CN1788081A

CN1788081A - 一种抗癌靶向可调控基因－病毒及其构建方法

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Publication number: CN1788081A
Application number: CNA2004800131500A
Authority: CN
Inventors: 刘新垣; 裴子飞; 李兵华; 顾锦法; 邹卫国; 孙兰英
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2006-06-14
Anticipated expiration: 2024-05-28
Also published as: CN1453361A; WO2004106505A1; CN100497605C; US20070077226A1

Abstract

本发明公开了一种抗癌靶向可调控基因－病毒及其构建方法。本发明构建了携带有反式作用元件(trans－activator，TA)表达盒以及抗癌基因表达盒的无肠腺病毒。这两个表达盒结构相对独立、功能直接相关，使得目的基因的表达受hTERT控制仅限于肿瘤细胞并受小分子药物RU486的诱导，需要时打开，不需要时关闭，这样既避免了外源基因产物对正常组织的伤害，也实现了外源基因的长久表达。克服了传统的腺病毒载体靶向性差、目的基因表达不受控制以及表达时间短等缺点。

Description

一种抗癌靶向可调控基因 -病毒及其构建方法技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗癌靶向可调控基因-病毒及其构建方法。背景技术：

基因治疗是近十多年兴起的一种生物高技术方案，在整个基因治疗方案中肿瘤基因治疗方案占 60%以上，基因治疗被认为是人类最终征服肿瘤的希望。目前作为基因治疗的载体分为病毒和非病毒型两大类，病毒载体包括：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等；非病毒载体包括：裸露 DNA、脂质体和其它物质包裹的 DNA。病毒载体介导的基因治疗在近年得到迅速发展，其中在肿瘤的基因治疗中较为常用的还是腺病毒载体，这是因为腺病毒可感染多种类型的细胞，包括分裂期细胞和非分裂期细胞，它可以被大规模的培养并获得高滴度的病毒纯品。

野生型腺病毒是一种双链 DNA病毒，基因组长度约 36kb，分早期和晚期转录区。其早期转录区包含 E1-E4基因，编码病毒的调节蛋白；晚期转录区分 L1-L5区，编码病毒结构蛋白。目前对人腺病毒 2型（adenovirus type 2, Ad 2)以及人腺病毒 5型 (Ad 5)的研究背景最为清楚，腺病毒载体则以 Ad 2和 Ad 5为基础构建而成。重组腺病毒最大包装容量为野生型基因组 ±5%，即插入外源基因的长度为 2kb左右，要插入大片段的外源基因就必须缺失一段腺病毒的基因组成分，缺失太多也不行，那就要补充一些核苷酸片段。

第一代腺病毒载体：缺失腺病毒基因组的 E1 区（有时还包括 E1与 E3 区同时缺失）而构建的载体。 E1区位于腺病毒基因组 1.0-10.6mu处，为病毒复制必需区。缺失 E1区的腺病毒只能在有 E1区基因产物表达的细胞（如 293 细胞或其它类似细胞）内复制，因此这样的载体也叫复制缺陷型载体。

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确认本 El区缺失长度可达 3.2kb， E3区也可缺失，缺失长度可达 3.1kb。 E3 区基因是病毒复制的非必需基因，缺失 E3区的腺病毒载体仍有复制能力。目前使用的第一代腺病毒载体大多是 E1 与 E3 区同时缺失，携带外源基因的容量可达 8.3kb。第一代腺病毒载体的基因转移和表达效率很高，但是第一代腺病毒携带外源基因表达的同时也表达一定水平的病毒本身的蛋白，容易引起宿主细胞对病毒蛋白的免疫反应，病毒被清除，外源基因的表达会受到限制，此时用腺病毒载体再次感染时，已经形成的免疫应答会很快地将其清除，使得病毒携带的外源基因无法表达。为了延长腺病毒介导的外源基因表达时间，就必须开发出新的腺病毒载体。

