Neu2的野生型和R41Q突变型与oseltamivir carboxylate结合的能力进行仿真分析,结果如图2所示。图2a是野生型Neu2与oseltamivir carboxylate结合的示意图,图2b是R41Q突变型与oseltamivir carboxylate结合的示意图,图中间的六元环化合物为oseltamivir carboxylate,41位的精氨酸或天冬酰胺用粗线条突出出来,可以看出41位的精氨酸排斥oseltamivir carboxylate的C4基团,R41Q突变型对oseltamivir carboxylate结合能力较之野生型Neu2有了显著增强,这意味着具有Gln41突变型的个体可能对Tamiflu的副作用表现得更为敏感。
四、Neu2的野生型和R41Q突变型对oseltamivir carboxylate结合能力的实验分析
为了进一步验证上述的假设,本发明相关的研究对Neu2野生型和R41Q突变型进行了表达纯化,一共表达出2.92mgNeu2和2.09mg R41Q。随后,设计了测定唾液酸酶的酶活体系对oseltamivir carboxylate针对Neu2野生型和R41Q突变型的结合能力分别进行了定量测定。
反应体系如下所示:
缓冲液:0.1M pH5.6的柠檬酸钠/磷酸缓冲液(0.1M Na citrate/phosphate pH5.6);
底物:0.286M的4MU-NANA;
酶:Neu22.42mg/mL,每次用量15μL,或R41Q 0.61mg/mL,每次25μL;
抑制剂:oseltamivir carboxylate。
检测条件:温度37℃,检测波长为340nm。
实验结果如图3所示。可以看出,R41Q突变型对oseltamivir carboxylate结合能力较之Neu2野生型有了显著增强,导致酶活下降更为显著。这意味着具有Gln41突变型的个体对Tamiflu的副作用表现得更为敏感。
五、该SNP的人口分布分析
从上述分析可知,由SNP导致的Arg41→Gln41替换会显著增强Tamiflu的活性形式oseltamivir carboxylate对Neu2的结合能力,从而引起类似唾液酸酶被抑制的疾病相关的症状,进一步的,本发明相关研究对该位点SNP的人口分布进行了统计分析。根据NCBI的单核苷酸多态性数据库(dbSNP)记录,该位点突变体在亚洲出现的概率为9.29%,在撒哈拉沙漠以南的非洲地区出现的概率为0.55%,而在欧洲和美洲出现的概率为0,即亚洲国家相对于其他国家和地区更容易出现Tamiflu副作用的案例,而目前副作用报道主要发生在日本,即目前已知的该位点的SNP分布表明数据与副作用报告案例的地域分布恰好相符。
六、其它的抗感冒病毒药物
通过对其他类似药物的比较发现,药物分子C4位置为氨基的达菲类六元环抗感冒病毒药物,同样会由于该SNP的存在而增强与Neu2蛋白的亲和力,从而引起潜在的副作用。如结构为下列式1~7的可作为抗感冒病毒药物的化合物,均为感冒病毒的神经酰胺酶抑制剂(influenza neuraminidase inhibitors)(Varghese,J.N.et al.Drug design against a shiftingtarget:a structural basis for resistance to inhibitors in a variant of influenza virus neuraminidase.Structure 1998;6:735-46.)。其中,式7为Tamiflu的活性形式。通过运用InsightII软件对这些药物与Neu2结合能力的仿真分析发现,与Tamiflu的活性形式结构类似的式3~6化合物(C4位置为氨基)都可以较好地与Arg41Gln突变型的Neu2结合。
式1 式2 式3
式4 式5 式6
式7
本发明的目的在于提供一种预测个体使用达菲类药物安全性的方法,该方法通过测定受试者功能基因的单核苷酸多态性来预测其对达菲类药物副作用的敏感性。
本发明的技术方案如下:
通过测定受试者唾液酸酶(sialidase)蛋白家族Neu2蛋白基因Arg41Gln单核苷酸多态性(SNP)位点(SNP ID:rs2233385)的基因型,预测受试者对达菲类药物副作用的敏感性:对于该SNP位点的基因型为A/A的个体,达菲类药物会引起副作用;对于基因型为A/G的个体,使用达菲类药物存在一定的风险性;对于基因型为G/G的个体,使用达菲类药物是安全的。
