CN1699409A - 人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用 - Google Patents

人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用 Download PDF

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CN1699409A CN 200510076909 CN200510076909A CN1699409A CN 1699409 A CN1699409 A CN 1699409A CN 200510076909 CN200510076909 CN 200510076909 CN 200510076909 A CN200510076909 A CN 200510076909A CN 1699409 A CN1699409 A CN 1699409A
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Abstract

本发明公开了人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用。本发明所提供的人富含甘氨酸蛋白的活性片段是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰且具有抗菌作用的多肽。该人富含甘氨酸蛋白的活性片段可作为抗菌肽，用于制备具有抗菌作用的生物药物。还可将上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段编码基因插入质粒作为核酸疫苗用于抗菌。本发明的人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其编码基因可广泛用于需要抗菌治疗及处理的不同领域。

Description

人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用
技术领域
本发明涉及人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用。
背景技术
抗菌素几乎与所有生物健康生存密切相关。抗菌素的发现，医治了大量致病菌感染个体，挽救了不计其数的生命，是人类生存第一需要的药物，发挥了巨大的社会经济效益。然而，近二十多年来，由于罕有新抗菌素家族的发现和由于抗菌素本身的特点及应用不当，抗药、耐药菌株快速产生，严重威胁生物体的健康，人类感染具有抗药性的金黄色葡萄菌而死亡的病例已有报道。
抗菌肽的应运而生将带来生物医药领域的一场革命。大量研究结果表明，抗菌肽是生物体天然免疫系统的重要组成成分之一，它们保证了生物体在充满感染源的环境中健康生存。至今，已在大量昆虫、两栖类动物、高等植物、高等动物乃至人类鉴定出700余种抗菌肽。研究发现，这些抗菌肽通常分子量较小，具有良好的热稳定性质，抗菌谱广，抗菌作用较强，对耐药菌有效且靶菌不易或不产生耐药性。抗菌肽作用机理的研究表明，它通过与细胞膜的相互作用，直接影响细胞膜的稳定性，进而使细胞膜形成裂孔，导致细胞内容物外泄而杀死细菌。这种杀菌机理赋予了其具有广谱抗菌作用的基础。抗菌肽的上述优点奠定了其在未来生物学界广泛应用的美好前景。部分抗菌肽还兼具抗病毒、抗原虫及抗肿瘤的作用，进一步扩展了抗菌肽的应用前景。因此，近十多年来，关于抗菌肽研究的学术论文数呈直线上升，多种抗菌肽已进入临床前研究，抗菌肽药物的面市已为期不远。
抗菌肽的研究尚不尽如人意，已发现的抗菌肽中，大多为非人源性，影响其发展成为生物药物的进程。部分抗菌肽具有较强的溶血作用，阻断了其成为生物药物的可能。寻找发现具有发展成为生物药物良好前景的抗菌肽已成为本研究领域的关键。
发明内容
人富含甘氨酸蛋白hL52的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰且具有抗菌作用的多肽。
序列表中的SEQ ID №：1是由19个氨基酸残基组成的多肽，名称为pCM-19，是人富含甘氨酸蛋白(序列3)的自氨基端的第42-60位氨基酸残基。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰。
所述富含甘氨酸蛋白的活性片段优选为具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽。
所述富含甘氨酸蛋白的活性片段可通过多肽合成仪合成，也可以通过生物工程技术如利用微生物表达获得，其中以酵母表达系统为优选。
