CN1843506A - 一种结核杆菌疫苗套药 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结核杆菌疫苗套药及其应用。该套药，由配套使用的结核杆菌核酸疫苗和卡介苗组成；所述结核杆菌核酸疫苗，是将Ag85B、MPT－83和MPT－64基因或所述Ag85B、MPT－83和MPT－64三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与Ag85B、MPT－83和MPT－64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核表达载体中，将得到的至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物。该套药对动物结核病的预防和治疗效果远远好于单独用结核杆菌核酸疫苗或者卡介苗的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核杆菌疫苗套药。
背景技术
结核病是一种人畜共患的慢性消耗性传染病。随着爱滋病患者人数的增加、抗药性菌株的产生等，结核病的发病率有逐年增加的趋势。国外有关资料报导，目前世界上约有10-20亿人口感染有结核杆菌，每年大约有三百万人死于结核病，同时又有1000万新病例出现。我国目前有上亿人感染有结核分枝杆菌，结核病患者约600万人，每年因治疗不及时造成死亡的人数约25.6万余人。如果不尽快改进结核病的控制措施，将有2亿多人发展成活动性肺结核。牛结核是家畜的一种慢性传染病且能传染给人。人畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因。如果奶牛患有结核病，不但影响泌乳量和乳汁的营养成份，而且可通过各种途径传染给人。而控制牛结核病传播最有效的方法是对于感染牛群的大规模屠宰，但是这对于大多数国家来讲，无疑将造成了一项难以承受的经济负担。另外一条有效的途径，就在于使用疫苗免疫，防患于未然。
自Calmette和Guerin研究出卡介苗(BCG)之后，人类已将致弱的卡介苗用于预防结核病的感染。但卡介苗在世界许多地方使用效果不佳，尤其对成人容易丧失保护力。对不同人群的保护效率不一致，一般为0-85％。因此，研制更全面有效的新疫苗是控制结核病的重要途径。基因工程技术为重组亚单位疫苗以及DNA疫苗的发展提供了一条新途径，其中DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力，已成为疫苗研究领域中的热点之一(Gurunathan，S.，D.M.Klinman，and R.A.Seder.2000.DNA vaccines：immunology，application，and optimization.Annu.Rev.Immunol.18：927-974.)。
研究表明，结核分枝杆菌分泌蛋白能刺激机体产生保护性免疫反应，诱导抗体产生并诱导CD4+和CD8+T细胞介导的免疫应答。在结核病感染实验过程中，病人淋巴细胞早期识别的主要是一些分泌性蛋白，如Ag85复合体分布于大部分分枝杆菌中，其中Ag85B具有分枝酸转移酶的活性，与分枝杆菌细胞壁的合成有关，并与人纤维连接蛋白结合后参与致病过程，在分枝杆菌分泌蛋白中含量占居首位，在一系列纯化抗原试验中，该抗原的抗原性最强。MPT-83是一个附着在细胞表面促使抗原决定基暴露的脂化糖基化的蛋白(Wiker H G，uptyuioiloii S，Hewinson R G，Russell W P，and Harboe M.Heterogenous expression of the related MPB70 andMPB83 proteins distinguish various substrains of Mycobacterium bovis BCGand Mycobacterium tuberculosis H37Rv.Scand J.Immunol.1996，43：374-380)。