CN1837360A - 前列腺素还原酶 - Google Patents

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CN1837360A CNA2005100992188A CN200510099218A CN1837360A CN 1837360 A CN1837360 A CN 1837360A CN A2005100992188 A CNA2005100992188 A CN A2005100992188A CN 200510099218 A CN200510099218 A CN 200510099218A CN 1837360 A CN1837360 A CN 1837360A
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庄立民
常旭芬
周文岭
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Abstract

本发明公开了一种分离的多肽，其含有SEQ IDNO：1的序列或SEQ ID NO：1的功能性等价物，其中所述多肽还原15－酮前列腺素而不还原白三烯B4。本发明还公开了特异性结合所述多肽的抗体以及一种用于抑制15－酮前列腺素－Δ13－还原酶的表达的双链核糖核酸。

Description

前列腺素还原酶
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年3月22日提交的美国临时申请No.60/664,473的优先权，而No.60/664,473要求2004年6月10日提交的美国临时申请No.60/651,469的优先权。上述两个临时申请以其全部在此并入作为参考。
背景技术
过氧化物酶体增殖因子活化的受体(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)属于调节脂质和葡萄糖代谢的核受体家族。已经鉴定了三种哺乳动物的PPAR，即PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ。当被膳食中的脂肪酸或其代谢衍生物激活后，PPAR触发一连串的转录事件，导致脂质和葡萄糖的代谢改变。例如，被激活后，PPAR-γ，其在脂肪组织中高表达，促进葡萄糖摄取并降低血糖水平。
除了其在脂质和葡萄糖代谢中的作用，PPAR也是一些疾病的有前途的治疗靶位，这些疾病例如为II型糖尿病、肥胖症、血脂异常、冠心病、炎症性疾病和癌症。一种合成的PPAR-γ激动剂AVANDIA已经用于治疗II型糖尿病。另一种合成的PPAR-α激动剂Fibrates已经用于治疗血脂异常。见Lehmann等，J Biol Chem，(1995)270：12953-12956；Fruchart等，Curr.Opin.Lipdol.(1999)10：245-257。不过，大多数PPAR治疗剂的功效很有限且具有明显的不良反应。
因此需要开发更加有效的用于通过调节PPAR活性而调控脂质和葡萄糖代谢的药物。
发明内容
本发明涉及用于通过调节对象的PPAR活性而治疗PPAR相关性疾病的方法。
在一方面，本发明公开了一种分离的多肽，所述多肽还原15-酮前列腺素而不还原白三烯B4。前列腺素(PG)是一类生理学介质，其特征为具有中心环和不同不饱和程度的侧链。15-酮前列腺素的实例包括但不限于15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α和15-酮PGF1α。白三烯是另一类生理学介质，其与前列腺素的部分不同之处在于不具有中心环。
在另一方面，本发明公开了一种特异性地结合到上述多肽上的抗体。该抗体，或是多克隆抗体或是单克隆抗体，可以结合到该多肽的一个片段上。
在另一方面，本发明公开了一种双链核糖核酸(dsRNA)，以及编码它的DNA载体，以抑制具有15-酮前列腺素-Δ13-还原酶活性的多肽的表达。15-酮前列腺素-Δ13-还原酶是指一种通过还原前列腺素的Δ13双键来催化15-酮前列腺素转化为13，14-二氢-15-酮前列腺素的酶。15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的例子包括15-酮前列腺素-Δ13-还原酶/白三烯B4 12-羟基脱氢酶(PGR/LTB4DH)和锌结合醇脱氢酶1(PGR2/ZADH1)。dsRNA包含两条多聚核糖核苷酸链。第一链等同于编码15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的核酸的19至49个连续的核苷酸。第二链与第一链互补。优选地，至少该dsRNA的一端具有一1至4个核苷酸的突出端。15-酮前列腺素-Δ13-还原酶可以是PGR/LTB4DH或PGR2/ZADH1。