上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因，以及含有上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因的表达载体、细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。
实验证明上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段可抑制革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阴性细菌鼠疫杆菌的生长，其抗菌作用机理为破坏细胞膜的完整性，并且无溶血作用，可作为抗菌肽，用于制备具有抗菌作用的生物药物。还可将上述人富含甘氨酸蛋白的活性片段编码基因插入质粒作为核酸疫苗用于抗菌。本发明的人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其编码基因可广泛用于需要抗菌治疗及处理的不同领域。
附图说明
图1A为转化了pET-22b(+)空载体的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线
图1B为转化了pET-22b(+)-UBF和pET-22b(+)-PTH的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线
图1C为转化了pET-22b-hL52的阳性克隆1和8的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线
图2A为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌BL-21生长的影响
图2B为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌HB101生长的影响
图2C为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌DH5α生长的影响
图3为pCM-19局部直接点样对大肠杆菌BL21菌生长的影响
图4为pCM-19多肽对大肠杆菌BL21生长的影响
图5为不同剂量pCM-19多肽与BL-21细菌菌落生成数之间的量效关系
图6为pCM-19多肽对减毒型鼠疫杆菌生长的影响
图7A为加盐水对照组30分钟的流式细胞仪分析测试结果
图7B为pCM-19与靶菌作用5分钟的流式细胞仪分析测试结果
图7C为pCM-19与靶菌作用10分钟的流式细胞仪分析测试结果
图7D为pCM-19与靶菌作用20分钟的流式细胞仪分析测试结果
图7E为pCM-19与靶菌作用30分钟的流式细胞仪分析测试结果
图8A-图8D为氨苄青霉素与pET22b(+)转化后获得氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BL21分别作用5、10、20和30分钟后PI着染细胞比例的变化
图8E-图8H为pCM-19多肽与pET22b(+)转化后获得氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BL21分别作用5、10、20和30分钟后PI着染细胞比例的变化
图9为不同剂量pCM-19对人外周血红细胞的溶血作用
具体实施方式
发明人利用抑制性差减杂交的方法，对LTC(long term culture)培养前后的小鼠骨髓基质细胞差异表达基因进行了大量筛选，获得了131个差异表达的EST克隆。生物信息学分析证实，这些克隆代表了26种已知或部分已知功能的基因和7条全新的基因，其中5条具有完整的开放阅读框架，3条已在GenBank注册，鼠源的mL52基因就是其中之一，该基因的全长cDNA序列521bp，其GenBankTM注册号为AY028425。相关内容参见《实验血液学杂志》2002第10期第177-182页。
在得到鼠源mL52后，发明人根据鼠源基因设计一对引物(5’引物Pa：5-CGATGCCGGTGGCCGTGGGTCCCT-3；3’引物Pb：5-TTAGCATCGTATGCCCATTCCA-3)，通过PCR扩增人胎肝cDNA文库，获得了人富含甘氨酸蛋白(hL52)同源基因序列，完整的ORF序列共240bp(序列2)，以及根据ORF序列推测的氨基酸序列(序列3)。发明人利用生物信息学手段对序列进行了详细分析：核酸序列比较结果显示hL52基因定位于人染色体20q11.21区域，由三个外显子组成，编码79个氨基酸的小分子蛋白；氨基酸序列分析结果表明，它具有明显的疏水区，提示该蛋白可能是一种分泌型蛋白或胞膜蛋白。
