CN1766125A - 一种利用pon2基因第九外显子多态性预测2型糖尿病易感性的方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用PON2基因第九外显子多态性预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者PON2基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列第105位的单核苷酸多态性位点(SNP)的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性：第105位的基因型为C/C时，受试者的易感性较低；第105位的基因型为C/G或G/G时，受试者的易感性较高。本发明的优点是：首次阐明了PON2基因第九号外显子第26位的单核苷酸多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

一种利用PON2基因第九外显子多态性预测2型糖尿病易感性的方法及试剂

技术领域

本发明涉及一种利用PON2基因第九外显子多态性预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。

背景技术

糖尿病是一种暂时无法治愈的慢性疾病，并可引发多种合并症，累及眼、肾、神经、心脏、血管等多种组织器官。糖尿病患者常伴有血脂代谢紊乱、高血压、肥胖等疾病，其发生冠心病、脑血管病的危险性也明显高于非糖尿病人群。糖尿病已经成为威胁人类健康的主要疾病之一，它带来的经济负担也与日剧增。目前认为，糖尿病(diabetes mellitus，DM)不是一种简单疾病，而是一种内分泌、代谢异常综合征，是由遗传因素与后天环境因素联合作用而导致的一种机体慢性高血糖状态。按1999年世界卫生组织(WHO)推荐的糖尿病分型意见，目前主要划分为4种类型，即1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病，其中近90％为2型糖尿病。2型糖尿病患者多见于40岁以上的中、老年人，但也可发生于其他任何年龄，曾被称为非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)。其发病具有较强的遗传易感性，且发病率随着年龄和体重的增加、运动减少而增长，肥胖尤其是中心性肥胖是此类糖尿病的明显诱发因素，易引起胰岛素抵抗(IR)并伴有胰岛素分泌的相对不足。随着社会经济的发展，人们生活方式的改变，糖尿病的发病率逐年升高。

研究表明，2型糖尿病可由于一种以上基因异常及致病环境因子与基因呈正性或负性相互作用而引起，遗传因素在2型糖尿病的发病机制中起非常重要的作用。2型糖尿病主要存在两种遗传模式：(1)单基因模式，即由单个基因的突变引起，但突变位点位于基因关键位点，其突变严重影响了基因功能；此类疾病表型往往较严重，如MODY等，这一模式在T2DM患者中比较罕见，只占发病人数的5％。(2)多基因模式，单一或少数几个基因变异的效应不足以引起疾病明显表型的出现，只有多个基因变异效应累积达到某一阈值时才出现疾病表型；而且可能不同的基因变异组合将引起不同的表型变化；不同的人群也有不同的易感基因位点组合。中国北方人T2DM的易感基因组合仍不清楚。但是人们将这些突变基因组合分为两种：1)主效基因作用模式，即1-2个主效基因对疾病易感性起主导作用，且其基因变异在群体中的发生频率较高，其余的次要基因对2型糖尿病易感性贡献率很小。这种模式在T2DM研究中，还没有肯定的证据；据推测，这一模式可能存在于30岁以前发病的患者中。2)微效基因作用模式，即源于多个位点的大多数风险等位基因在群体中的发生频率都很低，它们之间有相互作用，效应具有可累加性，符合数量性状的剂量-效应关系，它们对T2DM遗传易感性的共同贡献，使易感人群达到疾病发生的临界阈值。

2型糖尿病被认为是复杂遗传病，即多基因疾病，不仅受到基因与基因之间相互作用的影响，而且受到环境因素的修饰。近年来，在确定2型糖尿病易感基因方面取得了很大的成功。使人们对2型糖尿病的发病机制有了更深入的认识。目前寻找多基因遗传疾病易感基因的方法有两种：候选基因筛选法和全基因组扫描定位克隆法。候选基因法指通过选择与血糖调节或能量代谢有关蛋白的编码基因作为研究对象，并假设它们的基因变异与2型糖尿病的遗传易感性有关，通过病例一对照关联研究等求证方法证实这些基因与2型糖尿病易感性的相关性，是一种简单直接的方法。如果已知候选基因的功能，采用这一方法则相对容易。

PON2基因与PON1和PON3基因均定位于7q21-22，属于同一基因家族。在此基因位置上，Prochazka等人在皮玛印第安人中进行的基因组扫描研究中发现2型糖尿病的易感基因。PON2具有抗氧化功能，可以分解芳香脂类化合物，对肝脏解毒具有一定的作用。PON2基因的变异主要有Prochazka等发现的Ser 311/Cys和Mochizuki等发现的Ala148/Gly。群体研究中，Hegele等在Oji-Cree人群发现Gly148等位基因纯合子与空腹高血糖和2型糖尿病有关；在中国南方2型糖尿病患者中发现PON2基因C311S与缺血性休克相关。此外，更多的研究表明PON基因家族多态与心血管疾病相关。这些都表明PON2基因的变异可能对2型糖尿病的发生具有潜在的关联，是一个有价值的候选基因。

