CN1746300A

CN1746300A - 磷酸激酶及其应用

Info

Publication number: CN1746300A
Application number: CN 200410054290
Authority: CN
Inventors: 孙筱清; 束放
Original assignee: Shanghai Genomics Inc
Current assignee: Shanghai Genomics Inc
Priority date: 2004-09-06
Filing date: 2004-09-06
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2024-09-06
Also published as: CN100543134C

Abstract

本发明提供了一种新的磷酸激酶－RX218蛋白，编码RX218蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种RX218蛋白的方法。RX218蛋白可与P16相互作用，因而可作为药物靶点筛选新药。

Description

磷酸激酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的具有抗肿瘤功能的磷酸激酶-RX218蛋白以及编码RX218蛋白的多核苷酸。本发明还涉及此多核苷酸和蛋白质的制法和用途，以及含该RX218蛋白的组合物。

背景技术

“高质量”的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。人类基因组计划的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白药外，基因本身并不一定是药靶。从基因到新药，这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。其中，基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。

国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。

在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公认的药物筛选基因靶点，与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各类受体统称为一类靶点。磷酸激酶(kinase)将ATP或GTP位的磷酯基转移到底物蛋白质氨基酸残基上，催化蛋白质磷酸化。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是蛋白质调节其功能/活性的一种重要方式。如MAPK和转录因子CREB，Jun等，在磷酸化状态时具有活性，而在非磷酸化状态时没有活性；而转录因子IкBα等则相反，在磷酸化状态时没有活性，而在非磷酸化状态时具有活性。

蛋白质的磷酸化-去磷酸化是细胞信号转导过程中的重要环节。细胞信号转导是指细胞通过位于胞膜或胞内的受体，感受细胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换，发挥生物学效应，进而几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎症(inflammation)反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NF-кB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到治疗疾病的目的。信号转导过程的顺利进行有赖于多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化，而这个过程正是由磷酸激酶催化完成的。

鉴于信号转导通路在细胞增殖、分化和多种疾病发生过程中的重要、甚至决定性的作用，以及磷酸激酶在信号转导通路极其重要的地位，设计和开发以磷酸激酶为靶点的新药，通过调节、控制信号转导通路治疗疾病，无疑是一种针对性强、高效的理想途径，具有治疗多种疾病的潜在前景。目前针对激酶的药物包括PKC活性调节剂、PKA抑制剂、PTK抑制剂和受体介导的钙通道调节剂等，其中部分已经进入临床试验。但现有的激酶药物靶点尚远远不能满足人类战胜疾病、攻克肿瘤的需求，本领域仍需更特异、更有效的新的激酶作为药靶，从而有效拓宽治疗疾病的途径，增进人类的健康。因此，开发新的磷酸激酶成为一种新药开发的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的磷酸激酶-RX218蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些蛋白质的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些蛋白质的方法以及该蛋白质和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的RX218蛋白，它选自下组：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质，或其具有激酶活性的保守性变异蛋白质、活性片段、或活性衍生物。

较佳地，该蛋白质选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10，较佳地1-8个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，该蛋白具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它编码上述的RX218蛋白。

较佳地，所述的多核苷酸多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。更佳地，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中1-1101位的序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有上述编码RX218蛋白的多核苷酸，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种蛋白质的制备方法，该方法包含步骤：

(a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞；

(c)从培养物中分离出蛋白质，所述蛋白质含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在本发明的第五方面，提供了一种能与上述的RX218蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量(或0.001-99wt％)的上述的RX218蛋白、或其拮抗剂(如抗体)以及药学上可接受的载体。

在本发明的第七方面，提供了一种RX218蛋白的用途，它被用作P16蛋白的抑制剂。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了RX218的PCR产物电泳图。其中各泳道如下：泳道1.DNA分子量标准品；泳道2.以人体组织混合RNA为模板，常规RT-PCR扩增产物；泳道3.以人体组织混合RNA为模板，SMART RT-PCR扩增产物；泳道4-8.分别以胎脑、Hela、混合(Hela+胎脑+淋巴)、淋巴、肾cDNA文库为模板的扩增产物。结果表明，除不同来源的RT(包括SMART)产物外，在HELA文库，混合文库(Hela+胎脑+淋巴)，以及肾中有RX218条带。