其中,测定Neu2蛋白基因Arg41Gln SNP位点基因型的方法有很多种,比较简单快捷的方法有:针对该SNP位点通过聚合酶链式反应(PCR)扩增Neu2蛋白基因片断,然后利用特定的限制性核酸内切酶消化、凝胶电泳检测分析该SNP位点的基因型;直接对PCR扩增出来的含该SNP位点的Neu2蛋白基因片断进行DNA测序;制备R41Q突变型Neu2的特异抗体,通过ELISA(酶联免疫吸附实验)反应来确定该SNP位点的基因型。此外,还可以使用其它常见的SNP测定方法,例如:通过设计核苷酸探针与目的片断进行杂交,根据杂交复合体的稳定性检测SNP位点;通过分子信标(molecular beacons)(Mhlanga,M.M.,Malmberg,L.,Using molecular beacons to detect single-nucleotide polymorphisms withreal-time PCR.Methods.2001 Dec,25(4):463-71.)、蝎状探针(scorpion primer)(Whitcombe,D.,Theaker,J.,Guy,S.P.,Brown,T.,Little,S.,Detection of PCR products using self-probingamplicons and fluorescence.Nat Biotechnol.1999 Aug,17(8):804-7.)等基于杂交和荧光共振原理的方法检测SNP位点。
上述使用限制性核酸内切酶测定Neu2蛋白基因Arg41Gln SNP位点基因型的方法包括以下步骤:
1.提取宿主细胞的基因组DNA;
2.应用聚合酶链式反应(PCR)扩增含Arg41Gln SNP位点的Neu2蛋白基因片断;
3.限制性核酸内切酶消化;
4.电泳检测以确定Neu2蛋白基因Arg41Gln SNP位点的基因型。
上述步骤2可使用如下序列的引物:
上游引物:5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’(SEQ ID No.1)
下游引物:5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’(SEQ ID No.2)
PCR反应最好选用高保真耐热DNA聚合酶Pfu,反应条件可设定为:
PCR产物大小:466bp
上述步骤3所使用的限制性核酸内切酶可选择MspA1I核酸内切酶,该酶的酶切位点是CMGCKG,其中M表示A或C,K表示G或T。当最后的G突变为A后,该酶将不能识别这段核酸序列,而Neu2野生型在所述SNP处序列为CAGCGG,R41Q突变型序列为CAGCGA。对于使用上述引物扩增得到的Neu2蛋白基因片断,经该酶酶切后,使用琼脂糖凝胶电泳分析,若表现为在220bp处有一条带,表明该个体在这个SNP位点的基因型为G/G,达菲类药物对该个体是安全的;若表现为在220bp和460bp处各有一条带,表明该个体在这个SNP位点的基因型为A/G,使用达菲类药物存在一定的风险性;若表现为在460bp处有一条带,表明该个体在这个SNP位点的基因型为A/A,应慎重考虑是否使用其它药物代替达菲类药物。
上述直接测定Neu2蛋白基因片断序列的方法包括以下步骤:
1.提取宿主细胞的基因组DNA;
2.PCR扩增含Arg41Gln SNP位点的Neu2蛋白基因片断;
3.对PCR产物进行测序确定所述SNP位点的基因型。
上述步骤2的PCR反应可使用如下序列的引物:
上游引物:5’-CGGAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTG-3’(SEQ ID No.3)
下游引物:5’-CTGAACCTGGTGGGTGGGTGC-3’(SEQ ID No.4)
最好采用高保真耐热DNA聚合酶Pfu进行扩增,PCR反应条件可设定为:
PCR产物大小:220bp
上述通过ELISA反应来确定所述SNP位点的基因型的方法包括以下步骤:
1.利用Neu2蛋白基因Arg41Gln突变位点附近的氨基酸序列设计并获取R41Q免疫抗体;
2.用上述R41Q免疫抗体包被反应板,洗涤除去未结合的抗体;
3.在反应孔中加入待测样品,温育后形成免疫复合物,然后洗涤除去未结合的物质,同时做空白对照、阴性对照和阳性对照;
4.在各反应孔中加入酶标抗体,温育后洗涤除去未结合的酶标抗体;
5.加底物液显色;
6.一定时间后加终止液终止反应;
7.肉眼直接观察反应孔内溶液的颜色或用检测仪测定其OD值,与阴性和阳性对照对比确定待测样品的所述SNP位点的基因型。
上述步骤1所述的氨基酸序列可为:llafaeqQaskkdeh(SEQ ID No.6),其中大写的Q为41位的天冬酰胺。通常将设计并合成的多肽免疫兔子获得R41Q免疫抗体。
本发明的另一目的在于提供一种简便易行的预测个体使用达菲类药物安全性的试剂盒,包括:
A液:四种脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP),高保真耐热DNA聚合酶及其反应缓冲液;
上述DNA聚合物最好选用Pfu(Pfu DNA Polymerase),其2×反应缓冲液成份为200mM Tris-HCl,100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1.0%Triton X-100和1mg/ml BSA,保存温度为-20℃;