该蛋白还是一个从感染了M.bovis的牛身上发现的sero-dominant抗原，并且只在感染的T淋巴细胞内可以检测到，而在BCG免疫过的动物细胞中检测不到(0’Loan C J，Pollock J M，Hanna J，and Neill S D.Immunoblot analysis ofhumoral immune responses to Mycobacterium bovis in experimentally infectedcattle：early recognition of a 26-kilodalton antigen.Chin.Diagn.Lab.Immunol.1994，1：608-611；Vordermeier H M，Cockle P C，Whelan A，RhodesS，Palmer N，Bakker D，and Hewinson R G.Development of diagnostic reagentsto differentiate between Mycobacterium bovis BCG vaccination and M.bovisinfection in cattle.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1999，6：675-682)。MPT64是结核分枝杆菌的特异蛋白，可诱导强烈的T细胞反应并在豚鼠中诱导了迟发的过敏性反应(Oettinger T，Holm A，Mtoni IM，Andersen AB，Hasloov K.Mappingof the delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of secreted proteinMPT64 from Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun 1995；63：4613-8)。ESAT-6是结核分枝杆菌早期分泌的一种小分子量蛋白，只存在于人型结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，BCG中缺少该抗原的编码基因。最新的研究证明，ESAT-6不仅是抗结核分枝杆菌细胞免疫应答的主要配体，还是效应性T细胞的主要靶抗原之一，可刺激感染结核病的小鼠释放γ-干扰素。因此，编码这些蛋白的基因已成为核酸疫苗的首选对象。
国外有关结核分枝杆菌核酸疫苗的研究报道很多。虽然单价疫苗在一定程度上可以诱导明显的免疫反应，但是越来越多的证据表明，多价核酸疫苗的免疫效果明显高于单价效果。比如2000年，Morris对单价和多价结核杆菌DNA疫苗投放后的免疫应答进行了评价。单价DNA疫苗包括编码MPT-63和MPT-83的DNA疫苗，多价联合DNA疫苗包括ESAT-6，MPT-83，MPT-63，KatG，结果表明：多价联合DNA疫苗比活苗BCG诱导的保护更为强烈(Morris S，Kelley C，Howard A，et al.Theimmunogenicity of single and combination DNA vaccines against tuberculosis.Vaccine.2000，18：2155-2163)。2001年2月，McShane等人报道，使用编码ESAT6和MPT63抗原的DNA疫苗初发免疫继而用编码相同抗原的安卡拉牛痘病毒加强免疫小鼠后，诱导产生了特异分泌干扰素的CD4+T细胞和相应CD8+T细胞的产生，从而表明异源加强的方法激发了T细胞的增殖并达到类似BCG的免疫效果(McShane，H.，Brookes，R.，Gilbert，S.，and Hill，A.V.S.(2001)Enhanced immunogenicityof CD4+T-cell responses and protective efficacy of a DNA modified vacciniavirus Ankara prime-boost vaccination regimen for murine tuberculosis.Infect.Immun.69，681-686.)。2003年，McConkey等人在Nature Medicine上报道，用编码了麻风病红细胞前体抗原(TRAP)的重组安卡拉病毒来加强DNA疫苗来免疫人，取得了比单独使用DNA疫苗或重组安卡拉病毒疫苗高出5到10倍的T细胞反应。(McConkey，S.J.，Reece，W.H.H.，Moorthy，V.S.，et al.(2003).Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted byrecombinant modified vaccinia virus Ankara in humans.Nat.Med.9，729-735.)