本发明还公开了一种治疗PPAR相关性疾病的方法，这些疾病例如为II型糖尿病、肥胖症、血脂异常、冠心病、炎症性疾病和癌症。该方法包括给对象施用有效量的15-酮前列腺素-Δ13-还原酶调节物。15-酮前列腺素-Δ13-还原酶调节物是指影响15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的活性或表达的一种分子或者一种分子复合体。调节物可以是15-酮前列腺素。它也可以是一种抑制15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的活性或表达的抑制剂，例如，上述dsRNA。
在以下说明书中记载了本发明的一个或多个实施方式的详细描述。本发明的其它特征、目的和优点根据说明书和权利要求书的内容将是显而易见的。
具体实施方式
本发明是基于发现了15-酮前列腺素-Δ13-还原酶家族的一个成员，15-酮前列腺素-Δ13-还原酶2(PGR-2)。本发明人出乎意料地发现，PPAR活性可以通过其底物和抑制剂来控制。这些底物和抑制剂对于治疗PPAR相关性疾病是有用的，这些疾病例如为II型糖尿病、肥胖症、血脂异常、冠心病、炎症性疾病和癌症。
预期属于本发明范围内的是一种如SEQ ID NO：1所示的分离的多肽或其功能性等价物，该多肽还原15-酮前列腺素但不还原白三烯B4。如下所示是其氨基酸序列(SEQ ID NO：1)及其编码核苷酸序列(即SEQ IDNO：2)。
  1 - ATGATCATACAAAGAGTGGTATTGAATTCCCGACCTGGGAAAAATGGAAATCCAGTCGCA -60
    - M  I  I  Q  R  V  V  L  N  S  R  P  G  K  N  G  N  P  V  A
 61 - GAGAACTTCAGGGTGGAAGAGTTCAGTTTACCGGATGCTCTCAATGAAGGTCAAGTTCAA -120
    - E  N  F  R  V  E  E  F  S  L  P  D  A  L  N  E  G  Q  V  Q
121 - GTGAGGACTCTTTATCTCTCGGTGGATCCTTACATGCGCTGTAAGATGAACGAGGACACT -180
    - V  R  T  L  Y  L  S  V  D  P  Y  M  R  C  K  M  N  E  D  T
181 - GGCACTGACTACTTGGCACCGTGGCAGCTGGCGCAGGTGGCTGATGGTGGAGGAATTGGA -240
    - G  T  D  Y  L  A  P  W  Q  L  A  Q  V  A  D  G  G  G  I  G
241 - GTTGTAGAGGAGAGCAAGCACCAGAAGTTGACTAAAGGCGATTTTGTGACTTCGTTTTAC -300
    - V  V  E  E  S  K  H  Q  K  L  T  K  G  D  F  V  T  S    F  Y
301 - TGGCCCTGGCAAACTAAGGCAATTCTAGATGGGAATGGCCTTGAAAAGGTAGACCCACAA -360
    - W  P  W  Q  T  K  A  I  L  D  G  N  G  L  E  K  V  D  P  Q
361 - CTTGTAGATGGACACCTTTCATATTTTCTTGGGGCTATAGGTATGCCTGGCTTGACTTCC -420
    - L  V  D  G  H  L  S  Y  F  L  G  A  I  G  M  P  G  L  T  S
421 - TTGATTGGGGTACAGGAGAAAGGCCATATATCTGCTGGATCTAATCAGACAATGGTTGTC -480
    - L  I  G  V  Q  E  K  G  H  I  S  A  G  S  N  Q  T  M  V  V
481 - AGTGGAGCAGCAGGCGCCTGTGGATCTTTGGCTGGGCAGATTGGCCACCTGCTTGGCTGT -540
    - S  G  A  A  G  A  C  G  S  L  A  G  Q  I  G  H  L  L  G  C
541 - TCCAGAGTGGTGGGAATTTGTGGAACGCAGGAGAAATGTCTCTTTTTGACCTCAGAGCTG -600
    - S  R  V  V  G  I  C  G  T  Q  E  K  C  L  F  L  T  S  E  L