B液:PCR引物,由寡核苷酸合成仪合成;
C液:限制性核酸内切酶MspA1I,保存温度为-20℃;
D液:限制性核酸内切酶MspA1I的反应缓冲液;
可选用NEB公司提供的MspA1I的10×反应缓冲液,其成份为NEBuffer 4+BSA 50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,1mM DTT。
该试剂盒的PCR引物序列可以如下所示:
上游引物:5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’(SEQ ID No.1)
下游引物:5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’(SEQ ID No.2)
本发明的积极效果:根据已知NCBI dbSNP数据,该SNP的突变型在日本和中国的出现的比例分别为8.7%和9.1%。据日本官方报道(FDA),发生在日本的两起自杀事件和64例神经方面的不良反应(抽搐,精神狂乱等)可能是由Tamiflu的副作用引起的。虽然中国没有像日本一样大规模使用Tamiflu,我们预测如果大量使用Tamiflu,副作用可能会频繁地在中国出现,这一点具有重要的现实意义。如何针对亚洲约10%的个体设计特异性的、低副作用的抗禽流感药物是今后应努力的方向,而在使用Tamiflu一类抗流感药物前进行个体基因型的检测是必要的。
附图说明
图1是人体所含的四种唾液酸酶序列比对图。
图2a是野生型Neu2与oseltamivir carboxylate结合的示意图;
图2b是R41Q突变型Neu2与oseltamivir carboxylate结合的示意图。
图3是Neu2的野生型和R41Q突变型对oseltamivir carboxylate结合能力的比较图。
具体实施方式
实施例一:使用酶切试剂盒预测个体使用Tamiflu类药物的安全性一种预测个体使用Tamiflu类药物的安全性的试剂盒,该试剂盒包括:
A液:脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP),高保真耐热DNA聚合酶Pfu(Pfu DNA Polymerase)及其2×反应缓冲液;
上述缓冲液成份可为200mM Tris-HCl,100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mMMgSO4,1.0% Triton X-100和1mg/ml BSA,保存温度为-20℃;
B液:含有用于扩增含Arg41Gln SNP位点的Neu2蛋白基因片断的PCR引物,由寡核苷酸合成仪合成;
C液:限制性核酸内切酶MspA1I,保存温度为-20℃;
D液:限制性核酸内切酶MspA1I的10×反应缓冲液;
可选用NEB公司提供的MspA1I的10×反应缓冲液,其成份为NEBuffer 4+BSA 50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,1mM DTT。
该试剂盒的PCR引物序列为:
上游序列:5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’(SEQ ID No.1)
下游序列:5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’(SEQ ID No.2)
使用本试剂盒预测个体使用Tamiflu类药物的安全性的步骤如下:
[1]取个体血样,提取个体的基因组DNA(使用promega公司提供的基因组提取试剂盒);
[2]以上述个体基因组为模版(template),PCR扩增目的基因片段:
25μL PCR反应体系中加入基因组DNA 1μL,A液12.5μL,B液2μL,ddH2O 9.5μL,按以下条件进行PCR反应:
PCR产物大小:466bp
[3]限制性内切酶消化:MspA1I核酸内切酶处理25μL PCR扩增产物,C液1μL,D液5μL,加ddH2O至50μL,37℃温育一小时。
[4]电泳检测Neu2R41Q多态性位点基因型:
MspA1I核酸内切酶的酶切位点是CMGCKG,其中M表示A或C,K表示G或T。当最后的G突变为A后,该酶将不能识别这段核酸序列,而Neu2野生型在所述SNP处序列为CAGCGG,R41Q突变型序列为CAGCGA。使用3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,使用100bp ladder标示产物片段大小。若酶切产物仅在凝胶220bp处呈现条带,表明该个体在这个SNP位点的基因型为G/G;若在凝胶220bp处和460处均呈现条带,表明该个体在这个SNP位点的基因型为A/G;若仅在凝胶460bp处呈现条带,表明该个体在这个SNP位点的基因型为A/A。
