CN1711108A - 用于免疫球蛋白Fab片段选择性和定量官能化的方法、由其获得的缀合化合物及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了免疫球蛋白Fab片段和赋予诊断或治疗效用的分子实体之间的化学缀合物，其中Fab片段上仅有的缀合位点是由所述Fab片段的链间二硫键的选择性和定量还原所得的一个或两个巯基基团，且其中所述赋予诊断或治疗效用的分子实体具有至少一个游离巯基反应基团，其特征在于分子实体与Fab片段的缀合化学计量摩尔比在0.95到1.05的范围内或者在1.95到2.05的范围内。本发明也提供了用于制备所述缀合物的方法及其药物组合物。

Description

用于免疫球蛋白Fab片段选择性和定量官能化的方法、 由其获得的缀合化合物及其组合物
发明领域
本发明涉及免疫球蛋白Fab片段(Fab)的缀合物，其中所述Fab仅在该分子预定的特定期望位点上被定量和选择性地官能化。
本发明也涉及用于实现所述选择性和定量官能化的方法，以及包含所述缀合物的药物组合物。
发明背景
单克隆抗体(mAb)为具有众所周知的在体外和体内定位于暴露它们所特异针对的抗原的细胞或组织的能力的蛋白质。这种特性在它们一些众所周知的蛋白水解片段中得以维持，如Fab、Fab′和F(ab′)2。特别是免疫球蛋白Fab片段(下文也是复数，简单地称之为Fab)维持了这种特性。
众所周知，不同类型的诊断或治疗分子或其前体可共价连接于mAb或其片段。其中连接的诊断或治疗分子不干扰与靶抗原结合能力的那些缀合物能够运输分子从而将其靶向携带抗原的细胞和组织，这里它可发挥其目的用途，例如象诊断信号的产生或治疗性细胞杀伤。
Fab片段作为诊断或治疗制剂尤为重要，因为它们比完整的免疫球蛋白或它们的一些其它片段如F(ab′)2更小。小提高了其穿过血液进入组织间隙的速率，在这里它们多数找到其靶标。这也提高了其在组织间隙中的扩散率，由此促进和加快了其到达靶位以及所述位点上未结合分子的消失。而且，这提高了其排泄速率，从而有利于减少非特异性背景效应。
仅在最小程度上比Fab片段更大的为Fab′片段。这些是通过还原连接两重链的二硫桥而由F(ab′)2片段获得的，且需要通过化学修饰游离的巯基而稳定化。
用于将合适的诊断或治疗分子缀合到mAb及其各种片段上的许多方法已有描述。典型地，缀合分子在各种位点修饰mAb或其片段，包括干扰与抗原结合的有些位点。与抗原结合的重大丧失通常可通过缀合分子与蛋白的低化学计量比实现。特别是对于放射诊断目的，有时基本上低于1的化学计量比是可接受的，尽管并非总是如此。当其可接受时，解释一方面见于抗原位点数目相对于mAb或其片段数目的提高是满意的信号发生所必需的，而另一方面见于mAb或其片段浓度的提高并无有害的药理学活性的事实。在这些特殊情况下，过量未标记的mAb或其片段并不显著干扰其放射性标记的缀合物的结合，而且，由信号发生的观点看，它们是不活跃的。
相反，当抗原位点数目极低时，或者当mAb或其片段具有有害的药理学活性时，高度优选多数或所有mAb或片段被放射性标记。
对于升高比例的、优选全体mAb或片段被放射性标记的需求在放射疗法的情况下尤其突出。在这种情况下，抗原结合位点的数目几乎总是限制治疗效果。当必需包含在内的mAb或其片段具有有害的药理学活性时，同样的需求也成立。在这些情况下，需要避免未标记的mAb或片段占据任何位点。
缀合分子与蛋白升高的化学计量比可通过例如化学修饰游离氨基基团(氨基末端α-氨基基团和赖氨酸的ε-氨基基团)或者游离羧基基团(羧基末端α-羧基基团以及天门冬氨酸和谷氨酸分别的γ-、δ-羧基基团)而容易地实现。不幸地，多数时候这伴随着大量比例的不再与抗原结合或与之较差结合的缀合物的产生。当放射性标记时，此类缀合物给诊断操作增添噪音而非信号，并且给治疗方案增添辐照负荷而不见相伴的治疗益处。而且，所述的化学缀合法对所选的蛋白位点是非特异性的，因此不可用于获得这样的终产物，即其中蛋白或蛋白片段上缀合位点的数目和/或类型已知且被很好地限定。相反地，缀合在多个反应性且较差限定的位点上随机发生。结果，缀合产物的化学计量关系，即诊断/治疗成分与蛋白/蛋白片段的摩尔比也导致被较差地限定。充其量仅能够测量缀合分子与蛋白的平均化学计量摩尔比，以及能够估计某些氨基酸残基的占据分数。实际的终产物一般由复杂的、较差限定的各色各样取代化合物的混合物组成，这些化合物中每一个都具有其化学计量的取代。此类缀合产物混合物的临床应用与有关经典药物制品的标准不符。因此健康管理机构要求化学上被较好限定的涉及免疫球蛋白和/或其片段的缀合物。
