CN1772371A - 万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料及其制备方法 - Google Patents
万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料及其制备方法。它是将糖肽类大环抗生素－万古霉素化学键合到硅胶载体上，再与苯异氰酸酯进行衍生化反应制成的手性色谱固定相填料。采用硅胶为载体，载体与3－氨丙基三乙氧基硅烷进行硅烷化反应；硅烷化后的载体与间隔臂进行活化，活化后的硅胶载体与糖肽类大环抗生素万古霉素键合，再与苯异氰酸酯进行衍生化反应完成。用这种方法合成的万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料装柱后，可以在正相、反相及极性有机相色谱条件下使用。本发明可在简单的极性有机相模式下拆分佐米曲坦和拉米夫定等药物对映体。
Description
技术领域
本发明是涉及一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料及其制备方法。该固定相在极性有机相条件下拆分了佐米曲坦和拉米夫定药物对映体，属于分析化学领域。
背景技术
互为对映异构体的两个手性化合物，在生物活性、药理动力学、药物潜在的毒副作用等方面往往有较大的差别，目前市场上出售的西药有半数左右含手性中心，这其中又有大约一半是以外消旋体的形式出售，为此美国、欧共体及日本、加拿大等国卫生管理部门对新的外消旋药提出了极为严格的要求，要求对其对映体的代谢和药动力学有明确的说明，规定今后凡是发展具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果。在分离分析药物对映体的方法中，高效液相色谱手性固定相法具有快速、简单、高效的优点，对手性固定相的研制，是手性色谱发展的前沿，也是手性色谱发展的关键和核心。
自1994年Armstrong等首次将糖肽类抗生素作为手性选择剂应用于高效液相色谱手性固定相以来，由于这类抗生素的对映体选择性高，具有较广泛的手性识别能力，被称之为新一代的手性选择剂，成为目前最具发展潜力的一类新型手性固定相。
佐米曲坦(Zolmitriptan，311C90)化学名(S)-4-{[3-[2-(二甲氨基)乙基-1H-吲哚-5-基]甲基]-2-噁唑烷酮，是一种5-HT1B/1D受体激动剂，广泛的应用于临床治疗偏头痛症状，不仅能够迅速的缓解头痛，还能缓解畏光、惧声、恶心等并发症，其结构中存在1个手性碳原子，具有右旋光性。在合成过程中必须进行手性分离分析，以便控制将其左旋对映体分离。目前只有少数文献报道了其拆分，如以β-环糊精及其为流动相添加剂，利用毛细管电泳[何梅，夏之宁，刘毅，项顺锋，李根荣.佐米曲普坦与其左旋对映体的毛细管电泳分离方法研究.药物分析杂志，2002，22：438-440；杨更亮，刘妍，宋秀荣，陈义.毛细管电泳手性分离佐米曲坦及其对映体.分析化学，2003，31：1149]和利用纤维素衍生物AD-H手性固定相[L.S.Yu；T.W.Yao，S.Q.Ni，S.Zeng，Determination ofzolmitriptan enantiomers in rat liver microsomes by chiral high performance liquidchromatography with fluorescence detection.Biomed.Chromatogr.2005，19：191-195；M.K.Srinivasu，B.M.Rao，G.Sridhar，P.R.Kumar，K.B.Chandrasekhar，A.Islam.A validated chiral LC method for the determination of Zolmitriptan and itspotential impurities.J.Pharm.Biomed.Anal.2005，37：453-460]，以及去甲万古霉素键合手性固定相[丁国生，刘莺，丛润滋，王俊德.去甲万古霉素键合手性固定相拆分β-受体阻滞剂类药物及其结构类似物的研究.色谱，2004，22：386-389]拆分了佐米曲坦对映体。
拉米夫定(Lamivudine，3TC)，即(2R-顺式)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1，3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮，是核苷类抗病毒药，开始用于治疗艾滋病，1995年后逐渐发现其对HBV DNA的抑制作用，并在全球先后进行了拉米夫定治疗乙型肝炎的II期和III期临床试验，是迄今为止唯一经历长期慢性乙型肝炎治疗试验的核苷类药物，其R-对映体比S-对映体更加具有生物毒性作用。文献中有关拉米夫定的对映体的分离报道较少，目前仅发现利用环糊精衍生物作为手性添加剂或手性固定相及生物酶催化法进行过分离[Manus M.Rogan，ChristopherDrake，David M.Goodall，Kevin D.Altria.Enantioselective EnzymaticBiotransformation of 2`-Deoxy-3`-thiacytidine(BCH 189)Monitored by CapillaryElectrophoresis.Anal.Biochem.，1993，208：343-347；Jonathan A.V.Coates，NicholasCammack，Helen J.Jenkinson，Ian M.Mutton，Bridget A.Pearson，Richard Storer，Janet M.Cameron，Charles R.Penn.The Separated Enantiomers of2`-Deoxy-3`-Thiacytidine(BCH 189)Both Inhibit Human Immunodeficiency VirusReplication In Vitro.Antimicrob.Agents Chemiother.1992，36：202-205；Jonathan A.V.Coates，Nicholas Cammack，Helen J.Jenkinson，Amanda J.Jowett，Michael I.Jowett，Bridget A.Pearson，Charles R.Penn，Philippa L.Rouse，K.Claire Viner，Janet M.Cameron.(-)-2`-Deoxy-3`-Thiacytidine Is a Potent，Highly Selective Inhibitor ofHuman Immunodeficincy Virus Type 1 and Type 2 Replication In Vitro.Antimicrob.Agents Chemiother.1992，36：733-739]，但是分离效果并没有达到基线分离，而拉米夫定作为中间体出口时需要将另一对映体控制在0.3％以下，美国药典推荐使用环糊精手性色谱柱进行拆分，但是由于不能基线分离，对检测低含量的组分误差较大。