简言之，以上背景表明，2型糖尿病是一种受遗传和环境双重影响的复杂代谢性疾病，通过候选基因法可以发现对2型糖尿病易感性有重要影响的关键功能基因并用于2型糖尿病的预测和预防。芳香酯酶2(Paraoxonase 2，PON2)是一种高度保守的生物酶。研究者认为，它与肝脏的解毒功能和有机体的抗氧化过程密切相关。(Pharmacogenetics 2003May 13(5)：291-5)

经过现有国内外文献检索，未见有PON2基因第九号外显子多态性与2型糖尿病易感性相关的报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种利用PON2基因第九外显子预测2型糖尿病易感性的方法及试剂。

本发明的第二个目的是提供一种预测2型糖尿病的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测2型糖尿病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者PON2基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列第105位的单核苷酸多态性位点(SNP)的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性：第105位的基因型为C/C时，受试者的易感性较低；第105位的基因型为C/G或G/G时，受试者的易感性较高。

其中，单核苷酸多态性(SNP)主要指基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，是第三代分子标记，在所有的已知多态性中占绝对优势。

基因分型及等位基因频率分布是指同一生物群体中，相同等位基因核苷酸序列顺序分析，在此表示相同SNP位点在不同个体中的组成成分的确定，为基因分型。等位基因频率是指所研究的同一种类型的等位基因里，所期望出现的等位基因占的比例，即变异等位基因所占的比例。

疾病易感性(2型糖尿病易感性)是指人群对疾病的易患程度或可能性。

病例-对照关联分析是指一种由果及因的回顾性研究。它先按照疾病状态确定调查对象，分为病例和对照组，通过比较病例组与对照组间所研究的遗传标志出现频率的差异而获得该标志与疾病间关联的信息。

本发明人经过广泛而深入的研究，已经发现了PON2基因第九号外显子所编码的蛋白序列中第311位Cys(C)→Ser(S)多态(即第九号外显子上第26位C→G多态性存在与中国人群，并在此基础上完成了本发明。

根据对2型糖尿病人PON2基因测序结果，发现该SNP存在于中国人群，该SNP导致第311位氨基酸由Cys(C)→Ser(S)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致PON2基因第九号外显子所编码的蛋白活性发生改变。

本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，在第105位为G。该核酸序列为PON2基因第九号外显子，其中氨基酸编码区为第80-238位。PON2基因的基因组全序列和mRNA及蛋白质序列可以由Genebank中获得。基因组序列在Genebank中的编号为gi：27658001。

本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可以用于检测PON2基因第九号外显子中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)：DNA测序、杂交测序、DNA芯片、PCR-RFLP、PCR-SSCP、酶促错配切割、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱(DHPLC)等。

用于本发明方法或检测试剂盒的引物，根据PON2基因第九外显子和其5’端内含子与3’端非编码区的基因组序列进行设计，并可用常规的合成技术进行合成。本发明提供了一组等位基因特异性的引物，具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的碱基序列，其长度为18-26bp，且特异性的杂交并扩增出含人PON2基因第九号外显子的SEQ ID NO.1所示序列中第105位单核苷酸多态性的扩增产物。

用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的基因组DNA。对于检测PON2基因第九号外显子活性而言，可以任何表达PON2基因第九号外显子的样品，如血液、肝脏组织匀浆等。

另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体患2型糖尿病及其他PON2基因第九号外显子相关疾病的易感性。

本发明提供了一种检测T2DM易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增PON2基因第九号外显子序列的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常PON2基因第九号外显子第26位SNP相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：

本发明试剂盒供10人份检测应用，

其组分、含量和来源包括：

20ul 10×PCR缓冲液(Pharmacia)，

4ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

2ul(5unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，

各10ul(10pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，

1.5ml纯水(自制)，

10ul 10×限制酶反应缓冲液(Biolab)，

4ul(5unit/ul)限制酶Dde I(Biolab)。

使用方法：

1)通过PCR扩增PON2基因第九号外显子基因：制备混合液，加入基因组DNA溶液100ng、2ul 10×PCR缓冲液、0.4ul 10mM dNTP、1.0单位Taq DNA聚合酶和10pmolF1和R1分别为有义引物和反义引物，实施例2叙述的每种引物。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，72℃0.5分钟，进行35个循环。反应完成后，将3ul每种PCR反应液在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，如扩增了331bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。

