CN1688691A - 具有更快的抗原结合速率的抗体变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有更快的抗原结合速率的抗体变体。该抗体变体在至少一个超变区内或其邻近处具有一种或多种氨基酸变异，所述变异增加抗体变体和该抗体结合的抗原之间的电荷互补性。

Description

具有更快的抗原结合速率的抗体变体

技术领域

本发明涉及具有更快的抗原结合速率的抗体变体。该抗体变体具有位于至少一个超变区内或邻近处的一种或多种变异，所述变异增加抗体变体与其所结合的抗原之间的电荷互补性。

背景技术

抗体是显示对特定抗原的结合特异性的蛋白。天然抗体通常是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链相连，但不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫连接的数目不同。各重链和轻链还具有规则间隔的链间二硫桥。每条重链的一个末端具有可变区(V_H)，后面接着几个恒定区。每条轻链的可变区(V_L)在其一个末端，恒定区在另一末端；轻链的恒定区与重链的第一恒定区并列，轻链的可变区与重链的可变区并列。特定氨基酸残基据信形成轻链和重链可变区之间的接触面。

本文术语“可变的”指可变区的特定部分在不同抗体中的序列不同，并决定每种特定抗体对其特定抗原的结合特异性。然而，可变性通常不均匀地分布在抗体的可变区中。可变性聚集在轻链和重链可变区的被称为互补决定区(CDR)的三个片段中。可变区更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包含4个FR区，大部分采用由三个CDR连接的β折叠构型，这三个CDR形成连接β折叠结构的袢或有时形成β折叠构型的一部分。每条链的CDR通过FR区密邻，并与其他链的CDR形成抗体的抗原结合位点(见Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。

恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但其显示各种效应器功能。根据它们的重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体或免疫球蛋白分成不同种类。有五种主要的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，而且这些种类中的一些可被进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4；IgA1和IgA2。相应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。在各种人免疫球蛋白种类中，已知只有人IgG1，IgG2，IgG3和IgM活化补体。

将抗体用于治疗人类疾病的应用正快速增长。一种此类的治疗相关抗体被构建成靶向血管内皮生长因子(VEGF)(Chen等，Journal of MolecularBiology 293(4)：865-81(1999)；Kim等，Nature 362(6423)：841-4(1993)；Muller等，Structure 5(10)：1325-38(1997)；WO 96/30046；WO 98/45331；和WO 00/29584)。通过对跨膜受体Flt-1和KDR的刺激，VEGF特异地引起血管增生(Ferrara，N.Current Topics in Microbiology & Immunology 237：1-30(1999))。VEGF拮抗剂被证实可以抑制包括癌症在内的疾病，在这些疾病中不受控制的血管生成造成了疾病状态(Kim等，Nature 362(6423)：841-4(1993))。

在体内，抗体的亲和力成熟通过对亲和力较高的抗体变体进行抗原筛选来驱动，所述抗体变体主要是通过体细胞超诱变(somatic hypermutagenesis)制备的。“所有组成成分转变(repertoire shift)”常出现在二级或三级反应的主要种系基因(predominant germline genes)与初级或二级反应的主要种系基因不同的情形中。

多个研究组试图通过在体外将突变引入抗体基因并使用亲和筛选分离具有增强的亲和力的突变体来模仿免疫系统的亲和力成熟过程。这种突变抗体可展示于丝状噬菌体的表面，而且可通过对抗原的亲和力或通过从抗原中解离的动力学(解离速率(off-rate))来筛选抗体。Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。CDR步查诱变(walking mutagenesis)可被用于亲和力成熟的人抗体，该抗体与人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的人包膜糖蛋白gp120结合(Barbas III等，PNAS(USA)91：3809-3813(1994)；和Yang等J.Mol.Biol.254：392-403(1995))；以及与抗-c-erbB-2单链Fv片段结合(Schier等J.Mol.Biol.263：551567(1996))。抗体链改组(shuffling)和CDR诱变被用于抗HIV第三超变环的高亲和力人抗体的亲和力成熟(Thompson等J.Mol.Biol.256：77-88(1996))。Balint和Larrick Gene 137：109-118(1993)描述了一种技术，他们创造(coin了“简约诱变(parsimonious mutagenesis)”，该技术涉及计算机支持的寡脱氧核糖核苷酸介导的扫描诱变(computer-assistedoligodeoxyribonucleotide-directed scanning mutagenesis)，其中同时并彻底地检查了可变区基因的所有三个CDR以搜索改良的变体。Wu等，用初始限制的诱变策略使avβ3特异的人源化抗体亲和力成熟，其中所有六个CDR的每个位置均发生突变，并随后对包括亲和力最高的突变体在内的组合文库进行表达和筛选(Wu等，PNAS(USA)95：6037-6-42(1998))。噬菌体抗体的综述见Chiswel and McCafferty TIBTECH 10：80-84(1992)；以及Rader andBarbas III Current Opinion in Biotech.8：503-508(1997)。

蛋白-配体对的亲和力用解离常数(Kd)描述，并定义为溶液中未结合的分子与结合的分子的平衡分布(公式1)。这一关系也可通过解离速率常数(off-rate常数，k_-1)与结合速率常数(on-rate常数，k₁)的比值来定义。

公式1

$K_d=\frac{\left[P\right]\left[L\right]}{\left[\mathrm{PL}\right]}=\frac{k_{-1}}{k_1}$

许多蛋白-蛋白相互作用的突变体之间的亲和力差异(Voss，E.W.Journal of Molecular Recognition 6(2)：51-8(1993))主要是通过其解离速率的差异定义的。这一观察与增加亲和力的突变参与蛋白-蛋白接触面的直接接触，以及解离速率常数有赖于有利的短范围相互作用的破坏相一致。反之，结合速率常数(k₁)有赖于两个分子之间的碰撞频率(Z)，以及每次碰撞导致复合物形成的效率。后者又有赖于空间位因子(stericfactor)(p)来解决两个分子和具有足够的热活化能的分子群的定位要求(Fersht，A.R.(1985)。EnzymeStructure and Mechanism，W.H.Freeman and Company，New York，NY)(公式2)。

公式2：

$k_1={\mathrm{Zpe}}^{\frac{-\mathrm{Ea}}{\mathrm{RT}}}$

其中Ea是用于形成复合物的活化能，R是通用气体常数，T是温度(以Kelvins为单位)。

理论上，通过突变增加碰撞的速率或碰撞的效率可以增加结合速率。据推测这是可以实现的，且无需破坏包括结合接触面在内的短-范围接触，它是通过突变结合接触面外周的残基，产生有利的静电转向力(electrostaticsteering forces)来实现(Berg & von Hippel(1996)Nat.Struct.Biol.3：427-31；Radic等(1997)J.Biol.Chem.272：23265-77；Selzer等(2000)Nat.Struct.Biol.7：537-41)。对这一现象的研究集中在Brownian动力学模拟(Browniandynamics simulations)和复合物计算机分析(complex computational analysis)上，以解决全部非线性Poisson-Boltzman等式(the full non-linearPoisson-Boltzman equation)，来预测在不同粘度和盐度的溶液中的结合速率(Slagle等(1994)J.Biomolec.Struct.Dynam.12：439-56；Kozack等(1995)Biophys.J.68-807-14；Fogolari等(2000)Eur J Biochem.267：4861-9；Gabdoulline & Wade(2001)J Mol.Biol.306：1139-55)。然而最近显示，可以以同源电介质常数为80，通过计算相互作用的静电能量预测一下复合物的结合速率：barnase-barstar复合物(Schreiber & Fersht(1996)Nat.Struct.Biol.3：427-31；Vijayakumar等(1998)J.Mol.Biol.278：1015-24)，TEM-内酰胺酶-BLIP抑制剂复合物(TEM-lactamase-BLIP complex)(Selzer等(2000)Nat.Struct.Biol.7：537-41)，乙酰胆碱酯酶-束蛋白(acethylcholinesterase-fasciculin)复合物(Radic等(1997)J.Biol.Chem.272：23265-77)，和水蛭素-凝血酶复合物(hirudin-thrombin complex)(Jackman等(1992)J.Biol.Chem.267：15375-83；Betz等(1991)Biochem.J.275：801-3)。

发明内容

本发明提供了制备亲本抗体的抗体变体的方法，包括a)鉴定亲本抗体可变区内的靶氨基酸残基，所述靶残基是1)溶液中暴露的残基；2)在超变区内或与之相邻；和3)在亲本抗体结合的抗原的约20之内；和b)用不同的取代氨基酸残基取代步骤a)的靶残基，使得抗体与抗原之间的电荷互补性(charge complementarity)增加。在一方面，本发明的方法产生了比亲本抗体具有更快的抗原结合速率的抗体变体。本发明进一步提供了根据前述段落描述的方法制备的抗体变体。

此外，本发明提供了一种抗体变体，它包含位于其超变区内或与超变区相邻的氨基酸的变异，该变异可增加抗体变体与其结合的抗原之间的电荷互补性。

本文涉及各种形式的抗体变体。例如，抗体变体可以是全长抗体(例如，具有人免疫球蛋白恒定区)或抗体片段(例如Fab或F(ab′)₂)。进一步，该抗体变体可用可检测的标记物标记，被固定于固相上和/或与异源化合物(例如细胞毒剂)偶联。

本发明涉及抗体变体的诊断和治疗用途。在一种诊断应用中，本发明提供用于检测目的抗原的存在的方法，包括将可疑含有该抗原的样品暴露于该抗体变体，并测定抗体变体与样品的结合。为此应用，本发明提供一种试剂盒，它包含所述抗体变体和用于说明如何使用该抗体变体检测抗原的说明书。

本发明进一步提供：编码所述抗体变体的分离的核酸；包含该核酸的载体，并且可选地所述核酸与由该载体转化的宿主细胞所能识别的控制序列可操作地连接；以所述核酸转化的宿主细胞；制备所述抗体变体的方法，包括培养该宿主细胞使其表达核酸，可选地，自宿主细胞培养物(例如，从宿主细胞培养基中)回收该抗体变体。回收的抗体变体可以和例如细胞毒剂或标记物等异源分子相偶联。

本发明还提供包含抗体变体和可药用的载体或稀释剂的组合物。用于治疗用途的该组合物是无菌的并可以是冻干的。

本发明进一步提供用于治疗哺乳动物的方法，包括对哺乳动物用药有效量的抗体变体。

本发明进一步提供用于测定抗体的抗原结合速率的方法，包括以下步骤：

(1)在溶液中混合抗体和抗原，然后

(2)随着时间变化测定抗体-抗原复合物的形成。

附图说明

图1A-B描述了下述序列的比对：亲本抗体Y0101 Fab的轻链和重链氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs：1和2)；变异的轻链“S26T-Q27K-D28K-S30K”序列(SEQ ID NO：3)；变异的轻链“S26T-Q27K-D28K-S30T”序列(SEQ ID NO：4)；和变异的轻链“T28D-S100aR”序列(SEQ ID NO：5)。在图1A-B中，编号是连续的，而不是根据Kabat编号系统进行编号。因此，对于重链突变体，S100aR突变(Kabat编号系统)是突变S105R(连续编号系统)。

图2表示荧光光谱。约10nM Fab Y0101(黑色虚线)的发射光谱，约120nM VEGF(灰色实线)的发射光谱，以及10nM Fab与120nM VEGF的混合物(黑色实线)的发射光谱。Fab和VEGF各自的光谱之和以灰色虚线显示。