此类产品，即使是高度急需的，迄今尚不可行，因为通过现有的手段，它们以低产量获得，而且需要昂贵且工业上不实用的分离方法。因而高度期望发现允许诊断或治疗分子与mAb或其片段在化学计量比的至少一个、并且仅在很好限定的不干扰与抗原结合的位点上缀合的方法。本发明提供了优选就Fab片段而言的该问题的解决方法。
Fab片段含有四个多肽链内二硫桥和一个多肽链间二硫桥。所述单个链间二硫桥位于靠近两条多肽链羧基端之处，即位于与分子上负责抗原结合的位点相对的一端。该位点上的化学修饰因此预期对与抗原的亲和力具有最小限度的影响。因此，实现能够仅对所述链间二硫键选择性官能化、而留下其它四个链内二硫键以及分子中其它可能的活性基团不动的方法，对于获得高度纯的且在结构上很好限定的化合物最为重要。
蛋白中的二硫桥可被还原为成对的游离巯基基团。大多数时候，这伴随着将蛋白暴露于极大分子过量的小分子量巯基化合物，例如象巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸或谷胱甘肽。在这些条件下，在小分子量巯基化合物之间形成二硫键，而蛋白二硫桥被还原为游离的巯基基团。很难在反应终止时消除过量的还原性巯基化合物及其氧化产物而不导致蛋白的巯基基团再次地实质上重新氧化为二硫桥。因而，通常，当期望蛋白巯基基团随后的巯基特异性化学修饰时，在过量小分子量巯基化合物及其氧化产物的持续存在下加入修饰剂。由于反应混合物中的所有巯基基团，即位于蛋白上的那些以及位于小分子量巯基化合物上的那些，都经历相同的与修饰剂的反应，后者必需相比于蛋白巯基基团的数目大为过量地、事实上相比于小分子量巯基化合物的巯基基团稍微过量地添加。当利用昂贵的修饰剂时，从工业角度看，这类进程致使不实际。而且，此类条件难以完全标准化，并且最糟的是，并不能在感兴趣蛋白或蛋白片段期望的巯基基团上获得特异性且化学计量上很好限定的修饰，而留下其它基团不动。换言之，这类反应至少部分地涉及蛋白的所有二硫基基团，并且有时也涉及该蛋白的其它活性基团，从而产生随机反应和未反应的巯基基团的混合物。
本发明主要聚焦于涉及Fab片段的缀合物，实质上是因为其大小。
正如已提及的那样，存在许多文献，也包括专利和专利申请，涉及免疫球蛋白及其片段与合适的诊断或治疗成分的缀合物的制备。实际上没有一篇所述文献解决或给出有用的建议用于解决需要向患者给药含已仅在分子期望的特定位点上选择性和定量官能化、从而表现出预定的、精确的取代化学计量关系的Fab片段作为活性成分的药物制剂的问题。
例如，EP-A-131836公开了通过用过量巯基乙醇、二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇还原多个链间二硫键、进而烷基化所得的巯基基团获得的S-烷基化的人免疫球蛋白(IgG)的Fab或Fc片段。然而，所公开的方法不允许对抗体片段上缀合的化学计量关系进行精确控制，从而产生各种可能产物的复杂混合物。而且，过量还原剂使得使用大为过量的烷基化剂成为必需。
US 5,612,016中公开了相似的方法，并且仅仅应用于完整IgG或F(ab′)2片段。二硫基的还原用过量硫醇衍生物进行，并且能够涉及不止一个二硫基基团。终缀合物可能每一抗体或F(ab′)2片段含至少一个配基，但等同地允许不同的比率。未见报道提及精确、很好限定的缀合化学计量关系以及缀合的精确位点。在这种情况下，也需要大为过量的烷基化剂，以克服过量的还原剂。
US 5,274,119证明用二硫苏糖醇选择性还原F(ab′)2片段的链间二硫桥，仅在极为严格控制的条件下有可能，如pH＝7。而且随后在GF-250HPLC柱上的纯化是强制性的。这意味着该法不能在工业规模上应用，并且至少有些游离巯基基团重新转化为二硫键。
通过由还原二硫桥得到的游离巯基基团与巯基基团的不同修饰剂的反应获得的抗体或其片段的其它缀合物公开在EP-A-453082、US4,741,900、EP-A-417927、EP-A-023779、EP-A-332022、EP-A-453082、EP-A-277088、US 5,082,930中。然而，所有这些文献一般地公开了产生未限定结构的产物混合物的化学；其中没有一篇允许或公开、或直接或间接地教导制备特异性取代的以预设和实质上受控的缀合化学计量关系为特征的缀合物。
