CN1673391A - 一种检测多药耐药基因多态性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医学检验领域，涉及临床个体基因型的测定方法，具体涉及一种检测多药耐药基因多态性的方法。本发明方法采用变性高效液相色谱技术，检测多药耐药基因C3435T的单核苷酸多态性，敏感度和特异性可达96％～100％，明显高于常用的变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、单链构像多态性和限制性片段长度多态性等变异检测技术；检测结果显示与DNA测序法完全相符。与直接测序法比较，本发明方法灵敏度和精确度高，检测更快速，成本更低。可用以预测病人服药后血药浓度与基因型的关系。
Description
技术领域
本发明属医学检验领域，涉及临床个体基因型的测定方法，具体涉及一种检测多药耐药基因多态性的方法。
背景技术
不同病人对同一药物表现出不同的药物疗效和毒副作用的现象一直困扰着临床医疗及制药业。随着分子生物学、分子遗传学与分子药理学等学科的发展，人们逐渐认识到不同个体对同一药物反应的不同大多源于个体基因的差异，主要是由于药物代谢酶、药物转运蛋白、药物作用靶点(如受体)等药物相关基因的多态性造成。最常见的人类基因的多态性形式是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP在基因组中广泛存在，据报道，平均每500bp就会产生1个SNP。SNP主要从以下两个方面导致人类个体的多样性：(1)编码区SNP(cSNP，即coding region SNP)：cSNP可以改变基因的编码，使得基因表达的蛋白质中某些氨基酸发生变化，而影响其功能。这可以看作基因“质”上的变化。(2)调节区SNP(rSNP，regulatory SNP)：这些rSNP往往会影响基因的表达和调控，使基因的表达量产生变化。不同人群间的SNP等位频率可以有相当大的差异，某些SNP甚至呈现群体专一性。因此存在于这些酶、受体、转运蛋白基因上的任何能引起蛋白质“质”或“量”改变的SNPs都可能影响药效的发挥。
P-糖蛋白(P-gp)是由多药耐药基因(multidrug resistance gene，MDR1)编码的一种转运蛋白。它是ATP依赖的跨膜外流泵，能从细胞内向外泵药物或其代谢物，降低细胞内的药物浓度。这些药物包括抗肿瘤药物、地高辛、环孢素A(CsA)和HIV-1抑制剂等多种药物。已知MDR1基因由28个外显子组成，含有29个SNPs，其中，26外显子C3435T的多态性与MDR1和P-gp的功能和表达密切相关。文献报道，具有TT型的健康白种人群中，P-gp的表达比其他基因型(CC和CT型)低2倍，三种基因型的血药浓度和药物清除率存在差别。
目前检测SNP的方法主要有变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、单链构像多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)和直接测序法等。DGGE和SSCP均耗时长、检出率低、成本高；由于并不是所有的SNP都能找到相应的酶切位点，因此RFLP法应用受到限制；直接测序法虽结果准确，但耗时长、成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测多药耐药基因多态性的方法。具体涉及一种快速、准确测定多药耐药基因C3435T多态性的方法。本方法可用以预测患者服用P-糖蛋白底物的药物，如抗肿瘤药物、地高辛、环孢素A(CsA)和HIV-1抑制剂等药物后的血药浓度及疗效。
本发明方法通过下述步骤进行，
①样品预处理：抽取测试者全血，提取基因组DNA；
②PCR反应：设计针对多药耐药基因(Genbank accession no：AC005068)第26外显子C3435T位点的引物，进行PCR反应，扩增出序列1的包括C3435T位点的长度为248bp的产物；
③DHPLC检测SNPs：直接用变性高效液相色谱(denaturing high-performanceliquid chromatography，DHPLC)分析上述PCR产物，
其中，DHPLC的变性温度为58～65℃，流动相起始为45％～50％的A液和50％～55％的B液组成的梯度溶液，其中A液含0.1mol的三乙胺醋酸盐溶液(TEAA，Transgenomic)，B液含0.1mol三乙胺醋酸盐溶液和20％～25％v/v的乙腈溶液(ACN)。结束梯度为35％～40％的A液和60％～65％的B液。以0.5ml/min～1.0ml/min的速度带至DNA分离柱，洗脱液为100％的D液，其中含73％～77％v/v的ACN。
④根据洗脱峰形判断基因的多态性。
本发明方法采用变性高效液相色谱技术，检测了40余例健康志愿者C3435T的单核苷酸多态性，并与DNA测序法进行了比较，结果显示完全相符。本发明方法的敏感度和特异性可达96％～100％，明显高于常用的变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、单链构像多态性(SSCP)和限制性片段长度多态性(RFLP)等变异检测技术。上述DGGE和SSCP均耗时长、检出率低、成本高；由于并不是所有的SNP都能找到相应的酶切位点，因此RFLP法应用受到限制；与直接测序法比较，本发明方法灵敏度和精确度高，检测更快速，成本更低，可用以预测病人服药后血药浓度与基因型的关系。具有下述优点：1.高通量检测：适合于大规模SNPs的筛查，2.自动化程度高：能减轻劳动强度，提高检测效率，3.灵敏度和特异性均较高：与直接测序相当，检测未知的SNPs的准确率可达95％以上，4.快速且成本较低：每份标本的检测时间不超过10分钟，平均费用约为40元人民币，5.将数份DNA样品混合后组成样品池，如其中存在杂合突变可立即检测到，使成本进一步降低，6.检测结果直观易判断。