图2显示了RX218蛋白的结构。其中，SEQ ID NO：2的第18-41位的氨基酸构成ATP结合位点，第12-272位氨基酸构成其激酶结构域。

图3显示了RX218的定量荧光PCR检测结果。其中图A是肺鳞状细胞癌及相应正常肺组织；图B为食管鳞状细胞癌及相应正常食管组织。

图4显示了RX218与P16的免疫共沉淀结果。其中，CP表示对照蛋白。在293T细胞进行转染和免疫共沉淀后，可以看见RX218和P16之间存在明显的相互作用。

图5显示了RX218的磷酸化活性。Flag-RX218能够自身磷酸化，而Flag-RX218的ATP结合位点突变型(RX218mut)则不能。

图6显示了RX218是P16的抑制剂，可影响P16引起的G1期阻滞。在U2OS细胞中转染了P16基因后(B)可以看到明显G1期的阻滞作用(G1期从A：45.19％上升至B：71.35％)，共转RX218之后这一作用消失(E)。相反，共转P16和RX218m(ATP结合位点突变型)(F)则对P16的G1期的阻滞作用没有明显影响。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，首次分离出了新的人磷酸激酶RX218的全长cDNA，其编码含367个氨基酸的RX218蛋白。RX218蛋白含有磷酸激酶的结构域，磷酸化实验证实RX218确是磷酸激酶。酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验结果证实了RX218和P16之间确实具有直接的相互作用。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“磷酸激酶RX218”或“RX218蛋白”或“RX218多肽”可互换使用，都指基本上具有RX218蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白质。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的RX218蛋白。这些术语还包括含有或不含有信号肽的RX218蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白质如从天然状态中与存在的其他物质中分开，则为分离纯化。

如本文所用，“分离的RX218蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术(尤其是 HPLC)分离纯化出RX218蛋白。

本发明的蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白质还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括RX218蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然RX218蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白质。本发明的蛋白质片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白质，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白质，或(iii)成熟蛋白质与另一个化合物(比如延长蛋白质半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白质，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白质序列而形成的蛋白质(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白质的序列或酶原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“RX218蛋白”指具有RX218蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的蛋白质。该术语还包括具有与RX218蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸残基如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸残基取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸残基也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RX218蛋白的活性片段和活性衍生物。

该蛋白质的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RX218DNA杂交的DNA所编码的蛋白质以及利用抗RX218蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白质。本发明还提供了其他蛋白质，如包含RX218蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了RX218蛋白序列的可溶性片段。通常，该片段具有RX218蛋白序列的至少约10个连续氨基酸残基，通常至少约30个连续氨基酸残基，较佳地至少约50个连续氨基酸残基，更佳地至少约80个连续氨基酸残基，最佳地至少约100个连续氨基酸残基。

发明还提供RX218蛋白的类似物。这些类似物与天然RX218蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将蛋白质暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。

在本发明中，“RX218保守性变异蛋白质”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成蛋自质。这些保守性变异蛋白质最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser

Gln(Q)	Asn	Asn
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟蛋白质的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白质的编码序列；成熟蛋白质的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白质的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白质的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白质的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白质的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白质与SEQ IDNO：2所示的成熟蛋白质有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RX218蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的RX218核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。也可直接通过RT-PCR的方法扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RX218蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RX218蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码RX218蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，RX218蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RX218蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：原生质体法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白质。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的RX218蛋白有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进或对抗RX218蛋白功能的抗体、蛋白质或其它配体。用表达的重组RX218蛋白筛选蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激RX218蛋白功能的蛋白质分子。

另一方面，本发明还包括对RX218编码DNA或是其片段编码的蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于RX218蛋白或片段。较佳地，指那些能与RX218蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RX218蛋白的分子，也包括那些并不影响RX218蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的RX218蛋白结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的RX218蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RX218蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用RX218蛋白的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白质合成仪合成。与RX218蛋白的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