第二代腺病毒载体：腺病毒的免疫原性主要产生于病毒表达的晚期蛋白，而晚期蛋白的表达在很大程度上受早期基因产物的控制，因此第二代腺病毒载体是在第一代腺病毒载体的基础上又将 E2和 E4基因进行改造或缺失，削弱早期基因的功能以减少晚期蛋白的表达量。第二代腺病毒为 El、 E3 缺失同时伴有 E2或 E4区缺失，因此外源基因的插入量可大到 14kb。第二代腺病毒载体虽然在一定程度上降低了自身的免疫原性，但是病毒的复制能力比第一代腺病毒减低了很多，同时载体的免疫原性仍然无法完全消除，而且由于第二代腺病毒的制备方法各不相同、不统一等等，第二代腺病毒还不如第一代腺病毒那样为科学家所青睐，故较少使用。

第三代腺病毒载体为无肠腺病毒载体（gutless adenovirus, 简称 GL-Adv), 它缺失了腺病毒基因组的所有编码区，仅保留有腺病毒的反向末端重复序列 (ITR)、病毒包装信号（Ψ)。因为腺病毒本身所有的编码区基因已全部被除去，病毒失去了包装能力，为了达到其有效包装长度，还需装入一些无关的 DNA序列（如 intron), 当再加上外源目的基因后，使病毒基因组的总长度不小于 30kb，但又不能超过 38kb。由于第三代腺病毒载体完全消除了免疫原性，又可使外源基因能得到长期表达，这些特点使得无肠腺病毒成为了基因治疗的最好载体之一。但是，第三代腺病毒由于缺失了基因组的所有编码区，病毒本身不能复制，产生子代病毒粒子必须是在特殊的包装细胞内、并有辅助病毒的参与才能完成。目前用于无肠腺病毒包装的细胞系是 293Cre4，它是在普通的 293 细胞系中转入 Cre重组酶基因，使该细胞系能稳定表达重组酶。 Cre重组酶能识别大小为 34bp的 ΙοχΡ序列，如果某基因或某一 DNA片段的两端各有一 ΙοχΡ序列，在有 Cre重组酶存在的情况下，由于 ΙοχΡ序列会发生同源重组，该基因或 DNA片段被剪切下来，如图 2所示。发明目的

本发明的第一个目的就在于提供一种靶向可调控抗癌基因-病毒，其能够克服传统的腺病毒载体靶向性差、目的基因表达不受控制以及表达时间短等缺点

本发明的第二个目的就在于提供一种靶向可调控抗癌基因 -病毒的构建方法。发明概要

为达到上述目的，本发明的靶向可调控抗癌基因-病毒含有两个表达盒，分别为反式作用元件表达盒（表达盒 -1 ) 和抗癌基因表达盒（表达盒 -2)，并以无肠腺病毒作为两个表达盒的载体；

其中，表达盒 -1的构成是：（1 ) 肿瘤组织特异性启动子；（2) 反式作用元件 (trans-activator, TA)， TA的构成依次是：源于酵母的 GAL4因子 DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子 NF-kB的 p65亚基基因片段以及终止信号；

表达盒 -2的构成是：（1 )源于酵母的 GAL4上游序列 17-mer; (2) TATA 盒; (3 ) 位于 TATA盒下游的抗癌基因；（4) 终止序列。

本发明的靶向可调控抗癌基因 -病毒的构建方法包括以下步骤- 一、克隆质粒 pRS-hTERT/Trail的构建

反式作用元件表达盒，即表达盒 -1，的构建：用限制性内切酶 Kpnl消化质粒 pShuttle/hTERT, 回收 hTERT启动子片段再插入 pRS-17的 Kpnl位点，命名为 pRS-hTERT，鉴定方向使 hTERT的启动子控制 TA的表达。

抗癌基因表达盒，即表达盒 -2，的构建：从 pCA13-Trail中用 Hindlll/Xbal 切出 Trail基因，克隆到中间载体 p GL3-Basi_C的相应位点；然后再用 Nhel/Clal 切出该基因克隆到 pRS-hTERT的相应位点，得到克隆质粒 pRS-hTERT/Trail; 二、包装质粒 pGL-hTERT/Trail的构建

用限制性内切酶把克隆质粒 pRS-hTERT/Trail的两个表达盒切出，连接到质粒 pGL的酶切位点上，得到包装质粒 pGL-hTERT/Trail;

