CN1832743A - 包含ag013736的剂型 - Google Patents

Abstract

本发明提供了式(1)化合物或其可药用盐、溶剂合物或前药的剂型。本发明进一步提供了通过对哺乳动物使用这些剂型治疗细胞异常生长如癌症的方法。

Description

包含AG013736的剂型

本申请享有2003年4月3日提交的美国临时申请号60/460,695及2003年7月31日提交的美国专利临时申请号60/491,771的优选权，两者公开的内容在此整体引入作为参考。

发明背景

本发明涉及可用于治疗哺乳动物细胞异常增长如癌症的VEGFR抑制剂。本发明也涉及一种使用这些化合物治疗哺乳动物尤其是人细胞异常增长的方法，还涉及包含这些化合物的药学组合物。

如式1所示的化合物6-[2-(甲基氨基甲酰基)苯硫基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑：

为一种强效的选择性VEGFR/PDGFR酪氨酸激酶抑制剂，在结肠、黑色素瘤、乳腺癌和肺癌的异种移植模型中具有广泛的临床前活性(Hu-Lowe D，Heller，D，Brekken J，Feeley R，Amundson K，Haines M，Troche G，Kim Y，Gonzalez D，Herrman M，Batugo M，Vekich S，Kania R，McTigue M，Gregory S，Bender S，Shalinsky D.，Pharmacological Activities of AG013736，a SmallMolecule Inhibitor of VEGFR/PDGFR Receptor Tyrosine Kinases；Proc.Am.Assoc.Cancer Res.2002：abstract#5357)。使用动态对照增强MRI(dceMRl)评价的临床前肿瘤血管反应与肿瘤生长指数相吻合(Wilmes LJ，Hylton NM，Wang D，Fleming LM Gibbs J，Kim Y，Dillon R，Brasch RC，Park JW，Li K-L，Henry RG，Partridge SC，Shalinsky DR，Hu-Lowe D，McShane TM和PallaviciniMG.，AG013736，a Novel VEGFR TK Inhibitor，Suppresses Tumor Growth andVascular Permeability in Human BT474 Breast Cancer Xenografts in NudeMice″；Proc.Am.Assoc.Cancer Res.2003：Abstract #3772.)。

发明概述

本发明提供了使用式1化合物的剂型和治疗方法，

式1化合物可系统命名为6-[2-(甲基氨基甲酰基)苯硫基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑。

在一个实施方案中，本发明提供了一种对哺乳动物给药的剂型，该剂型包含式1化合物或其可药用盐、溶剂合物、前药或其混合物，给药哺乳动物后，其量有效提供式1化合物或其活性代谢物的24小时AUC血浆值不超过4500ng·小时/mL。24小时AUC血浆值可用发明详述中的方法确定。

在该实施方案的具体方面，24小时AUC血浆值的上限为不超过4000ng·小时/mL或不超过3000ng·小时/mL或不超过2500ng·小时/mL或不超过2000ng·小时/mL或不超过1500ng·小时/mL或不超过1000ng·小时/mL或不超过800ng·小时/mL或不超过700ng·小时/mL。优选地，结合上述任一上限，24小时AUC血浆值为至少10ng·小时/mL或至少25ng·小时/mL或至少50ng·小时/mL或至少75ng小时/mL或至少100ng小时/mL或至少125ng·小时/mL。24小时AUC血浆值的范围包括从上述任一下限至上述任一上限的范围。优选范围的具体非限制实例包括25ng·小时/mL～4500ng·小时/mL、50ng·小时/mL～2500ng·小时/mL、75ng·小时/mL～1000ng-小时/m、100ng·小时/mL～800ng·小时/mL以及125ng·小时/mL～700ng·小时/mL。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种剂型，该剂型包含使用量不超过30mg的上述式1化合物或其可药用盐、溶剂合物、前药或其混合物。应当理解为，当剂型中的全部或部分化合物为盐、溶剂合物或前药时，其量为式1化合物的等效量，本领域技术人员基于摩尔质量很容易将其计算出来。

在该实施方案的具体方面，上述量的上限为不超过20mg或不超过15mg或不超过12mg或不超过10mg或不超过8mg或不超过7mg。优选地，结合上述任一上限，上述量为至少0.5mg或至少1mg或至少1.5mg或至少2mg或至少2.5mg或至少3mg。范围包括从上述任一下限至上述任一上限的范围。优选范围的具体非限制实例包括0.5mg～30mg、1mg～20mg、1.5mg～15mg、2mg～10mg、2.5mg～8mg以及3mg～7mg。

本发明进一步提供了一种通过对哺乳动物给药上述式1化合物或其可药用盐、溶剂合物、前药或其混合物治疗哺乳动物包括人的细胞异常生长的方法，给药哺乳动物后，其量有效提供式1化合物或其活性代谢物的24小时AUC血浆值不超过4500ng·小时/mL的量。24小时AUC血浆值可用发明详述中的方法确定。

在该实施方案的具体方面，24小时AUC血浆值的上限为不超过4000ng·小时/mL或不超过3000ng·小时/mL或不超过2500ng·小时/mL或不超过2000ng·小时/mL或不超过1500ng·小时/mL或不超过1000ng·小时/mL或不超过800ng·小时/mL或不超过700ng·小时/mL。优选地，结合上述任一上限，24小时AUC血浆值为至少10ng·小时/mL或至少25ng·小时/mL或至少50ng·小时/mL或至少75ng·小时/mL或至少100ng小时/mL或至少125ng·小时/mL。24小时AUC血浆值的范围包括从上述任一下限至上述任一上限的范围。优选范围的具体非限制实例包括25ng·小时/mL～4500ng·小时/mL、50ng·小时/mL～2500ng·小时/mL、75ng·小时/mL～1000ng-小时/m、100ng·小时/mL～800ng·小时/mL以及125ng·小时/mL～700ng·小时/mL。

本发明通过以每次不超过30mg的剂量对哺乳动物施用上述式1化合物或其可药用盐、溶剂合物、前药或其混合物，进一步提供了一种治疗哺乳动物包括人的细胞异常生长的方法。应当理解为，当剂型中的全部或部分化合物为盐、溶剂合物或前药时，其量为式1化合物的等效量，本领域技术人员基于摩尔质量很容易将其计算出来。

在该实施方案的具体方面，上述量的上限为不超过20mg或不超过15mg或不超过12mg或不超过10mg或不超过8mg或不超过7mg。优选地，结合上述任一上限，上述量为至少0.5mg或至少1mg或至少1.5mg或至少2mg或至少2.5mg或至少3mg。范围包括从上述任一下限至上述任一上限的范围。优选范围的具体非限制实例包括0.5mg～30mg、1mg～20mg、1.5mg～15mg、2mg～10mg、2.5mg～8mg以及3mg～7mg。

此处所述的任一发明方法的具体实施方案中，细胞异常生长为癌症，其包括，但不限于肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊锥瘤(spinal axis tumors)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤，或一种或多种前述癌症的组合。在所述方法的另一种实施方案中，细胞异常生长为一种良性的增殖性疾病，包括，但不限于牛皮癣、良性的前列腺肥大或血管再狭窄。

在另一个实施方案中，通过对哺乳动物施用治疗可接受量的式1化合物，本发明提供了一种抑制哺乳动物PDGFR BB介导的癌细胞迁移的方法。

在另一个实施方案中，通过对哺乳动物给药治疗可接受量的式1化合物，本发明提供了一种抑制哺乳动物c-KIT活性的方法。

此处所述的任一发明方法的其它具体实施方案中，所述方法进一步包括对哺乳动物施用一定量的一或多种物质，该物质选自抗肿瘤药物、抗血管生成药物、信号转导抑制剂和抗增殖药物，其使用量一起可有效治疗所述的细胞异常生长。这些物质包括在PCT公开号WO00/38715、WO00/38716、WO00/38717、WO00/38718、WO00/38719、WO00/38730、WO00/38665、WO00/37107和WO00/38786中公开的那些物质，其公开的内容在此整体引入作为参考。