新近，在Bioconjugate Chem，2001，12，178-185中，描述了通过使用2-巯基乙醇进行二硫键还原的Fab片段。显示了在C-末端巯基基团上修饰的Fab的图解说明。然而，所述还原作用每分子Fab引入3.67个硫醇基，从而即使在这种情况下，也产生不良限定的缀合化学计量关系的缀合物。这进一步证实使用硫醇衍生物作为还原剂不构成获得Fab片段期望的选择性还原以及相应化学计量上良好限定的缀合需求的解决之道。
在Fab片段的情况下，其带有抗原结合位点，研究者强烈地察觉到仅在C-末端巯基基团上选择性缀合的问题，但其不能通过用于完整免疫球蛋白的方法来解决。尽管存在这种明显的需求，迄今尚未描述过能够特异性和定量地将缀合反应仅定向于不参与稳定多肽链折叠的巯基基团，即衍生自链间二硫键的两个巯基的其它方法。
使用特定的膦衍生物如三丁基膦和三-(羧乙基)膦(TCEP)作为蛋白质中二硫键的还原剂已在许多论文中公开：例如在Methods in Enzymol.1977，47，116-122、J.Org.Chem.1991，56，2648-2650；Eur.J.Nucl.Med.1995，22，690-698、Biophisical Journal 1998，74，A179，abstr.Tu-Pos196、Faseb Journal 1997，11，A1361，abstr.2948、Eur.J.Nucl.Med.1999，26，1265-1273、Anal.Biochem.1999，273，73-80；Protein Science，1993，2，1749-1755；不过，从未提示过所述膦制剂为Fab及Fab′片段中链间二硫键可能的选择性还原剂。
不论现有技术的一般教导如何，我们目前令人惊讶地发现有可能容易地且以满意的产量来制备Fab片段与诊断或治疗剂、或其有用前体的缀合物，其在很窄的误差限度内以准确的缀合化学计量关系为特征，即表现出1∶1或2∶1的制剂与Fab的缀合摩尔比，其中Fab仅在Fab预定位置上的一个或两个特定巯基基团处选择性官能化，即由链间二硫键的选择性还原得到的那些巯基。
发明概述
在第一个优选的实施方案中，本发明提供了免疫球蛋白Fab片段和赋予诊断或治疗效用的分子实体之间的化学缀合物，由此Fab片段上仅有的缀合位点是由所述Fab片段的链间二硫键的选择性和定量还原所得的一个或两个巯基基团，且其中所述赋予诊断或治疗效用的分子实体具有至少一个游离巯基反应基团，其特征在于分子实体与Fab片段的缀合化学计量摩尔比在0.95到1.05的范围内或者在1.95到2.05的范围内。
发明详述
缀合物是这样获得的，即通过仅选择性和定量还原Fab片段的链间二硫键、然后通过与具有至少一个游离巯基反应基团且提供治疗或诊断效用的第一分子实体反应而定量官能化所获得的两个巯基基团中的一个，然后，如期望，用具有至少一个游离巯基反应基团并赋予诊断或治疗效用的第二分子实体也定量官能化Fab的另一巯基基团，所述第二成分与第一个完全相同或者甚至不同，这种情况下可能也产生不同的诊断或治疗特性。
备选且优选地，在链间二硫键还原之后，有可能通过直接使所述还原的Fab片段与化学计量上过量的所述缀合成分之一反应而定量地获得对称双缀合产物。
如本文所用，术语“定量官能化”意味着终缀合化合物表现出：
a)当还原Fab的两游离巯基基团中仅有一个缀合时，缀合分子实体与Fab片段之间的摩尔比在0.95到1.05的范围内，
b)当两巯基基团非对称或对称地都缀合时，缀合分子实体与Fab片段之间的摩尔比在1.95到2.05的范围内。
在仅有一个由Fab链间二硫键选择性和定量还原所得的巯基基团期望作为缀合基团的情况下，另一个巯基基团可保持作为游离巯基基团，或者，可依次由封闭基团官能化。该封闭基团优选包括不赋予诊断或治疗效用的化学成分，其中所述化学成分优选从硫醇基的保护基或小的烷基化剂或芳基化剂中选择。