三、病毒的包装

用限制性内切酶切割包装质粒 pGL-hTERT/Trail使之线性化，与辅助病毒共转染到包装细胞 293Cre4中；

四、病毒的收集纯化

挑选单克隆，鉴定后大规模培养，收集细胞培养物，经梯度离心纯化病毒。

本发明的基因 -病毒构建方法采用无免疫原性的无肠腺病毒，使无肠腺病毒载体不受机体免疫系统的攻击，进而使所携带的外源基因能长久有效地在肿瘤中表达。

利用本发明的方法得到的表达抗癌基因的可调控肿瘤特异性无肠腺病毒或具有如下有益效果：

1、本发明提供一种携带抗癌基因的无肠腺病毒，经细胞实验证明，目的基因可以特异性地在肿瘤细胞中表达，而不在正常细胞中表达；

1、本发明提供的携带抗癌基因的无肠腺病毒，调控 TA的启动子是可以更换的。根据所使用的启动子来源不同，目的基因的表达可以是在多数种类的肿瘤组织，也可仅限于某些特定的肿瘤细胞； 3、本发明提供的携带抗癌基因的无肠腺病毒，目的基因的表达是受小分子药物 RU486的诱导调控，需要时打开，不需要时关闭。该无肠腺病毒无抗原性，可长期使用而不失活；

4、本发明提供了一种无肠腺病毒的构建、包装方法。该方法可用于其它基因-病毒的无肠腺病毒的构建与包装，易于掌握；

5、本发明构建的无肠腺病毒载体，能够非常方便的装入外源抗癌基因，我们称之为基因-病毒。这个载体能够构建表达多种不同抗癌基因的多种基因 -病毒，为肿瘤的基因-病毒治疗提供良好的基础；

6、本发明构建的多种基因-病毒经试验证明能选择性的杀死瘤细胞，而不影响正常细胞。基因-病毒表达的抗癌基因能加强病毒的抗肿瘤效果。这种新型的基因-病毒为今后用于人类肿瘤治疗打下了良好基础；附图说明图 1为本发明的携带两个表达盒的无肠腺病毒构建过程及工作原理示意图，其中 1为腺病毒基因组示意图， 2为无肠腺病毒， 3为携带有两个表达盒的无肠腺病毒， 3.1为表达盒 -1， 3.2为表达盒 -2， 4为表达盒的作用机理；图 2为在有 Cre重组酶存在的情况下， loxP序列发生同源重组的示意图，位于两段 loxP之间的为 Ψ序列，随着 loxP之间的同源重组， Ψ序列被剪切下来。

图 3为本发明的基因-病毒的靶向性和可调控检测的检测结果示意图。具体实施方式

实施例 1 : 克隆质粒 pRS-hTERT/Trail的构建

一、实验材料及原理：

1、质粒 pRS-17:含有反式作用元件，依次为源于酵母的 GAL4因子 DNA 结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子 NF-kB的 p65亚基基因片段，同时含有 17-mer x4 GAL4上游序列、 TATA盒以及多克隆位点 MSC的序列。 pRS-17的构建过程如下：

a、用 Hindlll/Xbal酶切 pGL3-Basic (Promega) , 然后用 Klenow酶补平后连接，把 pGL3-Basic中的 luciferase基因去掉，命名为 pGL3 -Basic Δ Luc; b、用定点突变的方法把质粒 pSwitch(Invitrogen)中的 Clal位点去掉。引物为 ( 1 ) 5> ccgagattgatgtcgaccccO , (2) 5> ggggtcgacatcaatctcggO；两段序列互补，把原质粒中的 atcgat突变为 attgat, Clal位点消失，具体的实验方法按照 stratagene QuikChange® II Site-Directed Mutagenesis Kits说明书进行； c、用以下引物从突变过的 pSwitch中扩增出 Gal4UAS:

( 1 ) 5> atttgcggccgccggagtactgtcctccgagO (下划线位置是酶切位点，下同）；

( 2) 5> cgacgcgtttcgaggccacacgcgtc<3 (用 Invitrogen公司的 Pfu DNA polymerase扩增，下同；条件： 94 °C lmin， 56V lmin, 72 °C 30sec， 30个循环）；