抗肿瘤药物的实例包括有丝分裂抑制剂，例如长春花生物碱衍生物，如长春花碱、异长春花碱、长春地辛和长春新碱；秋水仙碱别胆烷，半软骨藻氨酸、N-苯甲酰基三甲基-甲基醚秋水仙酸、多拉司他汀10、maystansine、rhizoxine、紫杉烷类如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇(TaxotereTM)、2′-N-[3-(二甲氨基)丙基]glutaramate(TaxolTM衍生物)、thiocholchicine、三苯甲基半胱氨酸、替尼泊苷、氨甲喋呤、咪唑硫嘌呤、5-氟尿苷、阿糖胞苷、2′2′-二氟脱氧胞苷(吉西他滨)、阿霉素和mitamycin。烷基化药物，例如顺铂、卡铂、oxiplatin、异丙铂、N-乙酰-DL-肌氨酰基-L-亮氨酸的乙基酯(Asaley或Asalex)、1，4-环己二烯-1，4-二氨基甲酸、2，5-双-(1-氮杂丙啶基)-3，6-二氧代，二乙基酯(地吖醌)，1，4-双(甲磺酰氧基)丁烷(bisulfan or leucosulfan)、氯脲菌素、氯乙矾、氰基吗啉多柔比星、cyclodisone、dianhydroglactitol、氟多潘、hepsulfam、丝裂霉素C、羟甲硫蒽酮丝裂霉素C、米托唑酰胺、1-(2-氯乙基)-4-(3-氯丙基)-哌嗪二盐酸盐、哌嗪二酮、哌泊溴烷、甲基丝裂霉素、spirohydantoin mustard、替罗昔隆、四铂、硫替派、曲他胺、尿嘧啶氮芥、双(3-甲磺酰丙基)胺盐酸盐、丝裂霉素、亚硝基脲药剂如环己基-氯乙基亚硝基脲、甲基环己基-氯乙基亚硝基脲、1-(2-氯乙基)-3-(2，6-二氧代-3-哌啶基)-1-亚硝基-脲、双(2-氯乙基)亚硝基脲、甲苄肼、甲嗪咪唑胺、氮芥相关的化合物如mechloroethamine、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、雌二醇氮芥钠、strptozoin、替莫唑胺。DNA抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、羟基脲、2-[(3-羟基-2-pyrinodinyl)亚甲基-肼硫代羟酸酰胺、脱氧氟尿嘧啶、5-羟基-2-甲酸吡啶缩氨基硫脲、α-2′-脱氧-6-硫乌嘌呤、aphidicolin glycinate、5-氮杂脱氧胞嘧啶、β-硫乌嘌呤脱氧核糖甙、安西他滨、胍唑、inosine glycodialdehyde、macbecin II、pyrazolimidazole、克拉屈滨、喷司他丁、硫乌嘌呤、巯基嘌呤、博来霉素、2-氯脱氧腺苷，胸腺嘧啶合成酶抑制剂如雷替曲塞和培美曲塞二钠、氯苯吩嗪、氟尿苷和氟达拉滨。DNA/RNA抗代谢物，例如L-阿拉诺新、5-氮胞苷、阿西维辛、氨喋呤及其衍生物如N-[2-氯-5-[[(2，4-二氨基-5-甲基-6-喹唑啉基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-天冬氨酸、N-[4-[[(2，4-二氨基-5-乙基-6-喹唑啉基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-天冬氨酸、N-[2-氯-4-[[(2，4-二氨基蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-天冬氨酸、可溶的Baker’s antifol、二氯烯丙基散沫花素、布喹那、呋氟尿嘧啶、二氢-5-氮胞苷、氨甲喋呤、N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸四钠盐、吡唑并呋喃、三甲曲沙、plicanycin、放线菌素D、cryptophycin及类似物如cryptophycin-52或，例如，欧洲专利申请号239362中公开的一种优选的抗代谢物，如N-(5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代喹唑啉-6-基甲基)-N-甲基氨基]-2-噻酚甲酰基)-L-谷氨酸；生长因子抑制剂；细胞周期抑制剂；嵌入(intercalating)抗生素，如多柔比星和博来霉素；蛋白质，例如干扰素；以及抗-激素类，例如抗-雌激素类如Nolvadex^TM(他莫昔芬)，或例如抗-雄激素类如Casodex^TM(4′-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3′-(三氟甲基)丙酰苯胺)。这种结合治疗可能通过对治疗的各个成分同时、相继或单独给药的方式达到。

抗血管生成药物包括MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂及COX-II(环氧化酶II)抑制剂。可用的COX-II抑制剂实例包括CELEBREX^TM(alecoxib)、伐地考昔和罗非考昔。可用的基质-金属蛋白酶抑制剂在WO96/33172(1996年10月24日公开)、WO96/27583(1996年3月7日公开)、欧洲专利申请号97304971.1(1997年7月8日提交)、欧汌专利申请号99308617.2(1999年10月29日提交)、WO98/07697(1998年2月26日公开)、WO98/03516(1998年1月29日公开)、WO98/34918(1998年8月13日公开)、WO98/34915(1998年8月13日公开)、WO98/33768(1998年8月6日公开)、WO98/30566(1998年7月16日公开)、欧洲专利公开号606,046(1994年7月13日公开)、欧洲专利公开号931,788(1999年7月28日公开)、WO90/05719(1990年5月331日公开)、WO99/52910(1999年10月21日公开)、WO99/52889(1999年10月21日公开)、WO99/29667(1999年6月17日公开)、PCT国际申请号PCT/IB98/01113(1998年7月21日提交)、欧洲专利申请号99302232.1(1999年3月25日提交)、英国专利申请号9912961.1(1999年6月3日提交)、美国专利申请号60/148,464(1999年8月12日提交)、美国专利5,863,949(1999年1月26日授权)、美国专利5,861,510(1999年1月19日授权)以及欧洲专利公开780,386(1997年6月25日公开)中被描述，所有这些在此整体引入作为参考。优选的MMP-2及MMP-9抑制剂为那些对MMP-1具有很小或无抑制活性的化合物。更优选的为那些选择性抑制MMP-2和/或MMP-9，相对于其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)。

MMP抑制剂的实例包括AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830以及下列引用的化合物：

3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸；

3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧杂-双环「3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；

(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；

4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；

3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；

4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；

3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺；

(2R，3R)-(4-氟-2-甲基-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；

3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；

3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羟基氨基甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；

3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；

3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；和

3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺

及其可药用盐、溶剂合物和前药。

信号转导抑制剂的实例包括抑制EGFR(表皮生长因子受体)反应的药物，如EGFR抗体、EGF抗体和EGFR抑制剂分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂；和erbB2受体抑制剂，如与erbB2受体结合的有机分子或抗体，例如HERCEPTIN^TM(Genentech，Inc.of South San Francisco，California，USA)。

EGFR抑制剂在例如WO95/19970(1995年7月27日公开)、WO98/14451(1998年4月9日公开)、WO98/02434(1998年1月22日公开)以及美国专利5,747,498(1998年5月5日授权)中被描述。EGFR抑制药剂包括，但不限于单克隆抗体C225和抗-EGFR 22Mab(ImClone Systems Co.ofNewyork，Newyork，USA)、化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc.of Annandale，NewJersy，USA)及OLX-103(Merck & Co.of Whitehouse Station，New Jersy，USA)、VRCTC-310(Ventech Research)以及EGF融合毒素(Seragen Inc.ofHopkinton，Massachusetts)。

VEGF抑制剂，例如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South SanFrancisco，Califomia，USA)，也可与式1化合物联合用药或同时给药。VEGF抑制剂在例如WO99/24440(1999年5月20日公开)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(1999年5月3日提交)、WO95/21613(1995年8月17日公开)、WO99/61422(1999年12月2日公开)、美国专利5,834,504(1998年11月10日授权)、WO98/50356(1998年11月12公开)、美国专利5,883,113(1999年3月16日授权)、美国专利5,886,020(1999年3月23日授权)、美国专利5,792,783(1998年8月11日授权)、WO99/10349(1999年3月4日公开)、WO97/32856(1997年9月12日公开)、WO97/22596(1997年6月26日公开)、WO98/54093(1998年12月3日公开)、WO98/02438(1998年1月22日公开)、WO99/16755(1999年4月8日公开)和WO98/02437(1998年1月22日公开)中被描述，所有这些在此整体引入作为参考。一些特异性VEGF抑制剂的其它实例为IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Washington，USA)；抗-VEGF单克隆抗体贝伐单抗(Genentech，Inc.of South San Francisco，Califomia)；angiozyme^TM，一种由Ribozyme(Boulder，Colorado)和Chiron(Emeryville，Califonia)公司合成的核酶。