601 - GGGTTTGATGCTGCAGTTAATTACAAAACAGGGAATGTGGCAGAGCAGCTGCGAGAAGCG -660
    - G  F  D  A  A  V  N  Y  K  T  G  N  V  A  E  Q  L  R  E  A
661 - TGCCCGGGCGGAGTGGATGTCTACTTTGACAATGTTGGAGGTGACATCAGCAACGCGGTG -720
    - C  P  G  G  V  D  V  Y  F  D  N  V  G  G  D  I  S  N  A  V
721 - ATAAGTCAGATGAATGAGAACAGCCACATCATCCTGTGTGGTCAGATTTCTCAGTACAGT -780
    - I  S  Q  M  N  E  N  S  H  I  I  L  C  G  Q  I  S  Q  Y  S
781 - AACGATGTGCCCTACCCTCCTCCACTGCCCCCTGCAGTAGAAGCCATCCGGAAGGAACGA -840
    - N  D  V  P  Y  P  P  p  L  P  P  A  V  E  A  I  R  K  E  R
841 - AACATCACAAGAGAGAGATTTACGGTATTAAATTATAAAGATAAATTTGAGCCTGGAATT -900
    - N  I  T  R  E  R  F  T  V  L  N  Y  K  D  K  F  E  P  G  I
901 - CTACAGCTGAGTCAGTGGTTTAAAGAAGGAAAGCTAAAGGTCAAGGAGACCATGGCAAAG -960
    - L  Q  L  S  Q  W  F  K  E  G  K  L  K  V  K  E  T  M  A  K
961 - GGCTTGGAAAACATGGGAGTTGCATTCCAGTCCATGATGACAGGGGGCAACGTAGGGAAA -1020
    - G  L  E  N  M  G  V  A  F  Q  S  M  M  T  G  G  N  V  G  K
1021- CAGATCGTCTGCATTTCAGAAGATTCTTCTCTGTAG(SEQ ID NO：2)           -1056
    - Q  I  V  C  I  S  E  D  S  S  L  *(SEQ ID NO：1)
分离的多肽是指完全独立于天然相关分子的多肽，也就是说，其以干重计算的纯度至少为75％(即包括介于75％与100％间的任一数值)。纯度可以通过任何一种适当的标准方法测量，例如，通过层析柱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。本发明的分离的多肽可以纯化自一种天然来源，通过重组DNA技术或化学方法来制备。术语“功能性等价物”是指具有还原15-酮前列腺素但不还原白三烯B4的活性的如SEQID NO：1所示的多肽的变体，例如，具有一个或者多个点突变、插入、缺失、截短或其组合。在一个实施方式中，本发明的分离的多肽或其功能性等价物包含一段与SEQ ID NO：1具有至少80％(例如85％、95％或100％，或者包括介于80％-100％间的任一数值)相同性的序列。它可以是一种融合蛋白。
15-酮前列腺素-Δ13-还原酶活性是指将15-酮前列腺素经酶促转化为13，14-二氢-15-酮前列腺素。该特异性活性如下测定：在37℃条件下，于含有0.1M Tris-HCl(pH 7.4)、0.5mM NADPH和0.57mM 15-酮PGE2的反应缓冲液中对10μg待分析蛋白质制备物进行孵育。该反应在黑暗中于37℃进行10分钟，并通过添加700μl含有50mM，pH3.0的邻苯二甲酸氢钾和1％Tween 20的缓冲液来终止反应。以200μl含有790μM氯化吲哚硝基四氮唑(indonitrotetrazolium chloride)、60μM吩嗪硫酸甲酯和1％Tween 20的显色剂氧化任何未反应的NADPH。在490nm处的吸光度用ELISA分析仪进行测量。用含有NADPH的连续稀释量的反应缓冲液产生标准曲线。至少90nmole/min/mg蛋白的特异性活性表明该多肽具有15-酮前列腺素-Δ13-还原酶活性。