用 Notl/Mlul 装入 pUC6S 载体（ GeneBanli: ID: M74308 ) , 命名为 pUC6S/Gal4。用 Mlul/Clal从 pGL3-Basic A Luc切出 SV40 poly(A)，装入相应位点，命名为 pUC6S/Gal4-poly(A)；

d、用以下引物从 pSwitch扩增出 TA(Glp65)-BGH poly(A)：

( 1 ) 5> ccategatggtaccatggactcccagcagccagatc<3；

( 2 ) 5>aaaggcgccgcggccgccagctggttctttccgc<3 (条件： 94。C lmin, 55 °C lmin, 72°C 3min， 30个循环）；

用 Narl/Clal酶切后装入 pUC6S/Gal4-poly(A)的 Clal位点，因 Narl和 Clal 为同尾酶，故需要鉴定方向，使保留的 Clal位点位于两个表达盒之间，命名为 pRS-17。上有多处常用限制性内切酶的位点，因此在进行改造时多用到单酶切克隆、平端连接以及基因在不同载体中的转换；

2、质粒 pShuttle/hTERT: 带有 hTERT启动子的腺病毒穿梭载体，其构建过程如下： a.以 ( 1 )5>gcatggatccatatgcggtgtg<3禾口 ( 2 ) 5>cggggtacctgagtaacacaaaattattc<3 (条件：94°C lmin, 55°C lmin, 72°C 4min， 30个循环）为引物， pShuttle-CMV 为模板用 PCR方法扩增出的片断酶切后取代 pShuttle-CMV中的 BamHI/Kpnl 包含 CMV启动子的片断，得到的质粒命名为 pShuttle。

b.根据文献 ( Cancer Research, 59:551-557, 1999)，用以下引物扩增出 hTERT启动子的核心区域（一 378— +78) ： ( 1 ) 5>taggtaccctcccagtggattcg<3 ,

(2) 5>taggtacccagggcttcccacgtg<3 (条件： 94 °C lmin, 58 °C lmin, 72。C lmin, 30个循环），用 Kpnl酶切后装入 pShuttle中的 Kpnl位点，鉴定方向正确。

如图 1所示即为本发明的携带有两个表达盒的无肠腺病毒的构建过程及工作原理示意图。

二、实验步骤：

表达盒 -1的构建：用限制性内切酶 Kpnl消化质粒 pShuttle hTERT, 回收 hTERT启动子片段再插入 pRS-17的 Kpnl位点，命名为 pRS-hTERT，鉴定方向使 hTERT的启动子控制 TA的表达

表达盒 -2的构建：从 pCA13-Tmil (microbix公司）中用 Hindlll/Xbal切出 Trail基因，克隆到中间载体 p GL3-Basic (Promega公司）的相应位点；然后再用 Nhel/Clal切出该基因克隆到 pRS-hTERT的相应位点,得到克隆质粒 pRS-hTERT/Trail;

上述步骤中 hTERT启动子也可以以下启动子替换： 1 ) 端粒酶逆转录酶催化亚基基因启动子； 2) 甲胎蛋白 (AFP)启动子； 3 )癌胚抗原 (CEA)启动子； 4) 前列腺特异性抗原启动子； 5 ) 乳腺癌组织特异性启动子。

具体可以是如通过中间克隆使含有上述启动子的两端都成为 Kpnl位点等，都可以实现，这些对于本领域的技术人员来说是显而易见的，故此处不再赘述。

此外，表达盒 -2中除使用 Trail作为抗癌基因外，也可以以下抗癌基因替代： 1 )肿瘤坏死因子超家族中的 Trail基因； 2) 抑癌基因； 3 ) 细胞因子基因； 4)'促细胞凋亡基因； 5 )血管抑制基因； 6) 自杀基因；或 7)其他基因。肿瘤坏死因子基因：肿瘤坏死因子超家族中的一员 Trail与细胞表面受体结合后，启动细胞凋亡途径，并选择性地促使肿瘤细胞凋亡。