在获得具有编码完整ORF的hL52基因后，发明人将该基因(序列2)构建到原核表达载体pET-22b(+)中，得到含有序列2的人源基因的重组表达载体pET-22b(+)-hL52。再将pET-22b(+)-hL52转化到大肠杆菌BL2 1中，比较IPTG存在和不存在两种情况下细菌生长状态的变化。hL52基因在不加IPTG诱导剂时不表达，而只在培养液中加入IPTG诱导后才大量表达；进一步地，在诱导条件下，如果hL52不具有抗菌活性，则同样不会影响细菌生长；但是如果hL52具有抗菌作用，则会明显影响细菌生长；在诱导条件下，随着培养时间延长，IPTG不断消耗，hL52的表达逐渐停止，理论上此时细菌的生长应逐渐恢复。每隔45分钟测量OD600一次，共测量20次。以时间为横轴，OD600对数值为纵轴做生长曲线。转化了pET-22b(+)空载体的大肠杆菌BL21在0.5mMIPTG诱导和不诱导条件下绘制半对数生长曲线如图1A，转化了不具抗菌活性的无关基因pET-22b(+)-UBF(GenBank number：UBF-fl AF294842，中国应用生理学杂志，20：66，2004)和pET-22b(+)-PTH(GenBank NM000315)的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线见图1B，转化了待测的pET-22b(+)-hL52阳性克隆1和8的大肠杆菌BL21在0.5mM IPTG诱导和不诱导条件下的半对数生长曲线见图1C。结果表明单转空载体pET-22b(+)的菌株在加入和不加入IPTG两种情况下细菌的生长曲线基本吻合(图1A)；在单转两个已知不具有抗菌活性基因UBF和PTH的情况下，加入和不加入IPTG两种情况下细菌的生长同样不受影响(图1B)；但是，在转入含hL52基因的质粒后，加入和不加入IPTG两种情况下细菌的生长曲线明显不同，在加入IPTG的情况下细菌的生长明显受到抑制(图1C)；从图中还可以看出，随着培养时间延长IPTG消耗殆尽，细菌的生长又得以恢复，而其他测试基因都没有此现象。上述结果充分说明这种抗菌效应是hL52蛋白本身的作用。
在初步证实hL52基因具有抗菌作用后，发明人根据hL52基因的氨基酸序列，分段合成了不同长度的多肽，从蛋白水平直接证明hL52蛋白的抗菌作用和发现核心肽段。四条肽段的位置分别为hL52氨基酸序列的第31-46(pMG-16)，42-60(pCM-19)，53-59(pMT-7)，61-79(pMG-19)个氨基酸。所合成肽段的纯度为85-90％。上述肽段经用灭菌去离子水溶解后进行抗菌活性检测。采用的方法为Kirby-Bauer disk diffusion(David T.Kingsbury et al.Microbiology，2ndedition，ed by Harwal Publishing，1990，page 37)法。所采用的靶细菌为大肠杆菌BL21(图2A)，大肠杆菌HB101(图2B)和大肠杆菌DH5α(图2C)工程菌。图2A，图2B和图2C中标号1-5分别为pCM-19 32、64、128、256和512μg，标号6为pMG-19 512μg，标号7为pMG-16 512μg，标号8为pMT-7 512μg，标号9为氨苄青霉素512μg，标号10为溶剂对照。由图中结果可以发现，上述四种多肽溶液在浓度相同的条件下，对三种靶菌的作用类似，同浓度时不同多肽溶液的抗菌作用差别较大，其中pCM-19和pMT-7具有较强抗菌作用，pCM-19比pMT-7更强。
进一步，发明人采用多种方法对pCM-19进行了一系列分析。首先将pCM-19与大肠杆菌BL21在较小体积时先共同作用一段时间，然后加入LB培养液在37℃摇床培养3小时，测定OD600吸收值的改变。图4中结果显示，与单纯加LB培养液或补加溶剂组比较，pCM-19明显抑制了靶细菌的生长，与氨苄青霉素比效果略差。此外，在已经生长有大肠杆菌BL21的琼脂板上，直接将pCM-19滴在局部，观察该抗菌肽对细菌生长的影响。图3中标号1为氨苄青霉素30μg/15μl，标号2-5分别为pCM-19肽溶液300μg/15μl，200μg/15μl，100μg/15μl和50μg/15μl，标号6为溶剂对照。实验结果表明，与溶剂组比较，pCM-19具有直接杀死局部生长的工程菌的作用，在较低局部浓度时，作用不够完全，点样圈内不清晰。
