CN1828357A - 物镜和显微镜 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于全内反射显微镜的物镜(1)，其中照明光(3)和探测光(14)通过所述物镜(1)传导，且在物镜光瞳的平面上的照明光(3)具有一个焦点。所述物镜(1)的特征在于：在所述物镜光瞳的附近或其平面上设置一个光阑(13)，而且所述的光阑(13)具有一个所述照明光(3)不能透过而所述探测光(14)能透过的中心区和一个所述照明光(3)能透过的边缘区(16)。另外本发明还涉及具有本发明物镜(1)的显微镜。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于全内反射显微镜的物镜，其中照明光和探测光均通过该物镜传导，而且在物镜光瞳的平面上的照明光具有一个焦点。另外，本发明还涉及一种具有物镜和光源的、尤其被用于短暂地照明样品的显微镜，其中所述照明光优选地利用相应的物镜而在所述物镜光瞳的平面上具有一个焦点。
背景技术
在全内反射显微镜中，利用了光从光密介质过渡到光疏介质时的折射特性。因此，例如对于从盖玻片(n1＝1.518)过渡到水(n2＝1.33)将产生61°的临界角、也即全反射的角度。在全反射的条件下(角度≥61°)，在具有较小折射率的介质内形成一种短暂的驻波。该波的强度与离边界面的间隔成指数下降。据此，离边界面更远的荧光团不会被激发。背面荧光被大大减少。在此情形下，图像对比度被改善，同时分辨率也明显被提高。利用上述现象的前提条件是，盖玻片与介质的折射率有足够大的差。
在US 2002/0097489A1中已经公开一种具有样品暂时照明的显微镜。该显微镜包含一个白光源，其光线通过一孔隙光阑穿过显微镜物镜被耦合输入到承载样品的载物台上，以用于暂时照明。该照明光在载物台内通过全内反射被传播，其中样品的照明只在从载物台突出来的暂时区域的范围内进行。这种显微镜以名称TIRFM(全内反射荧光显微镜)而被公知。由于伸入样品内仅仅约100nm的暂时区域，TIRFM的z分辨率非常良好。
DE 10108796A1公开了一种尤其用于TIRF应用的高孔径物镜。该物镜包括具有正折射率的第一透镜和具有负折射率的第二透镜，其中两个透镜的焦距比位于-0.4和-0.1的范围，而且总折射率大于0。另外，该物镜还包括两个正透镜，其外径与焦距之比大于0.3且小于0.6。另外，该物镜还包括一个负透镜和一个会聚透镜，其中所述负透镜面对前组，而且所述负透镜和所述会聚透镜的焦距比在-0.5和-2之间。
在DE 10217098A1中公开了一种用于TIRF显微镜的入射照明装置。该入射照明装置包括一个照明源和一个偏转装置，所述照明源在工作时发出一被极化过的与光轴成一个角度进行传播的照明辐射束，所述偏转装置偏转所述的照明辐射束并与光轴平行地将之耦合输入到物镜中。在该入射照明装置中规定，由照明源发出的照明辐射束包括具有相差的s极化方向和p极化方向，并且由所述偏转装置反射所述照明辐射束x次，其中x＝(n×180°-d)/60°。
DE 10143481A1公开了一种用于TIRM(全内反射显微术)的显微镜。该显微镜具有一个显微镜外壳和一个物镜。从照明装置发出的照明光可以通过一个能移入该显微镜外壳的适配器被耦合输入。
US 2004/0001253A1公开了一种具有光学照明系统的显微镜，该系统能在暂时照明和反射照明之间进行简单的切换。该照明系统包括一个激光光源，其光线被耦合输入到一个光纤中。另外还设有耦合输出镜组，其把从光纤出来的光线聚焦到显微镜物镜的后部焦点上。所述的光纤可以在一个与显微镜物镜的光轴垂直的平面上移动。
DE 10229935A1公开了一种用于在显微镜中耦合输入光线的装置。那里，在明场光阑平面上通过一个被实施为闸门的光导纤维耦合输入器把激光指到标本上。该发明尤其适合于TIRF方法。