利用本发明RX218蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RX218蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。通常，建立适用于高通量筛选的分子和细胞水平筛选模型并进行高通量筛选等相关研究工作。应用E.coli或Bacula virus表达系统，克隆与表达酪氨酸磷酸酯酶活性片段，分离纯化重组蛋白，并应用这些重组酶，建立适用于高通量筛选的分子水平筛选模型。通过对大量来源于传统中草药的粗提物和纯化合物的筛选，寻找有效的活性部位或纯化合物。活性指导从有效的活性部位中分离单体。应用高通量筛选获得小分子抑制剂，检测对RX218抑制效果，确定小分子抑制剂对RX218的特异性。并应用高通量筛选获得的小分子抑制剂检测细胞水平抑制效果。

本发明RX218蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明RX218蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可用于抑制p16的活性。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1纳克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的RX218蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/天，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/天-约0.5毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

一种检测样品中是否存在RX218蛋白的方法是利用RX218蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与RX218蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RX218蛋白。

本发明的主要优点在于：本发明的RX218是一种新的磷酸激酶，与P16有相互作用，因此可作为药物靶点进行小分子化合物的筛选，建立针对RX218的药物筛选模型，寻找能调节RX218激酶活性的小分子化合物，为疾病的诊断、治疗带来新途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、RX218基因的筛选：

从已建立的由Genbank中的EST序列合成、没有任何功能注释或注释不完全的“新”基因的cDNA文库中，应用现代生物信息学PFAM/Profile模式对磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、单过膜受体进行优先筛选，预测到一个新的没有任何功能注释的基因，含有磷酸激酶结构域，命名为RX218。

实施例2、RX218基因的获得：

为了获得RX218基因的全长，合成如下引物，以常规方法抽提的人体组织混合RNA为模板，通过常规RT-PCR方法进行扩增。

上游引物：5′GGCCAATCCGGCCATGGATGACGCTGCTGTCCTCAAGC3′(SEQ ID NO：3)

下游引物：5′GGCCTCTAAGGCCTCACTGGGCCCGCGTCTCTGG 3′(SEQID NO：4)

该对引物含有SfiI穿梭克隆位点、起始密码子和终止密码子，在该酶切位点之间是RX218的编码序列。

利用该对引物PCR扩增获得了一个大小约为1100bp的条带(图1，泳道2和3)，将此片段回收、克隆入载体后测序得到RX218基因的全长序列，共1104bp(SEQ ID NO：1)。

实施例3、RX218序列分析和定位

实施例1获得的1104bp的序列中包含RX218基因的完整编码区，编码一个由367个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO：2)。其中，第18～41位的氨基酸构成ATP结合位点，第12-272位氨基酸构成激酶结构域(图2)。

根据RX218的EST信息，将其定位于人染色体5q22.3。将人RX218的编码区与大鼠、小鼠RX218基因序列进行同源性比对，发现有较高同源性。

序列分析结果显示RX218基因序列中仅含有一个外显子。由于绝大多数基因都是由内含子和外显子共同组成，为排除RT-PCR获得的RX218基因是模板污染的结果，进一步在胎脑、Hela、混合(Hela+胎脑+淋巴)、淋巴、肾组织的cDNA文库中利用引物(SEQ ID NO：3和4)、通过常规PCR方法进行验证，结果如图1中第4～8泳道所示。从图中可以看出，在Hela、肾脏和混合cDNA文库中均检测到RX218基因的存在。因此，这排除了RX218是假基因的可能，克隆获得的RX218序列确实是由一个外显子构成的目前尚无任何功能注释的新基因。

实施例4、RX218的组织分布

实时荧光定量PCR(Q-PCR)是目前对基因进行定量分析最为灵敏、精确的技术。用常规方法构建了约300余对肿瘤组织及其对应正常组织的冰冻组织库，包含18种肿瘤类型。为了进一步确定RX218基因在各种肿瘤组织中的表达情况，对制备的冰冻组织库，通过Q-PCR技术，进行定性、定量的研究。