为了测定pCM-19与靶细菌之间的量-效关系，在相同BL-21菌浓度的试管中分别加入不同浓度的pCM-19溶液，37℃作用1小时，然后取相同体积菌液经适当稀释，涂布于1％的琼脂板表面，再在37℃培养20小时，计所形成的菌落数。图5结果显示，在pCM-19浓度较低时，其与靶细菌之间有较好的量-效关系，当体系中pCM-19大到20μg时，所形成的菌落数骤然减少。该实验结果证实，pCM-19具有确切的抗菌作用，但只在小剂量范围内有量-效关系，可能与其作用机理有关。
上述实验结果证实，pCM-19具有确定的抗菌作用，但只是对工程菌有效。为了证实其是否对致病菌同样有效，将100μg/200ul和200μg/200ul pCM-19肽溶液分别加入到含有1×104CFU/200ul的减毒鼠疫杆菌液中，37℃作用1小时，然后将所有混合液涂布在1％琼脂板表面并继续培养3天。图6的结果表明，经pCM-19处理后的减毒鼠疫杆菌几乎完全失去了生长能力。说明pCM-19对减毒鼠疫杆菌同样有杀伤作用。
作用机理的分析对抗菌效果评价是有益的补充。抗菌肽通常是通过改变细胞膜结构实现其抗菌作用。因此，在pCM-19与BL-21菌作用的同时加入PI荧光染料，然后在不同时间取样洗去游离的PI染料并进行流式细胞仪分析，观察荧光染料着染细胞数随pCM-19与靶细菌相互作用时间的变化规律。结果见图7A-E。图中结果显示，与加溶剂对照组(30分钟的测定结果)比较，pCM-19作用5分钟即可观察到PI着染细胞比例增加，到作用20分钟达高峰，30分钟着染细胞比例反而降低。这一实验结果提示了pCM-19对靶细菌细胞膜的完整性具有破坏作用。根据这一实验结果不难想象，pCM-19对细胞膜结构类似的不同细菌都具有同样的作用。为此，发明人选用已经获得氨苄青霉素抗性的pET22b(+)/BL21为靶细菌，以相同剂量的氨苄青霉素作为平行对照，分析了pCM-19和氨苄青霉素分别与pET22b(+)/BL21相互作用的过程中，PI着染细胞的比例随作用时间延长的变化规律。图8E-图8H结果表明，在pCM-19作用组中，PI着染细胞比例随作用时间延长而显著增加，作用20分钟达高峰，30分钟有下降趋势。相反，氨苄青霉素作用组(图8A-图8D)在30分钟作用的过程中，PI着染细胞比例几乎无变化。这一实验结果证实，氨苄青霉素与pCM-19的抗菌作用机理明显不同，pCM-19明显影响了靶细菌膜的完整性。
已发现的多种抗菌肽具有溶血作用，这一作用决定了抗菌肽能否发展成生物药物的命运。发明人以0.1％TritonX-100为阳性对照，以溶剂为阴性对照并与氨苄青霉素比较，分别将10μg/100μl，20μg/100μl，50μg/100μl，100μg/100μl，200μg/100μl，300μg/100μl的pCM-19加入到100μl的抗凝人血红细胞悬液中，37℃作用1小时，离心取上清用Cary 50 Bio UV-visible Spectrophotometer仪测定570nm的光吸收值。图9结果显示，不同剂量的pCM-19对人红细胞几乎无溶血作用。进一步，以溶剂作为对照，分别给正常Balb/c小鼠静脉注射5mg/0.2ml/kg和10mg/0.2ml/kg的pCM-19溶液，注射后20分钟和2小时，用SysmexF-820血细胞自动分析仪对尾静脉血进行分析。表1和表2结果表明，注射不同剂量pCM-19后20分钟和2小时后，小鼠活动状态无异常变化，外周血红细胞计数和血红蛋白含量与对照组比无显著差别。上述体外和体内实验结果均表明，pCM-19无溶解红细胞的作用。
综上所述，pCM-19具有确定的抗菌作用，其作用机理是影响靶菌细胞膜的完整性；体外及体内实验证实，它无溶解红细胞的作用。因此，pCM-19具有发展成为具有抗菌作用的生物药物的良好前景，可广泛用于需要抗菌治疗及处理的不同领域。
实施例1、内源性诱导表达的hL52对大肠杆菌BL21的生长抑制试验
1、pET-22b-hL52的构建
将不带任何标签的hL52基因(序列2)重组到原核表达载体pET-22b(+)(购自Novagen公司)的EcoR I和Xho I识别位点之间，转化大肠杆菌BL21，提质粒，通过酶切鉴定出阳性克隆1和8。将在pET-22b(+)的EcoR I和Xho I识别位点间插入有hL52基因的质粒命名为pET-22b-hL52。
2、对照质粒pET-22b(+)-UBF和pET-22b(+)-PTH的构建
将UBF基因(GenBankUBF-fl AF294842；中国应用生理学杂志，20：66，2004)和PTH基因(甲状旁腺激素的34肽基因序列)(GenBank NM000315)分别克隆入pET-22b(+)的多克隆位点得到对照质粒pET-22b(+)-UBF和pET-22b(+)-PTH。将pET-22b(+)-UBF和pET-22b(+)-PTH分别转化大肠杆菌BL21，筛选得到含有pET-22b(+)-UBF的阳性克隆，含有pET-22b(+)-PTH的阳性克隆。