在电子光栅显微镜中，利用光辐射照明一个样品，以便观察从该样品发出的作为发射光或荧光形式的探测光。照明光辐射束的焦点借助于可控的辐射偏转装置、通常是通过翻转两个反射镜而在样品平面内移动，其中偏转轴大多数是相互垂直的，使得一个反射镜在x方向偏转，而另一个在方向上偏转。反射镜的翻转例如借助于检流计-调节元件来实现。来自于物体的探测光的功率根据扫描辐射的位置被测量。通常，所述的调节元件装有用于测定当前反射镜位置的传感器。特别是在共焦电子光栅显微镜中，物体是利用光辐射的焦点被三维地扫描的。
共焦电子光栅显微镜通常包括一个光源、一个用于将光源的光聚焦到孔眼光阑(所谓的激发光阑)上的聚焦镜组、一个辐射分配器、一个用于辐射控制的辐射偏转装置、一个显微镜镜组、一个探测光阑和用于检测所述探测光或荧光的探测器。照明光通过一个辐射分配器被耦合输入。来自于物体的荧光或发射光通过所述辐射偏转装置回到所述的辐射分配器，经过该辐射分配器，以便随后被聚焦到后面设有探测器的探测光阑上。该探测装置被称为DESCAN装置。非直接来源于焦点区的探测光采取另一个光路，并且不经过所述的探测光阑，使得获得一种点信息，该点信息通过用所述照明光辐射束的焦点顺序地扫描物体而产生三维的图像。三维图像大都通过逐层地获取图像数据来实现。
所述由现有技术公开的系统具有这样的缺点：在显微镜的光程中部分地需要非常昂贵且需要空间的镜组，以便耦合输入TIRF照明光。这不利地影响了尤其是探测光程，并经常导致探测光功率的损耗。
如同在前面已经讲述的，这里围绕的是显微的TIRF检查，其中以非常平的角度照明样品，也即为了在样品表面上产生全反射。在现有技术中，人们为此采用具有非常大孔径的物镜，以便实现大的照明孔径。荧光激发通过激光源实现，其中激光被规则地投射到物镜的瞳孔边缘的一个点上。从现有技术还已经知道，为荧光激发而采用气体放电灯。在此，在照明光程的孔径平面上安装一个环形光阑，使得只有物镜的瞳孔边缘才被照明。
在迄今为止所实现的用于TIRF显微术的技术中，缺点是：需要极准确地校准偏转镜、光阑或类似物。为了消色差地投影物镜光瞳中的孔径光阑，需要被极好地校正的照明镜组。因此，迄今为止是采用非常特殊的显微镜，其具有外部荧光照明和激光装置。
发明内容
本发明的任务在于给出一种实施简单的用于全内反射显微镜的物镜，其可以被用于照明光和探测光的常规光程中。另外还应该给出一种相应的显微镜。
本发明的物镜通过权利要求1的特征来解决上述任务。据此，形成前序部分的物镜的特征在于：在所述物镜光瞳的附近或其平面上设置一个光阑，而且所述的光阑具有一个所述照明光不能透过而所述探测光能透过的中心区和一个所述照明光能透过的边缘区。
根据本发明已经认识到，穿越物镜的样品的暂时照明可以用建设性的简单方式来实现，也即通过以下方式来实现：在所述物镜光瞳的附近或其平面上采取一种特殊的建设性措施，即设置一个特殊的光阑。所述的光阑被如此地构造或设计，使得其具有一个所述照明光不能透过而所述探测光能透过的中心区和一个所述照明光能透过的边缘区。换句话说，激发光在所述的中心区内被阻挡，而只能在瞳孔边缘通过，然后以一个平的角度输入所述的样品。来自于样品的探测光、例如荧光可以通过全物镜孔径接收，因为该探测光能够透过所述的中心区。在最简单的情况下，也即对观察孔径没有限制的情况下，所述的边缘区同样是可以透过该探测光的。
只要希望减小观测孔径，则有利的是，所述边缘区不能透过该探测光，也即不能透过来自于样品的荧光。通过该措施来进行物镜孔径或观测孔径的减小。由样品发出的荧光不能经过所述的边缘区，并相应地在该边缘区内被阻挡。
以进一步有利的方式，尤其是为了实现对称的照明情况，阻挡照明光的所述光阑的中心区被构造为圆形面。以进一步有利的方式，该边缘区紧接着所述圆形面的周围，并围绕所述圆形面延伸成环形面。根据上述的实施方案，该环形面可以透过所述的探测光(全物镜孔径)或不透过所述的探测光(减小的物镜孔径)。
在非常简单的结构的范畴内，所述光阑的不同透射区-中心区和边缘区-被实施为薄的、优选被涂敷在一个透光载体上的层。所述的层可以被蒸镀在所述的载体上。所述的层可以通过不同的光刻处理来产生。