上述核苷酸序列，即SEQ ID NO：2，能被用于表达本发明的多肽。核苷酸序列是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)或者DNA或RNA类似物。DNA或RNA类似物可以自核苷类似物合成。该核酸分子可以是单链的或双链的，但优选为双链的。为了表达蛋白，可以将该核酸可操作地连接到适当的调控序列上以制得表达载体。载体是指一核酸分子，它能转运已被连接于其上的另一核酸。载体能够自我复制或被整合到宿主DNA中。载体的例子包括质粒、粘粒或病毒载体。该载体可以包括以适于宿主细胞中的核酸表达的形式存在的核苷酸序列。优选地，载体包括一个或多个被可操作地连接到待表达的核酸序列上的调控序列。“调控序列”包括启动子、增强子、和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。调控序列包括那些负责核苷酸序列的组成性表达的序列，以及组织特异性调控和/或诱导序列。该表达载体的设计可依赖于待转化宿主细胞的选择、所期望蛋白质的表达水平等这样的因素。该表达载体能被导入宿主细胞以生产本发明的多肽。同样，含有上述核酸的宿主细胞也落入本发明的范围内。例子包括有E.coli细胞、Sf9昆虫细胞(例如，利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。参见，例如，Goeddel，(1990)Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。为制备本发明的多肽，可以在允许由本发明的核酸编码的多肽表达的条件下，于培养基中培养宿主细胞，并纯化获自培养细胞或细胞培养基的多肽。或者，该核苷酸序列可以在体外被转录和翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
上面所描述的多肽能被用于在动物体内产生抗体。能够理解抗体也能自该多肽的片段产生。在动物体中制备单克隆和多克隆抗体及其片段的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Harlow和Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork。术语“抗体”包括完整的分子及其片段，这些片段有例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv(单链抗体)和dAb(结构域抗体；Ward等，(1989)Nature，341，544)。
一般地，本发明的多肽可以与载体蛋白例如KLH偶联，可以与佐剂混合并可注射入宿主动物体内。然后在该动物体内产生的抗体可以通过肽亲和层析法纯化。通常使用的宿主动物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。可用于增加免疫反应的各种佐剂取决于宿主的物种，所述佐剂包括弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油化乳化液、钥孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin)和二硝基酚。有用的人类佐剂包括BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗体即抗体分子的异质性群体存在于免疫对象的血清中。单克隆抗体，抗本发明多肽的抗体的均质性群体，可以使用标准杂交瘤技术制备(参见例如Kohler等，(1975)Nature 256，495；Kohler等，(1976)Eur J Immunol 6，511；Kohler等，(1976)Eur J Immunol 6，292；以及Hammerling等，(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.)。具体地，利用通过连续的细胞系培养生产抗体分子的任何技术可以获得单克隆抗体，如Kohler等，(1975)Nature 256，495和美国专利No.4,376,110；人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，(1983)Immunol Today 4，72)；Cole等，(1983)Proc.Natl.Acad Sci.USA 80，2026；和EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1983)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)所述的技术。这些抗体可以是包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD的免疫球蛋白类及其任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外和在体内培养。体内生产高滴度单克隆抗体的能力使其成为特别有用的生产方法。