研制更全面有效而更安全的新核酸疫苗对控制结核病的传播和流行具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种结核杆菌疫苗套药及其应用。
本发明提供的结核杆菌疫苗套药，由配套使用的结核杆菌核酸疫苗和卡介苗(BCG)组成；所述结核杆菌核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和MPT-64基因或所述Ag85B、MPT-83和MPT-64三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与Ag85B、MPT-83和MPT-64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核表达载体中，将得到的至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物。
所述结核杆菌核酸疫苗至少两组。
所述结核杆菌核酸疫苗，优选为将Ag85B、MPT-83和MPT64基因分别克隆到真核表达载体中得到的三种重组表达载体进行混合得到的多价结核杆菌核酸疫苗。
所述三种重组表达载体按照相同重量份数比进行混合。
所述真核表达载体可为带有真核表达启动子的表达载体，如巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子，老鼠看家基因的启动子等，真核表达载体优选为pJW4303。
动物表达载体pJW4303，其物理图谱如图1所示，带有巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子，是保证目的基因在肌肉细胞中高效转录的强启动子。该载体还带有组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的胞外分泌信号序列，定向克隆在这一信号序列下游的外源基因产物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原与巨噬细胞的接触机会，加速了依赖于蛋白酶体的内源性合成抗原的降解，导致体内诱导的细胞介导的应答增强。此外，pJW4303含有11个CpG序列，在DNA疫苗诱发机体产生免疫应答中起重要作用，可在无T细胞存在的情况下直接激活B细胞，刺激分泌免疫球蛋白及白细胞介素6，也可直接激活单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞，上调共刺激分子的表达，有利于产生多种Th1型细胞因子，提高了保护性免疫力。
三个基因的基因Bank收录号分别为：Ag85B：X62398；MPT-83：X94579；MPT64：U34849。
上述结核杆菌核酸疫苗中还含有佐剂DDA，MPL，Quil-A，RIBI adjuvant和/或saline或其它佐剂(铝佐剂，弗氏佐剂等)。该疫苗中联合多价结核杆菌核酸疫苗与DDA或MPL的重量份数比可为5∶6，与其它佐剂的重量份数比可为3∶1；联合多价结核杆菌核酸疫苗在saline中的浓度可为1mg/ml。
本发明的结核杆菌疫苗套药可用于预防和/或治疗动物结核病，特别是预防和/或治疗人、牛、羊结核病。使用时，可分三次或更多次免疫，即首免和二免等使用上述结核杆菌核酸疫苗，第三次和第三次以上使用卡介疫苗加强免疫。
本发明的结核杆菌疫苗套药将含有Ag85B、MPT-83和MPT64基因质粒DNA混合与BCG联合免疫牛，导致Ag85B、MPT-83和MPT64的特异性IgG抗体反应水平显著提高。结核杆菌疫苗套药免疫过的牛能够产生对结合杆菌有效而长期的免疫性并激发显著的Th1 cytokine反应。结核杆菌疫苗套药免疫牛在特异抗原刺激下，Th1型γ-干扰素(IFN-γ)的产生水平与对照组相比有了显著提高。通过测定在肺脏相对CFU数量发现，结核杆菌疫苗套药提高了牛抗结核杆菌M.bovis的保护效率。经结核杆菌疫苗套药免疫过的牛对肺脏和脾脏内结核菌的生长有抑制。组织病理学分析显示结核杆菌疫苗套药免疫牛大大提高了感染后肺部病理状况。本发明的结核杆菌疫苗套药不仅增强了免疫动物的肌体体液应答反应，同时增强了细胞介导的免疫反应，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提条件，更重要的是本发明的结核杆菌疫苗套药延长了核酸疫苗引起的免疫反应的时间。