本实施例中，采用Trizol一步法抽提各组织总RNA，并经过DNA酶消化后，作为RT的模板。随后，设计并合成了以下引物，利用FAM-TAMRA标记的荧光探针实施Q-PCR，

上游引物：5’TCAAGAAGATGCTGCGTATCCA 3’(SEQ ID NO：5)

下游引物：5’TGTGGTAGATGAGGTCCTTGCA 3’(SEQ ID NO：6)

探针序列：5’FAM-CACCGCGTCAACTTCCCACGCT 3’-TAMRA(SEQ ID NO：7)

部分实验结果见下表和图3。

Q-PCR部分结果

样本RX编号	病理诊断	MT/N比值
样本RX编号	病理诊断	MT/N比值	RX-T-F-0041	食管鳞状细胞癌	51.77832917
RX-T-F-0042	食管溃疡型鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为33.9	RX-T-F-0041	食管鳞状细胞癌	51.77832917
RX-T-F-0042	食管溃疡型鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为33.9	RX-T-F-0045	食管菌伞型鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为33
RX-T-F-0179	食管溃疡型鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为37	RX-T-F-0045	食管菌伞型鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为33
RX-T-F-0179	食管溃疡型鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为37	RX-T-F-0005	肺鳞状细胞癌	35.30533646
RX-T-F-0002	肺鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为31	RX-T-F-0005	肺鳞状细胞癌	35.30533646
RX-T-F-0002	肺鳞状细胞癌	N未检出，MT CT值为31	RX-T-F-0150	肺低分化鳞形细胞癌	N未检出，MT CT值为31

N：正常组织；MT：肿瘤组织。

CT：荧光信号达到阈值的PCR循环数。

从上述结果的MT/N比值可以看出，RX218基因或者在食管、肺鳞状细胞癌的表达较之正常组织明显增高；或者在其正常组织不表达，特异性的表达于食管、肺鳞状细胞癌。从Q-PCR扩增曲线可以看到，肿瘤组织的扩增曲线在30个循环后有明显的上升趋势，而相应的正常组织无此变化。这同样说明RX218基因在食管、肺鳞状细胞癌中的表达增高，与相应正常组织的差异显著(图3)。

实施例5、筛选与RX218相互作用的蛋白

在本实施例中，采用Clontech公司的Gal4酵母双杂交系统进行筛选，确定与RX218具有相互作用的蛋白。方法如下：将测序验证的RX218基因通过SfiI克隆位点穿梭转移到改造过的融合质粒pGBKT 7载体(购自Clontech公司，参见US6770446，US6376652)上，以此作为诱饵(bait)，先后通过转化法(transformation)和点阵法(mating)对Hela、淋巴和胎脑文库进行大规模的筛选。

结果，这两种方法均获得了P16阳性克隆。这表明，RX218与P16蛋白有相互作用。

实施例6、验证RX218与p16的相互作用

由于酵母双杂交系统本身可能产生假阳性，因此利用免疫共沉淀技术(Coimmunoprecipitation，Co.IP)进一步在哺乳动物细胞中验证RX218与P16的作用关系。

用常规方法在pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位点中添加SfiI位点，在分别将flag-tag和myc-tag引入SfiI位点N端，获得分别带有上述tag的pcDNA3.1载体。将PCR扩增的RX218(实施例2)和P16基因通过SfiI位点分别克隆入已构建好的带有flag-tag和myc-tag的pcDNA3.1真核表达载体。然后，用上述重组载体转染常规的293T细胞。培养24小时后，离心收集细胞，加细胞裂解液裂解后，离心收集上清上样。分别利用anti-flag、anti-myc的单克隆抗体(购自Sigma公司)，通过Westen-blot法检测RX218、P16蛋白的表达情况。

结果见图4。从图中可以看出，RX218和P16蛋白表达情况良好、表达量稳定。

然后，用anti-flag抗体和Protein G免疫沉淀后，共沉淀产物经SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维膜上，用酶标anti-myc抗体行蛋白免疫印迹杂交。可以看见RX218和P16之间存在着相互作用(图4，泳道2)。