并非由此限制本发明的概括性，具有巯基反应基团并赋予诊断或治疗效用的第一分子实体优选的实例包括合适的放射性核素螯合剂或螯合物的衍生物、顺磁性金属离子或发光金属离子、发色的荧光或磷光分子、生物素分子、被独特的抗体或其片段所识别的半抗原、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白分子、治疗性药物、整合到脂质体中的具亲脂链的分子实体、磷脂稳定化的微泡、基于甘油三酯或聚合物的微球体、携带诊断或治疗制剂的微球。所述第一成分可进一步包括一个或多个官能团，其本身或在去保护后或在化学修饰后可用作为选择性连接等同于或不同于第一Fab片段的第二Fab片段或者赋予诊断或治疗效用的第二分子实体的靶标。
并非由此限制本发明的概括性，合适的巯基反应基团优选的实例包括碘乙酰基、溴乙酰基、乙烯基或马来酰亚胺基团，或者多氟苯或二硝基氟苯衍生物。如果期望，可通过与另一含二硫基的分子反应并形成混合二硫基而获得可逆连接。
第二分子实体可与第一个相同，或者它可以不同，从而提供不同残基、以及有可能是不同诊断或治疗效果、或者甚至是混合诊断和治疗用途的组合。
具有巯基反应基团并赋予诊断或治疗效用的所述第二分子实体优选的实例包括合适的放射性核素螯合剂或螯合物的衍生物、顺磁性金属离子或发光金属离子、发色的荧光或磷光分子、生物素分子、被独特的抗体或其片段所识别的半抗原、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白分子、治疗性药物、整合到脂质体中的具亲脂链的分子实体、磷脂稳定化的微泡、基于甘油三酯或聚合物的微球体、携带诊断或治疗制剂的微球。所述第二成分可进一步包括一个或多个官能团，其本身或在去保护后或在化学修饰后可用作为选择性连接等同于或不同于第一Fab片段的第二Fab片段或者赋予诊断或治疗效用的第二分子实体的靶标。
甚至在这种情况下，合适的巯基反应基团优选的实例包括碘乙酰基、溴乙酰基、乙烯基或马来酰亚胺基团，或者多氟苯或二硝基氟苯衍生物。如果期望，可通过与另一含二硫基的分子反应并形成混合二硫基而获得可逆连接。
Fab片段通过已知的方法获得：尤其优选使用rFab，即通过重组DNA技术获得的Fab。
根据另一优选的实施方案，本发明提供了用于制备所述缀合物的方法，所述方法包括：
a)选择性和定量还原Fab片段的链间二硫键，以产生两个游离巯基基团；
b)用具有至少一个游离巯基反应基团且赋予诊断或治疗效用的分子实体将来自步骤a)的一个或两个巯基基团定量官能化，以产生单缀合或双缀合化合物，所述双缀合物源自于巯基基团的对称或非对称官能化。
如上文所公开的那样，许多可用于还原二硫键的还原剂是已知的，但是，在本案中，需要特定的试剂和特定的反应条件以便仅仅定量还原Fab片段的链间二硫键，而留下其它二硫键不受影响。也就是说，本领域众所周知用于二硫键的还原剂可选自硼氢化物、氰基硼氢化物、膦、硫醇化合物、二价锡离子、抗坏血酸和连二亚硫酸盐。然而，迄今它们中没有一个已被公开作为用于Fab片段链间二硫键的特异性还原剂。
出乎意料地，膦高度有希望触及该领域，尤其是三丁基膦和三-(羧乙基)膦。最后一个，下文简短地以首字母缩写TCEP称呼，产生了所选的还原剂，令人惊讶地允许实现期望的仅Fab片段链间二硫键的定量和选择性还原，同时留下其它四个-S-S-链内键不受影响。该目标通过使用控制的工作条件以及较之于其它可能的还原化合物相当低过量的还原剂实现。而且，通常不发生与缀合成分的相互作用，因此也有可能在接下来的缩合步骤期间限制缀合成分的过量。结果，使用更少的反应物，形成更少的副产品，不存在对还原的Fab片段进行中间纯化的需求，获得了更高产量的更纯、更易于纯化的终化合物。
本发明的选择性和定量还原发生的优选建立的实验条件在下文简略地概述，并在实验部分进一步详述。
在根据实施例1和3的教导在缓冲条件下(提供期望的pH范围的每一类缓冲剂等同地可用)混合起反应的物质后，获得了具有如下特征的终缓冲水性反应溶液：
Fab浓度：    1-100μM，优选1.5-10μM，最优选2-5μM；
膦浓度：     0.1-10mM，优选0.5-5mM；
缓冲溶液pH： 在4和8之间，优选在5和7之间；
反应时间从5到180分钟，优选从25到70分钟的范围内变化；
反应温度保持在自4到45℃，优选自25到40℃。
缩合反应通常在二硫键还原结束后即刻在同一反应介质中通过添加期望缀合分子实体的缓冲水溶液进行，而无需事先纯化还原的Fab片段。
优选建立的缩合条件在实验部分实施例1、4和6中详细公开。终缓冲水性反应溶液(提供期望的pH范围的每一类缓冲剂等同地可用)优选具有如下特征：
Fab浓度：       2-5μM；
膦浓度：        0.5-5mM；
缀合成分浓度：  0.1-100mM；
缓冲溶液pH：    在5和7之间；
反应时间优选≥30分钟；
反应温度保持在自4到45℃，优选自20到40℃。
为了证实本发明的缀合物性质、尤其是缩合反应的化学计量关系的目的，我们缀合了重组抗-单纯疱疹病毒Fab片段(根据：Cattani P，Rossolini GM，Cresti S，Santangelo R，Burton DR，Williamson RA，Sanna PP.Fadda G；J Clin Microbiol.1997 Jun；35(6)：1504-9.″Detection and Typing of Herpes Simplex Viruses by UsingRecombinant Immunoglobulin Fragments Produced in Bacteria″制备)，如实施例1中所公开的那样，由β-马来酰亚胺丙酸通过使用本发明的方法在链间二硫键处选择性还原。最后这个分子向游离巯基基团添加了羧酸酯残基，从而使得通过使用简单的离子交换层析法测量缀合分子的数目和类型成为可能。
烷基化反应在二硫键还原结束后即刻在同一反应介质中进行，而无需纯化还原的Fab片段。
所述烷基化反应如实施例1中所充分公开的那样在本发明优选建立的条件下进行。
在反应终止时，有可能计算所添加的羧酸酯基团的总数目，在这种情况下证实两个游离巯基基团都经历了缀合反应，正如也在图1中所示的那样。
反应条件可根据各种硫醇反应分子实体的反应性、根据其分子量和位阻、根据期望的终化合物(单缀合或双缀合、对称或非对称)而变，并且如果省略还原步骤的话，控制不发生侧向反应通常是可取的(这证实仅仅由Fab的单个链间二硫桥还原所得的两个巯基基团与缀合成分反应了)。
尤其优选不事先分离过量的还原剂而进行烷基化反应，因为链间二硫键可容易地重新形成。
本发明的缀合化合物尤为有利，这是因为：
预设控制的缀合化学计量关系极大地降低了终化合物中残留杂质的百分比，所述杂质可能是无活性的或抑制性的，或者甚至是毒性的；
产物容易表征，且为向卫生当局药物注册的目的可描述特征；
制备产品的过程相对容易，具有好的产量，并且可在工业规模上应用；
终诊断或治疗化合物或其前体的纯化简单，因为这意味着分离主要含具有0、1或2个取代基的产物的混合物，所述混合物极大地富集仅其中之一；
缀合成分专一地位于Fab重链和轻链的羧基末端附近，因此它们不太可能干扰抗原识别位点，所述位点是由靠近多肽链氨基端部分的残基构成的；
Fab的初始构象得以维持。
根据本发明的Fab缀合物通常将针对具有治疗或诊断意义的抗原，如针对肿瘤抗原、受体、组织标记、特定病理学、感染、炎症、退行性变过程等的标记。
因此，根据另一优选的实施方案，本发明也提供了含所述缀合物作为活性成分的诊断和/或治疗组合物。
为了期望的诊断或治疗应用，本发明的缀合化合物将配制为合适的组合物，通常为用于肠胃外给药的悬液、溶液或乳剂、用前重构的冻干品形式，或者甚至为适合于其它期望的不同给药类型的其它药物组合物的形式。剂量将取决于若干参数(配基种类、患者病情)，但通常在诊断应用的情况下，将在每单次给药从0.1到10mg缀合物的范围内，并且在治疗应用的情况下，将在每单次给药从10到500mg缀合物的范围内。
本发明的缀合化合物也因其体外应用而尤其有利，由此它们表现出其效用，优选的是应用于体外免疫化学试验的时候。
本发明等同地适用于Fab′片段，该片段如以前所提及的那样，具有类似于Fab的结构，且尺寸上比其大得不多。
附图说明
图1显示了实施例1的rFab与β-马来酰亚胺丙酸之间的反应混合物的阳离子交换HPLC分析。在所有的操作轮中，在5分钟前洗脱的峰是归因于在215nm吸收的盐和反应物。
A)为完全反应混合物，含TCEP和β-马来酰亚胺丙酸；
B)为初始未反应的rFab溶液；
C)为不完全反应混合物，不含TCEP，但含β-马来酰亚胺丙酸。
A)显示初始rFab已完全反应，产生独特的缀合化合物。质谱(MS)分析证明获得了双取代的产物。所用质谱为MALDI-TOF-MS型(Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionozation Time-Of-FlightMass Spectrometry)。
B)显示了实施例1的初始rFab，其包括rFab和由单脱酰胺化的rFab组成的次要组分/杂质；
C)显示反应是特异性的，并且不存在还原剂时不发生。
图2显示了基本上不含脱酰胺化形式的rFab在与实施例2的D化合物彻底缀合前(上图)和后(下图)的HPLC阳离子交换分析，对应于图3的泳道3和4。该图显示由于缀合，主峰位移到较低的保留时间，并且一旦除去试剂，制剂的纯度类似于起始rFab的纯度(3分钟左右空体积时的峰归因于试剂)。
图3显示rFab制剂在与实施例2的D化合物彻底烷基化前后的天然电泳。反应混合物未经任何纯化步骤而进行分析。与D化合物反应后迁移距离的下降证实连接了明确数目的带负电基团。MALDI-TPOF MS分析证实获得了双取代的产物。
1.rFab(prep.1)
2.与D化合物缀合的rFab(prep.1)
3.rFab(prep.2)
4.与D化合物缀合的rFab(prep.2)
5.rFab(prep.3)
6.与D化合物缀合的rFab(prep.3)
通过参照下列非限制性的实施例进一步详细阐释本发明。
实施例1
β-马来酰亚胺丙酸对重组抗-单纯疱疹病毒Fab的还原和烷基化
建立了模型反应体系以便测试几种反应条件，并容易地表征反应产物。选择商业上可获得的赋有可离子化基团的马来酰亚胺衍生物-β-马来酰亚胺丙酸(下面通式I的化合物)作为模型化合物，这允许通过简单的离子交换层析分析连同MS分析来评估缀合成分的数目。
Figure A20038010320800171
优化的操作如下：
通过0.5M商业产品(Pierce)在彻底脱气的含50mM Tris-HCl，5mM EDTA pH＝7.0的缓冲液中进行1比250的稀释来制备1体积V的2mM TCEP溶液。然后，将该溶液添加到等体积V的10μM题述rFab溶液(根据先前提及的Cattani P等参考文献制备)，并于37℃温育30分钟。然后，添加V/2体积的溶于pH＝5的0.1M醋酸缓冲液中的50mM β-马来酰亚胺丙酸，并使反应混合物在37℃保持1小时。在此时间点，反应完全，并且如果需要，可通过常规的分离操作除去过量的反应物，象透析或凝胶过滤。
为了分析的目的，将样品注射到阳离子交换HPLC柱中，并用盐梯度洗脱。在WP Carboxy-sulfon柱(J.T.Baker)上使用从60到120mMpH5.8的磷酸缓冲液的15分钟梯度以1mL/min进行层析。在215nm进行检测。结果示于图1，并证明rFab被完全转化为具有2个更多的负电荷的均质产物(图1A)，因而对应于双取代的衍生物。MS分析证实了双取代。未缀合的相同初始rFab示于图1B，连同8.8分钟处洗脱的小峰，该峰归因于rFab的单脱酰胺化形式，并且是仅相差1个电荷的rFab种类洗脱位置的有用标记。也对这一种类进行还原和烷基化，并产生图1A中6.38分钟处洗脱的相应双取代衍生物。图1C显示了其中省略了还原步骤即未添加还原剂TCEP的反应混合物的内含物。相对于图1B未缀合的rFab而言，未修饰的洗脱谱证明烷基化是对硫醇基团特异性的，并且如果二硫键完整则不发生。
实施例1的rFab，在选择性还原链间二硫键之后，与二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)新颖的马来酰亚胺衍生物进行反应，它是众所周知且广泛使用的证明具有诊断和治疗效用的螯合剂(实施例2的D化合物)，以产生缀合产物。
实施例2
N2，N2-二[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]-N6-[4-(2，5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代丁基]-L-赖氨酸(D化合物)的合成
题述的化合物遵循下文的两步方案由A化合物(其根据″Anelli，P.L.等；Bioconjugate Chem.1999，10，137-140″制备)起始合成：
第一步：
于-15℃在氮气下将氯甲酸异丁酯(15mmol)滴入到商业来源的4-马来酰亚胺丁酸(B化合物；13.6mmol)和三乙胺(15mmol)的四氢呋喃溶液(55mL)中。15分钟后，向其中滴入如以前所公开的那样制备的A化合物(13.6mmol)的四氢呋喃溶液(20mL)，同时使温度保持在-4℃。15分钟后中断冷却，并在室温下搅拌混合物1小时，然后在真空下蒸发。将残余物溶于乙酸乙酯(50mL)中，然后用水洗涤。然后在硫酸钠上干燥有机相、过滤并在真空下蒸发。
残余物通过在乙酸乙酯/石油醚混合物中行快速层析纯化，以获得黄色油C化合物(产率：8.12mmol，相当于60％)。分析数据与期望的结构相符。
第二步：
向C化合物(6.25g，6.86mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)中添加三氟乙酸(68.6mmol)。15小时后，溶液在真空下蒸发，并将残余物吸收于另外的10ml三氟乙酸中。6小时后，混合物再次蒸发，将残余物吸收于50mL水中，在Amberlite XAD 16.00T柱上用水/乙腈混合物纯化，并对相关级分进行蒸发，以获得白色固体D化合物(59％的产率)。分析数据与提出的结构相符。
实施例3
rFab链间二硫基的选择性还原
1体积V实施例1的10μMrFab溶液的还原用等体积V溶于pH＝5的100mM醋酸缓冲液的5mM TCEP溶液于37℃进行1小时。用前通过向缓冲剂鼓入氮气而从反应介质中除去尽可能多的氧气。在这些条件下，链间二硫基的还原基本上是完全的，如通过SDS-PAGE分析所观察到的那样。不过，rFab构象未丧失，如通过除去还原剂并在0.1MTris-HCl pH＝8中温育还原的rFab 2小时，则链间二硫基再次形成的事实所证明的那样。该事实极为重要，意味着终产物将维持识别抗原反应活性位点的能力。
实施例4
D化合物与还原rFab的双缀合
将作为实施例3特异性还原的结果形成的半胱氨酸与实施例2的D化合物直接在同一还原反应介质中通过简单地添加一半体积V/2的100mM D化合物的0.5M醋酸钠溶液(反应溶液的终pH大约为5)并于30℃温育16小时而进行缀合。在所述条件下，如图2所示，以定量的产率形成单一产物，报道了与D化合物缀合前(上部)后(底部)rFab的HPLC阳离子交换分析。
在WP Carboxy-sulfon柱(J.T.Baker)上使用15分钟的从60到120mM pH5.8的磷酸缓冲液梯度以1mL/min进行层析。在215nm进行检测。
终产物的MS分析证实了双缀合物的形成。
实施例5
还原rFab与D化合物双缀合物的表征
由于每个DTPA衍生物分子的引入都导致蛋白质总负电荷的增加，蛋白质电荷分析可用于评估制剂的均质性，即确保未形成与可变数目的DTPA衍生物的缀合物、进而产生不同化合物的混合物。电荷分析可通过电泳和层析技术进行。所用的电泳技术为天然电泳。根据该技术，蛋白迁移取决于分子量和电荷两者，然而，对于与C化合物缀合前后的还原rFab，蛋白质质量基本上是相同的，电泳运行的差异仅仅归因于由DTPA衍生物引入的电荷的差异。如图3所示，与D化合物缀合前后所分析的rFab三种制剂表现出相同的行为，即在缀合后朝阴极迁移距离的下降。同一分析证明缀合产物是均质的，且可再现。
实施例6
还原rFab与D化合物的单缀合
如实施例3所述选择性还原实施例1中rFab(1体积V的10μMrFab溶液)的链间二硫键，然后在大约5℃直接向同一还原反应介质中极慢地滴入半数体积V/2的0.5mM D化合物的0.5M醋酸钠溶液(反应溶液的终pH大约为5)，并由HPLC持续监测缩合。
单烷基化产物的形成通过在未反应的还原rFab和双缀合产物之间中间保留时间的增大的峰的出现显示。当该峰面积变得比其它两个产物更大时，终止反应，并通过层析纯化终混合物。MS分析证实主峰对应于单烷基化的化合物。

Claims (22)

1.免疫球蛋白Fab片段和赋予诊断或治疗效用的分子实体之间的化学缀合物，其中Fab片段上仅有的缀合位点是由所述Fab片段的链间二硫键的选择性和定量还原所得的一个或两个巯基基团，且其中所述赋予诊断或治疗效用的分子实体具有至少一个游离巯基反应基团，其特征在于分子实体与Fab片段的缀合化学计量摩尔比在0.95到1.05的范围内或者在1.95到2.05的范围内。
2.根据权利要求1的缀合物，其中由链间二硫键的选择性和定量还原所得的所述巯基基团的第一个通过与赋予诊断或治疗效用的所述分子实体之一反应而被定量地官能化。
3.根据权利要求2的缀合物，其中由链间二硫键的选择性和定量还原所得的所述巯基基团的第二个通过与赋予诊断或治疗效用的第二所述分子实体反应也被定量地官能化，所述第二分子实体与第一分子实体不同或相同。