本发明的结核杆菌疫苗套药容易生产，稳定性强，较安全，不引起结核菌素的敏感反应。从免疫牛的肺部载菌量来看，本发明的结核杆菌疫苗套药的保护效率要高于卡介苗，表明本发明的疫苗可以取代传统的卡介苗用于结核病的预防。
本发明的结核杆菌疫苗套药与现有的结核杆菌核酸疫苗的不同之处在于本发明的结核杆菌核酸疫苗免疫动物后，由于BCG的加强作用，确保了抗原高效持续表达并分泌到胞外。本发明可使用佐剂DDA等提高了疫苗的保护效率。本发明的结核杆菌疫苗套药直接应用在大型动物牛上，取得了非常明显保护效率。如果用该结核杆菌疫苗套药免疫牛，必将大大减少牛患结核的机率，保证牛肉及牛奶的产量和质量。如果用该结核杆菌疫苗套药免疫人，不但能让人体产生对结核杆菌的免疫力，而且不会发生结核菌素的敏感反应，增强了疫苗的安全性。总之，本发明的结核杆菌疫苗套药对提高动物及人类对结核杆菌的免疫力，更有效地控制结核病的传播和流行，繁荣畜牧业及增强人类体质具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为真核表达载体pJW4303。
图2为末次免疫后4周用PPD方法检测各组牛皮厚度的变化柱形图。
图3为末次免疫后4周测定的全血中淋巴细胞的增殖情况柱形图。
图4为攻毒前后测定全血培养上清中的IFN-γ的浓度柱形图。
图5为末次免疫后4周测定的各实验组中外周血T淋巴细胞亚型CD4+及CD8+细胞所占的百分比柱形图。
图6为具有代表性的流式细胞仪检测所得各组CD4+T细胞亚型的百分比比较。
图7为攻毒后22周各组肺部组织变化的比较照片。
图8为攻毒后22周各组淋巴结组织变化的比较照片。
具体实施方式
实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、结核杆菌疫苗套药的制备
一、真核表达载体的构建
用PCR方法扩增结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85B，MPT-83和MPT64基因并克隆到真核表达载体pJW4303上用于在真核细胞内表达。基因Bank收录号分别为：Ag85B：X62398；MPT-83：X94579；MPT64：U34849。以常规方法提取的结核杆菌基因组DNA为模板，用PCR扩增Ag85B，MPT-83和MPT64基因并定向克隆到pJW4303载体(物理图谱如图1所示)上的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)信号序列下游，形成融合蛋白。扩增所用的引物序列如下：
Ag85B：5’-AAATGGGGCACAGCTAGCCATATGACAGACGTGAGCC-3’和
5’-ACTAGGATCCTAAGCAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGC-3’；
MPT64：5’-TAGAGTACTGCTAGCGTGCGCATCAAGATCTTC-3’和
5’-TAGAGTACTGGATCCTAGGCCAGCATCGAGTCG-3’；
MPT83：5’-ATTGCTAGCATGATCAACGTTCAG-3’和
5’-TATGGATCCCGAACGTTACTGT-3’。
5’端引物都含Nhe I位点，3’端引物都含有BamH I位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后按QIAquick Gel Extraction Kit说明书操作回收，得到目的基因。分别用Nhe I和BamH I双酶切经凝胶纯化的目的基因产物及pJW4303载体DNA，用T4DNA连接酶处理16h(16℃)，取5μl连接产物(总体积20μl)转化感受态大肠杆菌DH5α菌株。挑取转化菌单菌落抽提质粒，Nhe I和BamH I双酶切鉴定后进行序列分析以证实插入片段序列是否正确。分别选取3个含有不同目的基因表达载体的菌株进行DNA序列分析，以获取带有正确读码框的表达载体，把含有Ag85B基因的表达载体命名为pJAg85B，把含有MPT-83基因的表达载体命名为pJMPT-83和把含有MPT64基因的表达载体命名为pJMPT64。将pJAg85B、pJMPT-83和pJMPT64转化到TOP10大肠杆菌中，在含氨苄青霉素Amp(100μg/ml)的琼脂中再次筛选重组菌株，用QIAGEN Plasmid Maxi Kit和Mega Kit大量制备质粒DNA，用灭菌生理盐水稀释成浓度为1-2μg/μl，紫外分光光度计定量。