3、生长抑制试验
分别挑取含有pET-22b-hL52的阳性克隆1和8，含有pET-22b(+)-UBF的阳性克隆，含有pET-22b(+)-PTH的阳性克隆，分别接种到AMP抗性的液体LB培养基(其中氨苄青霉素为50μg/ml)中，于37℃，250rpm的摇床培养12h；以1∶100的体积比接入试管，继续培养至OD值为0.03时，向每只试管中加入IPTG至终浓度为0.5mM，阴性对照组则加入相应体积的PBS；于30℃、250rpm摇菌，每隔45分钟取出1毫升菌液测OD600值，连续测10次以上。以时间为横轴，OD600对数值为纵轴做生长曲线。结果如图1A，图1B和图1C所示，图1A表明单转空载体pET-22b(+)的菌株在加入和不加入IPTG两种情况下，细菌的生长曲线基本吻合；图1B表明在单转两个已知不具有抗菌活性基因UBF和PTH的情况下，加入和不加入IPTG两种情况下，细菌的生长同样不受影响；图1C表明，在转入人hL52基因后，加入和不加入IPTG两种情况下细菌的生长曲线明显不同，在前一种情况下细菌的生长明显受到抑制，从图中还可以看出，随着培养时间延长IPTG消耗殆尽，细菌的生长又得以恢复，而其他测试基因都没有此现象。上述结果充分说明这种抑菌效应是hL52蛋白本身的作用。
实施例2、人工合成不同长度hL52蛋白多肽的抗菌作用分析
根据hL52基因的氨基酸序列，由吉尔生化有限公司分段合成了不同长度的多肽，四条肽段的位置分别为hL52氨基酸序列的第31-46(H3N+-Met-Ala-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Gly-Thr-Phe-Ser-Cys-Leu-Arg-Ile-Gly-COO-，pMG-16)，42-60(序列1，pCM-19)，53-59(pMT-7，H3N+-Met-Gly-Gly-Ile-Gly-Lys-Thr-COO-)，61-79(pMG-19，H3N+-Met-Gln-Ser-Gly-Gly-Thr-Phe-Gly-Thr-Phe-Met-Ala-Ile-Gly-Met-Gly-Ile-Arg-Cys-COO-)个氨基酸。所合成肽段的纯度为85-90％。用无菌去离子水溶解成20mg/ml。抗菌实验采用的方法为Kirby-Bauer diskdiffusion(David T.Kingsbury et al.Microbiology，2nd edition，ed by HarwalPublishing，1990，page 37)法。将含1％的琼脂LB培养基平铺在高压灭菌后15cm直径的玻璃皿，琼脂冷凝后将OD600＝4.0的30μl菌液(大肠杆菌BL21，HB101或DH5α)经LB稀释到2ml，分别均匀涂布在LB琼脂固体培养基表面，在每一划定的方格中放置一直径8mm的灭菌滤纸片，将15μl测试样品滴到滤纸片上。将平皿放置在37℃培养箱中培养4-10小时后，取出平皿观察结果，与氨苄青霉素阳性对照和溶剂(无菌去离子水)阴性对照组比较，以抑菌圈的大小判定结果。结果如图2A，图2B和图2C所示，表明上述四种多肽溶液在浓度相同的条件下，对三种靶菌的作用类似，同浓度时不同多肽溶液的抗菌作用差别较大，其中pCM-19和pMT-7具有较强抗菌作用，pCM-19比pMT-7更强。图2A，图2B和图2C中标号1-5分别为pCM-19 32、64、128、256和512μg，标号6为pMG-19 512μg，标号7为pMG-16 512μg，标号8为pMT-7 512μg，标号9为氨苄青霉素512μg，标号10为溶剂对照。
实施例3、人工合成pCM-19多肽的抗菌作用测定
直接点样法：将等体积不同pCM-19含量的肽溶液(溶剂为无菌去离子水)50μg/15μl、100μg/15μl、200μg/15μl、300μg/15μl和80℃加热30分钟的pCM-19 300μg/15μl，以及等体积的无菌去离子水和等体积的氨苄青霉素300μg/15μl的无菌去离子水溶液，分别直接点在已经生长有大肠杆菌BL-21的1％琼脂LB培养板上，37℃培养6-10小时，观察pCM-19滴样局部抑菌圈的大小和清晰度。结果如图3所示，实验结果表明，与溶剂组比较，pCM-19具有直接杀死局部生长的工程菌的作用，在较低局部浓度时，作用不够完全，点样圈内不清晰。图3中标号1-4分别为pCM-19多肽溶液50μg/15μl，100μg/15μl 200μg/15μl和300μg/15μl，标号5为80℃加热30分钟pCM-19 300μg/15μl，标号6为溶剂对照，标号7为氨苄青霉素300μg/15μl。