2)通过用限制酶处理PCR反应产物测定PON2基因第9号外显子的多态性。往5ul上述扩增的PCR反应产物中加入1ul限制酶反应缓冲液、0.4ul限制酶Dde I，并在37℃水浴中消化过夜。之后，在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

3)多态性定型：用限制酶Dde I处理片段，在第105个碱基是C等位基因时，出现128bp、105bp、67bp和31bp的条带。如为G等位基因时，出现172bp、128bp和31bp的条带。

在进行本发明的基因诊断时，优选使用用于测定根据PON2基因第九号外显子的突变类型存在的诊断试剂，诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定PON2基因第九号外显子基因突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由PON2基因定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作为用于测定的特异限制酶。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含PON2基因第九号外显子的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，它们也包含于本发明的诊断试剂之中。

本发明的优点是：本发明首次阐明了PON2基因第九号外显子第26位SNP与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制。

附图说明

图1为PON2基因外显子9 Ser311Cys多态PCR-RFLP分型电泳图谱，右侧第一泳道为Marker。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下。

需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

SDS：十二烷基硫酸钠

TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)

10×PCR缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化镁(MgCl2)0.01％(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

甲酰胺颜料：95％去离子甲酞胺，0.05％葡聚糖蓝

APS：过硫酸铵→10×TBE：Tris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于纯水中，总体积为1升。

实施例1血液样本收集和基因组DNA的提取

按WHO(1999)标准明确诊断入选病例，须经空腹8-12小时口服溶入300ml温水中的75g无水葡萄糖，2小时后检测其血浆葡萄糖值≥11.1mmol/L或者以前经由县市以上级别医院明确诊断的糖尿病患者，共计收集来自黑龙江和北京的无亲缘关系T2DM患者396例，平均年龄50.0岁±12.7岁，其中男性191例，同地区的健康对照志愿者319例，平均年龄45.2岁±5.7岁，其中男性181例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。

根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至50ng/ul，置-20℃冰箱保存。

实施例2  SNP的识别确定

本发明采用PCR-RFLP和PCR测序技术对PON2基因第九号外显子进行检测。

1)特异性引物如下：

上游引物：5’-tggaaaacagggcttattgatga-3’(SEQ ID NO：2)

下游引物：5’-ctgggtcaatgttgctggttaaa-3’(SEQ ID NO：3)

2)PCR扩增PON2基因第九号外显子片段：反应容器中加入实施例1制备的基因组DNA溶液100ng、2ul 10×PCR缓冲液、0.4ul 10mM dNTP、1.0单位Taq DNA聚合酶和10pmol上述步骤1)叙述的每种引物。加入纯水，使总体积为20ul。反应在94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，72℃0.5分钟，进行35个循环。反应完成后，将3ul每种PCR反应液在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳获得了单一的条带，观察在BioRad成像仪，应用Gel Doc 2000程序。

3)扩增得到了331bp的片段，直接进行测序。委托华大中生科技发展有限公司进行序列测定工作。“往5ul上述扩增的PCR反应产物中加入1ul限制酶反应缓冲液、0.4ul限制酶DdeI，并在37℃消化过夜。此后，在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。多态性的测定为：用限制酶Dde I处理片段，在第105个碱基是C等位基因时，出现128bp、105bp、67bp和31bp的条带。如为G等位基因时，出现172bp、128bp和31bp的条带。”

实施例3  2型糖尿病易感基因PON2基因第九号外显子内SNP的相关研究

统计方法：利用SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算PON9基因多态性的Hardy-Weinberg平衡检测，并计算等位基因频率、基因型频率在病例对照群体中分布的差异性，统计学的显著性水平设定为P＜0.05。采用单因素Logistic回归分析计算T2DM的患病风险0R值及其95％可信区间(CI)。

1.中国北方汉族人群2型糖尿病患者及正常对照标本的收集

2型糖尿病组外周血样本采自北京人民医院内分泌科门诊，正常对照组样本采自哈尔滨医科大学，标本来源均为我国北方地区汉族，分别以北京和黑龙江为主。糖尿病可为散发，也可为糖尿病家系成员(同一家系中具有血缘关系的成员仅能入选一人)，正常对照要求家庭三代以内无糖尿病患者(包括I型糖尿病)，对照组与患病组年龄及性别相匹配。共收集样本614份，其中病例组295份，对照组319份，每个入选成员均应在知情同意书上签字。