二、结核杆菌疫苗套药的制备
取相同质粒pJAg85B、pJMPT-83和pJMPT64各500μg，混匀，取1000μg，分两份，每份500μg，分别用500μl生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)溶解，制成疫苗I和疫苗II。然后将1×106CFU BCG(购自中国药品生物制品检定所，编号230014，批准文号：(91)卫生标字0030。本品可用500μl生理盐水溶解)制成疫苗III。疫苗I、疫苗II和疫苗III组成结核杆菌疫苗套药，用的时候按时间点为0周，4周，8周三次分别注射疫苗I、疫苗II和疫苗III。
实施例2、结核杆菌疫苗套药的效果实验
将40头牛分为4组，分别进行如下处理：第一组为DNA疫苗组，实施例1中制备的质粒pJAg85B、pJMPT-83和pJMPT64各500μg，共同用1500ml生理盐水或PBS溶解，混匀，平均分成三份，分三次肌肉注射免疫，免疫剂量为1500μl/头/次，时间点为第0周，第4周，第8周；第二组为结核杆菌疫苗套药组，按时间点为第0周，第4周，第8周三次分别注射结核杆菌疫苗套药的疫苗I、疫苗II和疫苗III；疫苗I、疫苗II和疫苗III的免疫剂量均为1500μl/头/次、1500μl/头/次和500μl/头/次；第三组为BCG组，在第0周和第8周接受皮下注射的用500μlml生理盐水溶解的1×106CFU的卡介苗BCG(购自中国药品生物制品检定所)，免疫剂量为500μl/头/次；第四组为非免疫组(对照)，每只注射2ml生理盐水。将这四组免疫处理的牛进行如下实验：
一、PPD皮试试验
将上述四组末次免疫四周后的牛接种0.1mg牛结核菌素(PPD)，72小时后确定其牛皮的厚度(皮肤厚度)，阳性的牛以其皮厚超过4mm计，结果如图2所示，结核菌素对各组处理所产生的牛皮厚度增加是可以忽略的，均为阴性。
二、外周血淋巴细胞增殖实验。
把实施例1得到的Ag85B，MPT-83和MPT64基因分别克隆到原核表达载体pET-22质粒中在大肠杆菌中表达，在变性条件下用Ni亲和法纯化三种带有多聚组氨酸标签的重组蛋白，即为Ag85B，MPT-83和MPT64抗原。
将上述四组末次免疫四周后的牛外周血分别用肝素抗凝，然后分别用RPMI-1640稀释5倍，在细胞培养板中培养6天后，将第一组、第二组和第四组免疫牛的外周血分为三组，分别加入上述制备的Ag85B，MPT-64、MPT-83抗原；第三组免疫牛的外周血中加入PPD，分别进行抗原刺激。其中，Ag85B，MPT-64和MPT-83蛋白抗原终浓度为10μg/ml，PPD终浓度为20μg/ml，对照组则不用抗原刺激。培养6天后，用MTT法测定：将培养好的细胞板中每孔加入20μl MTT(二甲基噻唑二苯肼基偶氮苯)继续孵育4小时，最终每孔加150μl DMSO，混合其黑色沉淀，并在OD570nm读数，并以OD650nm的读数加以校正，测定的增值指数则由每孔里读数的OD值与对照组平均OD值的比例来衡量。
结果如图3所示，末次免疫后4周，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)对于Ag85B，MPT-64和MPT-83抗原的刺激产生了强烈反应，与非免疫组(第四组)存在极显著或显著的差异。另外，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)所产生的高的刺激系数也表明此组比BCG组(第三组)或DNA疫苗组(第一组)诱导了更为强烈的增殖反应。
三、干扰素测定牛攻毒前后γ-干扰素水平的测定和比较
分别取免疫前和上述免疫处理后的牛颈静脉的肝素化血，全血培养，将第一组、第二组和第四组免疫牛的外周血分为三组，分别加入上述制备的Ag85B，MPT-64、MPT-83抗原；第三组免疫牛的外周血中加入PPD，分别进行抗原刺激。其中，Ag85B，MPT-64和MPT-83抗原终浓度为10μg/ml，PPD终浓度达到20μg/ml，对照组则不用抗原刺激。培养上清在37℃的二氧化碳温箱里孵育24小时后收集上清，用BOVIGAMTMBovine γ Interferon Test Kit(CSL，Victoria，Australia)测定γ-干扰素(IFN-γ)。结果以实验组与对照组OD450的比值(ODI)来表示。