[5]推断个体使用Tamiflu类药物的安全性:
根据上一步的检测结果,如果个体在这个SNP位点的基因型为G/G,Tamiflu类药物对该个体是安全的;若个体在这个SNP位点的基因型为A/G,使用Tamiflu类药物存在一定的风险性;若个体在这个SNP位点的基因型为A/A,则应慎重考虑是否使用其它抗禽流感病毒药物代替Tamiflu。
实施例二:用ELISA方法预测个体使用Tamiflu类药物的安全性
ELISA(酶联免疫吸附实验)是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。使用ELISA预测个体使用Tamiflu类药物的安全性的实验步骤如下:
[1]利用R41Q位点附近的15个氨基酸llafaeqQaskkdeh(SEQ ID No.6)设计并获取R41Q兔源抗体。
[2]包被:用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟(简称洗涤,下同)。
[3]加样:加一定稀释的待检样品0.1mL于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,然后洗涤,同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔。
[4]加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体0.1mL,37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
[5]加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml,37C孵育10~30分钟。
[6]终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
[7]结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色;也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性,表示个体在这个SNP位点的基因型为A/A或A/G。
[8]推断个体使用Tamiflu类药物的安全性:
根据上一步的检测结果,如果个体在这个SNP位点的基因型为G/G,我们认为Tamiflu类药物对该个体是安全的;若在个体在这个SNP位点的基因型为A/G或A/A,则建议应慎重考虑是否使用其它抗禽流感病毒药物代替Tamiflu。
实施例三.基于直接测序的方法预测个体使用Tamiflu类药物的安全性
PCR反应溶液:
A液:脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP),高保真耐热DNA聚合酶Pfu(Pfu DNAPolymerase)及其2×反应缓冲液;
上述缓冲液成份可为200mM Tris-HCl,100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mMMgSO4,1.0% Triton X-100和1mg/ml BSA,保存温度为-20℃;
B液:PCR引物,由寡核苷酸合成仪合成,其序列如下:
上游引物:5’-CGGAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTG-3’
下游引物:5’-CTGAACCTGGTGGGTGGGTGC-3’
实验步骤如下:
[1]取个体血样,提取个体的基因组DNA(使用promega公司提供的基因组提取试剂盒);
[2]以上述个体基因组为模版(template),PCR扩增目的基因片段:
25μL PCR反应体系中加入基因组DNA 1μL,A液12.5μL,B液2μL,ddH2O 9.5μL,按以下条件进行PCR反应:
PCR产物大小:220bp
[3]凝胶回收上述PCR产物并用测序仪测序,下面的序列(SEQ ID No.5)是一名欧洲个体的测序结果,用边框突出的“G”即为该SNP位点。...GAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTGCAGAAGGAGAGCGTGTTCCAGTCGGGAGCCCATGCCTACAGAATCCCTGCCCTGCTCTACCTGCCTGGGCAGCAGTCCCTGCTGGCCTTCGCGGAACAGCG
GCAAGCAAGAAGGATGAGCACGCAGAGCTGATTGTCCTGCGCAGAGGAGACTACGACGCACCCACCCACCAGGTTCAG...