2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1997年颁发的标准执行，即：空腹血葡萄糖浓度≥7.8mmol/L或餐后与口服75克葡萄糖2小时血糖≥11.1mmol/L为糖尿病，服糖后2小时葡萄糖浓度＜7.8mmol/L为正常。入选的每个成员记录基本情况，包括性别、年龄、身高、体重、心率、血压等。对病例组还增加了发病年龄、用药情况、合并症、家族史等指标内容。

2.SNP位点基因型分析

采用PCR-RFLP进行SNP分型：此SNP改变了限制性内切酶Dde I的酶切位点，可以先进行PCR扩增，扩增产物用内切酶Dde I消化，电泳后根据条带位置判断基因型，完全酶切产生两条带的为野生型GG纯合子，不能被酶切产生一条带的为突变型纯合子，不完全酶切的为CG杂合子，请参阅图1。

3.病例一对照关联分析

在病例、对照组中，分型的PON2基因第九号外显子SNP位点均符合哈代-温伯格平衡。经SPSS统计软件10.0版进行卡方分析，PON2基因第九号外显子SNP位点基因型频率和等位基因频率的分布在两组中的差异具有统计学意义(对基因型频率和等位基因频率分别为P＜0.01，P＜0.05)，如表1所示。

表1病例组与对照组PON2基因第九号外显子SNP分型SPSS统计分析结果

PON2	HWE(P)	n	Genotype(％)			Allele(％)
								CC	CG	GG	C	G
			T2DMControl	0.0160.057	458316	296(64.6)239(75.6)	154(33.6)67(21.2)						8(1.8)10(3.2)	746(81.4)545(86.2)	170(18.6)87(13.8)
x2＝15.00，P＝0.001(df＝2)								x2＝6.21，P＝0.013

如上表可以看出，位于PON2基因第九号外显子的SNP位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组存在显著差异，因此提示此SNP位点与2型糖尿病相关，G等位基因是2型糖尿病的风险等位基因，可以显著升高2型糖尿病的发病几率，OR值为1.43，95％置信区间为1.08-1.89。从而提示PON2基因为一个新的2型糖尿病易感基因。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例4  检测试剂盒

制备检测T2DM相关风险的试剂盒，包含有可扩增出PON2基因第九号外显子的SNP位点的引物对，及其PCR-RFLP相应试剂，成分和含量如下，于-20℃保存：

20u1 10×PCR缓冲液(Pharmacia)，

4ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

2ul(5unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，

各10ul(10pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，

1.5ml纯水(自制)，

10ul 10×限制酶反应缓冲液(Biolab)，

4ul(5unit/ul)限制酶Dde I(Biolab)。

                              序列表

<110>卫生部北京医院

<120>一种利用PON2基因第九外显子多态性预测2型糖尿病易感性的方法及试剂

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>331

<212>DNA

<213>人属，人种(Homo sapiens，human)

<400>1

tggaaaacag ggcttattga tgattgagtg acatgcatgt acggtggtct tatattcata    60

ctttgtatcc cctgaatagg ttctccgcat ccagaacatt ctatctgaga agcctacagt    120

gactacagtt tatgccaaca atgggtctgt tctccaagga agttctgtag cctcagtgta    180

tgatgggaag ctgctcatag gcactttata ccacagagcc ttgtattgtg aactctaaat    240

tgtacttttg gcatgaaagt gcgataactt aacaattaat tttctatgaa ttgctaattc    300

tgagggaatt taaccagcaa cattgaccca g                                   331

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tggaaaacag ggcttattga tga                                              23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ctgggtcaat gttgctggtt aaa                                              23

Claims (8)

1.一种预测2型糖尿病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者PON2基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列第105位的单核苷酸多态性位点的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性：第105位的基因型为C/C时，受试者的易感性较低；第105位的基因型为C/G或G/G时，受试者的易感性较高。

2.一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，在第105位为G。

3.一组预测2型糖尿病易感性的引物，其长度为18～26bp，能特异性地扩增出含PON2基因第九外显子SEQ ID NO.1所示序列中的第105位SNP的扩增产物，具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

4.一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物序列和以下试剂，包括：20ul 10X PCR缓冲液，4ul 10mM dNTP混合液，2ul TaqDNA聚合酶，各10ul F1和R1引物，1.5ml纯水，10ul 10X限制酶反应缓冲液，4ul限制酶Dde I；本试剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。

5.根据权利要求4所述的一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，所述F1和R1引物的序列分别具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

6.根据权利要求4所述的一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，所述F1和R1引物的浓度为10pmol/ul。

7.根据权利要求4所述的一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，所述限制酶Dde I的浓度为5unit/ul。

8.根据权利要求4所述的一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶的浓度为5unit/ul。

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