发明内容
本发明提供了一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料及其制备方法。
万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料是将糖肽类大环抗生素-万古霉素化学键合到硅胶载体上，再与苯异氰酸酯进行衍生化反应制成的手性色谱固定相填料。
所述化学键合是指使用间隔臂来实现手性选择剂与载体的连接。硅胶载体为球形和无定形硅胶载体。
万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料的制备方法的步骤如下：
1)载体硅胶的硅烷化
硅胶载体用3～5mol L-1盐酸回流4～6小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8～10小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯，在冰浴及氮气保护下滴加2～4ml的1，6-二异氰酸酯正己烷(或1，3-二异氰酸酯苯)，混合物加热至65～75℃反应2～3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷(或1，3-二异氰酸酯苯)，加入100ml含1～2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下65～75℃搅拌反应10～12小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中110～120℃反应2～3小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
本发明通过化学键合的方法制备的万古霉素苯异氰酸酯手性固定相，在常用的极性有机相条件下实现药物佐米曲坦和拉米夫定对映体的基线分离，分离效果明显优于文献报导。
该手性固定相制备方法简单，并可在正相、反相和极性有机相等色谱模式下使用，而色谱柱的手性识别能力不受影响。该手性固定相在极性有机相条件下可以快速、简单地拆分药物佐米曲坦和拉米夫定对映体，适合于临床研究和质量控制的需要。
附图说明
图1是佐米曲坦对映体在甲醇/冰醋酸/三乙胺体系中的分离谱图，图中流动相：甲醇/冰醋酸/三乙胺(100/0.1/0.1，v/v/v)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：286；
图2是拉米夫定对映体在甲醇体系中的分离谱图，图中流动相：甲醇；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：276nm。
具体实施方式
本发明以糖肽类大环抗生素-万古霉素为原料，通过间隔臂化学键合至用3-(氨丙基)-三乙氧基硅烷进行硅烷化的硅胶载体上，再与苯异氰酸酯进行衍生化反应制成。
本发明中所述化学键合是指用间隔臂来实现万古霉素与载体的连接，其中间隔臂包括化学键合固定相中常用的所有间隔臂。
本发明中所述载体是指色谱用硅胶填料，包括球形和无定形硅胶。
本发明所述的固定相的具体实施步骤如下：
1)载体硅胶的硅烷化
硅胶载体用3～5mol L-1盐酸回流4～6小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8～10小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯，在冰浴及氮气保护下滴加2～4ml的1，6-二异氰酸酯正己烷(或1，3-二异氰酸酯苯)，混合物加热至65～75℃反应2～3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷(或1，3-二异氰酸酯苯)，加入100ml含1～2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下65～75℃搅拌反应10～12小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中110～120℃反应2～3小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
3)佐米曲坦对映体在甲醇/冰醋酸/三乙胺体系中的分离
流动相组成为甲醇/冰醋酸/三乙胺(100/0.1/0.1，v/v/v)，手性分离因子α＝1.53，分离度Rs＝3.14，此条件下的分离谱图见图1。
4)拉米夫定对映体在甲醇条件下的分离
流动相组成为纯甲醇，手性分离因子为α＝1.42，分离度Rs＝2.61，此条件下的分离谱图见图2。
实施例1
1)载体硅胶的硅烷化
称取10克Kromasil球形硅胶载体(粒径5μm，孔径10nm)用3mol L-1盐酸回流4小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入10ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯中，在冰浴及氮气保护下滴加2ml的1，6-二异氰酸酯正己烷，混合物加热至65℃反应2小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷，加入100ml含1g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下65℃搅拌反应10小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中110℃反应2小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
实施例2
1)载体硅胶的硅烷化