免疫后四周后，由四组小牛中各选出的5头小牛，共20头，通过气管攻击1×107CFU的强毒牛分枝杆菌M.bovis(Garnier et al.，Proc Natl Acad Sci USA.2003Jun 24；100：7877-82)。用80厘米长的细管从麻醉的小牛口中伸入，继而用1.5毫升包含M.bovis强毒株的接种体被吹入其中。攻毒后四周，按照上述方法进行抗原刺激并测定γ-干扰素(IFN-γ)。
结果如图4所示，免疫前(图4中A)，平均的IFN-γ的ODI范围约在1.58-1.98之间；末次免疫后(图4中B)，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组BCG加强DNA疫苗)在特异抗原刺激下不但产生了极其显著高于非免疫组(第四组)的IFN-γ水平，而且也高于BCG组(第三组)和DNA疫苗组(第一组)，并以Ag85B抗原诱导产生的IFN-γ水平最高。更重要的是，在攻毒后4周(图4中C)，除结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)外，其他免疫组IFN-γ的水平都降低到与非免疫组无显著差异的水平，而结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)的高水平IFN-γ一直持续到实验动物被处死。
四、酶联免疫试验(ELISA)检测免疫动物的特异性抗体。
末次免疫后4周的四组每组5头牛牛分别采血，分离血清。免疫小牛的血清混合后，从1∶100开始2倍系列稀释后用于检测，MPT64、MPT-83、Ag85B抗原以及PPD抗原用包被液(0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释至10μg/ml，分别加入96孔酶标板(NUNC)，100μl/每孔，4℃过夜，用洗涤液(PBS/Tween0.05％)洗涤3次。每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶粉PBS-Tween 0.05％)，置37℃恒温箱封闭60min，按上法洗涤3次。加待测血清，阴性血清(正常小牛)及稀释液，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各100μl加入孔中，置37℃恒温箱2h，反复洗涤3次。加酶标抗体HRP标记的兔抗牛IgG(1∶2000稀释抗抗体)，每孔加100μl，置37℃温育2h，洗涤3次，用TMB(四甲基联苯胺二盐酸)显色后，测波长450nm吸光度(A)。以正常鼠血清相对应稀释度作为阴性对照，吸光度值0.05以上、实验组吸光度A值/对照组或阴性组吸光度A值≥1.5为阳性。
结果如表1、表2和表3所示，末次免疫后4周，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)诱导了更高水平的针对三种抗原的特异抗体：此组中，抗Ag85与抗MPT83的抗体水平都在1∶400到1∶3200，尤其是抗MPT83的抗体在4头牛中都达到了1∶3200。然而，在DNA疫苗组(第一组)只有3头牛抗体水平达到1∶400到1∶1600。另外，在BCG组(第三组)中，只诱导产生了较低的抗PPD的抗体水平。在非免疫组(第四组)则没有任何抗原特异的抗体产生。
表1.DNA疫苗组(第一组)三次免疫后小牛的抗体滴度
| 牛号特异抗原 | 末次免疫完四周后的总抗体IgG滴度 | ||||
| 20 | 22 | 23 | 24 | 27 | |
| Ag85B | 1/3200 | 1/400 | 1/3200 | 1/100 | 1/400 |
| MPT-64 | 1/3200 | nob | nob | nob | nob |
| MPT-83 | 1/1600 | 1/400 | nob | 1/800 | nob |
注：nob表示没有测到。
表2.BCG加强DNA疫苗组(第二组)三次免疫后小牛的抗体滴度
| 牛号特异抗原 | 末次免疫完四周后的总抗体IgG滴度 | ||||
| 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | |
| Ag85B | 1/3200 | 1/400 | 1/3200 | 1/3200 | 1/400 |
| MPT-64 | 1/3200 | nob | 1/400 | nob | nob |