图3表示原始(raw)动力学数据。在不同浓度的VEGF的情况中，可测定复合物形成的速率(Δ荧光)相对时间的函数值(由灰到黑浓度增加)，并换算成单次指数(single exponential)以计算观察到的速率(K_obs)。

图4涉及k₁的计算。以观察到的复合物形成速率(k_obs)对所用的VEGF浓度做图，通过准一级分析(pseudo-first order analysis)来确定k₁，表示为直线的斜率。所示是重链变体T28E的数据。

图5显示了对Fab Y0101变体的k_obs和k_calc的比较。

图6A和6B分别显示了抗VEGF变体“34-TKKT+H97Y+VNERK”的轻链和重链序列(分别为SEQ ID NOs：4和8)；“34-TKKT+H97Y”的轻链和重链序列(分别为SEQ ID NOs：4和9)；和“34-TKKT+VNERK”的轻链和重链序列(分别为SEQ ID NOs：4和10)的比对。亲本抗体Y0101的序列用作比较。粗体和加下划线的残基表示取代。

图7图示了结合速率对离子强度的依赖性。测定Y0101的结合速率(实心圆圈)和快速结合变体“34-TKKT”((V_H-(T28D，S100aR)+V_L-(S26T，Q27K，D28K，S30T))(空心正方形)的结合速率作为盐浓度的函数。相应于U为+0.86kcal mol^-1的Y0101和U为-4.0 kcal mol^-1的快速结合变体的斜率(-U/RT)分别是-1.4和6.5。

图8提供了人源化抗-TF抗体D3H44的轻链和重链可变区的氨基酸序列。以粗体和加下划线的形式表示可能的(potential)On-RAMPS残基。

图9提供了人源化变体抗-HER2抗体4D5的轻链和重链可变区的氨基酸序列。以粗体和加下划线的形式表示可能的(potential)On-RAMPS残基。

优选实施方案详述

I.定义

术语“抗体”是指最广义上的抗体，具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(如双特异性抗体)和能够显示所需生物学活性的免疫球蛋白片段。

本文中术语“超变区”指抗体可变区的区域，其序列是超变的和/或形成结构上定义的环。超变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(CDR L1)，50-56(CDR L2)和89-97(CDR L3)，重链可变区中的31-35(CDR H1)，50-65(CDR H2)和95-102(CDRH3)；Kabat等，Sequence of proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或来自“超变环”的那些残基(即，轻链可变区中的残基26-32(环(loop)L1)，50-52(环L2)和91-96(环L3)，重链可变区中的26-32(环H1)，53-55(环H2)和96-101(环H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在上述两种情形中，可变区残基是根据上述Kabat等的文章中所述的方法被编号的。“框架区”或“FR”残基是除了本文定义的超变区残基以外的那些可变区残基。

“按Kabat的文章中所述的方法编号的可变区残基”的表述指Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)的抗体编排中用于重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有较少的或额外的氨基酸，分别相应于可变区的FR或CDR的缩短或插入其中的片段。例如，重链可变区可以包括位于CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的编号为残基52a)和位于重链FR残基82之后的插入残基(根据Kabat的编号为例如残基82a，82b，和82c等)。通过将给定抗体的同源序列区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对，可确定该抗体的残基的Kabat编号。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；二价抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异抗体。

本文中术语“单克隆抗体”是指来自基本上均一的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克隆抗体具有高度的特异性，针对单个抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对抗原上的单个表位。修饰词“单克隆的”表示抗体来自基本均一的抗体群的特点，而不被解释为需要通过任何特定的方法生产该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤法制备，或通过重组DNA法制备(美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如Clardson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol 222：581-597(1991)中所述的技术自噬菌体抗体文库中分离。

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合抗体”(免疫球蛋白)，所述抗体中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，本文单克隆抗体还包括这种抗体的片段(只要它们显示所需的生物活性)(美国专利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。

“人源化”型非人(例如小鼠)抗体是嵌合的抗体，它们包含非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者超变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供体抗体)的超变区残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰旨在进一步改善(refine)抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中起变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的相应部分。人源化抗体还可选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的V_H和V_L区，这些区存在于单个多肽链上。通常Fv多肽在V_H和V_L区之间还包含一个多肽接头，它能使sFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。

术语“二价抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括在同一条多肽链(V_H-V_L)上包含彼此连接的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)。通过使用很短而不能使同一条链上的两个区之间配对的接头，使所述区与另一条链上的互补区配对，并产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)中有对二价抗体更详细的描述。

本文术语“线性抗体”指Zapata等Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之，这些抗体包括一对串联的Fd片段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，它形成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异或单特异的。

“亲本抗体”是包含与本文公开的抗体变体相比，缺乏一个或多个氨基酸序列变异的氨基酸序列的抗体。因此，亲本抗体通常包含至少一个超变区，所述超变区与本文公开的抗体变体的相应超变区的氨基酸序列不同。亲本多肽可以包含天然序列(即天然存在的)抗体(包括天然存在的等位基因变体)，或具有在天然序列中事先存在的氨基酸序列修饰(例如插入，删除和/或其他变异)的抗体。优选的亲本抗体是嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。

本文中的“抗体变体”指具有与亲本抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体。优选，抗体变体包含重链可变区或轻链可变区，其具有天然中不存在的氨基酸序列。此种变体必需具有与亲本抗体100％以下的序列相同性或相似性。在优选的实施方案中，抗体变体含有这样一种氨基酸序列，它与亲本抗体的重链或轻链可变区的氨基酸序列具有约75％到小于100％，更优选约80％到小于100％，更优选约85％到小于100％，更优选约90％到小于100％，并最优选约95％到小于100％的氨基酸序列相同性或相似性。该序列的相同性或相似性在本文中定义为经序列比对并在需要时引入缺口以获得最大百分比序列相同性后，候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基(即相同残基)的百分比。N-末端，C-末端，或内部延伸，缺失，或插入可变区外的抗体序列不应被认为影响序列相同性或相似性。抗体变体通常包含位于该抗体一个或多个超变区内或邻近处的一种或多种氨基酸变异。

“氨基酸变异”指给定的氨基酸序列中的改变。变异的例子包括插入，取代和缺失。

“氨基酸取代”指用另一种不同的氨基酸残基取代给定氨基酸序列中存在的氨基酸残基。

“取代”氨基酸残基指一种氨基酸残基取代或替换氨基酸序列中的另一种氨基酸残基。取代残基可以是天然存在或非天然存在的氨基酸残基。

“氨基酸插入”指将一个或多个氨基酸残基引入给定的氨基酸序列。

氨基酸插入可包含“肽插入”，其中包含由肽键相连的两个或更多氨基酸残基的肽被引入给定的氨基酸序列。若氨基酸插入涉及肽的插入，被插入的肽可通过随机诱变产生，从而具有天然不存在的氨基酸。

“邻近超变区”的氨基酸变异指在超变区的N末端和/或C末端引入或取代一个或更多氨基酸残基，使得至少一个插入氨基酸残基或取代氨基酸残基与目的超变区的N末端和/或C末端氨基酸残基形成肽键。

“天然存在的氨基酸残基”是由遗传密码编码的残基，通常选自以下氨基酸：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Ile)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。

“非天然存在的氨基酸残基”在本文中指能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基的残基，但不是上述的那些天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸，鸟氨酸，正缬氨酸，高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等Meth.Enzym.202：301-336(1991)中描述的那些。为产生此种非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等Science244：182(1989)和Ellman等，见上文中的方法。简言之，这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基以化学方法活化抑制性tRNA，并随后进行RNA的体外转录和翻译。

“暴露的”氨基酸残基是在溶液中的多肽(例如抗体或多肽抗原)的情况下，至少部分表面在一定程度上暴露于溶剂的残基。优选，暴露的氨基酸残基是其中至少约三分之一的侧链表面区域暴露于溶剂的残基。可用多种方法测定残基是否暴露，包括分析多肽的分子模型或结构。

“带电的”氨基酸残基是带有净全正电(net overall positive charge)或净全负电(net overall negative charge)的残基。正电氨基酸残基包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。负电氨基酸残基包括天冬氨酸和谷氨酸。

本文术语“靶抗原”指本文定义的亲本抗体和抗体变体所结合的给定抗原。靶抗原可以是多肽，碳水化合物，核酸，脂类，半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。优选，靶抗原是多肽。虽然抗体变体通常以比亲本抗体更好的结合亲和力结合靶抗原，通常亲本抗体对靶抗原的结合亲和力(K_d)值不超过约1×10^-5M，并优选不超过约1×10^-6M。

本文的“结合速率”指抗体与抗原在溶液中形成复合物的结合速率常数(k₁)。

本文的“解离速率”指破坏抗体和抗原间的短距离相互作用的解离速率常数(k_-1)。

本文的“电荷互补性(charge complementarity)”指抗体的氨基酸残基和抗原的氨基酸残基之间的静电作用。本文的电荷指抗体与抗原结合时，抗体的氨基酸残基附近的抗原局部电荷。为增加例如带正电荷的抗体与带负电荷的抗原的电荷互补性，用中性残基(例如N或T)或带正电的残基(例如R或K)取代抗体中特定的带负电的氨基酸残基(例如D或E)，用以中和或逆转所带负电从而更好地与带负电的抗原互补。

“分离的”抗体指从蛋白的天然环境的成分中鉴定，分离和/或回收的抗体。其天然环境中的杂质成分是可干扰抗体用于诊断或治疗的物质，可包括酶，激素，及其它蛋白或非蛋白溶质。在优选的实施方案中，抗体可被纯化达到以下程度(1)通过Lowry方法测定的抗体重量的95％以上，并最优选大于99％重量，(2)足以通过采用转杯式测序仪得到N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)在还原或非还原条件下经SDS-PAGE及考马斯兰或优选银染色证实为均质。分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中至少一种成分不存在。但通常，通过至少一步纯化步骤制备分离的抗体。

“治疗”指治疗性疗法和防病或预防措施。需要治疗的包括那些已患该病和那些需预防该病的人。

“疾病”指任何可从所述抗体变体的治疗中受益的情况。包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物对目的疾病具有倾向性的那些病理情况。

术语“哺乳动物”是指哺乳类任何动物，包括人、家养动物和农用动物，非人灵长类动物，和动物园动物、运动项目用的动物或宠物，如犬、马、猫、牛等。

“分离的”核酸分子是从抗体核酸的天然来源中通常与其结合的至少一种杂质核酸分子中鉴定并分离出来的核酸分子。分离的核酸分子与天然中发现的该分子的形式和结构(setting)不同。因此分离的核酸分子可与存在于天然细胞中的核酸分子相区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞内含有的核酸分子，其中，例如核酸分子在染色体中的位置与其在天然细胞中的不同。

术语“控制序列”指具体宿主生物中，表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。例如适于原核生物的控制序列包括启动子，可选地包括操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸与另一种核酸序列处在功能相关的位置时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果要将前序列或分泌前导序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白，前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接于该多肽的DNA；如果要使启动子或增强子影响编码序列的转录，该启动子或增强子可操作地连接于该序列；或如果要使核糖体结合位点的位置有利于翻译，该核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。通常，“可操作地连接”意味着被连接的DNA序列是邻接的，并且如果是分泌前导序列，是邻接并处于阅读阶段的。然而，增强子不必为邻接的。该连接可通过在便利的限制性位点进行连接来实现。如果这种位点不存在，可根据传统操作使用合成寡核苷酸衔接子或接头。

本文术语“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的名称都包括子代。因此，名词“转化体”和“转化的细胞”包括来自上述细胞和培养物的原代受试细胞和培养物，而不考虑传代的次数。可以理解由于人为的或偶然的突变，所有子代的DNA内容可能不完全相同。具有与原始转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变子代也被包括在内。名称不同时，从上下文来看是明确的。

II.发明的实施模式

本发明至少部分涉及制备抗体变体的方法。亲本抗体或起始抗体可使用本领域用于产生此种抗体的技术制备。产生抗体的示例性方法在下文中更详细地描述。此外由于技术人员可使用目的抗体的可得的信息(例如氨基酸序列数据)来产生本文的抗体变体，本发明不需要实际上有形地产生亲本抗体。

亲本抗体针对目的靶抗原。优选，靶抗原是生物学上重要的多肽，而且将该抗体给药患有疾病的哺乳动物可在该哺乳动物中产生有益的治疗效果。然而，本发明也涉及针对非多肽抗原(例如肿瘤相关糖脂抗原；见美国专利5,091,178)的抗体。

如果抗原是多肽，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体例如生长因子。具体抗原包括的分子例如：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；甲状腺刺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；滤泡刺激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC，因子IX，组织因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子例如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；凝血酶原激活剂例如尿激酶或人尿或组织型凝血酶原激活剂(t-PA)；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽；RANTES(调控活化，通常是T细胞表达或分泌的)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；米勒管(Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素(activin)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductivefactors)；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(decay accelerating factor)；病毒抗原例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体(homing receptors)；地址素；调控蛋白；整联蛋白例如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原例如HER2，HER3或HER4受体；以及任意上述多肽的片段。

本发明抗体的优选分子靶包括CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20和CD34；ErbB受体家族成员，例如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；细胞粘附分子例如LFA-1，Macl，p150，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和αν/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a，抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子例如VEGF和TF；IgE；血型抗原(blood groupantigens)；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。

用于产生抗体的抗原可自其天然来源中分离，或通过重组方法产生或使用其它合成方法制备。可选地，包含天然或重组抗原的细胞可被用作制备抗体的免疫原。

亲本抗体可具有预先存在的对靶抗原的强结合亲和力。例如亲本抗体结合目的抗原的结合亲和力(K_d)值不超过约1×10^-7M，优选不超过约1×10^-8M，最优选不超过1×10^-9M。

亲本抗体优选是嵌合抗体(例如人源化抗体)或人抗体。嵌合抗体，人源化抗体或人抗体可选地也是“亲和力成熟的”抗体。使抗体亲和力成熟的技术在本文的“背景技术”的标题下的内容中涉及。在一个实施方案中，亲本抗体是抗体片段，或者制备完整抗体的抗体片段(例如Fab片段)以便简化对重组变体的筛选。优选，亲本抗体和抗体变体结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)。一种示例性亲本抗体包括下述抗-VEGF抗体的轻链可变区和重链可变区，例如Y0101(文中图1A-B)；Y0317(WO98/45331，包含于文中作为参考)；人源化抗-VEGF F(ab)-12(WO98/45331，包含于文中作为参考)；Y0192(WO98/45331，包含于文中作为参考)；Y0238-3(WO98/45331，包含于文中作为参考)；Y0239-19(WO00/29584，包含于文中作为参考)；Y0313-2(WO00/29584，包含于文中作为参考)或VNERK突变体(WO00/29584，包含于文中作为参考)。

本文的抗体变体优选显示比亲本抗体更快的抗原结合速率。可通过任何以复合物的形成作为时间的函数的方法测定结合速率。最广泛应用的方法是BIAcore^分析，其中技术人员测定抗体与固定在生物传感器表面上的抗原的结合(综述见Rich & Myszka，Curr.Opin.Biotechnol.11：54-61(2000))。可选地，通过混和抗原合抗体并测定复合物形成的速率对抗原浓度的函数(见实施例)，可以测定溶液中(而不是在固相表面上)的结合速率。此时，可使用各种检测法，包括测定由内在的(intrinsic)或人工的荧光团发出的荧光(综述见Linthicum等，Comb.Chem.High Thr oughput Screen 4：439-449(2001))。优选根据实施例中的方法测定结合速率。最优选，所述抗体变体的结合速率比其亲本抗体的结合速率快约5倍，或约10倍(例如最多快约1000倍，或最多快约10,000倍)。

此外，该抗体变体通常具有比其亲本抗体更强的靶抗原结合力亲合力。例如通过平衡方法(equilibrium methods)(例如酶联免疫吸附法(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如BIACORE^TM分析)可测定抗体“结合亲和力”。优选该抗体变体具有的靶抗原结合亲和力比其亲本抗体对该抗原的结合亲和力强至少2倍，并优选至少约强5倍，并优选至少强10倍或100倍(例如最多强约1000倍或强约10,000倍的结合亲和力)。所希望或要求的结合亲和力的增强有赖于亲本抗体的起始结合亲和力。

为了评估抗体作为药剂的“效力(potency)”或药理活性以及可能的有效性(potential efficacy)，还可对抗体进行其他“生物活性测定”。此类测定在本领域中已知，并有赖于该抗体的靶抗原和目的用途。实例包括角质细胞单层粘附试验(keratinocyte monolayer adhesion assay)和CD11a的混合淋巴细胞反应试验(mixed lymphocyte response(MLR))(见WO98/23761)；肿瘤细胞生长抑制试验(例如如WO89/06692所述)；抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)和补体介导的细胞毒(CDC)试验(美国专利5,500,362)；促效活性(agonistic activity)或造血试验(hematopoiesis assays)(见WO95/27062)；氚标记的胸苷的掺入试验(tritiated thymidine incorporation assay)；和alamar blue试验，用来测定细胞对例如VEFG等分子应答的代谢活性。抗体变体优选在选择的生物活性测定中具有的效力比其亲本抗体在该试验中的生物活性至少约大2倍(例如效力增强从约2倍到约1000倍或甚至到约10,000倍)，优选至少约大20倍，更优选至少约大50倍，有时至少约大100倍或200倍。

本发明提供了制备抗体变体的系统性方法，并可筛选其中改良的功能(例如改良的结合速率和/或亲和力)。优选，技术人员可评估涉及抗体-抗原的信息，来确定抗体中可增加抗体和抗原之间电荷互补性的候选氨基酸变异(candidate amino acid alterations)。可自该复合物的X线晶体结构或核磁共振(NMR)结构获得分子模型。见，例如Amit等，Science 233：747-753(1986)；和Muller等，Structure 6(9)：1153-1167(1998))。可选地，在例如晶体结构不可得的情况下，可利用电脑程序创造出抗体/抗原复合物的分子模型(见例如Levy等，Biochemistry 28：7168-7175(1989)；Bruccoleri等，Nature 335：564-568(1998)；和Chothia等，Science 233：755-758(1986))。

在一个实施方案中，所述变异涉及将一个或多个带电氨基酸插入其亲本抗体的一个或多个超变区内或其邻近处。在该实施方案中，通过分析抗体-抗原复合物发现插入的残基通常不与抗原结合。通常可插入，从约1个到约20个，或最多约40个增加电荷互补性的氨基酸残基。

在最优选的实施方案中，所述变异涉及取代位于一个或多个超变区内或其邻近处的一种或多种靶残基。根据本发明的这一实施方案，所述靶残基可选自以下残基：

1)优选该残基暴露于溶液中，例如将至少其侧链表面区域的三分之一暴露于溶剂。这一现象不能归于任何一种理论，而被认为是为了避免由于隐藏的(buried)残基的突变导致破坏抗体的稳定性。

2)可取地，所述残基在结合状态的抗原的至少约20的范围内(优选在约16的范围内)，这是由于静电引力可以由于距离的作用而衰减。

3)优选，所述残基不与结合状态的抗原直接接触，这是由于直接接触残基的突变可能破环结合态复合物的稳定性。

4)优选那些在超变区或互补决定区(CDR)内的残基而非位于所述区外的残基，这是由于据提示这些区域较少诱导病人的免疫源性应答。

5)通常，只考虑有可能增加所述抗体与所述抗原之间的电荷互补性的那些残基的变异。

因此，根据本发明优选的实施方案(在实施例中进一步阐明)，技术人员可鉴定一种或几种暴露的超变区氨基酸残基，它们位于与亲本抗体结合的抗原的约20的范围内，并用中性或带相反电荷的氨基酸残基取代一种或多种上述暴露的氨基酸残基。

虽然根据本文的标准本发明涉及单个氨基酸取代，优选组合2种或更多种取代，例如每个可变区约2种到约10种或约20种取代(即两个可变区分别高达约20个或约40个氨基酸取代)。文中增加抗体和抗原之间的电荷互补性的变异可以和超变区的其他氨基酸序列变异或抗体其它区的氨基酸序列变异组合。

在一个实施方案中，本发明的含有变异的超变区选自CDR L1，CDR L2，环H1(Loop H1)和CDR H3，最优选CDR L1。此外，可将两个或多个超变区，例如CDR L1，CDR L2，环H1和CDR H3中两个或多个的变异组合。例如，抗体变体可包含具有一种或多种在CDR L1中的变异的轻链可变区和具有一种或多种在环H1和/或CDR H3中的变异的重链可变区。

根据本发明的一方面，抗体变体或抗体可变区具有本发明的一种或更多取代，所述取代位于所述抗体轻链可变区氨基酸位置26L，27L，28L，30L，31L，32L，49L，50L，52L，53L，54L，56L，93L或94L中的一或多处和/或该抗体重链可变区氨基酸位置25H，28H，30H，54H，56H，61H，62H，64H，97H，98H，99H和/或100aH中的一个或更多个位置上。而且，这些位置上的取代可以组合。例如，可将所述抗体的轻链可变区的氨基酸位置26L，27L，28L或30L中的两个，三个或四个位置上的取代组合。技术人员可将修饰后的重链可变区(例如具有氨基酸位置28H和/或100aH的取代)和修饰后的轻链可变区(例如具有氨基酸位置26L，27L，28L和/或30L的取代)组合。这里的残基的编号是根据Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)进行的。

本发明还提供了根据本发明的方法可获得的抗体变体或修饰后的抗体可变区。优选，所述抗体变体或修饰后的抗体可变区包括该抗体超变区内或邻近处的氨基酸变异，所述变异可增加该抗体变体和其结合的抗原之间的电荷互补性。此类修饰后的可变区的实例包括，含有选自SATKKIKNYLN(SEQ ID NO：6)或SATKKITNYLN(SEQ ID NO：7)的CDR L1序列的轻链可变区，例如含有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链可变区；和包含T28D和S100aR取代，例如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的重链可变区。可选地，这些轻链和重链的可变区序列组合在一种抗体变体中，例如包含SEQ ID NO：4的轻链可变区序列和选自SEQ ID NO：5，8，9或10的重链可变区序列的抗体变体。优选，所述抗体变体的轻链可变区中包含SEQ ID NO：7所示CDR L1序列，而其重链可变区包含(T28D，S100aR)取代，这种取代组合在本文的实施例中被称为“34-TKKT”变体。这类取代(V_H-(T28，S100aR)+V_L-(S26T，Q27K，D28K，S30T))可在多种亲本抗体中制备，包括但不限于以下的抗-VEGF抗体：Y0101，Y0317，人源化抗-VEGF F(ab)-12，Y0192，Y0238-3，Y0239-19，Y0313-2，和VNERK突变体。例如，“34-TKKT+VNERK+H97Y”变体是通过将“34-TKKT”，“H97Y”和VNERK变体(轻链和重链的可变区分别为SEQID NOS：4和8)的变异组合而产生的。

可通过本领域已知的各种方法制备编码氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，对亲本抗体早期制备的变体或非变体形式(version)进行的寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变，以及盒式诱变。制备变体的优选方法是定点诱变(见例如Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1985))。而且，一旦想到所需氨基酸，就可用合成方法制备核酸序列。技术人员可通过肽合成，肽连接或其他方法制备所述抗体。

制备所述抗体变体后，可测定该分子相对亲本抗体的活性。如上所述，该过程涉及测定抗体的结合速率，和/或结合亲和力，和/或其他生物活性。在本发明优选的实施方案中，制备一组抗体变体并在一种或多种试验中筛选其结合速率和/或对抗原的结合亲和力和/或效力。对从首次筛选中选出的一种或多种抗体变体还可选进行进一步的一或多种功能测定，来确定所述抗体变体在一种以上的测定中具有改善的活性。

除了亲本抗体超变区内的上述变异外，技术人员可以在一个或更多个超变区的氨基酸序列中产生其他变异。例如，上述氨基酸变异可以和其他超变区残基的缺失，插入或取代组合。此外，可将FR残基的一种或多种变异(例如取代)引入亲本抗体中可导致抗体变体对抗原的结合亲和力提高的那些位置。可修饰的框架区残基的实例包括直接非共价地结合抗原的残基(Amit等，Science 233：747-753(1986))；与CDR的构象相互作用或影响CDR的构象的残基(Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；和/或参与形成V_L-V_H接触面的残基(EP 239 400B1)。这种氨基酸序列变异可存在于亲本抗体中，可与本文的氨基酸插入同时产生，或在具有本发明的氨基酸变异的变体生成后产生。本文还涉及所述亲本抗体或抗体变体的恒定区序列中的变异，例如改进或减弱抗体效应器功能的那些变异。见例如美国专利6,194,551B1；WO99/51642；Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)；WO00/42072(Presta)；和Shields等，J.Biol.CHem.9(2)：6591-6604(2001)，包含于文中作为参考。

所述抗体变体还可受到其它修饰，通常取决于该抗体的目的用途。此类修饰可以涉及进一步的氨基酸序列变异，与异源多肽融合和/或共价修饰。就氨基酸变异而言，关于示例性修饰的详述见上文。例如，任何不参与维持所述抗体变体的正确构象的半胱氨酸残基也可被取代，通常被丝氨酸取代，从而改进该分子的氧化稳定性并防止错误的交联。反之，可将半胱氨酸键加入该抗体以改进其稳定性(特别当该抗体是抗体片段例如Fv片段时)。另一种类型的氨基酸变体具有改变的糖基化模式。这可以通过消除该抗体的一个或更多个碳水化合物组分，和/或加入该抗体中原本不存在的一个或多个糖基化位点来实现。抗体的糖基化通常是N连接或O连接的。N连接指碳水化合物组分附着于天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物组分与天冬酰胺侧链酶促连接所需的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，多肽中出现这些三肽序列中的任何一个都会产生潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指N-乙酰半乳糖胺，半乳糖或木糖之一对羟基氨基酸(hydroxyamino acid)的附着，最通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。在抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或更多上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位置)来轻易实现。该改变也可通过在最初的抗体序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或被其取代(用于O-连接的糖基化位置)来实现。

制备抗体的技术如下(所述抗体可以是亲本抗体，从而需要根据本发明详述的技术进行修饰)：

A.抗体制备

(i)抗原制备

可溶性抗原或其片段，可选地与其他分子偶联的形式，可被用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体，其片段(例如受体的胞外区)可被用作免疫原。可选地，表达跨膜分子的细胞也可被用作免疫原。此类细胞可源自天然来源(例如癌细胞系)或可以是通过重组技术转化从而表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原和抗原形式对本领域技术人员是显而易见的。

(ii)多克隆抗体

优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中制备多克隆抗体。它可用来通过双功能制剂或衍生制剂将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白偶联，所述免疫原性蛋白例如匙孔血蓝蛋白(KLH)，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制物，所述双功能制剂或衍生制剂例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl₂，或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烷基基团。

通过将例如100μg或5μg蛋白或偶联物(分别对兔子或鼠而言)与3倍体积的弗氏(Freund′s)完全佐剂混合，并经皮内多位点注射该溶液，可以使动物对抗原、免疫原性偶联物、或衍生物致敏。一个月后，将含有1/5到1/10最初量的肽或偶联物的弗氏完全佐剂经皮下注射到多个位点，来给动物加强免疫。7到14天后，自动物取血并分析血清中抗体的滴度。给动物加强免疫指导达到滴度平台。优选用相同抗原但与不同的蛋白偶联和/或通过不同的交联剂进行偶联的偶联物给动物加强免疫。偶联物也可在重组细胞培养中产生为蛋白融合体形式。聚集剂例如明矾适宜用来增强免疫应答。

(iii)单克隆抗体

单克隆抗体可用Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤法制备或通过重组DNA法(美国专利4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠或短尾猿(macaque monkey)，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可在体外被免疫。然后随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。

由此制备的杂交瘤细胞被种于适宜的培养基并在其中生长，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。

优选骨髓瘤细胞为那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体、并对培养基例如HAT培养基敏感的细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell Distreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心(the American type culture collection)，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系也可用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur等，Moneclonal Antibody Production Techniques and Applications，(MarcelDekker，Inc.，New York纽约，(1987))51-63页)。

可在生长有杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。

产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞被鉴定后，这些克隆可通过有限稀释进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))使其生长。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。

上述亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典免疫球蛋白纯化方法如，例如，蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析从培养基，腹水或血清中分离。

使用传统方法(例如通过使用能与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)可轻易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，可以将它置入表达载体中，该载体随后被转染至宿主细胞例如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。抗体的重组制备详见下文。

在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的文章描述了通过链改组产生高亲和性(纳米级)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及将组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行(viable)选择。

还可以对所述DNA进行修饰，方法是例如，以人重链和轻链恒定区编码序列代替同源鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列融合。

通常这种非免疫球蛋白多肽可替代抗体的恒定区，或它们可替代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，该二价抗体包含对一种抗原具有特异性的抗原结合位点和对另一种抗原具有特异性的另一抗原结合位点。

(iv)人源化抗体和人抗体

人源化抗体具有一或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))所述，通过用啮齿类动物的CDR或CDR序列替换人抗体的对应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。

选择人源化抗体制备所用的人可变区轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适”方法，针对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。与啮齿类序列最接近的人序列作为人FR用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用基于特定亚群的人抗体序列的“共有”框架。同样的共有框架可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。

另外重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，根据优选方法，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型普遍可得，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，CDR残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。

可选地，现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(J_H)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到此类胚系突变小鼠中，经抗原攻击产生人抗体。见例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等，Nature 355：258(1992)。人抗体也可源自噬菌体展示文库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech14：309(1996))。

(v)抗体片段

已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biojphys.Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接产生。例如可自上述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，Fab′-SH片段可自大肠杆菌直接回收并利用化学方法偶联形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab′)₂片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。其它制备抗体片段的技术对本领域熟练技术人员是显而易见的。其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185。

(vi)多特异抗体

多特异抗体对至少两个不同的抗原具有结合特异性。虽然这类分子通常只结合两个抗原(即双特异抗体，BsAbs)，具有额外特异性的抗体例如三特异抗体也包含在本文所用的该术语中。BsAbs的实例包括一条臂针对肿瘤细胞抗原而另一条臂针对细胞毒激发(trigger)分子的那些抗体，例如抗FcγRI/抗CD15，抗p185^HER2/FcγRIII(CD16)，抗CD3/抗恶性B-细胞(1D10)，抗CD3/抗p185^HER2，抗CD3/抗p97，抗CD3/抗肾细胞癌，抗CD3/抗OVCAR-3，抗CD3/L-D1(抗结肠癌)，抗CD3/抗黑素细胞刺激激素类似物，抗EGF受体/抗CD3，抗CD3/抗CAMA1，抗CD3/抗CD19，抗CD3/MoV18，抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3，抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3，抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；BsAbs，其一条臂特异性结合肿瘤抗原且一条臂结合毒素，例如抗皂草素(saporin)/抗Id-1，抗CD22/抗皂草素，抗CD7/抗皂草素，抗CD38/抗皂草素，抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链，抗CEA/抗长春花碱；用于转化经过酶活化的前体药物的BsAbs，例如抗CD30/抗碱性磷酸酶(它催化磷酸丝裂霉素前体药物转化成醇丝裂霉素)；可用作纤维蛋白溶解剂的BsAbs，例如抗纤维蛋白/抗组织凝血酶原激活物(tPA)，抗纤维蛋白/抗尿激酶-型凝血酶原激活物(uPA)；将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAbs，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI，FcγRII或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的BsAbs，例如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)，抗T-cell受体：CD3复合物/抗流感病毒，抗FcγR/抗HIV；用于在体外或体内检测肿瘤的BsAbs，例如抗CEA/抗EOTUBE，抗CEA/抗DPTA，抗p185^HER2/抗半抗原；用作疫苗佐剂的BsAbs；和用作诊断工具的BsAbs，例如抗兔IgG/抗铁蛋白，抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素，抗生长抑素(somatostatin)/抗物质P，抗HRP/抗FITC。三特异抗体的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37，抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异抗体可被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，全长双特异性抗体的制备基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein and Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829(1993年5月13日公开)和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)。

依据另一种方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与免疫球蛋白重链恒定区融合，所述恒定区包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA，以及必要时，将编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，并共转染至适当的宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建时，能够较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。

在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。

根据WO 96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的接触面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的接触面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子接触面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的接触面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比不想要的终产物如同二聚体高。

双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂为本领域已知，并在美国专利4676980中和多种交联技术一同公开。

从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，Science，229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab′)₂片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的二巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇，再与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。

近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异抗体F(ab′)₂分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。

直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(V_H)，其通过接头与轻链可变区(V_L)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的V_H和V_L结构域被迫与另一片段上的互补V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。

本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异抗体。Tutt等J.Immunol.147：60(1991)。

(vii)示例性抗体

本发明范围内优选的抗体包括抗HER2抗体，包括rhuMAb 4D5(HERCEPTIN)(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利5,725,856)；抗CD20抗体例如美国专利5,736,137所述嵌合抗CD20“C2B8”(RITUXAN)，美国专利5,721,108，B1所述2H7抗体的嵌合或人源化变体或Tositumomab(BEXXAR)；抗IL-8(St John等，Chest，103：932(1993)，和国际公开WO95/23865)；抗VEGF抗体包括人源化的和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体，例如人源化的抗VEGF抗体huA4.6.1AVASTIN^TM(Kim等，Growth Factors，7：53-64(1992)，国际公开WO96/30046，和WO98/45331，1998年10月15日公开)；抗组织因子(TF)抗体(欧洲专利0420937B1，1994年11月9日授权)，包括人源化的和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体例如D3H44(WO01/70984)；抗PSCA抗体(WO01/40309)；抗CD40抗体，包括S2C6和其人源化变体(WO00/75348)；抗CD11a(美国专利5,622,700，WO98/23761，Steppe等，Transplant Intl.4：3-7(1991)，和Hourmant等，Transplantation 58：377-380(1994))；抗CD18(美国专利5,622,700，1997年4月22日授权或WO97/26912，1997年7月31日公开)；抗IgE(美国专利5,714,338，1998年2月3日授权或美国专利5,091,313，1992年2月25日授权；WO93/04173，1993年3月4日公开，1998年6月30日提交的国际申请PCT/US98/13410，美国专利5,714,338，Presta等，J.Immunol，151：2623-2632(1993)，和国际申请WO95/19181))；抗Apo-2受体抗体(WO98/51793，1998年11月19日公开)；抗TNF-α抗体，包括cA2(REMICADE)，CDP571和MAK-195(见美国专利5,672,347，1997年9月30日授权，Lorenz等，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)，和Dhainaut等，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗人α₄β₇整联蛋白(WO98/06248，1998年2月19日公开)；抗EGFR(嵌合的或人源化的225抗体，见WO96/40210，1996年12月19日公开)；抗CD3抗体，例如OKT3(美国专利4,515,893，1985年5月7日授权)；抗CD25或抗tac抗体，例如CHI-621(SIMULECT)和(ZENAPAX)(见美国专利5,693,762，1997年12月2日授权)；抗CD4抗体，例如cM-7412抗体(Choy等，Arthritis Rheum39(1)：52-56(1996))；抗CD52抗体，例如CAMPATH-1H(Riechmann等，Nature 332：323-337(1988))；抗Fc受体抗体，例如针对FcγRI的M22抗体，见Graziano等，J.Immunol，155(10)：4996-5002(1995)；抗癌胚抗原(CEA)抗体，例如hMN-14(Sharkey等，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995))；针对乳腺上皮细胞的抗体，包括huBrE-3，hu-Mc3和CHL6(Ceriani等，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等，Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体，例如C242(Litton等，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗CD33抗体例如Hu M195(Jurcic等，Cancer Res 55(23 Suppl)：5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771；抗CD22抗体，例如LL2或LymphoCide(Juweid等，Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗EpCAM抗体，例如17-1A(PANOREX)；抗GpIIb/IIIa抗体，例如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO)；抗RSV抗体，例如MEDI-493(SYNAGIS)；抗CMV抗体，例如PROTOVIR；抗HIV抗体，例如PRO542；抗肝炎抗体例如抗Hep B抗体OSTAVIR；抗CA 125抗体OvaRex；抗独特型GD3表位抗体BEC2；抗αvβ3抗体VITAXIN；抗人肾细胞癌抗体例如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体，例如Smart ID10或抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。

(viii)免疫偶联物

本发明还涉及免疫偶联物，它包含与细胞毒制剂偶联的本文所述抗体，所述细胞毒制剂例如化疗剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物源性的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶联物)。

上文已描述了用于产生此类免疫偶联物的化疗剂。可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括²¹²Bi，¹³¹I，¹³¹In，⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

抗体和细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glu tareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备。C¹⁴标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。

B.载体，宿主细胞和重组方法

本发明还提供了编码本发明公开的抗体变体的分离的核酸，包含该核酸的载体和宿主细胞，以及产生所述抗体变体的重组技术。

为重组产生抗体变体，可将编码它的核酸分离并插入可复制的载体中用以进一步克隆(DNA的扩增)或表达。使用传统的方法(例如通过使用能够特异结合编码抗体变体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可轻易分离编码所述抗体变体的DNA并对其进行测序。可获得多种载体。载体的组分通常包括但不限于，以下组分的一种或几种：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。此类载体组分的描述见WO00/29584，其包含于文中作为参考。

在本文载体中克隆或表达DNA的适宜宿主细胞包括原核生物细胞，酵母细胞，或更高等真核生物细胞。适宜这个目的的原核生物细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠细菌科如埃希氏菌属，如大肠杆菌，肠杆菌(Enterobacter)，欧文氏菌(Erwinia)，克雷伯氏菌(Klebsiella)，变形杆菌(Proteus)，沙门氏菌(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，和志贺氏菌(Shigella)，以及芽孢杆菌(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD266,710中地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌，和链霉菌(Streptomyces)。优选的E.coli克隆宿主是E.coli 294(ATCC31,446)，但其他菌株例如E.coli B，E.coli X1776(ATCC 31,537)，和E.coliW3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子用于说明而不是限制性的。

除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母也是编码抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或面包酵母(common baker′s yeast)是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属，种，和菌株通常是公众可得的并且可用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主(Kluyveromyces hosts)例如，乳克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragili)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威肯克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)，和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉(yarrowia)(EP 402,226)；巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyc)例如许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌例如，脉孢霉(Neurospora)，绿霉菌(Penicillium)，Tolypocladium，和曲菌(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulan)和黑曲霉(A.niger)。

适合表达糖基化抗体的宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多杆状病毒毒株和变体及其相应容许性昆虫宿主细胞，这些细胞来自以下宿主，例如秋粘虫(Spodopterafrugiperda)((蠋)caterpillar)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊(mosquito))，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊(mosquito))，黄果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇(fruitfly))，和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyxmori)的Bm-5毒株，此类病毒可以作为本发明的病毒具体用于转染秋粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花，玉米，马铃薯，大豆，矮牵牛，西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。

然而，最大的兴趣还在于脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞也成了常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆的293或293细胞，生长于悬浮培养中，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼年仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠足细胞(mouse sertoli cells)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。

利用上述用于产生抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在改良的传统培养基中培养宿主细胞，该改良的培养基适合用于诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

用来产生本发明的抗体变体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可购得的培养基例如Ham′s F10(Sigma)，极限必需培养基((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基((DMEM)，Sigma)适合培养所述宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；美国再版专利30,985中描述的任何培养基均适合用于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种在必要时都可添加激素/或其他生长因子(例如胰岛素，运铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如GENTAMYCIN^TM药物)，微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)，和葡萄糖或等价的能量来源。任何其他的必要添加剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度掺入。采用以前培养经选出的表达宿主细胞的诸如温度，pH等培养条件，这些条件对于本领域的普通技术人员是显而易见的。

使用重组技术时，所述抗体变体可产生在细胞内，在周质空间中，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体变体是产生在细胞内，首先要通过例如离心或超滤作用除去颗粒状残渣(为宿主细胞或溶解的片段)。如果抗体变体被分泌入培养基中，通常首先使用诸如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元等可购得的蛋白浓缩滤器浓缩这种表达系统的上清。例如PMSF等蛋白酶抑制剂也可用于上述任何一步中以便抑制蛋白水解，而且还可以加入抗生素防止外来污染物的生长。

从所述细胞中制备的抗体组合物可以利用诸如羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析等方法纯化，优选亲和层析纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性有赖于所述抗体变体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类或同种型。蛋白A可被用来纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。据称蛋白G可用于纯化所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质最常是琼脂糖，但也有其它基质。机械稳定的基质例如可控孔度玻璃(controlledpore glass)或聚苯乙烯二乙烯基苯(poly(styrenedivinyl)benzene)与琼脂糖相比，其流速更快且加工时间更短。如果所述抗体变体包含C_H3区，BakerbondABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。根据被回收的抗体变体，也可利用其他蛋白纯化技术，例如在离子交换柱上分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，硅层析，肝素SEPHAROSE层析，阳离子或阴离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。

C.药用配制剂

可以制备所述抗体变体的治疗配制剂用于保存，方法是将具有所需纯度的抗体变体与可选的生理可接受的载体，赋形剂，或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成冻干配制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度对受者无毒性，包括缓冲剂例如磷酸，柠檬酸及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本发明的配制剂还可以包括一种以上治疗具体适应症所需的活性化合物，优选活性互补但相互无副作用的那些。例如，可能希望进一步提供一种免疫抑制剂。这类分子以有效量联合存在。

活性成分也可包裹在通过诸如凝聚技术(coacervation technique)或接触面聚合而制备的微胶囊中，例如，分别在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳状液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。

用于体内给药的配制剂必需是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有所述抗体变体的固体疏水聚合物半通透基质，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron Depot^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化蛋白长时间停留在体内时，它们可能由于暴露在37℃潮湿环境中而变性或凝聚，导致损失生物活性，且免疫原性可能会改变。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定。

D.抗体变体的非治疗用途

本发明的抗体变体可用作亲和力纯化剂。在该方法中，使用本领域技术人员熟悉的方法将所述抗体固定于诸如Sephadex树脂或滤纸等固相上。固定的抗体变体与含有将要被纯化的抗原的样品接触后，用适宜的溶剂洗涤支持物，这样能够去除样品中除了待纯化的抗原以外的基本上所有物质，而抗原则与固定的抗体变体结合。最后，用另一种适合的溶剂例如甘氨酸缓冲液(pH＝5)洗涤支持物，使抗原从所述抗体变体中释放出来。

所述抗体变体也可用于诊断试验中，例如用于检测目的抗原在具体的细胞，组织或血清中的表达。

用于诊断时，所述抗体变体通常被可检测的组分标记。可以获得的多种标记通常分为以下几种：

(a)放射性同位素，例如³⁵S，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I。使用例如CurrentProtocols in Immunology，第1卷和第2卷，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs(1991)中所述的方法用放射性同位素标记所述抗体变体，并使用闪烁计数法测定放射活性。

(b)荧光标记物例如稀土元素螯合物(铕螯合物(europium chelates))或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红蛋白，和德克萨斯红(Texas Red)都是可以获得的。使用例如上述Current Protocolsin Immunology中的技术可将荧光标记物与所述抗体变体偶联。使用荧光计可定量荧光。

(c)可利用多种酶底物标记物，而且美国专利4,275,149提供了其中一些的综述。通常酶催化发色底物的化学改变，可由多种技术测定所述改变。例如，酶可催化底物变色，这可以用分光光度法进行测定。可选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。定量荧光改变的技术见上文。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态(electronically excited)，然后可以发射可测定的光(例如使用化学发光计)或将能量供给荧光受体。酶标记物的实例包括萤光素酶(例萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶，美国专利4,737,456)，虫萤光素，2，3-二氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。将酶偶联于抗体的技术在O′Sullivan等，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay，in Methods in Enzym中描述(J.Langone & H.Van Vunakis编)，Academic press，New York，73：147-166(1981)。

酶-底物组合物的实例包括，例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)以氢过氧化物酶作为底物，其中氢过氧化物酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺氢氯化物(3，3′，5，5′-tetramethyl benzidine hydrochloride)(TMB))；

(ii)碱性磷酸酶(AP)以对-硝基苯磷酸作为发色底物；和

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和发色底物(例如对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或发荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶。

本领域熟练技术人员熟悉多种其他抗体-底物组合。其综述见美国专利4,275,149和4,318,980。

有时，标记物与抗体变体间接地偶联。本领域熟练技术人员应理解有多种技术可实现所述连接。例如，抗体变体可以和生物素偶联而且上述三类标记物中的任何一种均可与抗生物素蛋白偶联，或反之。生物素与抗生物素蛋白选择性结合，从而使标记物与抗体变体以这种间接方式偶联。可选地，为使标记物和该抗体变体间接偶联，将所述抗体变体与小的半抗原(例如地高辛)连接，而且将上述不同类型的标记物的一种与抗半抗原抗体变体(例如抗地高辛抗体)偶联。由此可实现标记物与抗体变体的间接偶联。

在本发明的另一个实施方案中，所述抗体变体无需被标记，并且该抗体变体的存在可使用与抗体变体结合的标记抗体检测。

本发明的抗体可用于任何已知的实验方法，例如竞争结合试验，直接和间接夹心试验，和免疫沉淀试验。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manualof Techniques，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。

竞争结合试验有赖于标记的标准品与检验样品分析物竞争结合有限量的抗体变体的能力。检验样品中抗原的量与结合了抗体的标准品的量成反比。为更容易测定结合的标准品，通常在竞争前或竞争后降低所述抗体的溶解性，使得结合抗体的标准品和分析物可方便地从未结合抗体的标准品和分析品中分离出来。

夹心实验涉及使用两种抗体，每种均能够结合被测蛋白的不同免疫原部分或表位。在夹心试验中，测试样品分析物和固定在固相支持物上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，从而形成不溶的三部分复合物。见例如美国专利4,376,110。第二抗体自身可被可检测的组分标记(直接夹心试验)或可以使用可检测的组分标记的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心试验)该第二抗体。例如，夹心试验的一种类型是ELISA试验，在这种情况下，可检测的组分是酶。

就免疫组化而言，肿瘤样品可以是新鲜或冰冻的，或可以包埋于石蜡中并被例如福尔马林等防腐剂固定。

所述抗体也可用于体内诊断试验。通常，使用放射性核素(例如¹¹¹In，⁹⁹Tc，¹⁴C，¹³¹I，¹²⁵I，³H，³²P或³⁵S)标记抗体变体，使得利用免疫闪烁照相术可以定位该肿瘤。

E.诊断试剂盒

为方便起见，本发明的抗体变体可以提供在试剂盒中，所述试剂盒即预定量的试剂与进行诊断试验的说明书的组合包装。如果所述抗体变体是用酶标记的，所述试剂盒包括包括酶所需要的底物和辅因子(例如提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。此外，还可包括其他添加剂，例如稳定剂，缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可相差很大，以提供试剂在溶液中的这样一种浓度，该浓度基本上使该试验的敏感度最优化。具体地，所述试剂以干粉的方式被提供，通常是冻干的，并包含赋形剂，它在溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液。

F.抗体变体的体内应用

用于治疗时，以可药用的(例如上述的)剂量形式将本发明的抗体变体给药哺乳动物，优选人，包括经集合药团(bolus)或一定期间内持续输注的方式静脉给药，经肌内、腹腔、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径给药。所述抗体还可通过肿瘤内，肿瘤周，病灶内，或病灶周途径适宜地被给药，以发挥局部和系统治疗效果。预期腹腔途径在例如治疗卵巢肿瘤中尤其有效。此外，所述抗体变体还可适宜地通过脉冲输注的方式给药，尤其是以所述抗体变体的递减剂量。优选通过注射给药，更优选通过静脉内或皮下注射给药，给药方式是部分有赖于所述给药是短暂的还是长期的。

为防止或治疗疾病，抗体变体的适当剂量有赖于被治疗的疾病类型，疾病的严重性或病程，给药所述抗体变体是为了预防目的或是治疗目的，以前的治疗，病人的临床病史和病人对所述抗体变体的反应，以及主治医师的判断力。所述抗体变体适合一次给药患者或在一系列治疗中给药。

本发明的实施例涉及抗VEGF抗体。抗VEGF抗体可用于治疗多种肿瘤和非肿瘤疾病和病症。可治疗的肿瘤和相关疾病包括乳腺癌，肺癌，胃癌，食道癌，结肠直肠癌，肝癌，卵巢癌，泡膜细胞瘤，睾丸细胞癌，宫颈癌，子宫内膜癌，子宫内膜增生，子宫内膜异位症，纤维肉瘤，绒癌，头和颈癌，鼻咽癌，喉癌，肝母细胞瘤(hepatoblastoma)，Kaposi′s肉瘤，黑素瘤，皮肤癌，血管瘤，海绵状血管瘤(cavernous hemangioma)，血管母细胞瘤(hemangioblastoma)，胰腺癌，视网膜母细胞瘤，星状细胞瘤，神经胶质母细胞瘤，神经膜细胞瘤(Schwannoma)，寡突细胞瘤，成神经管细胞瘤，成神经细胞瘤(neuroblastomas)，横纹肌肉瘤，成骨肉瘤，平滑肌肉瘤，尿道癌，甲状腺癌，肾胚细胞瘤(wilm′s tumor)，肾细胞癌，前列腺癌，与母斑症(phakomatoses)相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，和梅格式综合征(Meigs′symdrome)。

可治疗的非肿瘤性病症包括类风湿性关节炎，银屑病，动脉粥样硬化症，糖尿病和其它增生性视网膜病，包括幼年视网膜病(retinopathy ofprematurity)，晶状体后纤维增生(retrolental fibroplasia)，新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)，老年黄斑变性(age-related macular degeneration)，甲状腺增生(包括Grave′s病)，角膜和其他组织移植，慢性炎症，肺炎，肾病综合症，子痫前期(preeclampsia)，腹水，心包积液(例如与心包炎相关的)，和胸膜腔积液。

老年黄斑变性(AMD)是导致老年人群严重视力丧失的首位原因。渗出型AMD的特征是脉络膜新生血管形成和视网膜色素上皮细胞脱离。由于脉络膜新生血管形成与预后显著恶化有关，预计本发明的VEGF抗体在降低AMD的严重性中特别有用。

根据疾病的类型和严重性，通过例如一次或多次分别给药或通过持续输入用药的起始候选剂量是约1ug/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体变体。代表性的日剂量可由约1ug/kg到100mg/kg或更多，随上述因素的变化而不同。对于几天或更长时间的重复给药，根据情况，治疗将持续有到出现所需的对疾病症状的抑制。然而，也可使用其他剂量方案(dosage regime)。本治疗的进展可容易地通过传统技术和方法监控。由于所述抗体变体的结合速率的改进，预期可给药更低剂量的所述抗体变体(与其亲本抗体相比)。

抗体变体组合物可以根据与良好医疗实践一致的方式配制，定量和给药。本文所考虑的因素包括被治疗的具体疾病，被治疗的具体哺乳动物，该病人的临床情况，疾病的病因，递送所述试剂的位点，给药方法，给药时序，以及医师已知的其他因素。将要给药的抗体变体的“治疗有效量”受这些因素的控制，并且是预防，改善或治疗疾病或病症的最小需要量。所述抗体变体无需，但可选地与目前用来预防或治疗目的疾病的一种或多种试剂一起配制。这种其他试剂的有效量有赖于所述抗体变体在配制剂中的量，疾病或治疗的类型，以及上述的其他因素。通常使用的这些试剂的剂量和给药途径与上文所述的相同，或者为以前所用剂量的约1％到99％。

G.制品

在另一本发明实施方案中，提供了含有对治疗上述病症有用的物质的制品。该制品包含容器和标签。适宜容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器，和试管。该容器可用各种物质如玻璃或塑料形成。该容器保存有一种组合物，它对治疗所述疾病有效，该容器还可以有无菌通道入口(例如该容器可以是静脉内注射溶液袋或具有用皮下注射针可穿透的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是该抗体变体。在容器上的或与容器相关的标签表明该组合物可用来治疗所选疾病。该制品可以还包含第二个容器，它含有可药用缓冲液，如磷酸盐缓冲液，林格溶液(Ringer′s solution)，和葡萄糖溶液。它还可包括商业需要和用户所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤器，针，注射器和带有使用说明书的包装插页。

H.抗原结合速率试验

本申请还描述了可用于测定抗体(例如本发明描述的抗体变体)的抗原结合速率的测定法。该方法具体适合具有较低的结合速率的抗体(例如其抗原结合常数慢于约10⁵M^-1秒^-1或慢于约10⁶M^-1秒¹的那些抗体)，从而使抗体-抗原复合物的形成可随时间定量。具有慢的抗原结合常数的抗体的一个实例是结合VEGF的抗-VEGF抗体，可由本发明涉及的多种抗-VEGF抗体作为例证。

本发明的测定法包括(1)使抗体和抗原在溶液中混合，并且然后(2)测定抗体-抗原复合物随时间的形成。因此，在抗体和抗原混合后测定复合物的形成。复合物随时间的形成可用各种方法测定，例如所述复合物的荧光或吸收，或使用NMR。然而，根据优选的实施方案，所述方法的第二步包括测定所述抗体-抗原复合物随时间的荧光发射强度。当抗体或抗原包含位于抗原-抗体结合接触面的色氨酸残基时，技术人员可测定该色氨酸残基的荧光发射强度(当色氨酸残基包埋于结合接触面中时强度改变)，从而实现上述第二步。荧光发射强度可使用约280-310nm(例如295nm)的激发波长检测，并且可检测在约330-360nm(例如约340nm)波长的发射强度。

以下实施例只用来举例，而不是用来在任一方面限制本发明的范围。本说明中所有专利的公开内容和引用的参考文献的全文均包含在此作为参考。

实施例1

本实施例证明了，通过一系列标准鉴定潜在的结合速率(on-rate)扩增位点，从而将靶位点总数降低到实验可处理的数量，在上述条件下，无需大量的计算，可将静电转向(electrostatic steering)的原理用于增加抗体与其抗原结合的结合速率。具体的实例是修饰抗-VEGF Y0101抗体的Fab片段(图1A-B)。由基于荧光的分析鉴定出在指定靶位点发生了突变的Fab Y0101，它们的结合速率提高了将近一个数量级。此外，观察到Fab-VEGF复合物的结合速率与通过计算Debye-Huckel反应能量所预计的结合速率没有相关性。预期结合速率较快的Fab Y0101变体由于具有更高的亲和力而可以作为更强的VEGF拮抗剂，而且还由于较快的结合而更为有效。后一性质的重要性不应被忽视(understated)，因为Fab Y0101-VEGF复合物的结合与解离速率比通常的蛋白-蛋白相互作用慢几个数量级(Chen等Journal ofMolecular Biology 293(4)：865-81(1999)；Gabdoulline等Journal ofMolecular Biology 306(5)：1139-55(2001))。本文所述鉴定ON-RAMPS的标准足以指导抗体片段的再设计，使其具有对其抗原增强的结合和整体结合亲和力。

材料和方法

鉴定On-Rate扩增位点(On-RAMPS)

在抗体片段(Fab)中有约445个残基，提高其与配体的结合速率的一个步骤涉及鉴定以下残基，当所述残基发生突变以增加电荷互补性时，会显著改变两个蛋白质间的静电作用。以下标准用于鉴定这些“结合速率扩增位点”(On-RAMPS)。

1)所述残基侧链表面积的至少三分之一暴露于溶剂，因为被包埋的残基的突变可降低Fab的稳定性。

2)所述残基在结合态VEGF的至少16内，这是由于静电引力作为距离的函数会衰减。

3)所述残基不与结合态的VEGF直接接触，这是由于直接接触的残基的突变会降低结合复合物的稳定性。

4)位于互补决定区(CDR)内的残基比不位于该区内的残基更优选，这是由于据称前者较不可能诱导病人体内的免疫源性反应。

5)只考虑可能增加Fab和其抗原之间的电荷互补性的残基。例如可使Y0101的V_L-D28突变以中和(D28N)或逆转(D28K)其电荷，从而更好地与带负电的抗原互补，而不能使残基V_H-K64突变来增加其正电荷。

诱变，蛋白表达和纯化

制备短VEGF(8-109)形式(Christinger等，Proteins 26(3)：353-7(1996))。已有关于构建和纯化Fab突变变体的方法的描述(Muller等Structure 6(9)：1153-67(1998))。简言之，通过Kunkel(Kunkel，T.A.，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA 82(2)：488-92(1985))公开的方法进行寡核苷酸定点诱变产生点突变。Fab在非抑制物(non-supressor)大肠杆菌细胞系34B8(Baca等Journal of Biological Chemistry 272(16)：10678-84(1997))中诱导表达，在对回收的细胞进行渗压震扰(osmotic shock)后，Fab用蛋白G树脂(Amersham)通过亲和层析进行纯化。通常产量为每升生长物(growth)2 nmoles Fab。

结合速率测定

在本文的实验中，将VEGF加入振荡的小杯中，所述小杯含约10nM Fab的25mM Tris pH 7.2溶液，维持在37℃，使用8000-series SLM-Aminco分光光度计(THERMOSPECTRONIC)测定荧光发射强度(λ_激发＝295nm；λ_发射＝340nm，16nm带通(bandpass))。

解离速率实验

根据文献(Muller等Structure 6(9)：1153-67(1998))，在BIACORE-2000仪(BIAcore，Inc.)上通过表面胞质基因共振(surface plasmon resonance)测定解离速率。在约10个共振-反应单位(resonance-response units)处，通过将胺偶联于B1芯片(chip)来固定VEGF。在1μM，500nM，250nM，125nM，62.5nM，和31.3nM测定Fab的结合。按一对一结合模型(one-to-one bindingmodel)计算解离。所有试验均在37℃磷酸缓冲盐溶液pH 7.2中以20μL min-1的流速进行，所述盐溶液含有0.05％Tween-20和0.01％NaN3。

结果

结合速率试验的发展

尽管表面胞质基因共振技术已被证明适合亲和力测定，具体结合反应的变体之间的微小差异可能由于多种原因而未被注意到，原因包括流体动力学的复杂性(Fivash等Current Opinion in Biotechnology 9(1)：97-101(1998))和非特异性胺偶联(Kortt等Analytical Biochemistry 253(1)：103-11(1997))以及仅仅不能准确确定正确折叠且有活性的蛋白的浓度。

由于本发明的工作涉及抗-VEGF Fab的变体之间结合速率的差异，因此开发出一种技术，其敏感度足以检测出结合速率之间的微小差异，所述差异可指示溶液中的反应，并且与各种Fab变体的浓度无关。

色氨酸残基的荧光特性对其局部环境是敏感的(Lakowicz，J.R.(1999)。Principles of fluorescence spectroscopy.第二版，Kluwer Academic Press，NewYork，N.Y)。如该研究所用的VEGF和抗VEGF Fab的共同结构(co-structure)(Muller等Structure 6(9)：1153-67(1998))所示，Fab中有三个色氨酸与结合态的VEGF接触，且所述色氨酸的荧光特性可以随着从非结合态到结合态的改变而变化。VEGF中没有色氨酸，但有两个酪氨酸和一个苯丙氨酸，它们形成了与Fab之间的结合接触面(Muller等Structure 6(9)：1153-67(1998))，如果被激发，上述氨基酸可产生荧光光谱。为避免这种潜在的错误来源，使用295nm的激发波长进行荧光测定，该波长与酪氨酸和苯丙氨酸的激发光谱的重叠最小(Lakowicz，J.R.Principles of fluorescencespectroscopy，第二版，Kluwer Academic Press，New York，N.Y(1999))。

Fab-VEGF复合物的荧光强度比各组分单独的荧光强度的和更大(图2)。荧光强度的增加率可做成单指数曲线(single exponential curve)(图3)。将观察到的速率作为VEGF浓度的函数进行绘图，这样可以进行次一级分析(pseudo-first-order analysis)，反应的斜率是k₁，y-截距是k_-1(图4)(Johnson，K.A.Transient-state kinetic analysis of enzyme reaction pathways。In TheEnzymes，20卷：1-61页，Academic Press，Inc.(1992))。

鉴定On-RAMPS

通过应用上述的标准，潜在诱变位点的数目从445个残基减少到22个(表1)。第一个标准，即暴露于溶剂，将该数目减少到173。第二个标准，即在VEGF的16内，将该数目减少到47。第三个标准，即不直接接触VEGF，将该数目减少到31。第四个标准，即所述残基位于CDR内，将该数目减少到23。最后一个标准消除了一个附加的残基(V_H-K64)，这是由于它与带负电的VEGF的电荷互补性不能被增加。根据Schreiber等(2000)Nat.Struct.Biol.7：537-41的方法，计算这些残基中每一个残基突变后与带正电残基的预期结合速率。

            表1.Fab Y0101的潜在ON-RAMPS

残基	％SASA	与VEGF的最小距离()	计算的结合速率(相对于野生型)
				轻链
Ser 26	38	15.7	1.2
				Gln 27	58	11.8	1.1
Asp 28	66	13.4	1.4
				Ser 30	50	11.2	1.3
Asn 31	44	12.5	1.2
				Tyr 32	48	6.3	1.1
Phe 50	43	9.7	1.2
				Ser 52	60	15.3	1.2
Ser 53	42	10.4	1.2
				Leu 54	37	13.9	1.1
Ser 56	90	10.5	1.1
				Thr 93	56	6.9	1.1
Val 94	34	3.9	1.1
				重链
Ser 25	54	15.1	1.1
				Thr 28	69	6.4	1.1
Thr 30	36	5.9	1.2
				Thr 54	36	4.4	1.2
Glu 56	80	6.5	1.6
				Ala 61	93	11.4	1.1
Asp 62	87	15.3	1.1
				Tyr 99	84	3.5	1.6
Ser 100a	68	4.9	1.3

根据Kabat系统(Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))为残基编号。使用1.4的探测半径(probe radius)计算％SASA。

观察到的结合速率

由于VEGF的净形式电荷(net formal charge)是-10(通过将N-末端，赖氨酸和精氨酸赋值为+1，且C末端，天冬氨酸和谷氨酸赋值为-1计算得到)，在结合接触面周围进行突变使得Fab上的净正电荷(野生型＝+2)增加。这些残基的突变导致结合速率增加到Y0101的两倍(表2)。另一方面，暴露于溶剂但不在VEGF的16内的残基的突变(表2，未定性)显示很小的变化，表明ON-RAMPS标准的作用。抗-VEGF Fab的结合速率进一步增加可通过突变多个残基来实现(表3)，其中结合最快的变体“34-TKKT”(V_H-(T28D，S100aR)+V_L-(S26T，Q27K，D28K，S30T))的结合速率比Y0101快6倍。反之，导致电荷排斥的突变造成结合速率的降低(表3：突变体V_L-S26E，Q27E，D28E，S30E和突变体V_L-T51E，S52E，S53E，L54E)。

                        表2：单突变的结合常数

突变	k1(×105M-1秒-1)	k-1(×10-4秒-1)0M NaCl	k-1(×10-4秒-1)0.15M NaCl	Kd(×10-9M)
					Y0101(野生型)	5.4±0.3	3.9±1.1	1.3±0.5	0.7
轻链				-
					R18Q*	4.8	3.8±0.5	0.9±0.3	0.8
R18E*	5.2	2.6±0.7	0.9±0.2	0.5
					S26K	7.4	3.3±0.5	0.6±0.3	0.4
Q27K	6.7	4.0±0.4	0.7±0.4	0.6
					D28K	7.0	3.3±0.2	0.9±0.4	0.5
D28N	6.5	2.8±0.8	0.9±0.3	0.4
					S30K	9.7	3.3±0.5	0.3±0.1	0.3
S30N	5.5	3.3±0.4	0.9±0.3	0.6
					N31K	6.9	3.3±0.5	0.3±0.2	0.5
N31R	7.8	3.8±0.2	0.4±0.2	0.5
					Y32K	7.3	2.5±0.4	0.4±0.2	0.3
Y32R	7.1	LE	LE	-
					S52K	6.2	3.8±0.2	0.6±0.2	0.6
S53K	8.0	3.8±0.2	0.5±0.2	0.5
					L54K	4.4	LE	LE	-
V94E	1.3	10.1±1.0	4.4±0.8	7.8
					E195R*	4.9	BG	LE	-
E195Q*	5.9	5.3±2.5	1.5±0.7	0.9
					E195L*	7.3	BG	0.6±0.2	-
重链				-
					T28K	3.6	LE	LE	-
T28R	4.0	4.8±0.4	LE	1.2
					T28E	7.8	4.8±0.3	1.0±0.1	0.6
T28D	10.	2.9±0.2	0.8±0.3	0.3
					T30D	6.0	2.6±1.4	1.0±0.1	0.4
T30E	4.8	7.2±0.3	1.4±0.2	1.5
					E56K	4.8	4.4±0.3	LE	0.9
Y99K	3.8	1.5±1.2	1.4±0.3	0.4
					Y99R	6.0	1.4±1.3	1.6±0.3	0.2
S100aR	8.7	2.4±0.8	0.7±0.1	0.3
					D218N*	4.9	BG	0.8±0.2	-
D218K*	5.3	BG	0.6±0.4	-

根据Kabat系统(Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))为残基编号。通过基于荧光的实验(fluorescence-based assay)测定k₁(三个实验的±标准差，仅野生型)。通过表面胞质基因共振(12个实验的±标准差)测定k_-1。k₁和k_-1(0M NaCl)试验在25mM Tris，pH 7.2，37℃的条件下进行。k-1(0.15M NaCl)试验在25mM Tris，150mM NaCl，25℃的条件下进行。从0M NaCl的数据中计算K_d。^*，没有达到ON-RAMPS标准的残基；LE，Fab限制性分析低表达(low expression of Fab limited analysis)；BG，本底结合，用于控制SPR数据的对照流动细胞限制性分析(background binding to control flowcell limited analysis of SPR data)。

                      表3.多重突变的结合常数

突变	k1(×105M-1秒-1)	k-1(×10-4秒-1)0M NaCl	k-1(×10-4秒-1)0.15M NaCl	Kd(×10-9M)
					轻链
S26E，Q27E，D28E，S30E	2.6	5.1±0.8	0.8±0.2	2.0
					S26K，Q27K，D28N，S30T	6.1	BG	LE	-
S26K，D28K，S30K	13	LE	LE	-
					S26K，Q27K，D28N，S30K	13	BG	0.7±0.1	-
S26K，Q27K，D28K，S30T	21	BG	0.4±0.1	-
					S26T，Q27K，D28K，S30K	25±1.0	BG	0.6±0.1	-
S26T，Q27K，D28K，S30T	29±2.9	BG	0.6±0.1	-
					T51E，S52E，S53E，L54E	3.3	4.4±1.0	40.8±14.7	1.3
S52K，S53K，L54T	13	BG	LE	-
					S26K，Q27K，D28K，S30K，T51K，S52K，S53K，L54K	24	7.8±1.1	0.9±0.2	0.3
重链
					T28D，S100aR	14	BG	1.1±0.3	-
最快地结合变体
					34-TKKT	33±3.9	2.6±1.2	0.2±0.1	0.08

根据Kabat系统(Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))为残基编号。通过基于荧光的实验测定k₁(三个实验的±标准差)。通过表面胞质基因共振(12个实验的±标准差)测定k_-1。k₁和k₁(0M NaCl)的试验在25mMTris，pH 7.2，37℃的条件下进行。k_-1(0.15M NaCl)的试验在25mM Tris，150mM NaCl，25℃的条件下进行。从0M NaCl的数据中计算K_d。34-TKKT，突变体V_H-(T28，S100aR)+V_L-(S26T，Q27K，D28K，S30T)；LE，Fab限制性分析低表达；BG，本底结合，用于控制SPR数据的对照流动细胞限制性分析。

观察到的结合速率与计算得到的结合速率的比较

据称计算Debye-Huckel静电作用能量可有力且精确地预测结合速率(Selzer，T.& Schreiber，G.Journal of Molecular Biology 287(2)：409-19(1999))。公众可在英特网址(http://www.weizmann.ac.il/home/bcges/PARE.html)获得Selzer和Schreiber所用的程序。利用该程序并根据他们的指导，可计算本发明中构建的不同变体的结合速率用来与试验测定的值进行比较。k_obs对k_calc作图表明两者之间的相关性很小，R值为0.46(图5)。

结合速率的盐依赖性

为说明不同变体之间的结合速率的差异是由Fabs和VEGF之间的静电作用而不是结合接触面的总体结构重排造成的，我们测量了野生型FabY0101和34-TKKT在不同的盐浓度的结合速率(图7)。结合最快的变体和Y0101在150mM NaCl中两者结合速率的差异小于2倍。

重要的是，从复合物的结构中计算出来的Fab和VEGF之间的反应静电能量(Y0101＝0.28 kcal mol^-1，34-TKKT＝-1.07 kcal mol^-1)是正确的预期(ofthe correct sign)(尽管数量级不同)，其值可从图7的斜率中计算出来。(Y0101＝0.86 kcal mol^-1，34-TKKT＝-4.0 kcal mol^-1)。

快速结合变体与其他亲和力成熟的变体的组合

上述快速结合变体(on-rate variant)可以和其他所鉴定的变体组合以获得更大的结合亲和力。例如，最快的结合变体“34-TKKT”可以和已知的抗VEGF变体例如Fab-12，VNERK或Y0317结合。可产生额外的序列变异以进一步优化该分子的结合亲和力和其他物理或化学特性。图6A和6B提供了三个这种“组合”变体的比对，其中“34-TKKT”的取代与VNERK插入，或与H97Y取代，或与VNERK插入和H97Y取代一起出现。预期产生的变体对VEGF具有更大的结合亲和力并因此当被用作VEGF的治疗性拮抗剂时，具有更好的效力。

实施例2

上述鉴定On-RAMPS和产生具有更快的结合速率的变体(在有关抗VEGF抗体的上下文中)的原理，可类似地被用于其它抗体变体，包括但不限于抗TF和抗HER2抗体变体。

在起始步骤中，使用类似于实施例1中所述的标准和算法，用亲本抗TF抗体D3H44(图8；轻链和重链可变区分别为SEQ ID NOS 11和12)和亲本抗HER2抗体4D5(图9；轻链和重链可变区分别为SEQ ID NOS 13和14)来鉴定潜在的ON-RAMPS。表4和表5分别列出了作为抗TF D3H44和抗HER2 4D5的潜在ON-RAMPS的第一套残基，以及对这些残基中每一个的单突变(single mutations)，并计算出突变体相对于野生型的结合速率。根据Schreiber等(2000)Nat.Struct.Biol.7：537-41的方法计算结合速率。使用类似的方法和算法对其它ON-RAMPS进行进一步修饰(refinements)，突变和鉴定。

    表4.D3H44的潜在ON-RAMPS和单突变

突变	计算的结合速率(相对于野生型)
		VL-K30M	1.2
VL-K30E	1.5
		VL-Y49E	1.5
VL-Y50E	2.0
		VL-S53D	1.5
VH-K30D	1.7
		VH-K30E	1.4
VH-Q54E	0.9
		VH-N56K	0.5
VH-K62E	1.7
		VH-K62D	1.7
VH-Q64E	1.7
		VH-A97D	4.8

根据Kabat系统(Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))为残基编号。

   表5.D3H44的潜在ON-RAMPS和单突变

突变体	计算的结合速率(相对于野生型)
		VL-Q27K	1.5-1.6
VL-D28K	8.0-20.0
		VL-S52K	1.8-2.3
VL-S56K	1.4-2.0
		VH-D98K	4.1-6.6

根据Kabat系统(Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))为残基编号。

鉴定ON-RAMPS并设计相应的单独或多个突变后，根据实施例1所述的方法观察并计算所得变体的结合速率，解离速率和总体结合亲和力。

然而具体地对于抗TF变体，由于TF和抗TF的结合太快而无法在振荡的试管(stirred cuvette)中观察到，因此，使用停流分光光度计(stopped-flowspectrophotometer)(Aviv)测定荧光发射强度(λ_激发＝280nm，2nm带通；λ_发射＞320nm，)。将50μL 100nM抗TF溶液溶于10mM HEPES，pH 7.0，25℃，然后迅速与50μL含有0nM，100nM，200nM，300nM，400nM，500nM，600nM，700nM，800nM，或900nMTF的溶液混合，在2秒钟内观察荧光的变化。荧光强度的变化速率符合单指数曲线。将观察的速率作为TF浓度的函数作图，从而确定结合速率。该直线的斜率即结合速率(表示为M^-1sec^-1)。

Claims (61)

1.制备抗原特异性亲本抗体的抗体变体的方法，包括以下步骤：

a)鉴定所述亲本抗体可变区内的靶氨基酸残基，所述靶氨基酸残基是1)溶液中暴露的残基；2)位于超变区内或与超变区相邻；和3)在与该亲本抗体结合的抗原的20范围内；和

b)用不同的取代氨基酸残基取代步骤a)中的靶残基，使得所述抗体和抗原之间的电荷互补性增加。

2.权利要求1中的方法，其中所述靶残基与抗原结合时不直接接触该抗原。

3.权利要求1的方法，其中所述靶残基侧链表面积的至少约三分之一暴露于溶剂。

4.权利要求1的方法，其中所述靶残基与抗原结合时在该抗原的至少约16内。

5.权利要求1的方法，其中所述亲本抗体是人源化抗体，人抗体或嵌合抗体。

6.权利要求1的方法，其中所述亲本抗体是抗体片段。

7.权利要求6的方法，其中所述抗体片段是Fab片段。

8.权利要求1的方法，其中所述抗体变体比其亲本抗体对其抗原具有更强的结合亲和力。

9.权利要求8的方法，其中所述抗体变体的结合亲和力比其亲本抗体的结合亲和力至少强约两倍。

10.权利要求1的方法，其中所述抗体变体比其亲本抗体具有更快的抗原结合速率。

11.权利要求10的方法，其中所述抗体变体的结合速率比其亲本抗体的结合速率快至少约5倍。

12.权利要求10的方法，其中所述抗体变体的结合速率比其亲本抗体的结合速率快至少约10倍。

13.权利要求1的方法，其中所述抗体变体与其亲本抗体相比，其超变区内具有约1-20个取代。

14.权利要求13的方法，其中每种取代均增加所述抗体和抗原之间的电荷互补性。

15.权利要求1的方法，其中所述抗原是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。

16.权利要求15的方法，其中所述亲本抗体包含人源化抗VEGF抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗VEGF抗体选自以下抗体：Y0101，Y0317，F(ab)-12，Y0192，Y0238-3，Y0239-19，Y0313-2，和VNERK。

17.权利要求1的方法，其中所述取代位于超变区内，所述超变区选自：CDR L1，CDR L2，环H1和CDR H3。

18.权利要求16的方法，其中所述取代位于该亲本抗体轻链可变区的氨基酸位置26L，27L，28L，30L，31L，32L，50L，52L，53L，54L，56L，93L或94L中的一个或多个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

19.权利要求18的方法，其中所述取代在该亲本抗体轻链可变区的氨基酸位置26L，27L，28L或30L中的两个或多个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

20.权利要求19的方法，其中所述取代在该亲本抗体轻链可变区的氨基酸位置26L，27L，28L或30L中的三个或四个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

21.权利要求16的方法，其中所述取代在该亲本抗体重链可变区的氨基酸位置25H，28H，30H，54H，56H，61H，62H，99H或100aH中的一个或多个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

22.权利要求1的方法，其中所述抗原是组织因子(TF)。

23.权利要求22的方法，其中所述亲本抗体包括人源化抗TF抗体的重链可变区和轻链可变区。

24.权利要求23的方法，其中所述人源化抗TF抗体是D3H44。

25.权利要求23的方法，其中所述取代在该亲本抗体轻链可变区的氨基酸位置30L，49L，50L，53L中至少一个或多个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

26.权利要求25的方法，其中所述亲本抗体的轻链可变区是SEQ IDNO：11。

27.权利要求23的方法，其中取代在该亲本抗体重链可变区的氨基酸位置30H，54H，56H，62H，64H或97H中至少一个或多个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

28.权利要求27的方法，其中所述亲本抗体的重链可变区是SEQ IDNO：12。

29.权利要求1的方法，其中所述抗原是HER2。

30.权利要求29的方法，其中所述亲本抗体包括人源化抗HER2抗体的重链可变区和轻链可变区。

31.权利要求30的方法，其中人源化的抗HER2抗体是rhuMAb 4D5。

32.权利要求30的方法，其中取代在该亲本抗体轻链可变区的氨基酸位置27L，28L，52L或56L中的至少一个或多个氨基酸位置上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

33.权利要求32的方法，其中所述亲本抗体的轻链可变区是SEQ IDNO：13。

34.权利要求30的方法，其中取代至少在亲本抗体重链可变区的氨基酸位置98H上，所述氨基酸位置是根据Kabat的残基编号系统编号的。

35.权利要求34的方法，其中所述亲本抗体的重链可变区是SEQ IDNO：14。

36.权利要求1的方法，包括在包含编码所述抗体变体的核酸的宿主细胞中制备该抗体变体。

37.权利要求36的方法，包括将通过所述宿主细胞制备的抗体变体与异源分子偶联。

38.根据权利要求36的方法制备的抗体变体。

39.亲本抗体的抗体变体，所述变体包含位于该亲本抗体超变区内部或其邻近处的氨基酸改变，该改变可增加所述抗体变体与其结合的抗原之间的电荷互补性。

40.权利要求39的抗体变体，其中所述改变是位于其亲本抗体的超变区内的氨基酸取代。

41.权利要求39的抗体变体，其中所述改变是位于其亲本抗体的超变区内或与邻近处的氨基酸插入序列，其中所插入的氨基酸不与抗原结合。

42.权利要求39的抗体变体，其中所述抗原是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。

43.权利要求42的抗体变体，所述变体包含的轻链可变区含有选自SATKKIKNYLN(SEQ ID NO：6)或SATKKITNYLN(SEQ ID NO：7)的CDRL1序列。

44.权利要求43的抗体变体，所述变体包含的轻链可变区含有SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

45.权利要求42的抗体变体，所述变体包含的重链可变区含有SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

46.权利要求39的抗体变体，其中所述抗原是组织因子(TF)。

47.权利要求46的抗体变体，其中所述亲本抗体是D3H44。

48.权利要求39的抗体变体，其中所述抗原是HER2。

49..权利要求48的抗体变体，其中所述亲本抗体是4D5。

50.一种组合物，它包括权利要求39的抗体变体和可药用的载体。

51.分离的核酸，它编码权利要求39的抗体变体。

52.包含权利要求51的核酸的载体。

53.由权利要求51的核酸转化的宿主细胞。

54.制备抗体变体的方法，包括培养权利要求53的宿主细胞使得所述核酸被表达。

55.权利要求54的方法，进一步包括从所述宿主细胞培养物回收所述抗体变体。

56.权利要求55的方法，其中所述抗体变体是从宿主细胞培养基回收的。

57.测定抗体的抗原结合速率的方法，包括以下步骤：

(1)在溶液中使抗体和抗原混合，然后；

(2)随着时间变化测定抗体-抗原复合物的形成。

58.权利要求57的方法，其中步骤(2)包括测定所述抗体-抗原复合物的荧光发射强度。

59.权利要求57的方法，其中所述抗体或抗原在抗原-抗体结合接触面包含色氨酸残基，而且步骤(2)测定了所述色氨酸残基的荧光发射强度，当该色氨酸残基被包埋时，该色氨酸残基的荧光发射强度发生改变。

60.权利要求57的方法，其中所述抗原是血管内皮细胞生长因子。

61.权利要求57的方法，其中所述抗体具有慢于105M-1秒-1的抗原结合常数。

Images