另外，可以使用用于生产“嵌合抗体”的技术。参见例如Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851；Neuberger等，(1984)Nature 312，604；以及Takeda等，(1984)Nature 314：452。嵌合抗体是一种该分子中的不同部分来源于不同动物种的分子，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。或者，可以采用生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778和4,704,692)来生产单链Fv抗体的噬菌体文库。通过经氨基酸桥将Fv区的重链片段和轻链片段连接形成单链抗体。此外，可以通过已知的技术产生抗体片段。例如，这些片段包括但不限于F(ab′)2和Fab片段，F(ab′)2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化来生产，Fab片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生。通过本领域已知的方法还可以将抗体人源化。例如，具有所需结合特异性的单克隆抗体可以通过商业途径人源化(Scotgene，Scotland；和OxfordMolecular，Palo Alto，Calif.)。完全人抗体如在转基因动物中表达的抗体也是本发明的特征(参见，例如Green等(1994)Nature Genetics 7，13；以及美国专利No.5,545,806和5,569,825)。
双链核糖核酸(dsRNA)也在本发明的范围内。这种dsRNA可用于抑制15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的表达。因此通过给对象施用dsRNA可治疗PPAR相关性疾病。术语“dsRNA”指通过靶RNA序列的降解沉默基因表达的双链核糖核酸，这一过程被称作RNA干扰(RNAi)。RNAi已用于在多种动物模型中(包括秀丽线虫，斑马鱼和鼠胚胎)以及在其它生物系统中(包括外植的鸡神经细胞和哺乳动物细胞培养)沉默基因表达。参见WO99/32619，WO00/44914，WO00/44914，WO00/44895，WO00/63364和WO01/36646A1。
本发明的RNA可以通过本领域熟知的技术合成。参见，例如Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Wincott等，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，以及Brennan，美国专利No.6,001,311。RNA也能从表达载体转录和使用标准技术分离。使用同样是本领域熟知的方法可以将本发明的RNA或载体输送到靶细胞。参见，例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.2，139。例如，可以使用脂质体、水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米囊或生物粘着微球将其引入细胞。或者，通过直接注射或使用输注泵可以局部输送RNA或载体。其它的方法包括各种转运和载体系统的使用，例如使用缀合物和可生物降解的聚合物。
可通过调节15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的活性或表达来治疗PPAR相关性疾病。术语“治疗”指将上述15-酮前列腺素-Δ13-还原酶调节物的一种或几种，即15-酮前列腺素-Δ13-还原酶底物和抑制剂，施用给患有PPAR相关性疾病、此类疾病的症状或具有患这种疾病的倾向的对象，其目的是产生一种治疗效果例如治愈、缓解、改变、影响、好转或预防PPAR相关性疾病、它的症状或对它的易患性。“有效量”指对治疗对象产生一种治疗效果所需的量。15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的底物包括15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α、15-酮PGF1α及其结构类似物。
PPAR相关性疾病(失调或病况)的例子包括，但不限于II型糖尿病、高血糖、糖耐量降低、X综合症、胰岛素抵抗、肥胖症、血脂异常、高脂血症、高血糖、高甘油三脂血症、高胆固醇血症、低HDL水平、高LDL水平、动脉粥样硬化(及其引起的病症如心绞痛、跛行、心脏病发作或中风)、血管狭窄、肠激惹综合症、炎症性疾病(例如炎症性肠病、类风湿性关节炎、克隆氏病、溃疡性结肠炎、骨关节炎、多发性硬化症、哮喘、脉管炎、缺血/再灌注损伤、冻伤或成人呼吸窘迫综合症)、胰腺炎、神经变性性疾病、视网膜病、致瘤性病变、癌症(例如前列腺、胃、乳房、膀胱、肺或结肠的癌症或脂肪细胞癌如脂肪肉瘤)、血管发生、阿耳茨海默病、皮肤疾患(例如痤疮、牛皮癣、湿疹或角化症)、高血压、卵巢雄激素过多症、骨质疏松症以及骨质减少。