ErbB2受体抑制剂，如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)、单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands，Texas，USA)及2B-1(Chiron)可与式1化合物联合给药。这些ErbB2抑制剂包括在WO98/02434(1998年1月22日公开)、WO99/35146(1999年7月15日公开)、WO99/35132(1999年7月15日公开)、WO98/02437(1998年1月22日公开)、WO97/13760(1997年4月17日公开)、WO95/19970(1995年7月27日公开)、美国专利5,587,458(1996年12月24日授权)及美国专利5,877,305(1999年3月2日授权)中描述的那些抑制剂，所有这些在此整体引入作为参考。可用于本发明的ErbB2受体抑制剂也在1999年1月27日提交的美国临时申请号60/117,341和1999年1月27日提交的美国临时申请号60/117,346中被描述，二者在此整体引入作为参考。

其它可用的抗增殖药物包括法尼基蛋白转移酶抑制剂和酪氨酸激酶受体PDGFr抑制剂，包括在下列美国专利申请中公开和要求专利保护的化合物：09/221946(1998年12月28日提交)；09/454058(1999年12月2日提交)；09/501163(2000年2月9日提交)；09/539930(2000年3月31日提交)；09/202796(1997年5月22日提交)；09/384339(1999年8月26日提交)；09/383755(1999年8月26日提交)；以及在下列美国临时专利申请中公开和要求专利保护的化合物：60/168207(1999年11月30日提交)；60/170119(1999年12月10日提交)；60/177718(2000年1月21日提交)；60/168217(1999年11月30日提交)；以及60/200834(2000年5月1日提交)。前述各专利申请和临时专利申请在此整体引入作为参考。

式1化合物也可联用其它药物用于治疗细胞异常生长或癌症，这些药物包括，但不限于能增强抗肿瘤免疫反应的药物，如CTLA4(细胞毒性淋巴球抗原4)抗体，和其它能阻滞CTLA4的药物；以及抗增殖药物如其它法尼基蛋白转移酶抑制剂。能用于本发明的特异性CTLA4抗体包括在美国临时申请60/113,647(1998年12月23日提交)中描述的那些抗体，该专利在此整体引入作为参考。

在另一实施方案中，本发明提供了一种药用组合物，包括式1化合物或其可药用盐、溶剂合物或前期药，以及治疗有效量的多西紫杉醇。

在另一实施方案中，本发明通过对哺乳动物施用式1化合物或其可药用盐、溶剂合物或前药以及治疗有效量的多西紫杉醇，提供了一种治疗哺乳动物包括人的细胞异常生长的方法。式1化合物和多西紫杉醇可分开使用或在同一组合物中使用，还可根据需要，以相同或不同给药方案使用。

定义

此处所用的“细胞异常生长”，除非另外说明，指不受正常调节机制调控(例如，失去接触抑制)的细胞生长。它包括以下的异常生长：(1)通过表达突变的酪氨酸激酶或超量表达受体酪氨酸激酶增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其他增殖性疾病的良性和恶性细胞，其中出现异常酪氨酸激酶激活；以及(4)通过受体酪氨酸激酶增殖的任何肿瘤。

此处所用的术语“治疗”，除非另外说明，指逆转、减轻、抑制此术语应用的疾病或状态，或该疾病或状态的一或多种症状的进展，或预防该疾病或状态。此处所用的术语“治疗”，除非另外说明，指紧接上述“治疗”所指的治疗行为。

此处所用的术语“可药用盐”，除非另外说明，包括可存在于化合物的酸性或碱性基团的盐。本质上碱性化合物可与各种无机和有机酸形成各种盐。可用于制备这些碱性化合物的可药用酸性加成盐的酸为可形成无毒酸性加成盐的那些酸，所述的盐即，包含可药用阴离子的盐，如乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、edislyate、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐、乙基琥珀酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、醣酵对氨基苯胂酸盐(glycolylarsanilate)、hexylresorcinate、海葱次苷、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸、isothionate、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、对甲苯磺酸盐、triethiodode和戊酸盐。

此处所用的术语“前药”，除非另外说明，指药物的前体化合物，其给药后，通过一些化学或生理过程在体内释放出药物(例如，一旦被带到生理pH值，前药就转变成所需要的药物形式)。

本发明还包含同位素标记的化合物，其与式1中列举的那些化合物相同，除一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然界中常见的原子量或质量数的原子取代。引入本发明化合物的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹p、³²p、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。本发明化合物及其前药，及包含前述同位素和/或其它原子同位素的所述化合物或所述前药的可药用盐和溶剂合物，都在本发明范围内。本发明中一些同位素标记的化合物，例如，引入了放射性同位素如³H和¹⁴C的那些化合物，可用于药物和/或底物在组织中的分布实验。特别优选氚，即³H和C-14，即¹⁴C同位素，由于其易于制备和测定。此外，以较重的同位素如氘，即²H取代可产生一些更好的治疗优点，该优点源于更大的代谢稳定性，例如体内半衰期增加或所需剂量减少，从而使其在一些情况下被优选。本发明中同位素标记的式1化合物及其前药通常以上述制备未标记化合物的方法制备，以易得的同位素标记试剂取代非同位素标记试剂。

附图概述

图1表示在狗口服单剂¹⁴C标记的化合物后确定的式1化合物的代谢物。

图2表示在小鼠口服单剂¹⁴C标记的化合物后确定的式1化合物的代谢物。

发明详述

式1化合物可以美国专利号6,531,491和6,534,524(分别于2003年3月11日和2003年3月18日授权)描述的方法制备，两者在此整体引入作为参考。可按本领域技术人员熟悉的方法制备一些原料及作一些合成上的修改。

式1化合物可与各种无机或有机酸形成各种不同的盐。尽管给药哺乳动物的这些盐必须可药用，在实践中，通常仍然需要首先将式1化合物以不可药用盐从反应混合物中分离，然后以碱性试剂处理简单地将后者再转变为游离碱化合物，然后将游离碱转变为一种可药用酸的加成盐。本发明的碱性化合物的酸加成盐化合物很易制备，即在含水溶性介质或合适的有机溶剂如甲醇或乙醇中，以基本等当量的精选无机酸或有机酸处理碱性化合物。小心地浓缩溶剂，很易制备所需的固体盐。通过向溶于有机溶剂的游离碱溶液加入合适的无机酸或有机酸，所需的酸加成盐也可从溶液中沉淀出来。

式1化合物的给药受任何可使化合物递送到作用部位的方法影响。这些方法包括口腔途径、十二指肠内途径、肠胃外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)、局部以及直肠使用。

例如，化合物可制成适于口腔给药的形式如片剂、胶囊，丸剂、粉剂、缓释制剂、溶液、悬液，或适于肠胃外注射给药的形式如无菌溶液、悬液或乳剂，或适于局部给药的形式如软膏或乳膏，或适于直肠给药的形式如栓剂。化合物可制成适于单次精确给药的单位剂型。优选地，剂型包括常规的药学载体或辅料及式1化合物作为活性成分。此外，剂型可包括其它医用或药用试剂、载体、佐剂等。

肠胃外给药形式的例子包括溶液或无菌水悬液，例如，丙二醇或葡萄糖溶液。必要时，这些剂型进行适当的缓冲。

合适的药学载体包括惰性稀释剂或填料、水和各种有机溶剂。必要时，药学组合物可包含其它成分，如调味剂、粘合剂、辅料等。因此，口服给药的包含各种成分如柠檬酸的片剂，可与各种崩解剂如淀粉、藻酸及一些复合硅酸盐以及粘合剂如蔗糖、凝胶和阿拉伯胶同时给药。此外，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉的润滑剂常用于片剂制备。类似的固体组合物也可用于填充软或硬明胶胶囊。因此，优选的材料包括乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇。当水悬液或酏剂需要经口给药时，其中活性化合物可与各种增甜剂或调味剂、色素以及，必要时，乳化剂或悬浮剂、稀释剂如水、乙醇、丙二醇、丙三醇或其组合物联合给药。