4.根据权利要求1的缀合物，其中由链间二硫键的选择性和定量还原所得的两个所述巯基基团通过与化学计量过量的赋予诊断或治疗效用的所述分子实体之一反应而被定量对称地官能化。
5.根据权利要求1或2的缀合物，其中由链间二硫键的选择性和定量还原所得的所述巯基基团之一通过与不赋予诊断或治疗效用的化学成分反应而被化学修饰，所述化学成分优选从硫醇基团的保护基或者小的烷基化剂或芳基化剂中选择。
6.根据权利要求1至5的缀合物，其中赋予诊断或治疗效用的所述分子实体包括放射性核素的螯合剂或螯合物的衍生物、顺磁性金属离子或发光金属离子、发色的荧光或磷光分子、生物素分子、被独特的抗体或其片段所识别的半抗原、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白分子、治疗性药物、整合到脂质体中的具亲脂链的分子实体、磷脂稳定化的微泡、基于甘油三酯或聚合物的微球体、携带诊断或治疗制剂的微球。
7.根据权利要求6的缀合物，其中所述分子实体进一步包括一个或多个官能团，其本身或在去保护后或在化学修饰后可用作为选择性连接等同于或不同于第一Fab片段的第二Fab片段或者赋予诊断或治疗效用的第二分子实体的靶标。
8.根据权利要求1至6的缀合物，其中所述巯基反应基团包括碘乙酰基、溴乙酰基、乙烯基、马来酰亚胺基团或者多氟苯或二硝基氟苯衍生物。
9.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中Fab片段为重组Fab。
10.用于制备权利要求1至9的缀合物的方法，包括：
a)选择性和定量还原Fab片段的链间二硫键，以产生两个游离巯基基团；
b)用具有至少一个游离巯基反应基团且赋予诊断或治疗效用的分子实体将来自步骤a)的一个或两个巯基基团定量官能化，以产生单缀合或双缀合化合物，所述双缀合物源自于巯基基团的对称或非对称官能化。
11.权利要求10的方法，其中所述链间二硫键的选择性和定量还原是用膦进行的，优选为三丁基膦和三-(羧乙基)-膦。
12.权利要求11的方法，其中还原剂为三-(羧乙基)-膦。
13.权利要求11的方法，其中还原通过在提供具有如下特征的终缓冲水性反应溶液的缓冲条件下混合起反应的物质而进行：
Fab浓度：     1-100μM；
膦浓度：      0.1-10mM；
缓冲溶液pH：  4-8；
反应时间：    5-180分钟；
反应温度：    4-45℃。
14.权利要求13的方法，其中优选条件如下：
Fab浓度：     1.5-10μM或1-5μM；
膦浓度：      0.5-5mM；
缓冲溶液pH：  5-7；
反应时间：      25-70分钟；
反应温度：      25-40℃。
15.权利要求10的方法，其中所述步骤b)的定量官能化在还原步骤a)结束之后即刻在同一反应介质中通过添加缀合分子实体的缓冲水溶液进行，而无需纯化还原的Fab片段。
16.权利要求15的方法，其中终缓冲水性反应溶液具有如下特征：
Fab浓度：       2-5μM；
膦浓度：        0.5-5mM；
缀合成分浓度：  0.1-100mM；
缓冲溶液pH：    5-7；
反应时间：      ≥30分钟；
反应温度：      4-45℃或20-40℃。
17.N2，N2-二[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]-N6-[4-(2，5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代丁基]-L-赖氨酸作为中间化合物用于制备权利要求1的缀合物。
18.药物组合物，包含权利要求1至9的缀合化合物作为活性成分。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述缀合化合物配制为用于肠胃外给药的悬液、溶液、乳剂、用前重构的冻干品的形式。
20.根据权利要求18的诊断组合物，其中活性成分的剂量在每单次给药0.1到10mg缀合物的范围内。
21.根据权利要求18的治疗组合物，其中活性成分的剂量在每单次给药10到500mg缀合物的范围内。
22.根据权利要求18的组合物，用于体外的分析免疫化学试验。
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