为治疗PPAR相关性疾病，可以将含有15-酮前列腺素-Δ13-还原酶调节物和药学上可接受的载体的药物组合物施用给需要的对象。可以口服或静脉输注，或皮下、肌内、鞘内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内和肺内注射或植入。
药物组合物可以是无毒的可接受的稀释剂或溶剂的溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂为甘露醇、水、林格氏液和等张氯化钠溶液。另外，可以将不挥发性油类常规用作溶剂或悬浮介质(如甘油单酯或甘油二酯)。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物在制备血管注射剂是有用的，如天然药学上可接受的油例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可含长链醇稀释剂或分散剂、羧甲基纤维素或类似的分散溶剂。根据配方的目的，也可使用其它通常使用的表面活性剂例如Tweens或Spans或通常用于药学可接受的固体、液体的制备的其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂，或其它剂型。
所需的剂量取决于给药途径的选择；配方的性质；对象疾病的性质；对象的大小、体重、表面积、年龄和性别；施用的其它药物；以及主治医师的判断。合适的剂量可以是0.01-100.0mg/kg范围内。鉴于可获得多种组合物以及多种给药途径的不同效能，可以预期所需的剂量有一个宽的变异。使用本领域熟知的对优化的标准经验常规可以调整这些剂量水平的变异。组合物包囊化在合适的输送载体中(例如聚合微粒或可植入装置)可以增加输送的效率，尤其是对于口服输送。
利用常规的方法可以将上述药物组合物配制成用于不同给药途径的剂型。例如，可以配制成口服给药的胶囊、凝胶密封剂或片剂。胶囊可含有任何标准的药学可接受材料如明胶或纤维素。按照常规的程序通过压缩所述组合物与固体载体和润滑剂组成的混合物而配制片剂。固体载体的例子包括淀粉和糖膨润土。组合物还可以以含有粘合剂如乳糖或甘露醇、常规填充剂和压片剂的硬壳片剂或胶囊形式给药。药物组合物还可以通过胃肠外途径给药。胃肠外剂型的例子包括活性药物或其它熟知的药学可接受的赋形剂的水溶液，等张盐水或5％葡萄糖。本领域普通技术人员熟知的环糊精或其它增溶剂可用作治疗药物输送的药学赋形剂。
可以在体外和体内评价如上所述的药物组合物的效能。简单地说，可以测试本发明药物组合物体外抑制15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的活性或表达的能力。对于体内研究，可以将药物组合物注射进动物(例如，小鼠模型)体内然后评价其治疗效果。根据这些结果，可以确定合适的剂量范围和给药途径。
下面具体的实施例应该理解为仅仅是例证本发明，而不是以任何形式限制本发明的其它部分。不需要进一步详细描述，相信本领域普通技术人员基于本文的描述，可以最大限定的利用本发明。本文所引用的全部出版物以其全部内容并入本文作为参考。
实施例
鉴定新的15-酮前列腺素-Δ 13 -还原酶
为鉴定脂肪生成过程中上调的基因，使用小鼠3T3-L1细胞进行mRNA差异展示分析。为诱导脂肪生成，用1μM地塞米松处理3T3-L1细胞并在37℃生长10天。分离了一个199个核苷酸的片段并发现其在诱导后第10天收获的3T3-L1细胞中高表达。确定这个片段的序列与两个GenBank的序列，即AK021033和AK020666的片段相同。
相应于该基因编码区的全长cDNA序列被称为小鼠PGR-2。这个序列如下分离克隆自3T3-L1脂肪细胞。PCR扩增PGR-2cDNA并通过T4DNA连接酶(Promega)连接入pGEM-T Easy Vector(Promega)。扩增PGR-2cDNA的正向和反向引物序列分别是：5’-CGG TAT AGC TTGGGA CGC TA-3’(SEQ ID NO：3)和5’-TGC ATG TTA AGA ATC TTTGTG G-3’(SEQ ID NO：4)。然后所得构建体(pTE-PGR-2)通过T7和SP6聚合酶测序。然后将PGR-2开放读框的编码区亚克隆入表达载体pCMV-Tag2B(Stratagene)中。为构建pFLAG-PGR-2，进行PCR反应，使用pTE-PGR-2作为模板，以及两个寡核苷酸作为引物，产生PGR-2的HindIII-SalI片段，所述引物为：5’-AAC TGA AGC TTC AAG TGATGA TCA TA-3’(SEQ ID NO：5)和5’-AGC TCT CCC ATA TGG TCGACC T-3’(SEQ ID NO：6)。然后将如此获得的PCR产物导入pCMV-Tag2B的HindIII-SalI位点，产生pFLAG/PGR-2的融合构建体。最后，通过将pFLAG/PGR-2的HindIII-XhoI片段连接到用SmaI和XhoI(Pharmacia)限制消化的pGEX-4T-3载体制备pGEX-PGR-2构建体。