[4]从测序结果推断个体使用Tamiflu类药物的安全性
根据上一步的检测结果,如果个体在这个SNP位点的基因型为G/G,Tamiflu对该个体是安全的;若在个体在这个SNP位点的基因型为A/G或A/A,则建议应慎重考虑是否使用其它抗禽流感病毒药物代替Tamiflu。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>北京大学
<120>一种预测达菲类药物用药安全性的方法
<130>JSP060004
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<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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<211>21
<212>DNA
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<400>4
ctgaacctgg tgggtgggtg c 21
<210>5
<211>207
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
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gcctacagaa tccctgccct gctctacctg cctgggcagc agtccctgct ggccttcgcg 120
gaacagcggg caagcaagaa ggatgagcac gcagagctga ttgtcctgcg cagaggagac 180
tacgacgcac ccacccacca ggttcag 207
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<213>人工序列
<400>6
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1 5 10 15
Claims (10)
1.一种预测达菲类药物用药安全性的方法,通过测定受试者唾液酸酶蛋白家族Neu2蛋白基因的Arg41Gln单核苷酸多态性位点的基因型,预测受试者对达菲类药物副作用的敏感性:对于该单核苷酸多态性位点的基因型为A/A的个体,达菲类药物会引起副作用;对于基因型为A/G的个体,使用达菲类药物存在一定的风险性;对于基因型为G/G的个体,使用达菲类药物是安全的。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,使用限制性核酸内切酶测定所述Neu2蛋白基因Arg41Gln单核苷酸多态性位点的基因型,包括以下步骤:
(1)提取宿主细胞的基因组DNA;
(2)应用聚合酶链式反应扩增含Arg41Gln单核苷酸多态性位点的Neu2蛋白基因片断;
(3)限制性核酸内切酶消化;
(4)电泳检测以确定所述单核苷酸多态性位点的基因型。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中聚合酶链式反应所用的引物序列为:上游引物:5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’;
下游引物:5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)的限制性核酸内切酶为MspA1I。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过直接测序的方法来测定所述单核苷酸多态性位点的基因型,包括以下步骤:
(1)提取宿主细胞的基因组DNA;
(2)聚合酶链式反应扩增含Arg41Gln单核苷酸多态性位点的Neu2蛋白基因片断;
(3)对扩增产物进行测序确定所述单核苷酸多态性位点的基因型。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中聚合酶链式反应所用的引物序列为:
上游引物:5’-CGGAATTCATGGCGTCCCTTCCTGTCCTG-3’;
下游引物:5’-CTGAACCTGGTGGGTGGGTGC-3’。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过ELISA反应来确定所述单核苷酸多态性位点的基因型,包括以下步骤:
(1)利用Neu2蛋白基因Arg41Gln突变位点附近的氨基酸序列设计并获取R41Q免疫抗体;
(2)用所述R41Q免疫抗体包被反应板,洗涤除去未结合的抗体;
(3)在反应孔中加入待测样品,温育后形成免疫复合物,然后洗涤除去未结合的物质,同时做空白对照、阴性对照和阳性对照;
(4)在各反应孔中加入酶标抗体,温育后洗涤除去未结合的酶标抗体;
(5)加底物液显色;
(6)一定时间后加终止液终止反应;
(7)肉眼直接观察反应孔内溶液的颜色或用检测仪测定其OD值,与阴性和阳性对照对比确定待测样品的所述单核苷酸多态性位点的基因型。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中的氨基酸序列为:
llafaeqQaskkdeh。
9.一种预测个体使用达菲类药物安全性的试剂盒,包括:
A液:四种脱氧三磷酸单核苷酸,高保真耐热DNA聚合酶及其反应缓冲液,保存温度为-20℃;
B液:含有用于扩增含Arg41Gln单核苷酸多态性位点的Neu2蛋白基因片断的PCR引物;
C液:限制性核酸内切酶MspA1I,保存温度为-20℃;
D液:限制性核酸内切酶MspA1I的反应缓冲液。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR引物序列为:
上游引物:5’-GGTGAGCACCACCTGTCT-3’;
下游引物:5’-GGTCCAGGGAACCATTAG-3’。
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