在本发明剂型的优选实施方案中，剂型为口服剂型，更优选为片剂或胶囊。

在本发明方法的优选实施方案中，式1化合物口服给药，如，例如此处所述的口服剂型。

本发明的方法包括给药任何所需剂量的式1化合物。在一个具体的实施方案中，化合物每日一次(quaque die，或QD)，优选每日2次(bis in die，或BD)，尽管本发明范围包括更多次或更少次的给药。化合物可用于哺乳动物，包括人，优选在禁饮食状态(在用药前后2小时内不进食或者饮料)。在一个特别优选的实施方案中，给药方式为每日两次、禁饮食。

对本领域研究人员而言，制备一定量的式1化合物的各种剂型的方法已知或很明显。例如，见 Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easter，Pa.，15th Edition(1975)。

AUC血浆值可通过直接测定式1化合物或其活性代谢物在不同时间间隔的血浆浓度，例如通过液相-串联质谱(LC-MS/MS)，并计算血浆浓度与时间的曲线下面积而测得。计算AUC的合适方法在本领域众所周知，如，例如给药梯形近似法：

${\mathrm{AUC}}_{(0-i)}=\underset{i=0}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}\frac{t_{i+1}-t_i}{2}(C_i+C_{i+1})$

其中n为数据点数，t₁和c₁为第i个数据点的时间和浓度(x和y值)。24小时AUC值可根据给药方案校正测得的血浆浓度确定。亚硫酸氢钠作为稳定剂加入重建的溶液中用于制备浓度标准。

式1化合物具有与调节和/或抑制激酶活性相关的有利特性，该激酶活性与VEGF-R、FGF-R、CDK复合物、CHK1、CSF-R和/或LCK相关。

如下述实施例所示，式1化合物在体外可诱导HUVEC凋亡，抑制HUVEC中VEGF介导的Akt和eNOS磷酸化，证实停用化合物后在HUVEC中对VEGFR-2的持久抑制作用，并抑制PDGF BB诱导的在基质蛋白质纤连蛋白上的癌细胞迁移。式1化合物通过抑制肿瘤的迁移和侵袭，从而具有阻止PDGFR诱导的肿瘤进程的活性。

当与Taxol^TM，更优选多西紫杉醇联合时，式1化合物还显示了更有效的肿瘤生长抑制活性。在联合治疗中观察到比药物单用时更显著的肿瘤消退。

本发明通过使用式1化合物，进一步涉及例如在哺乳动物组织中调节或抑制蛋白激酶活性的方法。本发明化合物作为蛋白激酶活性如激酶活性的调节剂的活性，可通过本领域技术人员已有的任何方法测定，包括体内和/或体外实验。适于测定活性的的实验的实例包括在Parast C.等，BioChemistry，37，16788-16801(1998)；Jeffrey等，Nature，376，313-320(1995)；WIPO国际公开号WO97/34876和WIPO国际公开号WO96/14843中所述的那些实例。这些特性可被评价，例如，通过使用一或多种下述实施例中的生物学实验方法。

下述实施例和制备进一步阐明和例证了本发明的剂型和方法。应当理解为，本发明的范围不受下述实施例范围的限制。

实施例1

式1化合物被用于测定：(1)数种方案的体内效力：sid，周末不给药及间歇给药；(2)在异种移植模型中与多西紫杉醇联合给药时的效力；(3)体外内皮细胞的eNOS和Akt磷酸化；(4)细胞物中及体内一氧化氮及相关产物的浓度以及(5)将全血细胞中的c-Kit信号作为该化合物的潜在的生物标志物。

生物学测试；酶实验

由生长因子如VEFG、FGF及其它因子刺激的细胞增殖依赖于各自相应受体酪氨酸激酶自身磷酸化的诱导。因此，蛋白激酶抑制剂阻断这些因子诱导细胞增殖的能力与其阻断受体自身磷酸化的能力直接相关。为测定化合物的蛋白激酶抑制活性，设计了下述构造构建体。

供测定的VEGF-R2构建体：该构建体测定受试化合物抑制酪氨酸激酶活性的能力。将人血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)胞质结构域的一个构建体(VEGF-R2Δ50)在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达，其缺乏激酶插入结构域68个残基中的50个位于中央的残基。在VEGF-R2全长的1356个残基中，VEGF-R2Δ50包含806-939、990-1171残基以及激酶插入结构域中相对于野生型VEGF-R2的一个点突变(E990V)。纯化的构建体在3mM ATP和40mM MgCl₂的条件下，4μM浓度的酶在含5％甘油、5mMDTT、pH 7.5的100mM HEPES中4℃温育2小时，完成自身磷酸化。自身磷酸化后，该构建体显示出催化活性，其活性基本相当于自身磷酸化的野生型激酶结构域构建体。参见Parast等，Biochemistry，37，16788-16801(1998)。

供测定的FGF-R1构建体：以杆状病毒载体表达系统表达人FGF-R1的细胞内激酶结构域，包括内源的蛋氨酸残基456至谷氨酸766，残基按照Mohammadi等，Mol Cell.BioL，16，977-989(1996)的残基编号系统进行编号。此外，该构建体还具有下列3个氨基酸取代：L457V、C488A和C584S。

供测定的LCK构建体：在昆虫细胞中将LCK酪氨酸激酶表达为N-端删除，包括氨基酸残基223至该蛋白质末端残基509，在N-端具有下列2个氨基酸取代：P233M和C224D。

供测定的CHK-1构建体：以杆状病毒/昆虫细胞系统表达C-端His标记的人全长CHK-1(FL-CHK-1)。在由476个氨基酸组成的人CHK-1的C-末端含有6个组氨酸残基(6×His-标记)。该蛋白质以常规的层析技术纯化。

供测定的CDK2/细胞周期素A构建体：以公开的方法(Rosenblatt等，J.Mol.Biol.，230，1317-1319(1993))将CDK2自感染了杆状病毒表达载体的昆虫细胞中纯化。细胞周期素A从表达全长的重组细胞周期素A的E.coli细胞中纯化，并且截短的细胞周期素A构建体通过限制性的蛋白质水解产生，并以前述方法(Jeffrey等，Nature，376，313-320(1995))纯化。

供测定的CDK4/细胞周期素D构建体：人CDK4与细胞周期素D3的复合物，或细胞周期素D1与CDK4和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白(GST-CDK4)的复合物，以常规的生物化学层析技术自共感染了相应的杆状病毒表达载体的昆虫细胞中纯化。

VEGF-R2测定：偶联的分光光度(FLVK-P)测定

使用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)及一个具有丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的系统，将伴有磷酰基转移的ATP生成ADP与NADH氧化相偶联。NADH的氧化利用Beckman DU 650分光光度计在340nm(e₃₄₀＝6.22cm^-1mM^-1)处吸光度的减少测定。磷酸化的VEGF-R2Δ50(下述表格中表示为FLVK-P)的测定条件如下：pH为7.5的200mM HEPES含1mM PEP、250μM NADH、50单位LDH/mL、20单位PK/mL、5mM DTT、5.1mM poly(E₄Y₁)、1mM ATP以及25mM MgCl₂。未磷酸化的VEGF-R2Δ50(表格中表示为FLVK)的测定条件如下：pH为7.5的200mM HEPES含1mM PEP、250μMNADH、50单位LDH/mL、20单位PK/mL、5mM DTT、20mM poly(E₄Y₁)、3mM ATP、60mM MgCl₂以及2mM MnCl₂。测定以5～40nM酶引发。K₁值通过测定不同浓度的受试化合物存在下的酶活性确定。数据以EnzymeKinetic and Kaleidagraph软件分析。

ELISA测定：磷酸胃泌素的形成以生物素化的胃泌素肽(1-17)作为底物监测。生物素化的磷酸胃泌素以链亲和素包被的96孔微量滴定板固定，随后以偶联辣根过氧化物酶的抗-磷酸酪氨酸-抗体测定。辣根过氧化物酶的活性以2，2′-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二铵盐(ABTS)测定。典型的测定液包括：pH为7.5的200mMHEPES含2μM生物素化的胃泌素肽、5mMDTT、20μM ATP、26mM MgCl₂以及2mM MnCl₂。实验以0.8nM磷酸化的VEGF-R2Δ50引发。辣根过氧化物酶活性以10mM ABTS测定。加酸(H₂SO₄)终止辣根过氧化物酶反应，然后读405nm下的吸光度。K₁值通过测定不同浓度受试化合物下的酶活性确定。数据以Enzyme Kinetic and Kaleidagraph软件分析。

FGF-R测定：分光光度测定以上述VEGF-R2的方法进行，仅有下述浓度变化：FGF-R＝50nM，ATP＝2mM以及poly(E4Y1)＝15mM。

LCK测定：分光光度测定以上述VEGF-R2的方法进行，仅有下述浓度变化：LCK＝60nM，MgCl₂＝0mM，poly(E4Y1)＝20mM.