| MPT-83 | 1/3200 | 1/3200 | 1/3200 | 1/1600 | 1/3200 |
注：nob表示没有测到。
表3.BCG组(第三组)三次免疫后小牛的抗体滴度
| 牛号 | 末次免疫完四周后的总抗体IgG滴度 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| PPD抗原 | 1/200 | nob | nob | 1/200 | 1/200 |
注：nob表示没有测到。
五、T细胞亚群分化的测定
取末次免疫后4周的牛的颈静脉的肝素化血，全血培养，分别使用MPT64、MPT-83和Ag85B抗原刺激，在37℃的二氧化碳温箱里孵育24小时后，用冷的PBS清洗后，分别与抗牛CD4(FITC标记)和抗牛CD8(RPE标记)一起孵育半小时后，PBS重悬并用4℃福尔马林固定后，样品于BD的FASCan流式细胞仪测定CD4+T和CD8+T细胞亚群含量，结果用特定的域来去除背景中未标记到或不相干死细胞的影响。
结果如图5中A(CD4+T细胞含量)和图中B(CD8+T细胞含量)和图6所示，结果表明结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)CD4+T细胞亚群的含量明显高于非免疫组(第四组)(极显著性差异，P＜0.01)，DNA疫苗组(第一组)以及BCG组(第三组)；同样，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)CD8+T细胞的平均百分比也在一定程度上高于其他各组。如此可见结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)诱导了以CD4+T细胞为主导的T细胞免疫反应。
六、M.bovis攻毒以检测BCG加强的DNA疫苗对小鼠的保护效率。
末次免疫后14周后，由四组小牛中各选出5头小牛，共20头，通过气管攻击1×107CFU的强毒牛分枝杆菌M.bovis(Garnier et al.，Proc Natl Acad Sci USA.2003 Jun 24；100：7877-82)。用80厘米长的细管从麻醉的小牛口中伸入，继而用1.5毫升包含M.bovis强毒株的接种体被吹入其中。攻毒后0，4，8和22周取血样，并在22周时静脉注射法处死，尸检，观察病变组织。用来做细菌计数的组织，磨匀后，3500g离心20分，并进一步分离结核菌。连续的10倍稀释后，肺组织匀浆涂布在Lowenstein-Jensen培养基上，8周后数平板上的克隆以估算感染细菌的数量。
结果如表4所示，在M.bovis强毒株(Garnier et al.，Proc Natl Acad SciUSA.2003 Jun 24；100：7877-82)攻击后，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)中只有两头牛淋巴结出现损伤，一头牛肺部出现损伤，其平均损伤指数明显低于非免疫组(第四组)，且此组在病理损伤相关的六项指标(如表4中所示)中都明显低于非免疫组(第四组)。正如报道中所述(Cai et al.2005.Combined DNA vaccinesformulated either in DDA or in saline protect cattle from Mycobacterium bovisinfection.Vaccine 23，3887-3895.)，很少能在非损伤部位分离出结核杆菌，也就是分离的结核杆菌都在损伤部位，结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)细菌计数结果(0.041 Log10CFU每克组织)显著低于非免疫组(第四组)(4.171 Log10CFU每克组织)，而相比于DNA疫苗或BCG组其保护效率要高出10到100倍。
表4.攻毒后的病理变化和显微分析
| 组别 | 动物比例 | 平均损伤指数 | 细菌培养阳性动物的比例 | 载菌量c(log10 CFU/g组织) | ||
| 肺损伤 | 淋巴结损伤 | 肺损伤a | 淋巴结损伤b | |||
| 非免疫组(第四组) | 5/5 | 5/5 | 2.96±0.43 | 3.50±0.23 | 5/5 | 4.171±0.48 |