进一步优选地，所述的层是干涉层，由此得出一种依赖于波长的光学作用。因此，所述的层可以是多带干涉层，使得同时可以产生多个荧光激发。这种设计有利于物镜的通用性。
具体地可以想见，非常一般地采用一个玻璃表面作为所述层的载体。在此，所述的玻璃表面可以是被集成在物镜中的小玻片的表面。同样可以想见，一个透镜的表面被用作所述层的载体，其中所述的透镜在承载所述层的那一面上可以被修平。将所述的层涂敷到拱形的表面是也同样是可以被想见的，由此可以达到类似的效果。
另外，所述层可以被构造在所述载体的背向物体的一侧，但也可以被构造在所述载体的面向物体的一侧，其中需要确保所述层被布置得靠近于物镜光瞳的平面。
就本发明的显微镜而言，上述的任务通过权利要求15的特征来解决。据此，对于形成前序部分的具有物镜和光源的显微镜，其尤其用于样品的暂时照明，其中在物镜光瞳的平面上的照明光具有一个焦点，其特征在于：在所述物镜光瞳的附近或其平面上设置一个光阑，而且所述的光阑具有一个所述照明光不能透过而所述探测光能透过的中心区和一个所述照明光能透过的边缘区。
在此需要指出，本发明的显微镜使用了非常特别的物镜，也即是一种根据权利要求15的特征组合的物镜，优选地是本发明的物镜，也即具有与该物镜有关的权利要求的特征的物镜。为避免重复，在此省去了对与该物镜有关的特征的单独论述。
就本发明物镜在本发明显微镜范畴内的具体应用而言，进一步的改进是有利的。重要所述显微镜在照明光程中布置有照明滤光器或激发滤光器，那么所述的照明滤光器可以与所述光阑或载体的边缘区具有相同的涂层。因此，只有被规定用于激发的照明光-根据照明滤光器的设计-通过所述的照明滤光器，该照明光在物镜内可以经过所述的边缘区以暂时地照明样品。因此，照明滤光器和光阑边缘区之间的协调可以简单地被实现。所述照明滤光器优选地被布置在一个照明光阑(明场光阑)及必要时的镜组与一个辐射分配器之间，优选地是在平行定向的照明光的区域内。
另外有利的是，在探测光程中在探测器之前布置一个探测滤光器。从样品返回的、在物镜中可能经过光阑中心区的发射光穿过所述的辐射分配器到达该探测滤光器。优选地，所述探测滤光器与所述光阑或载体的中心区具有相同的涂层，使得也在这一点上进行协调。该探测滤光器还避免了不希望的散光达到探测器。观测孔径通过所述中心区的大小以及通过探测光不能穿过的所述边缘区的大小来定义。
另外需要指出，所述探测光程中的探测滤光器可以被布置在所述辐射分配器和一个探测器之间的任何位置。
现在有不同的可能性用有利的方式来扩展和改进本发明的教导。为此，一方面可以参考位于权利要求1和14之后的权利要求，另一方面可以参考下面借助于附图对优选实施例的阐述。结合借助于附图对本发明优选实施例的阐述，也一般地阐述了该教导的优选的扩展和改进。
附图说明
在附图中，
唯一的图用示意的视图示出了本发明物镜的一个实施例，该物镜位于同样是根据本发明的显微镜的光程之中。
具体实施方式
该唯一的图示出了在同样按照本发明的显微镜的光程2之中的本发明物镜1的实施例，其中这里只示出了显微镜的单个组成部分。
照明光3来自于附图没有示出的激光光源，并且通过照明光阑4穿越使光线平行化的镜组5，并在穿越照明滤光器6后到达辐射分配器7。
通过辐射分配器7使照明光3沿着光轴8偏转以通过物镜1。
物镜1被简化地示出，并且除了物镜外壳9外还包括一个被示出的前透镜10和另一个透镜11。
物镜光瞳的平面通过用附图标记12表征的箭头给出。在这里所选的实施例中，在物镜光瞳的平面上设有一个光阑13，其中所述光阑13具有一个照明光3不能透过而探测光14能透过的中心区15和一个照明光3能透过的边缘区16。
由附图未示出的样品发出的荧光沿着光轴8穿过前透镜10和所述的另一个透镜11并且穿过玻璃体17，其中该玻璃体17以其平表面18用作为蒸镀层19、20的载体。该层19、20最后形成所述的光阑13，其中发出的光、也即探测光14可以通过中心区15并在穿越那里的蒸镀层19后从物镜1中出来到达辐射分配器7，并在穿越该辐射分配器7后经过一个探测滤光器21。探测光14从那里出来到达图中未示出的探测器。