由于P16基因在人类肿瘤中存在着高频率的改变，包括缺失和突变，为了明确RX218和不同P16的突变型的关系，本发明人又克隆了p16G101W，p16A100P，p16D74N等已被报道过的P16的病理突变型，同样在293T细胞进行转染和免疫共沉淀后发现，RX218和多个P16的突变型都有明显的相互作用，而且RX218和这些突变型的相互作用比野生型更强。这些结果提示，RX218可能是参与调节肿瘤的发生的一个重要基因。

实施例7、用体外磷酸化技术研究RX218的磷酸化作用

为了确定RX218确实具有激酶的活性，在本实施例中进行了RX218的体外自身磷酸化实验。

首先用常规的定点诱变法构建了RX218的ATP结合位点突变型RX218m(K41A)，即将SEQ ID NO：1第41位的Lys置换为Ala，从而使SEQ ID NO：2中的41位由K变为A。将RX218及其突变型RX218m都构建到带有Flag-tag的pcDNA3.1真核表达载体，转染293T细胞。培养24小时后，裂解细胞，收集上清。用带有anti-flag抗体的Protein G免疫沉淀后，取一半用于Western印迹法以鉴定RX218的表达；另一半用激酶反应缓冲液(20mM Tris/HCL pH＝7.4，150mMNaCl，10mM MnCl₂，50μM ATP，10mM MgCl₂)平衡，然后加入10μCiγ-³²P ATP，于30℃反应30min。加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃变性5min后，离心将样品加入15％ SDS-PAGE梯度胶电泳。电泳完毕，经干胶后，压X光片放射自显影。

结果显示RX218具有激酶的活性，能够自身磷酸化，而当将它的ATP结合位点突变之后，其激酶的活性也消失了(图5)。

实施例8、用FACS和免疫荧光等技术研究目标基因对细胞生理的影响

为了进一步明确RX218对细胞周期的作用，运用FACS技术在U2OS细胞中进一步研究RX218的过量表达是否对细胞周期有影响，并进一步明确与P16的关系。

在U2OS细胞(ATCC)中分别转染带有P16和RX218基因的pCDNA3.1真核表达载体，然后消化并固定细胞。当往6cm培养板的U2OS细胞中转染P16基因0.5ug时，可以看到明显的G1期的阻滞作用(图6-B：G1期从45.9％上升至69.7％)，共转RX218之后这一作用消失(图6-E)。相反，共转P16和RX218m(ATP结合位点突变型)(图6-F)则对p16的G1期的阻滞作用没有明显影响。这表明，RX218对P16活性有抑制作用，是P16的抑制剂。对应于图6的详细数据见下表。

RX218对P16活性的抑制作用

	A	B	C	D	E	F
	A	B	C	D	E	F	G1期	45.9％	69.7％	42.9％	45.8％	53.6％	63.8％
S期	38.8％	16.3％	41.1％	40.7％	34.9％	19.8％	G1期	45.9％	69.7％	42.9％	45.8％	53.6％	63.8％
S期	38.8％	16.3％	41.1％	40.7％	34.9％	19.8％	G2/M期	15.3％	14％	16％	13.5％	11.5％	16.4％

实施例9、兔抗RX218蛋白抗体的制备

取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。以1mg RX218蛋白样品(实施例6)加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在兔颈部多点注射。饲养半个月后，以1mg RX218蛋白样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状，再在兔颈部多点注射。一个月后，用1.5mgRX218蛋白样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。半个月后，再用1mgRX218蛋白样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。饲养半个月后，颈动脉取血，4℃静置过夜，2,000转离心3分钟。上层血清即为兔抗RX218蛋白抗体。

杂交结果显示，抗RX218蛋白抗体可与RX218蛋白与专一性地结合。

讨论

本发明人成功地克隆了RX218的全长cDNA，根据其cDNA分析，RX218编码的蛋白含有一个磷酸激酶的结构域。应用实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)，在多种肿瘤及其对应正常组织中检测RX218的表达情况。结果显示，RX218基因在食管、肺的鳞状细胞癌中表达明显增强，而在正常组织不表达或表达量很低。这提示，RX218基因在食管、肺鳞状细胞癌的特异性增高与这些肿瘤的发生、发展有一定相关性。