试管法：取OD600＝2.5的大肠杆菌BL21测试菌液8μl，加LB液体培养基稀释到20μl，再加入300μg/20μl pCM-19肽溶液(溶剂为无菌去离子水)(pCM-19组)或20μl的无菌去离子水(H2O组)或20μl的LB液体培养基(LB组)或300μg/20μl氨苄青霉素溶液(溶剂为无菌去离子水)(Amp组)，在37℃作用30分钟，再加入LB培养液4ml，在37℃，175rpm，摇床培养3小时，用Cary 50 BioUV-visible Spectrophotometer仪测定OD600光吸收值。结果如图4所示，表明与单纯加LB培养液或补加溶剂组比较，pCM-19明显抑制了靶细菌的生长。LB组为靶菌正常生长条件对照；H2O组为溶剂(无菌去离子水)对照组；Amp组为抑菌生长对照组。上述各组有3个样品。
类似方法被用于测定pCM-19与靶细菌之间的量-效关系。在15个试管中，分别加入OD600nm＝0.3的大肠杆菌BL21菌液5μl并用LB液体培养基稀释到20μl，将该15个试管均分为5组，分别加入20μl不同浓度的pCM-19的无菌去离子水溶液(0、5、10、20、50μg/20μl)，每个剂量点为3个重复。37℃作用1小时，然后分别取0.2ml菌液用无菌水稀释到1.0ml，涂布于1％的琼脂板表面，再在37℃培养12小时，计所形成的菌落数。结果如图5所示，表明在pCM-19浓度较低时，菌落生成数与加入的多肽量之间有较好的量-效关系，当体系中pCM-19大到20μg时，所形成的菌落数骤然减少至几乎无菌落生成。该实验结果证实，pCM-19具有确切的抗菌作用，但只在小剂量范围内有量-效关系。
进一步，在含有1×104CFU/200μl减毒鼠疫杆菌(军事医学科学院流行病学研究所)的每根试管中分别加入200μl无菌去离子水(阴性对照)、100μg/200μl和200μg/200μl的pCM-19多肽溶液，37℃作用1小时，将全部混合液均匀涂布在1％琼脂板表面，继续培养3天。结果如图6所示，表明对照平板有大量鼠疫杆菌生长，而与100μg或200μg pCM-19多肽作用后的减毒鼠疫杆菌完全失去了生长能力。图6中，A为无菌去离子水对照；B为100μg作用组；C为200μg作用组。
实施例4、pCM-19抗菌作用机理的分析
利用PI(propidium iodide)荧光染料掺入细胞膜不完整细胞的原理，在pCM-19与大肠杆菌BL21作用的同时加入PI荧光染料，然后在不同时间取样洗去游离的PI染料并进行流式细胞仪(FACS)分析，观察荧光染料着染细胞数与pCM-19和靶菌相互作用时间的变化规律。取OD600＝0.3的大肠杆菌BL21菌液50μl加入测试管中，加入生理盐水50μl，再加PI染料100μl，37℃，160rpm作用30分钟作为对照组。作为实验组，取OD600＝0.3的大肠杆菌BL21菌液50μl分别加入12个测试管中，分成5、10、20和30分钟4个时间点，每个时间点设3个测试管，每个试管中含菌液50ul，pCM-19肽溶液50ul(50μg)和100μl PI，37℃，160rpm摇床分别作用不同时间。到时间的各样品均用生理盐水洗两次以除去游离的PI，再用500μl生理盐水重新悬浮菌液并进行FACS分析。结果如图7A-E所示，表明加盐水的对照组30分钟的PI阳性细菌比例仅为1.7％，而pCM-19作用5分钟即可观察到PI着染细胞比例增加，到作用20分钟达高峰，30分钟PI着染细胞比例反而降低。图7A-E中PI阳性细菌百分数是3个样品的平均数，M1表示在该荧光强度范围内的细胞数。这一实验结果提示了pCM-19对靶菌细胞膜的完整性具有破坏作用。
采用同样的方法，测试了pCM-19对已获得氨苄青霉素抗性的BL21菌(将pET-22b(+)转化大肠杆菌BL21，筛选得到的含有pET-22b(+)的大肠杆菌BL21-pET22b(+)/BL21)细胞膜完整性的影响。取OD600＝0.5时氨苄青霉素抗性菌液(pET22b(+)/BL21)100μl/管，分别加入100μl(200μg)的氨苄青霉素或等量pCM-19肽溶液，再加PI至终浓度为25μg/ml。37℃摇床，160rpm分别作用5、10、20和30分钟。每个时间点3个样品。FACS样品制备及测试同上。结果如图8A-H所示，结果表明在pCM-19作用组中(图8E-H)，PI着染细胞比例随作用时间延长而显著增加，作用20分钟达高峰，30分钟有下降趋势。相反，氨苄青霉素作用组(图8A-D)在30分钟作用的过程中，PI着染细胞比例几乎无变化。图8A-H中每个时间点为3个样品，PI阳性细菌百分数是3个样品的平均数，M1表示在该荧光强度范围内的细胞数。这一实验结果证实，氨苄青霉素与pCM-19的抗菌作用机理明显不同，pCM-19明显影响了靶细菌膜的完整性。