另外，在该单个的附图中可以看出，照明滤光器6和探测滤光器21都被镀膜，也即敷设有与在物镜1的玻璃体17上所蒸镀的层相同的层。因此，照明滤光器6具有与被蒸镀在玻璃体7的边缘区16中的层相同的蒸镀层。
探测滤光器21具有与在玻璃体17的中心区所蒸镀的层相同的蒸镀层19。对于从该单个的附图不能得出的其它特征和优点信息，为避免重复可以参看说明书的一般部分。
最后需要非常特别地指出，上面解释的实施例只是被用来说明需要保护的教导，但该教导并不局限于该实施例。
Claims (19)
1.用于全内反射显微镜的物镜(1)，其中照明光(3)和探测光(14)通过所述物镜(1)传导，且在物镜光瞳的平面上的照明光(3)具有一个焦点，其特征在于：在所述物镜光瞳的附近或其平面上设置一个光阑(13)，而且所述的光阑(13)具有一个所述照明光(3)不能透过而所述探测光(14)能透过的中心区(15)和一个所述照明光(3)能透过的边缘区(16)。
2.如权利要求1所述的物镜，其特征在于：所述边缘区(16)对于所述探测光(14)是不能透过的。
3.如权利要求1或2所述的物镜，其特征在于：所述中心区(15)被构造为圆形面。
4.如权利要求3所述的物镜，其特征在于：所述边缘区(16)被构造为直接围绕所述圆形面延伸的环形面。
5.如权利要求1-4之一所述的物镜，其特征在于：所述光阑(13)的不同透射区(15，16)被实施为薄的、被涂敷在一个透光载体(17)上的层(19，20)。
6.如权利要求5所述的物镜，其特征在于：所述的层(19，20)被蒸镀在所述的载体(17)上。
7.如权利要求5或6所述的物镜，其特征在于：所述的层(19，20)是干涉层。
8.如权利要求7所述的物镜，其特征在于：所述的层(19，20)是多带干涉层。
9.如权利要求5-8之一所述的物镜，其特征在于：一个玻璃表面被用作所述层(19，20)的载体(17)。
10.如权利要求9所述的物镜，其特征在于：一个小玻片的表面被用作所述层(19，20)的载体(17)。
11.如权利要求9所述的物镜，其特征在于：一个透镜的表面被用作所述层(19，20)的载体(17)。
12.如权利要求5-11之一所述的物镜，其特征在于：所述载体(17)在承载所述层(19，20)的那一面上被构造成平的。
13.如权利要求5-12之一所述的物镜，其特征在于：所述层(19，20)被构造在所述载体(17)的背向物体的一侧。
14.如权利要求5-12之一所述的物镜，其特征在于：所述层(19，20)被构造在所述载体(17)的面向物体的一侧。
15.具有物镜(1)和光源的显微镜，尤其用于优选地利用权利要求1-14之一所述的物镜进行样品的暂时照明，其中在物镜光瞳的平面上的照明光(3)具有一个焦点，其特征在于：在所述物镜光瞳的附近或其平面上设置一个光阑(13)，而且所述的光阑(13)具有一个所述照明光(3)不能透过而所述探测光(14)能透过的中心区(15)和一个所述照明光(3)能透过的边缘区(16)。
16.如权利要求15所述的显微镜，其中在照明光程(3)中布置有一个照明滤光器(6)，其特征在于：所述的照明滤光器与所述光阑(13)或载体(17)的边缘区(16)具有相同的涂层。
17.如权利要求16所述的显微镜，其特征在于：所述照明滤光器(6)被布置在一个照明光阑(4)及必要时的镜组(5)与一个辐射分配器(7)之间，优选地是在平行照明光(3)的区域内。
18.如权利要求15-17之一所述的显微镜，其中在探测光程中布置一个探测滤光器(21)，其特征在于：所述探测滤光器(21)与所述光阑(13)或载体(17)的中心区(15)具有相同的涂层。
19.如权利要求18所述的显微镜，其特征在于：所述探测光程中的探测滤光器(21)被布置在所述辐射分配器(7)和一个探测器之间。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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