抑癌基因：抑癌基因包括 p53, Rb, NF1, VHL, APC。抑癌基因能够抑制肿瘤细胞的生长。

细胞因子基因：细胞因子具有杀伤肿瘤细胞，激活免疫细胞，增加造血功能等。它包括：白细胞介素 -2、 -12、 -24，粒-单集落刺激因子，干扰素 - α、 - β、 - Υ。

促细胞凋亡基因：细胞凋亡是多细胞生物生命活动的重要途径，细胞凋亡途径的异常是机体肿瘤发生的一个重要机制。抑制了细胞凋亡，肿瘤势必要发生。促细胞凋亡基因可加速肿瘤细胞的凋亡，是基因治疗肿瘤的有效基因。促细胞凋亡基因可以是 Bax、 Caspase, 也可以是 8₁1^0等₀

血管抑制基因：血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，肿瘤因营养不足而萎缩、死亡。血管抑制基因有：血管生成抑素基因 (angiostatin), 血管内皮抑素基因 (endostatin)。

自杀基因：包括大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，单纯疱疹病毒的脱氧胸腺嘧啶核苷激酶基因，水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因。

其他基因：血管内皮生长因子可溶性受体 flt-1基因可竞争性抑制血管内皮生长因子发挥作用。

通过中间克隆使目的基因的两端都成为 Clal位点（以便插入表达盒 -2启动子后的 Clal位点），或者前端是 Clal位点后端是一平端（以便插入表达盒 -2 启动子后的 Clal/Swal位点），或者是把基因两端用 Klenow聚合酶补平后插入 Swal位点。这些对于本领域的技术人员来说也都是显而易见的。实施例 2·· 包装质粒 pGL-hTERT/Trail的构建

一、实验材料及原理：

质粒 pGL (Merk Research Laboratories构建，可从 Microbix购得）：含有人源 5型腺病毒基因组两端的重复序列（ITR) 和包装信号（ Ψ 同时还含有填充序列，该序列是无活性的人源次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT)基因组的部分序列。 pGL质粒大小为 28.7kb，在两端重复序列（ITR) 的外侧有两个限制酶 Pme l的酶切位点。经 Pme l酶切后， pGL质粒被线性化，露出两端 ITR序列以适合病毒包装，同时也去除了 pGL质粒中属于原核细胞的抗性筛选标记及复制原点序列。 pGL上还有一个 Eagl位点。

二、实验步骤：

用 Not l消化实施例 1得到的 pRS-hTERT/Tmil，回收带有两个表达盒（表达盒 -1和表达盒 -2)的 DNA片段，克隆进质粒 pGL的 Eag I位点（Notl和 Eagl 为同末端酶），构建成包装质粒 pGL-hTERT/Trail。实施例 3: 无肠腺病毒的包装

一、实验材料和原理：

Helper virus H14和包装细胞 293Cre4均购于加拿大（Microbix Biosystem Inc. Toronto ) o 辅助病毒 (helper virus H14)是改造过的第一代腺病毒载体。位于其包装序列两边各有一个 ΙοχΡ位点，在有 Cre表达的细胞中由于发生同源重组丢失包装序列而失去自身包装能力。包装细胞 293Cre4能稳定表达 Cre 重组酶。把线性化的 pGL- hTERT/Trail与辅助病毒共转染到包装细胞，辅助病毒提供用于无肠腺病毒包装所需的全部蛋白，而自身由于缺少包装信号而不进行包装，包装质粒 pGL-hTERT/Trail含有包装信号，经线性化后利用辅助病毒提供的包装蛋白而组装成无肠腺病毒。

二、实验步骤：

1、扩增和纯化无肠腺病毒：

( 1 )用 Pmel酶消化 pGL-hTERT/Tmil，酚 /氯仿抽提后用乙醇沉淀 DNA。用磷酸钙法转染 2930re4细胞。六小时后移去培养基，用 5mol的辅助病毒感染细胞。 37°C， 5 % C0₂培养箱培养 48小时，待细胞呈现完全病变后收集细胞，冻融三次后存于一 80°C。 (2)将 1/2的上述病毒液感染更多的 293 Cre4细胞，同时加入 5mol的辅助病毒。培养，待发生病变后收集细胞，反复 4一 5次。