小鼠PGR-2的推导氨基酸序列，即SEQ ID NO：1如上所示。发现小鼠PGR-2与如下两个蛋白质同源：(1)人ZADH1(GenBank登录号：NM152444)，具有～92％同源性，及(2)PGR/LTB4DH或PGR-1，具有～54％同源性。
在3T3-L1细胞的脂肪生成过程中PGR-2表达增加。在诱导脂肪产生后的第6天观测到最大表达。在这个时间点，观测到脂滴广泛积聚在脂肪细胞中。确定了PGR-2的组织分布。其在脂肪组织中高度表达。与野生型小鼠相比，在纯合和杂合db/db小鼠中，PGR-2mRNA在网膜脂肪中的量明显较高。
按照标准方法，将小鼠PGR-2在大肠杆菌中作为GST融合蛋白重组表达。如此获得的重组PGR-2蛋白用于确定底物特异性和酶动力学。
如下确定酶活性：将10μg重组小鼠PGR-2蛋白在37℃在含有0.1M Tris-HCl(pH7.4)，0.5mM NADPH，及0.57mM 15-酮PGE2的反应缓冲液中温育。在37℃避光进行反应10分钟，加入700μl含有50mM邻苯二甲酸氢钾，pH3.0和1％Tween 20的缓冲液终止反应。加入200μl含有790μM氯化吲哚硝基四氮唑，60μM吩嗪硫酸甲酯(phenazenemethosulfate)及1％Tween 20的显色剂以氧化任何未反应的NADPH。用ELISA平板读数器在490nm测定吸光度。使用含有系列稀释的NADPH的反应缓冲液生成标准曲线。
使用如上述方法确定PGR-2的底物特异性，不同之处在于将15-酮PGE2用6个前列腺素底物的每一个、3个下游代谢物的每一个、或者白细胞三烯B4替代。15-酮PGE1、15-酮PGF1α和15-酮PGF2α与PGR-2特异反应。相反，6-酮PGF1α、PGF2α、11b-PGF2α、13，14-二氢-15-酮PGF2α、13，14-二氢-15-酮PGD2、13，14-二氢-15-酮PGE2和白细胞三烯B4没有检测到特异活性。
动力学研究表明PGR-2催化15-酮PGE2转化为13，14-二氢-15-酮PGE2最有效，然后是15-酮PGF1α、15-酮PGE1和15-酮PGF2α。不同于PGR/LTB4DH，PGR-2使用NADPH作为辅因子比NADH更有效。
在3T3-L1的脂肪生成过程中PGR-2的蛋白表达水平上调。在完全分化的脂肪细胞中检测到最大的PGR-2蛋白水平。在脂肪生成的较早期阶段显著诱导了PPAR-γ。低PGR-2表达定位在前脂肪细胞的核中。高PGR-2表达分布在分化的脂肪细胞的胞质中。
还研究了在人Hep3B细胞中PGR-2表达对调节PPAR-γ转录的作用，Hep3B细胞表达内源性人PPAR-α及-γ。发现在Hep3B细胞中PGR-2的过表达抑制PPAR-介导的转录激活。即使Hep3B细胞被PPAR-γ激活剂(即BRL49653)刺激，转录激活也被抑制。在3T3-L1细胞中获得了相似的结果。
前列腺素
研究了脂肪细胞中前列腺素对PPAR-γ活性的影响。用诱导细胞分化的培养基处理后，在脂肪生成过程中，自第2-4天，3T3-L1细胞用14μM15-酮PGE2、13，14-二氢-15-酮PGE2、15-酮PGF2α、13，14-二氢-15-酮PGF2α、或4.5μM的BRL49653，即一种PPAR-γ激动剂，进行处理。见Forman等，Cell(1995)83：803-812。在第6天，积聚的脂滴用油红O染色观察。15-酮PGE2以与BRL49653相似的水平有效增强了脂肪生成。被诱导分化2天后，3T3-L1细胞用报道基因转染。15-酮PGE2和15-酮PGF2α都显著增强了内源性PPAR活性。相反，相应的下游代谢物，即13，14-二氢-15-酮PGE2和13，14-二氢-15-酮PGF2α，不能增强PPAR活性。
将萤光素酶报道基因连同与酵母GAL4 DNA-结合结构域融合的PPAR-α、PPAR-γ或PPAR-S的配体结合结构域一起转染入3T3-L1细胞。15-酮PGE2和15-酮PGF2α激活了PPAR-γ，而PPAR-α程度较低。