CHK-1测定：通过丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的作用，以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)将ATP生成ADP，该过程伴有磷酰基转移至合成底物肽Syntide-2(PLARTLSVAGLPGKK)，与NADH氧化相偶联。NADH氧化通过下述HP8452分光光度计在340nm(∈340＝6.22cm^-1mM^-1)吸光度的减少测定。典型的检测液包括：pH为7.5的50mM TRIS包括4m NPEP、0.15mM NADH、28单位LDH/mL、16单位PK/mL、3mM DTT、0.125mM Syntide-2、0.15mMATP、25mM MgCl₂以及400mM NaCl。测定以10nM FL-CHK-1引发。K₁值通过测定不同浓度受试化合物下的酶活性确定。数据以Enzyme Kineticand Kaleidagraph软件分析。

HUVEC增殖测定：本测定确定受试化合物抑制生长因子刺激人脐静脉血管内皮细胞(″HUVEC″)增殖的能力。将HUVEC细胞(3-4代，Clonetics，Corp.)于T75培养瓶中的EGM2培养基(Clonetics Corp)中解冻。24小时后向培养瓶中加入新鲜的EGM2培养基。4～5天后，将细胞置于另一种培养基中(补加10％胎牛血清(FBS)、60μg/mL内皮细胞生长添加剂(ECGS)及10μg/m肝素的F12K培养基)。然后将指数生长的HUVEC细胞用于后述实验。将1～1.2万个HUVEC细胞置于装有100μL营养丰富培养基(上述)的96孔板中。细胞在培养基中贴壁24小时。然后吸取去除培养基，并向每孔加入115μL饥饿培养基(F12K+1％FBS)。18小时后，将溶解受试药物的15μL含1％ DMSO的饥饿培养基或单一饥饿培养基加入至每个处理孔中；DMSO的终浓度为0.1％。1小时后，将20μl含150ng/mL hrVEGF165的饥饿培养基加入所有孔中，除未处理的对照组以外；VEGF的终浓度为20ng/mL。72小时后，以MTT染料还原对细胞增殖量化，处理时，将细胞置于MTT(Promega Corp.)中4-5小时。加入终止溶液(Promega Corp.)终止Dye还原，自96-孔分光光度计平板读数器确定570和630nm的吸光度。

癌细胞增殖(MV522)测定：为确定蛋白激酶抑制剂在治疗癌症时是否有效阻断血管生成时，证实该抑制剂在不表达激酶受体的细胞中并不是非特异地阻断细胞增殖是至关重要的。其通过癌细胞的增殖测定完成。评价癌细胞增殖的方法与评价HUVEC细胞增殖的方法相似。将2000个肺癌细胞(MV522细胞系，从UCSD获得)接种于生长培养基(补加2mM谷氨酰胺和10％ FBS的RPM11640培养基)中。细胞贴壁1天后加入受试药物和/或溶媒。

同时以在HUVEC测定中使用的相同受试药物处理细胞。接触受试药物72小时后用MTT染料还原量化细胞增殖。

C-Kit强度测定：使用NCI-H526(ATCC)细胞测定抑制剂抗c-Kit的强度。细胞生长至接近融合时，将其于饥饿培养基中培养18小时。加入抑制剂，将细胞置于存在2.3％白蛋白和1mM Na₃VO₄(Sigma)的条件下37℃温育45分钟。将SCF，即c-Kit生长因子以50ng/mL的终浓度加入培养基中。5分钟后，以预冷的PBS冲洗2次，再用裂解缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、1mM PMSF、1％ NP40、1mM Na₃VO₄及蛋白酶抑制剂的混合物)裂解。免疫沉淀以1mg的每种裂解物总蛋白与4μg/mL CD117ab-3(K45，Neomarkers)在4℃温育过夜完成。次日早上将抗体复合物与蛋白A珠状物连接。SDS PAGE及Western Blot分析，使用磷酸化受体的抗磷酸酪氨酸抗体4G10(Upstate Biotechnology)或抗-c-Kit受体的抗体sc-1493(C-14，SantaCruz)完成，浓度为1∶1000。印迹以化学发光试剂ECL Plus显色。phosphorimager(Storm846，Molecular Dynamics)用于对印迹中的信号定量。

动物和哺乳动物总外周血细胞中的c-kit阳性细胞数减少可作为式1化合物活性的一种生物标志物。

eNOS和Akt磷酸化测定：HUVEC(Clonetics)用于测定抑制剂抑制eNOS和Akt的效力。细胞生长至接近融合时，将其于饥饿培养基中培养18小时。加入抑制剂，细胞于存在2.3％白蛋白和1mM Na₃VO₄(Sigma)的条件下37℃温育45分钟。将VEGF加入培养物中，浓度为50ng/mL。5分钟后，以预冷的PBS冲洗2次，再以裂解缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl、1mM PMSF、1％ NP40、1mM Na₃VO₄及蛋白酶抑制剂的混合物)裂解。以Western方法分析30-40μg总蛋白。eNOS和Akt的磷酸化通过使用磷酸-eNOS(Ser1177)#9571或磷酸-Akt(Ser473)#9271抗体(均来自Cell signaling)评价。蛋白质检测通过使用NOS3(C-20)sc-654(Santa Cruz)或Akt抗体#9272(Cell Signaling)完成。所有测定都需要连接了第二抗体的抗兔HRP，浓度为1∶3000。印迹以化学发光底物Super Signal West Dura(Pierce)显色。AlphaInnotech公司的Alpha Imager8800用于对印迹中的信号定量。

小鼠PK测定：药物在小鼠中的药代动力学(例如，吸收和排泄)用下述实验进行分析。将受试化合物在0.5％ CMC溶媒中制成悬液或在30∶70(PEG400∶酸化的H₂O)溶媒中制成溶液。该悬液或溶液通过口服(p.o.)或腹膜内注射(i.p.)于C3H雌小鼠(n＝4)。在时间点：0小时(给药前)、给药后0.5小时、1.0小时、2.0小时及4.0小时通过眼窝放血收集血样本。以2500rpm离心5分钟，自每个样本中获得血浆。以有机蛋白沉淀方法自血浆中提取受试化合物。将每次放血得到的50μL血浆与1.0mL乙腈混合，涡旋2分钟，然后4000rpm离心15分钟沉淀蛋白质，萃取受试化合物。然后，乙腈上清液(包含受试化合物的萃取液)倒入新试管中，于25℃热板上以N₂蒸发。向含有干燥受试化合物的萃取物试管中加入125μl流动相(60∶40，0.025MNH₄H₂PO₄+2.5mL/L TEA∶乙腈)。受试化合物通过涡旋重新悬浮于流动相中，4000rpm离心5分钟再除去更多蛋白质。将各样本倒入HPLC小管中，在具有UV检测的Hewlett Packard1100系列HPLC上作受试化合物分析。从各样本中取95μL注入150×3.2mm的Phenomenex-Prodigy反相C-18柱上，并以45-50％乙腈梯度洗脱10分钟。血浆中受试化合物的浓度(ug/mL)通过与标准曲线(峰面积vs.浓度ug/mL)比较确定，该曲线以上述方法从血浆样本中提取的受试化合物的已知浓度绘制。与标准及未知一起，进行了三组质控(0.25ug/mL、1.5ug/mL及7.5ug/mL)(n＝4)以确保分析的一致性。标准曲线的R2＞0.99，所有质控组均在其期望值的10％以内。定量的测试样本以Kaleidagraph软件绘图显示，其药代动力学参数以WIN NONLIN软件确定。