酵母双杂交和免疫共沉淀实验进一步证明，磷酸激酶RX218与p16确实具有直接的相互作用。

P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉实验室Kamb等发现的新抗癌基因，直接参予细胞周期的调控，通过抑制细胞周期蛋白质依赖激酶4、6(Cyclin dependent kinase，CDKE4和CDK6)使细胞周期阻滞于G1期，负调节细胞增殖及分裂，在细胞衰老、肿瘤发生等过程中都具有十分重要的作用。p16基因定位于染色体9P21，全长8.5kb，由2个内含子及3个外显子组成，编码16KD的蛋白。CDKs可能是调控细胞周期装置的核心，CDK4与细胞周期素(Cyclin)的复合体参予细胞周期G1-S转换的调控。p16蛋白抑制Cdk4活性，最终阻止细胞进入S期，一旦p16基因缺失、突变等导致功能丧失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖。因此，有人把p16比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会引起细胞恶性增殖、导致恶性肿瘤发生。

目前已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中检测出50％以上的p16基因纯合子缺失以及无义、错义、移码突变，表明p16基因以缺失、突变方式广泛参与肿瘤形成。作为细胞增殖的关键性负调控因子，对p16及其突变型的深入理解必将促进人类对自身健康和疾病的认识，有效拓宽治疗疾病的途径。然而迄今为止，p16的调控机制仍不清楚。它是如何调整起始转录的，有哪些上游调节因子调控p16的生物学活性，这些调节因子又是通过什么机制参与p16功能的调控，这些都成为对p16进一步研究中迫切需要解决的问题。本发明的新激酶RX218可能是信号转导通路中的重要分子，首次证明RX218基因在食管、肺鳞状细胞癌的mRNA表达有特异性增高，而且RX218与p16具有直接的相互作用，能够抑制p16所引起的G1期阻滞，这是一个令人鼓舞的结果。因此，对新激酶RX218的深入研究，可能为明确P16的激活及作用机制，进而开发出崭新的药物靶点，为人类战胜肿瘤、延缓衰老带来突破性进展。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海睿星基因技术有限公司

<120>磷酸激酶及其应用

<130>035694

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1104

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atggatgacg ctgctgtcct caagcgacga ggctacctcc tggggataaa tttaggagag 60

ggctcctatg caaaagtaaa atctgcttac tctgagcgcc tgaagttcaa tgtggcgatc 120

aagatcatcg accgcaagaa ggcccccgca gacttcttgg agaaattcct tccccgggaa 180

attgagattc tggccatgtt aaaccactgc tccatcatta agacctacga gatctttgag 240

acatcacatg gcaaggtcta catcgtcatg gagctcgcgg tccagggcga cctcctcgag 300

ttaatcaaaa cccggggagc cctgcatgag gacgaagctc gcaagaagtt ccaccagctt 360

tccttggcca tcaagtactg ccacgacctg gacgtcgtcc accgggacct caagtgtgac 420

aaccttctcc ttgacaagga cttcaacatc aagctgtccg acttcagctt ctccaagcgc 480

tgcctgcggg atgacagtgg tcgaatggcc ttaagcaaga ccttctgtgg gtcaccagcg 540

tatgcggccc cagaggtgct gcagggcatt ccctaccagc ccaaggtgta cgacatctgg 600

agcctaggcg tgatcctcta catcatggtc tgcggctcca tgccctacga cgactccaac 660

atcaagaaga tgctgcgtat ccagaaggag caccgcgtca acttcccacg ctccaagcac 720

ctgacaggcg agtgcaagga cctcatctac cacatgctgc agcccgacgt caaccggcgg 780

ctccacatcg acgagatcct cagccactgc tggatgcagc ccaaggcacg gggatctccc 840

tctgtggcca tcaacaagga gggggagagt tcccggggaa ctgaaccctt gtggaccccc 900

gaacctggct ctgacaagaa gtctgccacc aagctggagc ctgagggaga ggcacagccc 960

caggcacagc ctgagacaaa acccgagggg acagcaatgc aaatgtccag gcagtcggag 1020

atcctgggtt tccccagcaa gccgtcgact atggagacag aggaagggcc cccccaacag 1080

cctccagaga cgcgggccca gtga 1104

<210>2

<211>367

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Asp Asp Ala Ala Val Leu Lys Arg Arg Gly Tyr Leu Leu Gly Ile