(3 )将最后一次收集的细胞 1500rpm，离心 20分钟，去除上清用 2mlTris 溶液重悬细胞，冻融三次后贮于一 80°C。

(4)取（3 ) 中的病毒液 200 μ 1，用 QIAamp DNA Mini(Qiaamp)抽提病毒 DNA。用乙醇沉淀纯化的 DNA，最后用 ΙΟ μ ΙΤΕ重溶。在琼脂糖凝胶上比较病毒 DNA和 200ng pGL-hTERT/Trail的亮度。如果相当或更亮，进行大规模扩增；如果检测不到病毒 DNA，重新从 1开始做。

2、大规模扩增和纯化：

将（3 ) 中得到的病毒液感染更多的 293Cre4细胞，同时加入辅助病毒，待细胞完全病变后收集细胞，然后用 CsCl梯度离心分离病毒。辅助病毒的污染率可以用形成空斑的相对数量来衡量（辅助病毒和无肠腺病毒形成的空斑形态不通），或者用 Southern Blot比较二者的比例。在我们的系统中用到了 Cre-loxP重组系统，包装细胞内表达的 Cre酶可以有效的切除辅助病毒的包装信号，从而抑制辅助病毒的包装。这样可以将辅助病毒的污染控制在 0.2%以内。实施例 4: 无肠腺病毒基因表达的靶向性和可调控检测

用上述类似的方法，构建带有报告基因-荧光素酶基因（也可以是其它报告基因类）的无肠腺病毒，具体实施步骤如下：经 Nhel/Clal把 Luciferase 基因从 pGL3-Enhancer (购自 Promega公司）上切出，装入 pRS-hTERT，再用 Notl构建 pGL-hTERT/Luciferase，最后包装出病毒 GL- hTERT/Luciferaseo 将病毒 GL- hTERT/Luciferase感染正常和肿瘤细胞，并用 RU486进行诱导。检测 Luciferase基因的表达， Luciferase基因表达的定量测量参照 Promega 公司的产品说明书，结果如图 3所示。由图 3 的结果可见，在正常细胞中（NHLF) 不管加不加 RU486、有无 hTERT启动子荧光素酶的活性差别不大，并且都比较的低。而在肿瘤细胞 (7404和 Hda) 中，只有在同时存在 RU486和 hTERT启动子的组合中荧光素酶的活性才最高。可见，通过本发明的方法构建得到的基因-病毒具有靶向性和可调控性。

综上所述，本发明的抗癌靶向可调控基因-病毒中，受肿瘤组织特异性启动子控制的反式作用元件 TA表达盒由来源于酵母的 GAL4因子 DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子 NF-kB的 p65亚基基因片段及终止信号组成。表达出的 TA是一个嵌和体蛋白，其中的 GAL4结合片段可以结合 17mer _X4序列，突变的孕酮受体片段不会结合内源性的正常配体，但是可以结合 RU486(或 mifepristone), 结合 RU486以后，孕酮受体片段构象发生改变，使得整体嵌和体蛋白具备与 GAL4启动子 17mer x4序列结合的特点，进而启动转录的活性。而未与 RU486结合的孕酮受体构象不发生改变，整体嵌和体蛋白不具备转录激活作用。因此，反式作用元件 (TA)活性的发挥受双重因素的调控：在转录与翻译水平上受肿瘤组织特异性启动子的调控，在功能发挥上又受小分子药物 RU486的调控。

GAL4 是源于酵母的转录调控因子，与人的亲源关系相差甚远，不会识别人源的转录调控区，因此避免了反式作用元件 (TA)对人体内其他基因的干扰。

表达盒 -1 受。 hTERT 的控制，且表达出的反式作用元件无活性，需结合 RU486生成二聚体以后并发生构象改变，才可结合抗癌基因盒上游序列 17mer x4，从而激活抗癌基因的表达；因此抗癌基因受双重控制：一是 hTERT的控制，因为 hTERT控制 TA的表达，即 TA只能在肿瘤细胞中靶向表达而不会在正常细胞中表达；二是 RU486调控，没有 RU486虽有 TA也不能发挥作用，因此是可调控的，需要抗癌基因表达时加入 RU486,不需要时，不加 RU486, 即关闭了抗癌基因的表达，以减少副作用。