附图说明
图1是本发明方法DHPLC检测结果峰形图，其中，
(A)为CC型；(B)为C/T型；(C)为TT型；(D)为可用待测标本与control等体积混合后，同样条件进行DHPLC检测，如待测样本峰形不变，仍为单一峰形，则为CC型(纯合型)，如显示杂合峰形，则为TT型(纯合突变型)。
具体实施方式
实施例1
抽取测试者全血0.5ml，采用UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒(上海赛百盛基因技术有限公司)，完成DNA的提取。然后设计序列2和序列3的针对多药耐药基因第26外显子C3435T位点的引物，正向(Forward)：5’-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3’；反向(Reverse)：5’-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3’，在总体积25μl的PCR反应体系中，各成份的终浓度为：DNA模板25ng，Taq酶1u，1倍浓度缓冲液内含MgCl22.0mmol/L，Tris-HCl 10mmol/L和KCl 50mmol/L，dNTP 0.2mol/L，primers各0.3μmol/L。PCR反应条件为94℃先预变性1min，然后94℃变性30s，在54～60℃中复性30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃再延伸5min，扩增出包含C3435T位点的长度为248bp的PCR产物。PCR产物无需纯化，直接用变性高效液相色谱分析。所述DHPLC分析在自动化仪器(Transgenomic WAVETMDNA片段分析系统)中进行。样品在95℃下变性3min后，缓慢退火至室温，自动进样器自动吸取5μl PCR产物进行分析。
上述的变性温度为58～65℃，流动相起始为45％～50％的A液和50％～55％的B液组成的梯度溶液。所述A液含0.1mol的三乙胺醋酸盐溶液，B液含0.1mol的三乙胺醋酸盐溶液和20％～25％v/v的乙腈溶液，结束梯度为35％～40％的A液和60％～65％的B液。以0.5ml/min～1.0ml/min的速度带至DNA分离柱，洗脱液为100％的D液，含73％～77％v/v ACN。
杂合型(CT型)显示两个峰，纯合的CC型和TT型均为单一峰，为了区分这两种基因型，用待测标本与control(对测序验证基因型为纯合CC型的模板进行扩增，PCR的产物作为control)等体积混合后在95℃下变性3min～7min，然后缓慢退火至室温。退火处理后的PCR产物进样，同样方法进行DHPLC检测。如待测样本峰形不变，仍为单一峰形，则为CC型(纯合型)；如显示杂合峰形，则为TT型(纯合突变型)。
实施例2
抽取测试者全血0.5ml，采用UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒，完成DNA的提取。然后设计针对多药耐药基因第26外显子C3435T位点的引物，Forward：5’-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3’；Reverse：5’-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3’，在总体积50μl的PCR反应体系中，各成份的终浓度为：DNA模板约50ng、Taq酶约2u、缓冲液(MgCl2 2.0mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、KCl 50mmol/L)为1倍浓度，dNTP 0.2mol/L，primers各0.7μmol/L。PCR反应条件为94℃先预变性1min，然后94℃变性1min，在54～60℃中复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃再延伸5min，扩增出包含C3435T位点的长度为248bp的PCR产物。PCR产物无需纯化，在自动化仪器(Transgenomic WAVETM DNA片段分析系统)中直接用变性高效液相色谱分析。每个样品在95℃下变性7min后，退火至室温，自动进样器自动吸取5μl PCR产物进行分析。
上述的变性温度为58～65℃，流动相起始为45％～50％的A液和50％～55％的B液组成的梯度溶液。所述A液含0.1mol的三乙胺醋酸盐溶液，B液含0.1mol TEAA和20％～25％v/v的乙腈溶液，结束梯度为35％～40％的A液和60％～65％的B液。以0.5ml/min～1.0ml/min的速度带至DNA分离柱，洗脱液为100％的D液，含73％～77％v/v ACN。
用待测标本与control(对测序验证基因型为纯合CC型的模板进行扩增，PCR的产物作为control)等体积混合后在95℃下变性3min～7min后，退火至室温。退火处理后的PCR产物进样，同样方法进行DHPLC检测。区分杂合型峰与纯合型峰这两种基因型，如待测样本峰形不变，仍为单一峰形，则为CC型(纯合型)；如显示杂合峰形，则为TT型(纯合突变型)。
本发明方法所采用仪器为：
PCR扩增仪(GeneAmpPCR System 9700，USA)；WAVE DNA FRAGMENT ANALYSIS SYSTEM2100型(TRANSGENOMIC)；PCR扩增仪(Biometra，Germany)；紫外凝胶成像系统(UV/WHITE ANALYSIS RS-200，上海复日科技有限公司)；DYY-III-8B电泳仪(北京六一仪器厂)；台式离心机(市购)。