实施例5、pCM-19多肽的溶血作用测试
体外法：取新鲜抗凝人血100μl加入到系列试管中，分别加入无菌生理盐水100ul或10μl去离子水加90ul生理盐水作为阴性对照组，或加入氨苄青霉素的无菌去离子水溶液100μl(300μg)作比较组，或加100μl的0.1％TritonX-100作为溶血阳性对照组。实验组分别加入体积均为100μl的pCM-19肽的无菌去离子水溶液，pCM-19的含量为10、20、50、100、200、300μg。各剂量点均为3个样品。所有样品经37℃保温1小时后，离心1000g，5分钟，收集上清并用Cary 50Bio UV-visible Spectrophotometer仪测定OD570nm的吸收值。结果如图9所示，表明pCM-19对人红细胞无明显溶血作用。图9中，Control(NS)为100ul无菌生理盐水(相当于肽溶液的溶剂量)；H2O为10μl去离子水加90ul生理盐水(相当于肽溶液的溶剂量)。
体内法：首先，将雌性Balb/c小鼠随机分成三组，3只/组。阴性对照组尾静脉注射0.2ml生理盐水，两实验组分别注射0.2ml的pCM-19的无菌去离子水溶液(剂量为5mg/kg或10mg/kg)。注射后20分钟和2小时，分别取尾静脉血10μl，按照Sysmex F-820血细胞自动分析仪要求稀释样品并进行血象分析。动物在注射肽溶液或生理盐水后，未发现不良反应。血象分析结果如表1和表2所示，表明三组动物的RBC、血红蛋白含量和其它成分测试值之间无明显差别，无溶血现象。
表1.小鼠尾静脉注射5mg/kg或10mg/kg体重的pCM-19后20分钟的血象测定值
血液成份                             测定值(M±SD)
    盐水组     5mg/kg     10mg/kg
WBC(×109/L)RBC(×1012/L)HGB(g/L)HCT(fl)MCV(g/L)MCH(pg)MCHC(g/L)PLT(×109/L)     8.20±0.5298.24±0.790132.67±17.9260.43±0.03851.23±0.65116.23 ±2.757316.00±50.1201022.67±177.009     14.53±4.1108.63±0.358109.33±3.0550.47±0.02854.23±1.106**12.67±0.252234.00±9.165817.33±261.031     17.40±5.8287.73±0.392119.33±11.0150.40 ±0.02551.60±±0.62515.50±2.211300.67±46.522874.00±141.478
注：M±SD为3只小鼠样品的算术平均值±标准差
**与对照组相比0.01＜P＜0.05，其余组P＞0.05
表2.小鼠尾静脉注射5mg/kg或10mg/kg体重的pCM-19后2小时的血象测定值
血液成份                           测定值(M±SD)
    盐水组     5mg/kg   10mg/kg
WBC(×109/L)RBC(×1012/L)     8.20±0.5298.24±0.790     14.53±4.1108.63±0.358   17.40±5.8287.73±0.392
  HGB(g/L)HCT(fl)MCV(g/L)MCH(pg)MCHC(g/L)PLT(×109/L)     132.67±17.9260.43±0.03851.23±0.65116.23±2.757316.00±50.1201022.67±177.009     109.33±3.0550.47±0.02854.23±1.106**12.67±0.252234.00±9.165817.33±261.031     119.33±11.0150.40±0.02551.60±0.62515.50±2.211300.67±46.522874.00±141.478
注：M±SD为3只小鼠样品的算术平均值±标准差
**与对照组相比0.01＜P＜0.05，其余组P＞0.05
                            序列表
<160>3
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Ile Gly
                 5                  10                  15
Lys Thr Met
        19
<210>2
<211>240