人肝脏微粒体(HLM)测定：人肝脏微粒体中化合物的代谢以下述LC-MS分析测定方法检测。首先，将肝脏微粒体(HLM)解冻并用预冷的100mM磷酸钾(KPO₄)缓冲液稀释至5mg/mL。将适量KPO₄缓冲液、NADPH-再生溶液(含B-NADP，葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及MgCl₂)以及HLM置于13×100mm玻璃管中37℃预温育10分钟(每种受试化合物3管-3重)。将受试化合物(终浓度为5μM)加入各管中启动反应，以温和的涡旋搅拌，然后于37℃温育。在t＝0和2h时，从各温育管中取出250μL样本至不同的12×75mm玻璃管中，管中含有1mL冰冷的乙腈，包含0.05μM利血平。将样本在4000rpm离心20分钟以沉淀蛋白质及盐(Beckman Allegra 6KR，S/N ALK98D06，#634)。将上清液转移至新的12×75mm玻璃管中，以Speed-Vac旋转真空蒸发仪浓缩。将样本重新置于200μL 0.1％甲酸/乙腈(90/10)中并剧烈涡旋至溶解。然后将样本转移至不同的聚丙烯微型离心管中，在14000×g下离心10分钟(Fisher Micro14，S/NM0017580)。对于各个时间点(0和2h)的重复实验样品(#1-3)，将各受试化合物可分量的样本合并入一个HPLC管中(共6个样本)中用于LC-MS分析，如下所述。

将合并的化合物样本注入LC-MS系统，该系统由Hewlett-PackardHP 1100二极管阵列HPLC和一个Micromass Quattro II triple quadruple质谱仪组成，该质谱仪以正电喷雾SIR模式运行，该模式特定用于扫描各种受试化合物分子的离子。将各受试化合物在各个时间点的峰集中。对各化合物各个时间点(n＝3)的峰面积求平均数，2h处的平均峰面积除以0h处的平均峰面积得受试化合物在2h处的剩余百分数。

体外HUVEC凋亡测定

用ELISA对凋亡定量：HUVEC细胞凋亡用Cell Death Detection ElisaPLUS(catalog # 1775425，Roche Biochemicals，曼海姆，德国)测定，其定量细胞裂解物中与组蛋白相连的胞质内DNA片段。该步骤对操作说明书稍作修改。简言之，饥饿的HUVEC细胞以含有VEGF(20ng/mL)的不同浓度化合物A处理。在不同时间点收集细胞的胞质成分，在夹心的ELISA中将其作为抗原，ELISA具有包被于微量滴定板上的抗组蛋白mAb第一抗体及与过氧化物酶连接的抗DNA mAb第二抗体。凋亡细胞数通过加入显色过氧化物酶底物后，以分光光度计测定405nm(参考波长490nm)处的吸光度确定。

用TUNEL对凋亡成像：凋亡细胞的原位检测用TdT-介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术完成。简言之，将生长于8孔Lab-Tek chamber slides的HUVEC细胞饥饿O/N，然后用不同浓度的化合物A处理6h。再将细胞固定于4％多聚甲醛中，以Triton X-100透化处理，然后按照操作说明书以末端转移酶和核苷酸的混合物温育1h，该核苷酸包括荧光素-dUTP(Deadend Fluorometric TUNEL system，Promega，catalog # G3250)。细胞以碘化丙锭(PI)溶液复染。被荧光素染色和PI标记的阳性细胞用荧光显微镜成像和拍照。

PDGF介导的细胞迁移测定：本测定使用U87MG细胞。将包含0.5ng/mL纤连蛋白的6孔板预温育过夜。次日将U87MG细胞植入每孔，直至融合。将细胞以含有0.1％ FBS的饥饿培养基温育过夜。以移液枪吸头划一个约1cm的划痕，用饥饿培养基洗涤细胞。然后将培养板以0.5ng/mL纤连蛋白培养1小时，再次洗涤。加入含有100ng/Ll rhPDGF BB的实验培养基和化合物A的饥饿培养基。在0～15小时间对细胞拍照，将迁移成像。

细胞内VEGFR-2及下游分子磷酸化测定：HUVEC(Clonetics)培养接近至融合时，将其于饥饿培养基(F12K加0.1％ FBS)中培养18h。向置于2.3％白蛋白和1mM Na₃VO₄(Sigma)中的细胞加入化合物A。45分钟后，向培养基中加入终浓度为50ng/mL的VEGF。5分钟后，以预冷的PBS冲洗，再以裂解缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，1mM PMSF，1％ NP40，1mM Na₃VO₄及蛋白酶抑制剂的混合物)裂解。使用抗-Flk-1C-1158(Santa Cruz)将1mg裂解物总蛋白免疫沉淀。将抗体复合体与蛋白质A珠状物偶联，作SDS PAGE/Westem分析。磷酸化的VEGFR-2和蛋白质分别用抗磷酸酪氨酸抗体4G10(Upstate Biotechnology)和抗-Flk-1C-20(Santa Cruz)测定。对于eNOS和Akt，处理细胞的方法同上述。以总量为30-40μg的蛋白质完成Westem分析。eNOS和Akt磷酸化以磷酸-eNOS(Ser1177，# 9571)或磷酸-Akt(Ser 473，# 9271)抗体(Cell Signaling)探查。蛋白质以NOS3C-20(sc-654，Santa Cruz)或Akt抗体# 9272(Cell Signaling)评价。HRP连接的抗-兔IgG用作第二抗体。所有印迹用化学发光试剂Super Signal West Dura(Pierce)显色。用AlphaInnotech的Aipha Imager 8800对信号定量。

褪色实验：以上述方法处理HUVEC细胞。以化合物A(10nM)培养45分钟后，再以VEGF(50ng/mL)刺激5分钟，去除上清，洗涤，以含有VEGF和Na₃VO₄的饥饿培养基替换。在裂解细胞及以免疫沉淀、Westem作磷酸化的总VEGFR-2分析(见上述)之前，将细胞再温育所需的时间。另一实验中，在全部时间里如上述以VEGF处理细胞，同样地，在所需时间点评价总VEGFR-2。褪色时的信号以光密度分析法定量。相互矫正各测定的最大刺激(5分钟)虽度，比较两次实验各时间点的磷酸-VEGFR-2强度，这两个实验可确定VEGFR-2磷酸化恢复情况，恢复是相对于仅以VEGF刺激处理的细胞。

肿瘤模型：对于人MV522(结肠癌)和MDA-MB-231(乳腺癌)无胸腺小鼠模型(n＝8-12)，植入5×10⁶个细胞/部位(s.c.)；对于鼠科Lewis肺癌模型，以套针将肿瘤碎片(1-2mm²)植入B6D2F1小鼠的右侧。通常从第7天(MV522)或当肿瘤平均大小达到150-200mm³(MDA-MB-231)时开始给药。

将式1化合物以0.5％ CMC/H₂O制备，口服、每日两次。多西紫杉醇以7％EtOH/3％聚山梨醇酯/90％H₂O制备，每周一次静脉内给药。治疗通常持续3-4周。肿瘤的几何长度和宽度以电子尺每周测量3次。肿瘤体积为0.4×[长度×(宽度)²]。数据记录为平均值±SEM。研究结束时，将肿瘤和组织切除、称量和收集用于分析。收集血浆用于药物浓度分析。

结果见表1-3。

表1.化合物1的强度与选择性

靶标	酶活性，K1(nM)	受体磷酸化IC50(nM)a
			VEGFR-2(KDR)	1.1	0.25
VEGFR-1(Flt-1)	8.3	1.2b
			VEGFR-3(Flt-4)	nd	0.29
PDGFR-β	1.3	2.5
			c-Kit	nd	2
FGFR-1	56	218

^a通过细胞增殖测定检测；^b在2.3％白蛋白的存在条件下以IP/IB测定；nd：未测定。

其它已筛选但Ki值超出上述范围的有：cMet、LCK、c-Src、FAK、Pyk2、IRL、BTK、CDK1、CDK2、CDK4、PKA、PKC、PLK及Chk1。

表2 在MDA-MB-231人乳腺癌模型中同时给药化合物1

与多西紫杉醇的研究设计

化合物1(mg/kg)a	多西紫杉醇b	剂量选择方案
			25	0	ED90
5	0	ED50
			1	0	低剂量
0	20	对小鼠70％ MTD
			0	10	计算当量的人MTD
0	2	低剂量
			25	20	耐受性以及DDI
5	10	加和性以及DDI
			5	2	加和性以及DDI
1	10	加和性以及DDI
			1	2	加和性以及DDI