Claims

权利要求书

1、一种抗癌靶向可调控基因-病毒，其特征在于，所述基因 -病毒以无肠腺病毒为载体，包装有反式作用元件表达盒和抗癌基因表达盒。

2、如权利要求 1所述的抗癌靶向可调控基因-病毒，其特征在于，反式作用元件表达盒构成是：（1 ) 肿瘤组织特异性启动子；（2) 反式作用元件，依次是： GAL4 因子 DNA 结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子 NF-kB的 p65亚基基因片段以及终止信号；

3、如权利要求 1所述的抗癌靶向可调控基因-病毒，其特征在于，抗癌基因表达盒的构成是：（1 ) GAL4上游序列 17-mer; (2) TATA盒；（3 )位于 TATA盒下游的抗癌基因；（4) 终止序列。

4、如权利要求 1〜3中任一项所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于包括下列步骤- 一、克隆质粒 pRS-hTERT/Trail的构建

反式作用元件表达盒的构建：用限制性内切酶消化质粒 pAd/hTERT，回收 hTERT 启动子片段再插入到克隆载体 pBluescript 的多克隆位点，得到 pBS-hTERT;用限制性内切酶切割 pBS-hTERT，将含有 hTERT启动子的片段克隆到 pRS-17的相应位点，替换出 pRS-17原有的 TTR启动子，得到质粒 pRS-hTERT;

抗癌基因表达盒的构建：从 pCA13-Tmil中用限制性内切酶切出 Trail基因，克隆到中间载体 pBluescript的相应位点，然后再用 Bamffl/Xhol切出该基因插入另一中间载体 pSP72 的相应位点；最后用 Clal 切出 Trail, 插入 pRS-hTERT的 Clal位点，得到克隆质粒 pRS-hTERT/Trail;

二、包装质粒 pGL-hTERT/Trail的构建

用限制性内切酶把克隆质粒 pRS-hTERT/Trail的两个表达盒切出，连接到质粒 pGL的酶切位点上，得到包装质粒 pGL-hTERT/Trail; 三、病毒的包装

用限制性内切酶切割包装质粒 pGL-hTERT/Tmil使之线性化，与辅助病毒共转染到包装无肠腺病毒中；

四、病毒的收集纯化

挑选单克隆，鉴定后大规模培养，收集细胞培养物，经梯度离心纯化病毒。

5、如权利要求 4所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，反式作用元件表达盒中的 hTERT启动子可以用以下启动子替换： 1 ) 端粒酶逆转录酶催化亚基基因启动子； 2) 甲胎蛋白 (AFP)启动子； 3 )癌胚抗原 (CEA)启动子； 4)前列腺特异性抗原启动子； 5)乳腺癌组织特异性启动子。

. 6、如权利要求 4所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，抗癌基因表达盒中的 Trail基因，也可以以下抗癌基因替代： 1 ) 肿瘤坏死因子超家族中的 Trail基因； 2) 抑癌基因； 3 ) 细胞因子基因； 4) 促细胞凋亡基因； 5 ) 血管抑制基因； 6) 自杀基因。

7、如权利要求 6所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，所述抑癌基因可以是 p53、 Rb、 NF1、 VHL或 APC：。

8、如权利要求 6所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，所述细胞因子基因可以白细胞介素 -2、 -12、 -24，粒 -单集落刺激因子，干扰素- α、 - β、 - γ。

9、如权利要求 6所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，所述促细胞凋亡基因 Smac、 Caspases或 Bax。

10、如权利要求 6所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，所述血管生成抑制基因可以是血管生成抑素基因和血管内皮抑素基因。

11、如权利要求 6所述的抗癌靶向可调控基因 -病毒的构建方法，其特征在于，所述自杀基因可以是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，单纯疱疹病毒的脱氧胸腺嘧啶核苷激酶基因，水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因。