| DNA疫苗组(第一组) | 1/5 | 2/5 | 0.93±0.20* | 1.71±0.29* | 1/5 | 1.873±0.30* |
| BCG加强DNA疫苗组(第二组) | 1/5 | 2/5 | 0.34±0.30* | 1.02±0.46* | 1/5 | 0.041±0.01** |
| BCG组(第三组) | 3/5 | 3/5 | 1.96±0.37 | 2.46±0.31 | 3/5 | 2.626±0.01* |
注：a平均的肺损伤指数的计算：大于等于100个小的或整体直径大于60mm的损伤，4分；25-99个小的或整体直径在20-60mm的损伤，3分；10-24个小损伤，2分；1-9个小损伤，1分。只计算结核损伤，且每个处理用5头牛。
b平均淋巴结损伤指数的计算：直径大于10mm的，5分；中等大小(5-9mm)，4分；大于等于20个小损伤，直径1-4mm的，3分；5-19个小损伤，2分；1-5个小损伤，1分。
*与空载体组有显著性差异(P＜0.05)。
**与空载体组有极显著性差异(P＜0.01)。
攻毒后22周，取实验牛的肺部和淋巴结做病理分析，具体方法为：取出所有淋巴结，精细切片以检查。肺部可先叩打发病节结，损伤部位通过病理切片加以鉴定。所有实验动物取材部位包括左右支气管处、右前肩胛骨处、前后纵隔处淋巴结以及有损伤部位的其他淋巴器官。病理分析所用组织切片固定于10％福尔马林中，石蜡包埋、切片后用伊红-苏木精法染色后由专业病理师鉴定。免疫组与非免疫组尸检肺部组织变化的比较如图7所示，结果表明，非免疫组(第四组)70％-80％肺部软组织出现纤维化，且存在淋巴细胞浸润，少有巨噬细胞且没有中性粒细胞(图7中A和E)；BCG免疫组(第三组)的病理结果类似，约有45％的肺部病变，但是存在一部分包括淋巴细胞和巨噬细胞的浸润(图7中B和F)；DNA疫苗组(第一组)呈现更少的病理变化，且有淋巴和巨噬细胞的浸润(图7中C和G)；结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)少有病变，且有以大量巨噬细胞为特征的细胞浸润(图7中D和H)。图7中E、F、G、H分别为图7中A、B、C、D同等条件的放大图像(40×)。
攻毒后22周各组淋巴结组织变化的比较结果如图8所示，结果表明非免疫组(第四组)，皮质与髓质间可见多有纤维组织增生，并可见含大量淋巴细胞的增殖(图8中A)；DNA疫苗免疫组(第一组)，淋巴结正常，只在皮质鞘见有增大，有正常增生细胞(图8中B)；结核杆菌疫苗套药疫苗组(第二组)，组织类似DNA疫苗组(图8中C)；BCG免疫组(第三组)，淋巴结滤泡结构加厚伴随周围有增生细胞的生发中心(图8中D)。
Claims (7)
1、一种结核杆菌疫苗套药，由配套使用的结核杆菌核酸疫苗和卡介苗组成；所述结核杆菌核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和MPT-64基因或所述Ag85B、MPT-83和MPT-64三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与Ag85B、MPT-83和MPT-64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核表达载体中，将得到的至少两种重组表达载体进行混合得到的混合物。
2、根据权利要求1所述的结核杆菌疫苗套药，其特征在于：所述结核杆菌核酸疫苗至少两组。
3、根据权利要求2所述的结核杆菌疫苗套药，其特征在于：所述结核杆菌核酸疫苗为将Ag85B、MPT-83和MPT64基因分别克隆到真核表达载体中得到的三种重组表达载体进行混合得到的多价结核杆菌核酸疫苗。
4、根据权利要求3所述的结核杆菌疫苗套药，其特征在于：所述三种重组表达载体按照相同重量份数比进行混合。
5、根据权利要求4所述的结核杆菌疫苗套药，其特征在于：所述真核表达载体为pJW4303。
6、根据权利要求5所述的结核杆菌疫苗套药，其特征在于：所述结核杆菌核酸疫苗中还含有佐剂DDA、MPL和/或IL-2、IFN-γ或IL-12。
7、根据权利要求6所述的结核杆菌疫苗套药，其特征在于：所述结核杆菌核酸疫苗中所述多价结核杆菌核酸疫苗与DDA或MPL的重量份数比为5∶6，与IL-2、IFN-γ或IL-12的重量份数比为3∶1。
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