^a口服，每日两次；^b静脉注射，每周一次

表3 在MDA-MB-231异种移植模型中多西紫杉醇与化合物1

的联合治疗产生更大的抗肿瘤活性

化合物1(mg/kg)a	多西紫杉醇b	PR*	CR*
				0	0	0	0
25	0	3	0
				5	0	3	0
1	0	0	0
				0	20	4	0
0	10	6	0
				0	2	0	0
25	20	12	0
				5	10	10	2
1	10	7	2
				5	2	0	0
1	2	0	0

^a口服，每日两次；^b静脉注射，每周一次

联合给药组证实肿瘤全部及局部消退的发生率增加。当药物联合给药时，肿瘤生长率更大程度地降低。联合治疗与单一药物单独使用具有同等耐受性。

实施例2

式1化合物，6-[2-(甲基氨基甲酰基)苯硫基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑，以不同剂量给药于实体瘤患者。以BD或QD给药，30个患者(13个男性，17个女性)口服式1化合物片剂治疗。每个周期为28天。具体的诊断的肿瘤为乳腺癌(11)、甲状腺癌(5)、肾细胞癌(5)、肺癌(4)及其它癌症(5)。药代动力学数据以液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS)测定。在周期的第15天，于用药后1/2小时、1小时、2小时、4小时、8小时和12小时取血样本。

药代动力学结果(第15天的平均值)如表4所示。患者不禁食，除另有所指。括号中的数字为以百分比表示的变异系数。表中，C_max为观察到的式1化合物的最大血浆浓度，AUC(0-24)为24小时的AUC血浆浓度，并且T_1/2为由浓度时间曲线确定的半衰期。“#具有PK的患者”项表示获得药代动力学数据的患者数。

                                   表4

给药方案以及用量	#病人/#具有PK的病人	Cmax(ng/mL)	AUC(0-24)(ng.小时/mL)	T1/2(小时)
					5mg BID	6/6	27.1(36)	257(34)	2.2(16)
5mg BID禁食	8/6	54.5(48)	311(76)	2.7(39)
					15mg QD	6/6	78.6(54)	797(96)	3.5(46)
20mg BID	4/3	129.4(86)	1524(87)	3.1(51)

此外，第一组(n＝6)患者接受了10mg QD至30mg BD(PK未表示)的个体化的剂量。与进食状态相比，禁食状态下血浆浓度较高(约49％)，患者间变异程度减小。此时，在BD禁食状态下的最大耐受剂量(MTD)测定为5mg。在大于MTD剂量时的剂量限制性毒性(DLTs)为高血压(HTN)、抽搐、肝功能测试升高、胰腺炎、呼吸暂停以及口腔炎。此外，2个对NSCLC有反应的患者有严重咳血，一个发生于停药3周后。还观察到非剂量限制性的蛋白尿。在剂量少于或等于MTD时，DLT仅为1个患者发生2级口腔炎。在7/14个患者中观察到非剂量限制性HTN，用常规高血压药物控制。根据RECIST标准，在经过大量预处理的5个患者中观察到2个患者产生持久局部反应(在renal call及上颌窦腺样囊性肿瘤)和持续超过或等于4个月(4-13+个月的范围)的稳定疾病。使用dceMRI，初步分析了化合物1对21个患者的基线及第2、28、56天时诱导的血管效果。对各索引肿瘤(n＝1-4每个患者)，计算其平均K^trans的百分比变化(P.S.Tofts，G.Brix，D.L.Buckle，J.L.Evelhoch，E.Henderson，M.V.Knopp，H.B.W.Larsson，T.Lee，N.A.Mayr，G.J.M.Parker，R.E.Port，J.Taylor和R.M.Weisskoff，Estimating KineticParameters from Dynamic Contrast-EnhancedTi-Weighted MRI of a DiffusableTracer：Standardized Quantities and Symbols，Journal of Magnetic ResonanceImaging，10：223-232(1999))以及对照强度×时间曲线下的起始面积(IAUC)。至第2天时，肿瘤血管反应以大于或等于50％基线参数值确定。在6/18个可评价的患者中观察到肿瘤血管反应的急剧(第2天)下降(K^trans和IAUC减少量大于或等于50％)，且证实11/18个患者K^trans和IAUC减少量同时大于或等于40％。由于扫描仪的技术问题，3/21图像值不可利用。本实施例表明，通过临床反应和急剧的肿瘤血管变化证实式1化合物为一种具有高度活性的药物。

实施例3

下述将30mg游离碱/kg剂量[¹⁴C]-标记的式1化合物通过口服给药完整或胆管插入导管的比格犬中，观察各种代谢。生物转化途径包括氧化(单或双)、葡萄糖醛酸化(glucuronidation)、葡糖基化以及硫酸盐化或葡糖基化后的氧化。图1表示已确定的代谢物。在血浆中，M12(一种N-氧化物)为唯一的可测定代谢物。在尿液中，M5(一种脱吡啶基的羧酸)为主要的代谢物。胆汁中的主要代谢物包括M8(一种硫酸盐)及M12。排泄物中的主要代谢物M1的化学结构未知。

比格犬口服单剂量化合物后[¹⁴C]衍生的放射性排泄模式在雌雄个体中相似，放射性主要通过粪便排泄。其在完整雄性个体粪便及尿液中的平均回收率分别为85.5％和5.3％，而在完整雌性个体粪便和尿液中的回收率分别为80.9％和7.0％。胆管插入导管的雄犬胆汁中分泌相对较小的放射性(回收率为8.3％)，其它放射性在粪便(52.7％)和尿液(11.3％)中回收。胆管插入导管的犬尿液和胆汁中的放射性总量表明，约20％的放射性经过胃肠吸收。完整雄性、雌雄个体及胆管插入导管的雄性个体的所有样本总平均回收率分别为92.4％、92.6％和89.6％。所有代谢物的定性及结构解析以配有放射-HPLC的检测器(β-RAM)、阳极或阴极模式具有电喷雾(ESI)和大气压化学电离源(APCI)的MS检测完成。

实施例4

CD-1小鼠口服单剂量[¹⁴C]标记的式1化合物经过了各种代谢。在尿液和粪便中回收到低百分比的原形药物，并观察到各种I相及II相代谢物。生物转化途径包括氧化(单或双)、葡萄糖醛酸化、葡糖基化以及氧化后的葡萄糖醛酸化或葡糖基化。这些确定的代谢物如图2所示。在血浆中，原形药物及M12(一种N-氧化物)为两种主要成分。M7(一种葡萄糖醛酸甙)为尿液及粪便中的最重要代谢物。

雄性CD-1小鼠单次口服50mg游离碱/kg剂量的[¹⁴C]AG-013736后，在粪便中回收到大部分[¹⁴C]放射性¹。给药后48小时，粪便和尿液中放射性(％剂量)的平均(n＝2)回收率分别为65.8％和12.7％。排泄物中放射性排泄迅速，给药后24小时内回收到约72％的剂量。代谢物的定性和结构解析以LC-RAM-MS方法完成。

除图1和2中表示的代谢物外，其它已知的代谢物包括式1a所示的活性去甲基代谢物。

实施例5

血管生成使用免疫组织化学测定肿瘤微血管密度(MVD)评价。将冷冻的肿瘤部分的血管表面标志物CD-31染色，手工计数该组织切片的数个视野内的血管数。研究证实，与对照肿瘤相比，每日两次口服式1化合物2～3周后，经治疗的肿瘤中的血管数减少了70％。包括LLC、MV522及M24met的所有肿瘤模型中治疗后观察到微血管密度减小。当在LLC肿瘤模型中使用Alzet渗透泵连续递送时，式1化合物产生显著的生长抑制。3项研究数据表明，该药物在LLC模型中可达到78％的最大肿瘤生长抑制。在血浆浓度低至55±17ng/mL(N＝3)时，最大生长抑制可达到90％。该浓度被定为生物活性浓度(BAC)。28±11ng/mL(N＝3)的血浆浓度产生50％最大生长抑制。该浓度被定为最小有效浓度(MEC)。在一个研究组中，通过连续输注化合物形成574ng·小时/mL的AUC(0-24)产生70％的MGI，然而在同一个研究中，每日口服两次后形成720ng·小时/mL的AUG_(0-24)产生40％最大生长抑制(MGI。这些结果表明，在该模型中观察到槽形的化合物浓度-抗肿瘤效力，在小鼠中，连续低浓度的化合物可能足够产生最大抗肿瘤效力。