1 5 10 15

Asn Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Ala Lys Val Lys Ser Ala Tyr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Lys Phe Asn Val Ala Ile Lys Ile Ile Asp Arg Lys Lys Ala

35 40 45

Pro Ala Asp Phe Leu Glu Lys Phe Leu Pro Arg Glu Ile Glu Ile Leu

50 55 60

Ala Met Leu Asn His Cys Ser Ile Ile Lys Thr Tyr Glu Ile Phe Glu

65 70 75 80

Thr Ser His Gly Lys Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Ala Val Gln Gly

85 90 95

Asp Leu Leu Glu Leu Ile Lys Thr Arg Gly Ala Leu His Glu Asp Glu

100 105 110

Ala Arg Lys Lys Phe His Gln Leu Ser Leu Ala Ile Lys Tyr Cys His

115 120 125

Asp Leu Asp Val Val His Arg Asp Leu Lys Cys Asp Asn Leu Leu Leu

130 135 140

Asp Lys Asp Phe Asn Ile Lys Leu Ser Asp Phe Ser Phe Ser Lys Arg

145 150 155 160

Cys Leu Arg Asp Asp Ser Gly Arg Met Ala Leu Ser Lys Thr Phe Cys

165 170 175

Gly Ser Pro Ala Tyr Ala Ala Pro Glu Val Leu Gln Gly Ile Pro Tyr

180 185 190

Gln Pro Lys Val Tyr Asp Ile Trp Ser Leu Gly Val Ile Leu Tyr Ile

195 200 205

Met Val Cys Gly Ser Met Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Lys Lys Met

210 215 220

Leu Arg Ile Gln Lys Glu His Arg Val Asn Phe Pro Arg Ser Lys His

225 230 235 240

Leu Thr Gly Glu Cys Lys Asp Leu Ile Tyr His Met Leu Gln Pro Asp

245 250 255

Val Asn Arg Arg Leu His Ile Asp Glu Ile Leu Ser His Cys Trp Met

260 265 270

Gln Pro Lys Ala Arg Gly Ser Pro Ser Val Ala Ile Asn Lys Glu Gly

275 280 285

Glu Ser Ser Arg Gly Thr Glu Pro Leu Trp Thr Pro Glu Pro Gly Ser

290 295 300

Asp Lys Lys Ser Ala Thr Lys Leu Glu Pro Glu Gly Glu Ala Gln Pro

305 310 315 320

Gln Ala Gln Pro Glu Thr Lys Pro Glu Gly Thr Ala Met Gln Met Ser

325 330 335

Arg Gln Ser Glu Ile Leu Gly Phe Pro Ser Lys Pro Ser Thr Met Glu

340 345 350

Thr Glu Glu Gly Pro Pro Gln Gln Pro Pro Glu Thr Arg Ala Gln

355 360 365

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(38)

<223>引物

<400>3

ggccaatccg gccatggatg acgctgctgt cctcaagc 38

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>引物

<400>4

ggcctctaag gcctcactgg gcccgcgtct ctgg 34

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>5

tcaagaagat gctgcgtatc ca 22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>6

tgtggtagat gaggtccttg ca 22

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>探针

<400>7

caccgcgtca acttcccacg ct 22

Claims

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，它选自下组：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质，或其具有激酶活性的保守性变异蛋白质、活性片段、或活性衍生物。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的蛋白。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中1-1101位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(a)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

9.一种能与权利要求1所述的蛋白质特异性结合的抗体。

10.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白质以及药学上可接受的载体。