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
atgccggtgg ccgtgggtcc ctacggacag tcccagccaa gctgcttcga ccgtgtcaaa  60
atgggcttcg tgatgggttg cgccgtgggc atggcggccg gggcgctctt cggcaccttt  120
tcctgtctca ggatcggaat gcggggtcga gagctgatgg gcggcattgg gaaaaccatg  180
atgcagagtg gcggcacctt tggcacattc atggccattg ggatgggcat ccgatgctaa  240
<210>3
<211>79
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>3
Met Pro Val Ala Val Gly Pro Tyr Gly Gln Ser Gln Pro Ser Cys Phe
1               5               10                  15
Asp Arg Val Lys Met Gly Phe Val Met Gly Cys Ala Val Gly Met Ala
            20              25                  30
Ala Gly Ala Leu Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg
        35              40                  45
Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Met Met Gln Ser Gly
    50              55                  60
Gly Thr Phe Gly Thr Phe Met Ala Ile Gly Met Gly Ile Arg Cys
65               70                 75

Claims (9)

1、人富含甘氨酸蛋白的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或糖基化和/或羧基化和/或乙酰化和/或磷酸化修饰且具有抗菌作用的多肽。
2、根据权利要求1所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段，其特征在于：所述富含甘氨酸蛋白的活性片段是具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽。
3、权利要求1或2所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因。
4、含有权利要求3所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因的表达载体。
5、含有权利要求3所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因的细胞系。
6、含有权利要求3所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因的宿主菌。
7、权利要求1或2所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段在作为抗菌肽中的应用。
8、权利要求1或2所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段在制备具有抗菌作用的生物药物中的应用。
9、权利要求3所述的人富含甘氨酸蛋白的活性片段编码基因在抗菌中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1073117C (zh) * 1996-01-16 2001-10-17 中国农业科学院生物技术研究中心 抗菌肽及其生产方法和应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022538545A (ja) * 2019-06-17 2022-09-05 高麗大学校産学協力団 Ｒｏｍｏ１由来抗菌ペプチドおよびその変異体
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