还检测了15-酮PGE2诱导脂肪生成特异性的PPAR-γ靶基因，即IRS-1和-2的蛋白表达的能力。当用胰岛素和地塞米松处理时，3T3-L1细胞中检测到大量的PPAR-γ1和PPAR-γ2蛋白，而单独用甲基异丁基黄嘌呤(methylisobutylxanthine，MIX)处理则没有。加入15-酮PGE2和MIX及胰岛素和地塞米松显著增强了PPAR-γ1和PPAR-γ2的表达。15-酮PGE2和BRL49653即使在没有MIX时也强力诱导了脂肪细胞特异标记aP2的表达。存在胰岛素和地塞米松时，BRL49653处理显著增加了IRS-2表达。15-酮PGE2以与MIX相似的水平增强表达。胰岛素/地塞米松或MIX诱导IRS-1表达。PPAR-γ配体，包括15-酮PGE2和BRL49653，不增加IRS-1蛋白的量。
15-酮前列腺素-Δ 13 -还原酶抑制剂
RNA干扰(RNAi)方法用于沉默PGR-2表达。两个小干扰RNA(siRNA)双链体，即gaguucaguuuaccggaug(SEQ ID NO：7)和guucaagugaggacucuuu(SEQ ID NO：8)，先退火，然后通过使用Oligofectamine(Invitrogen)的转染方法导入3T3-L1成纤维细胞或分化的前脂肪细胞。siRNA双链体的转染降低了PGR-2表达。另一个实验中，siRNA双链体的转染增加了PPAR-γ转录激活。因此，人们可以通过RNA干扰沉默PGR-2表达而调节PPAR-γ活性。
其它实施方案
本说明书中的所有揭示的特征可以任何方式组合。本说明书中揭示的每个特征可以由相同、等价或相似的其它特征替代。因此，除非特别指出，每个揭示的特征只是一类等价或相似特征的例子而已。
根据上述说明，本领域技术人员可以容易地知道本发明的必要特征，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以根据用途和条件对本发明进行变化和修改。因此，其它实施方案也包括在权利要求书的范围内。

Claims (19)

1.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：1的序列或其功能性等价物，其中所述多肽还原15-酮前列腺素但不还原白三烯B4。
2.权利要求1的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％相同性的序列。
3.权利要求2的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性的序列。
4.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：1。
5.权利要求4的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
6.权利要求5的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
7.权利要求1的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
8.权利要求7的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
9.权利要求2的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
10.权利要求9的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
11.权利要求3的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
12.权利要求11的分离的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
13.一种抗体，所述抗体特异性结合权利要求1的多肽。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.权利要求13的抗体，其中所述多肽是SEQ ID NO：1。
16.权利要求15的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
17.一种用于抑制15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其包含一第一链多聚核糖核苷酸和一第二链多聚核糖核苷酸，其中第一链等同于编码15-酮前列腺素-Δ13-还原酶的核酸的19到49个连续的核苷酸，而第二链与第一链互补。
18.权利要求17的dsRNA，其中15-酮前列腺素-Δ13-还原酶是PGR/LTB4DH。
19.权利要求17的dsRNA，其中15-酮前列腺素-Δ13-还原酶是PGR2/ZADH1。
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