在人乳腺癌异种移植模型MDA-MB-231中，式1化合物单一使用有效。为准备式1化合物与多西紫杉醇在此模型中联合使用的有效性研究，在裸小鼠中进行了初步研究以确定潜在的药物-药物相互作用对PK和耐受性的影响。每周一次，共3周静脉注射使用15或30mg/kg多西紫杉醇后，确定多西紫杉醇处理动物的体重比对照降低(分别为7％和11％)。多西紫杉醇单独处理和多西紫杉醇联合式1化合物(30mg/kg/天，共16天；口服)联合处理的动物在体重方面无差异。使用多西紫杉醇不影响式1化合物的AUC，然而，与单独使用式1化合物相比，联合组中AG-013736的C_max值显著减小。

选定组织(肝脏、肾脏、心脏、脾、胃、小肠、大肠、卵巢、胸骨、关节)的组织学检验显示，在本研究中，单用式1化合物处理小鼠无靶器官效应。在多西紫杉醇处理小鼠中观察到的变化包括卵巢的卵泡坏死及最小或轻微的骨髓细胞减少。式1化合物与多西紫杉醇联合治疗不会加剧多西紫杉醇对卵巢的作用，但式1化合物/多西紫杉醇联合处理的动物骨髓细胞减少强度增加(最小或中等)。此外，在联合处理动物中观察到骨髓出血，很可能是细胞减少强度增加的次级效应。

在MDA-MB-231肿瘤模型中，式1化合物与多西紫杉醇联合用于效力评价。式1化合物(25、5及1mg/kg，口服，BD，给药3周)单独产生剂量依赖性的肿瘤生长抑制。20、10mg/kg而不是2mg/kg的多西紫杉醇(IV，每周)单独使用也有效。似乎在式1化合物与多西紫杉醇之间可能具有一种有益的治疗相互作用。当以高剂量或中等剂量联合用药时，这种增益更加明显。在相同剂量下，高剂量或中等剂量的联合使用引起肿瘤局部消退(肿瘤体积减小16％～97％)和完全消退的发生率远远大于药物单独使用时的发生率。由于测定组数有限且研究时间相对较短，故此发现还不确切。式1化合物在所有剂量下均具有很好的耐受性。在高剂量联合组(25mg/kg化合物1及20mg/kg多西紫杉醇)中，化学治疗药物给药3次后，与其它所有组相比，平均体重下降3％～7％。药代动力学分析证实，式1化合物的AUC值在多西紫杉醇存在时不受影响，但与单独使用式1化合物组相比，联合组中的C_max值显著减小。

在LLC模型中研究了式1化合物与多西紫杉醇联合时的抗肿瘤效力。LLC模型对多西紫杉醇高度耐药。在报道的MTD(30mg/kg的剂量，每周一次，iv)下，在细胞毒药物中没有观察到肿瘤生长延迟(TGD)(TGD＝3.2天)。由于大的原发性肿瘤，所有小鼠在测定的28天内被实施安乐死。相反，单用式1化合物产生剂量依赖性的、具有统计学意义的TGD(在10mg/kg下为13.4天，在30mg/kg下为15.4天，每日口服两次)。然而，药物仅延迟但不会阻止肿瘤向肺部的转移。高剂量联合组(TGD＝20.4天)而非低剂量联合组(TGD＝15.2天)与各单用组的具有统计学差异(分别为P＝0.0079和P＝0.254)。在高剂量联合组而非低剂量联合组中，更多动物(3/10)生存到实验终点。总之，式1化合物与多西紫杉醇的高剂量联合可比两者单用时在更大程度上延迟原发性肿瘤的生长和转移，但不能完全治愈。

一项MV522肿瘤模型的研究证实，每日口服一次(QD)60mg/kg式1化合物产生了与每日口服两次30mg/kg时相似的肿瘤生长抑制效果(p＝0.154)。此外，与每日口服两次30mg/kg相比，连续5天每日口服两次相同剂量之后停药2天的抗肿瘤效力似乎不受影响(p＝0.223)。这些结果表明，在这种非临床模型中，也许可能将式1化合物可以每日一次或某种间歇给药方式给药，并可达到显著的抗肿瘤效力。

在MV522异种移植模型中研究了受体抑制时间，及产生抗肿瘤效力所需的式1化合物的浓度。结果显示，口服给药(每日一次或每日两次)，每天约24小时超过EC₅₀(5ng/mL)浓度对于达到或大于50％的抗肿瘤效力而言是必需的。为达到90％的肿瘤生长抑制，每天至少4小时血浆浓度在40-60ng/mL是必需的。超过上述范围的使用并不产生额外的效力。在每日两次或每日一次组，均有相似的体重减少；两组均在5％以下。因此，如果剂量、使用时间适当，每日一次可能与每日两次方法同效。

还证实，与规则的定期给药相比，通过Alzet泵连续给药式1化合物产生更大的抗肿瘤效力。Alzet泵以10mg/mL递送，产生30ng/mL的恒定全身平均浓度，从而使肿瘤停滞。相反地，饱和给药(每日口服两次)式1化合物的血浆浓度超过上述计划的EC₉₀，仅可使肿瘤生长延迟。因此，在肿瘤治疗中，式1化合物连续全身给药似乎比每天两次口服给药更有效。

还研究了间歇给药时式1化合物的抗肿瘤效力。治疗组如下：每日给药、间歇给药、每日给药30mg/kg(每日两次)、间歇给药30mg/kg。间歇给药方案如下：第1周期(第12-18天给药，第19-28停止给药)，第2周期(第29-36给药，第37-44停止给药)。当肿瘤平均大小为250mm³时开始给药；所有的均给药AG-013736(每日口服两次)。总体而言，间歇给药与每日两次连续给药之间具有显著差异，连续每日给药对生长延迟更有效。对于间歇给药组，在停止给药后3-4天内，肿瘤恢复正常的生长率。然而，在第2周期给药的2天内，肿瘤生长抑制重新开始。正如预期，各组中均未见消退。

根据具体的和优选的实施方案已详述本发明，本领域技术人员应当理解为，通过本发明的常规实验和实践，可对本发明进行变动和修改。因而，本发明不受前述说明书的限制，但被后述权利要求及其等同物限定。

Claims (15)

1.一种给药哺乳动物的剂型，该剂型包括式1化合物、其可药用盐或溶剂合物、或其混合物：

在给药哺乳动物后，其给药量有效提供式1化合物或其活性代谢物的24小时AUC血浆值25～4500ng·小时/mL。

2.权利要求1的剂型，其中24小时AUC血浆值为100～800ng·小时/mL。

3.权利要求1的剂型，其中剂型为口服剂型。

4.包括式1化合物、其可药用盐或溶剂合物、或其混合物的剂型：

其量为0.5～30mg。

5.权利要求4的剂型，其中量为2～10mg。

6.权利要求4的剂型，其中剂型为口服剂型。

7.一种治疗哺乳动物细胞异常生长的方法，所述方法包括向哺乳动物给药权利要求1-6任何一项所述的剂型。

8.权利要求7的方法，其中剂型被口服给药。

9.权利要求7或8的方法，其中所述剂型的给药频率至少每日一次。

10.权利要求7或8的方法，其中所述剂型的给药频率至少每日两次。

11.权利要求7-10任何一项所述的方法，其中哺乳动物在给药步骤前禁食至少2小时，给药步骤后禁食至少2小时或在给药步骤前后均禁食至少2小时。

12.权利要求7-11任何一项所述的方法，其中细胞异常生长为癌症。

13.权利要求12的方法，其中癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊锥瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤，或其组合。

14.权利要求7-13任何一项所述的方法，其中该方法进一步包括同时给药选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应修饰剂、抗体、细胞毒药物、抗激素药、抗雄激素药及其混合物的抗肿瘤药物。

15.权利要求14的方法，其中抗肿瘤药物为多西紫杉醇。

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