称取10克Lichrosorb无定形硅胶载体(粒径5μm，孔径10nm)用5mol L-1盐酸回流6小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应10小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯中，在冰浴及氮气保护下滴加3ml的1，6-二异氰酸酯正己烷，混合物加热至70℃反应3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷，加入100ml含2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下70℃搅拌反应10小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中110℃反应3小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
实施例3
1)载体硅胶的硅烷化
称取10克Lichrospher球形硅胶载体(粒径5μm，孔径10nm)用5mol L-1盐酸回流4小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯中，在冰浴及氮气保护下滴加4ml的1，6-二异氰酸酯正己烷，混合物加热至75℃反应3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷，加入100ml含2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下75℃搅拌反应12小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中120℃反应3小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
实施例4
1)载体硅胶的硅烷化
称取10克Kromasil球形硅胶载体(粒径5μm，孔径20nm)用5mol L-1盐酸回流4小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯中，在冰浴及氮气保护下滴加4ml的1，6-二异氰酸酯正己烷，混合物加热至75℃反应3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷，加入100ml含2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下75℃搅拌反应12小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中120℃反应3小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
实施例5
1)键合手性固定相的合成
称取3克干燥的Kromasil-NH2球形硅胶载体(粒径5μm，孔径10nm)，加入无水甲苯中，在冰浴及氮气保护下滴加4ml的1，6-二异氰酸酯正己烷，混合物加热至75℃反应3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷，加入100ml含2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下75℃搅拌反应12小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中120℃反应3小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
实施例6
1)载体硅胶的硅烷化
称取10克Kromasil球形硅胶载体(粒径5μm，孔径10nm)用3mol L-1盐酸回流4小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入10ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8小时，冷却至室温过滤，用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥得3-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯中，在冰浴及氮气保护下滴加4ml的1，3-二异氰酸酯苯，混合物加热至65℃反应2小时，冷却至室温后除去溶剂及1，3-二异氰酸酯苯，加入100ml含1g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下65℃搅拌反应10小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中110℃反应2小时，过滤后，用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
Claims (4)
1、一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料，其特征在于：它是将糖肽类大环抗生素—万古霉素化学键合到硅胶载体上，再与苯异氰酸酯进行衍生化反应制成的手性色谱固定相填料。
2、根据权利要求1所述的一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料，其特征在于：所述硅胶载体为球形和无定形硅胶载体。
3、一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料的制备方法，其特征在于：方法的步骤如下：
1)载体硅胶的硅烷化
硅胶载体用3～5mol L-1盐酸回流4～6小时后水洗至中性，真空干燥，以无水甲苯做溶剂，加入-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应8～10小时，冷却至室温过滤，依次用甲苯、甲醇洗涤，真空干燥得-氨丙基硅胶；
2)键合手性固定相的合成
取3克上述干燥的3-氨丙基硅胶，加入无水甲苯，在冰浴及氮气保护下滴加2～4ml的1，6-二异氰酸酯正己烷(或1，3-二异氰酸酯苯)，混合物加热至65-75℃反应2～3小时，冷却至室温后除去溶剂及1，6-二异氰酸酯正己烷(或1，3-二异氰酸酯苯)，加入100ml含1～2g万古霉素无水吡啶溶液，氮气保护下65～75℃搅拌反应10～12小时，过滤，用吡啶、水、甲醇、乙腈、二氯甲烷洗涤，减压干燥后与苯基异氰酸酯在无水吡啶溶液中110～120℃反应2～3小时，过滤后，依次用吡啶、水、甲醇、丙酮、二氯甲烷洗涤干燥，得万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料。
4、根据权利要求3所述的一种万古霉素苯异氰酸酯手性色谱固定相填料的制备方法，其特征在于：所述硅胶载体为球形和无定形硅胶载体。
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