多药耐药基因序列1.txt
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学附属华山医院
<120>一种检测多药耐药基因多态性的方法
<130>Fudan-041011
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>248
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>exon
<222>(1)..(248)
<400>1
aca tta ggc agt gac tcg atg aag gca tgt atg ttg gcc tcc ttt gct 48
Thr Leu Gly Ser Asp Ser Met Lys Ala Cys Met Leu Ala Ser Phe Ala
1 5 10 15
gcc ctc aca atc tct tcc tgt gac acc acc cgg ctg ttg tct cca tag 96
Ala Leu Thr Ile Ser Ser Cys Asp Thr Thr Arg Leu Leu Ser Pro
20 25 30
gca atg ttc tca gca atg ctg cag tca aac agg atg ggc tcc tgg gac 144
Ala Met Phe Ser Ala Met Leu Gln Ser Asn Arg Met Gly Ser Trp Asp
35 40 45
acg atg ccc agg tgt gct cgg agc cac tga aca ttc agt cgc ttt att 192
Thr Met Pro Arg Cys Ala Arg Ser His Thr Phe Ser Arg Phe Ile
50 55 60
tct ttg cca tca agc agc tga aaa caa gag ttc aca gat caa ctt cag 240
Ser Leu Pro Ser Ser Ser Lys Gln Glu Phe Thr Asp Gln Leu Gln
65 70 75
gac cag ca 248
Asp Gln
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(27)
<220>
<221>exon
<222>(1)..(27)
<400>2
tgc tgg tcc tga agt tga tct gtg aac 27
Cys Trp Ser Ser Ser Val Asn
1 5
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
多药耐药基因序列1.txt
<220>
<221>exon
<222>(1)..(27)
<400>3
aca tta ggc agt gac tcg atg aag gca 27
Thr Leu Gly Ser Asp Ser Met Lys Ala
1 5
Claims (3)
1、一种检测多药耐药基因多态性的方法，其特征是包括下述步骤，
①样品预处理：抽取测试者全血，提取基因组DNA；
②PCR反应：设计多药耐药基因(Genbank accession no：AC005068)第26外显子C3435T位点的引物，进行PCR反应，扩增出包括C3435T位点的产物；
③DHPLC检测SNPs：直接用变性高效液相色谱分析上述PCR产物，
其中，变性温度为58～65℃，流动相起始为45％～50％的A液和50％～55％的B液组成的梯度溶液，A液含0.1mol的三乙胺醋酸盐溶液，B液含0.1mol三乙胺醋酸盐溶液和20％～25％v/v的乙腈溶液；结束梯度为35％～40％的A液和60％～65％的B液；以0.5ml/min～1.0ml/min的速度带至DNA分离柱，洗脱液为100％的D液，其中含73％～77％v/v乙腈溶液。
④根据洗脱峰形判断基因的多态性。
2、根据权利要求1所述的检测多药耐药基因多态性的方法，其特征是所述的PCR扩增出的包括C3435T位点的产物具有序列1的序列，长度为248bp。
3、根据权利要求1所述的检测多药耐药基因多态性的方法，其特征是所述的多药耐药基因第26外显子C3435T位点的引物具有序列2和序列3的序列。
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|---|---|---|---|---|
| CN101570798B (zh) * | 2009-03-20 | 2011-11-16 | 曹际娟 | 水产品中3种食源性病毒检测试剂盒及检测方法 |
| CN101624624B (zh) * | 2009-03-20 | 2011-11-16 | 曹际娟 | 饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法 |
| CN108004307A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-05-08 | 广州和康医疗技术有限公司 | 一种糖皮质激素疗效预测snp位点检测的方法及试剂盒 |
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2004
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |