CN1669434A - 蜂胶和银离子复合纳米消毒剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，是含有浓度为0.125～2g/100ml、平均粒径在30～100纳米之间的蜂胶和浓度为3.125～50ug/l的银离子的水包油型乳剂。本发明蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，是将蜂胶溶于有机溶剂中，室温条件下，将乳化剂滴加入该蜂胶有机溶液中，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相，然后边搅拌边滴加银离子水溶液直至最终形成复合乳剂。本发明乳剂具有杀菌时间短、杀灭效果明显的特点，并可在人体皮肤、粘膜上安全使用，对环境和人体无危害和刺激作用，可用于预防和抑制生物恐怖原感染、发病，并可对污染的环境、民用设施和精密仪器等实施消毒。
Description
技术领域
本发明涉及一种用作消毒剂的化学组合物，具体涉及一种新型蜂胶和银离子复合纳米消毒剂及其制备和应用。
背景技术
自2001年美国“9.11”恐怖事件后，相继在多个国家出现“白色粉末”-炭疽芽孢邮寄，生物恐怖成为现实，更为引起各国政府对生物恐怖的高度关注。生物工程和基因工程发展突飞猛进，不仅使生物恐怖病原更加容易取得，而且对烈性传染病原进行重建和改构，进一步加大了生物恐怖袭击的威胁和生物反恐的难度。目前可以使用应对类似生物恐怖病原的消毒剂为有机化工制品如甲醛、次氯酸等，这些消毒剂本身毒性较大，不仅对人体皮肤粘膜有一定的损伤，而且会造成环境污染。因此，研制高效、广谱杀灭生物恐怖病原，可在人体安全使用，有效预防和抑制生物恐怖原感染、发病，并可对污染的环境、民用设施和精密仪器等消毒的新型消毒剂成为生物恐怖防护的重要课题之一。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种能够广谱杀灭生物恐怖病原的新型蜂胶和银离子复合纳米消毒剂。
本发明的另一目的是提供一种上述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法。
本发明提供的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，是含有浓度为0.125～2g/100ml、平均粒径在30～100纳米之间的蜂胶和浓度为3.125～50ug/l的银离子的水包油型乳剂。
上述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂中，还包括有机溶剂，所述有机溶剂为乙醇、甲醇，正丁醇、或丙酮中的一种；所述乳剂中所用乳化剂为吐温-20、吐温-60、或吐温-80中的一种；所述银离子来自于硝酸银或磷酸银。
上述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂中，每100体积份乳剂中，含有2重量份蜂胶，5体积份乙醇，10～15体积份吐温-80，5×10-6重量份硝酸银，并且当体积份为毫升时，重量份对应为克，依此类推。
本发明提供一种所述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，包括以下操作：将蜂胶溶于有机溶剂中，室温条件下，将乳化剂滴加入该蜂胶有机溶液中，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相，然后边搅拌边滴加银离子水溶液直至最终形成复合乳剂即为所述消毒剂。
上述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法中，将乳化剂滴加入蜂胶有机溶液中滴加速度为1～2ml/min；滴加银离子水溶液时滴加速度为3～5ml/min。
上述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法中，所述乳化剂和蜂胶有机溶液的最佳体积比范围为1∶1～2∶1。所述银离子水溶液形成的水相与乳化剂和蜂胶有机溶液形成的油相的最佳体积比范围为7∶3～4∶1。
采用上述技术方案，本发明利用蜂胶广谱抗细菌、真菌和病毒及无毒的特性，配以银离子，提高蜂胶杀灭致病微生物的活性，尤其是对杆菌芽孢的灭活；采用本发明方法，不使用强力乳化机械，只在室温下温和搅拌，通过利用乳化剂具有亲水、亲油的特性，滴加银离子水溶液，可自发形成蜂胶纳米级颗粒的复合乳剂。实验证明，本发明乳剂具有杀菌时间短、杀灭效果明显的特点，毒性实验表明该乳剂大大降低了蜂胶溶解剂中刺激性有机溶剂的含量，可在人体皮肤、粘膜上安全使用，对环境和人体无危害和刺激作用。从而使制备的新型复合纳米消毒剂可强效杀灭多种致病微生物，并能在多种条件下安全使用。
具体实施方式
本发明中采用的抗菌或抑菌的功能成分为蜂胶和银离子。
研究表明，蜂胶抗菌的主要活性成分是蜂胶所含的黄酮类化合物及多酚，利用微量测热法和电子显微照相技术结果表明，蜂胶可通过阻止细胞分化抑制细菌生长，通过破坏细胞膜和胞浆的有序状态，引起部分溶菌和细菌蛋白质合成的抑制(Koo H，Gomes BP，Rosalen PL.In vitro antimicrobial activity of propolis and arnica Montanaagainst oral pathogens.Arch oral Biol.2000；45(2)：1416.)。
研究表明，银离子低浓度时(如50ug/l)，可强力吸附于细胞壁表面，细菌虽有某些生理功能被破坏，但仍有一定的生命力(抑菌作用)；银离子高浓度时在细胞表面吸附，过量的银离子就会穿透细胞壁进入细胞内部；滞留在细胞浆膜上，与此处含巯基的酶上的S，O，N原子结合，抑制酶的活性，使细菌死亡(杀菌作用)(Yahya MT，StraubTM，Gerba CP etal.Inactivation of coliphage MS-2 and poliovirus by copper，silver，andchlorine.Can J Microbiol.1992；38(5)：430.)
本发明是将蜂胶和银离子复合使用的一种消毒剂，并且使之形成一种水包油的乳剂结构。考虑消毒剂的毒性应控制在合理范围，本发明使用的银离子的含量最高限定在50ug/L，该浓度下的单一银离子仅具有抑菌作用，但用本发明方法将其与蜂胶复合使用，则形成增效作用，具有杀菌功能。
本发明利用蜂胶有机溶液和银离子水溶液为主要原料，配以适量乳化剂，用适当的方式将其混合形成一种乳剂即得到本发明的消毒剂。在该消毒剂中，油相包括蜂胶、一种或数种作为用于溶解蜂胶的有机溶剂和乳化剂，其中有机溶剂可以为不同浓度的乙醇溶液或甲醇，正丁醇、丙酮等，乳化剂为不同浓度的吐温类活性剂的一种，如吐温-20，吐温-60，吐温-80等，蜂胶的平均粒径在30-100纳米之间；水相为银离子水溶液，可由硝酸银、磷酸银等一定浓度的银离子水溶液组成。本发明消毒剂中，蜂胶终浓度较好在0.125～2.0g/100ml，而银离子浓度较好在3.125～50ug/l。
本发明还提供了一种蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，该方法不使用强力乳化机械，只在室温下温和搅拌，通过利用乳化剂具有亲水、亲油的特性，滴加银离子水溶液，可自发形成蜂胶纳米级颗粒的复合乳剂。具体步骤为：室温条件下，将乳化剂滴加入蜂胶有机溶液中，磁力搅拌至混合液澄清形成油相；然后边搅拌边滴加银离子水溶液，直至最终复合乳剂呈棕黄色透明液体，即得到本发明消毒剂。在制备过程中，其中油相中乳化剂和蜂胶有机溶液的最佳体积比范围为1∶1～2∶1，而水相和油相的最佳体积比范围为7∶3～4∶1。
实施例1、
将蜂胶2g溶于体积浓度为50％的乙醇10ml中，室温条件下，将10ml吐温-80滴加入该蜂胶乙醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相；然后边搅拌边滴加浓度为62.5ug/L的硝酸银水溶液80ml，滴加速度3～5ml/min，直至最终复合乳剂呈棕黄色透明液体，即得到本例消毒剂100ml。
本例消毒剂中各组分终浓度分别为：蜂胶2g/100ml，乙醇5％(v/v)，吐温-80为10％(v/v)，硝酸银5ug/100ml。乳剂中蜂胶颗粒平均粒径约为50nm。
实施例2、
将蜂胶2g溶于纯乙醇5ml中，室温条件下，将15ml吐温-80滴加入该蜂胶乙醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相；然后边搅拌边滴加浓度为62.5ug/L的硝酸银水溶液80ml，滴加速度3～5ml/min，直至最终复合乳剂呈棕黄色透明液体，即得到本例消毒剂100ml。
本例消毒剂中各组分终浓度分别为：蜂胶2g/100ml，乙醇5％(v/v)，吐温-80为15％(v/v)，硝酸银5ug/100ml。乳剂中蜂胶颗粒平均粒径约为90nm。
实施例3、
将蜂胶1g溶于体积浓度为50％的正丁醇10ml中，室温条件下，将20ml吐温-60滴加入该蜂胶正丁醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相；然后边搅拌边滴加浓度为71.4ug/L的磷酸银水溶液70ml，滴加速度3～5ml/min，直至最终复合乳剂呈棕黄色透明液体，即得到本例消毒剂100ml。
本例消毒剂中各组分终浓度分别为：蜂胶1g/100ml，正丁醇5％(v/v)，吐温-60为20％(v/v)，磷酸银5ug/100ml。乳剂中蜂胶颗粒平均粒径约为60nm。
实施例4、
将蜂胶1g溶于体积浓度为50％的乙醇10ml中，室温条件下，将15ml吐温-80滴加入该蜂胶乙醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相；然后边搅拌边滴加浓度为33.3ug/L的硝酸银水溶液75ml，滴加速度3～5ml/min，直至最终复合乳剂呈棕黄色透明液体，即得到本例消毒剂100ml。
本例消毒剂中各组分终浓度分别为：蜂胶1g/100ml，乙醇5％(v/v)，吐温-80为15％(v/v)，磷酸银2.5ug/100ml。乳剂中蜂胶颗粒平均粒径约为30nm。
经测试，上述实施例制备的消毒剂均满足下述理化性状：
外观：棕黄色透明
pH值：6.5
4500rpm离心后：无分层或混浊
电镜下颗粒直径(nm)：30-100
总黄酮含量(g)：0.55
本发明蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的抑菌、杀菌试验
1.复合乳剂与乳剂中各组分对大肠杆菌8099的抑制作用比较
将实施例1制备的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂(简称复合乳剂)用无菌水做1∶4，1∶8，1∶16，1∶32的稀释，按照消毒技术规范的要求进行大肠杆菌8099的悬液抑菌实验，确定最小抑制浓度(MIC)，并同时对照不同浓度、蜂胶、吐温-80、乙醇的抑菌作用。结果见表1：
表1复合乳剂对大肠杆菌8099的抑菌作用
| 分组 | 抑菌剂 | 稀释比例 | 对大肠杆菌抑菌效果 |
| 实验组 | 稀释后复合乳剂 | 1∶4 | - |
| 1∶8 | - | ||
| 1∶16 | - | ||
| 1∶32 | + | ||
| 吐温-80(v/v) | 10％ | + | |
| 5％ | + | ||
| 2.5％ | + |
| 对照组 | 乙醇(v/v) | 25％ | - |
| 12.5％ | + | ||
| 6.25％ | + | ||
| 蜂胶(g/100ml) | 1％ | - | |
| 0.5％ | - | ||
| 0.25％ | + | ||
| Ag+(ug/L) | 12.5 | + | |
| 50 | - |
注：倾注法活菌计数培养后：无菌生长或仅生长1-5个菌落记为-，表明有抑制作用；标记+的表明没有抑制作用。
表1结果显示：复合乳剂对大肠杆菌8099的最小抑制浓度为1∶16，此稀释后的复合乳剂中蜂胶的浓度为0.125％(g/100ml)，银离子浓度为3.125ug/L，该浓度条件下的复合乳剂就具有抑菌作用；而单独应用蜂胶和银离子MIC分别为0.5％(g/100ml)和50ug/L时才有抑菌效果，单独组分抑菌浓度是复合乳剂浓度的4-8倍。表1结果同时显示复合乳剂中所含的吐温-80和乙醇(1.25％)无抑菌作用，说明起抑菌作用的是复合乳剂。
2.复合乳剂对大肠杆菌8099的最短抑菌时间实验
将实施例2的复合乳剂以1∶4，1∶8，1∶16稀释，以稀释液与大肠杆菌8099的悬液作用不同时间后的抑菌试验确定最小抑制时间，并对照单独使用蜂胶、银离子的抑菌时间。结果见表2：
表2复合乳剂对大肠杆菌8099的最短抑菌时间
| 受试剂 | 作用不同时间(min)的抑制作用 | ||||||
| 复合乳剂 | 稀释度 | 1 | 3 | 5 | 10 | 15 | 30 |
| 1∶4 | - | - | - | ||||
| 1∶8 | - | - | - | ||||
| 1∶16 | - | - | - | ||||
| 2％(g/100ml)蜂胶 | + | + | + | + | + | - | |
| 银离子50ug/L | + | + | + | + | + | - | |
注：倾注法话菌计数培养后，无菌生长或仅生长1-5个菌落记为-，+无抑制作用。
表2结果可见复合乳剂对大肠杆菌8099的最小抑制时间为1min，而单独应用蜂胶(2％)，银离子(50ug/L)的MIC分别为30min和15min。表明复合乳剂的抑菌时间较单独使用明显缩短。
3.检测蜂胶-银离子纳米乳剂对大肠杆菌8099，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，绿脓杆菌和白色念珠菌(ATCC10231)的杀灭最短时间，杀灭最低浓度和杀灭对数值。试验方法参见《消毒技术规范》的悬液定量杀菌试验，结果见表3。
表3复合纳米乳剂杀灭不同微生物的试验结果
| 复合乳剂稀释度 | 受试菌种 | 作用不同时间的平均杀灭率(％) | |||
| 1min | 3min | 5min | 10min | ||
| 1∶4 | 大肠杆菌8099 | 100 | 100 | 100 | |
| 1∶8 | 100 | 100 | 100 | ||
| 1∶16 | 100 | 100 | 100 | ||
| 1∶4 | 金黄色葡萄球菌ATCC6835 | 100 | 100 | 100 | |
| 1∶8 | 100 | 100 | 100 | ||
| 1∶16 | 100 | 100 | 100 | ||
| 1∶4 | 绿脓杆菌ATCC15442 | 95 | 100 | 100 | |
| 1∶8 | 90 | 100 | 100 | ||
| 1∶16 | 75 | 100 | 100 | ||
| 1∶4 | 白色念珠菌ATCC10231 | 60 | 70 | 100 | 100 |
| 1∶8 | 35 | 50 | 100 | 100 | |
注：试验温度18-22℃。阳性对照组平均菌数，大肠杆菌为2.78×108cfu/mL，金黄色葡萄球菌为2.92×108cfu/mL，绿脓杆菌为2.53×108cfu/mL，白色念珠菌为2.56×107cfu/mL；复合乳剂使用实施例1配制的。
从表3数据可见，稀释后的复合乳剂对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌作用1min，绿脓杆菌作用3min，平均杀灭率为100％，最低杀灭浓度为原液的1∶16稀释，杀灭对数值(KL)为8.48和8.42和8.31。对白色念珠菌作用5min，平均杀灭率即可达到100％。最低杀灭浓度为原液的1∶8稀释，杀灭对数值(KL)为7.56。而单独使用蜂胶(2g/100ml)和银离子(50ug/L)仅具有抑菌作用而没有杀菌作用。
以上试验说明，利用本发明制备的复合纳米乳剂可有效广谱杀灭多种细菌如大肠杆菌、金葡球菌、绿脓杆菌及真菌白色念珠菌、病毒及杆菌芽胞等，且单独使用同浓度的蜂胶和银离子溶液仅有抑菌作用而无杀菌作用，说明本发明蜂胶银离子复合纳米消毒剂杀灭各种致病微生物的活性来源于本发明组配的复合乳剂各组分的协同增效作用。
本发明蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的急性毒性试验
该实验按照《消毒技术规范》具体要求进行。分别对实施例1和实施例3的复合乳剂进行试验。
1、急性经口毒性试验：选取体重18～22g昆明系小鼠20只，雌雄各半。随机分为2组，每组10只。灌胃前禁食过夜，按最大剂量5000mg/kg一次性灌胃，试验组灌复合乳剂原液，对照组灌生理盐水。观察14d内小鼠的中毒表现，死亡时间和死亡只数。结果见表4
表4复合纳米乳剂经口毒性结果
| 组别 | 反应动物数 | 行为活动 | 运动 | 死亡(14d内) |
| 复合纳米乳剂原液组 | 0/10 | 无异常 | 无异常 | 0/10 |
| 生理盐水对照组 | 0/10 | 无异常 | 无异常 | 0/10 |
结果表明，复合纳米乳剂的LD50大于10000mg/kg，，属于实际无毒性。
2.皮肤刺激试验：选取3只纯种日本大耳白兔。试验前24h，脊柱两侧去毛左右各约3cm×3cm，不损伤皮肤。左侧滴原液0.5ml，右侧滴0.5ml的生理盐水作为对照。4h后，用温水除去残留受试物。观察1h、24h和48h皮肤局部反应。按红斑和水肿形成的程度计分并计算皮肤刺激指数评定刺激强度。结果见表5。
表5皮肤刺激试验结果
| 组别 | 皮肤刺激反应：红斑和水肿形成 | 刺激平均积分 | 皮肤刺激指数 | 刺激强度 | ||
| 复合乳剂组 | 1h无 | 24h无 | 48h无 | 0 | 0 | 无刺激 |
| 对照组 | 无 | 无 | 无 | 0 | 0 | 无刺激 |
结果表明，复合纳米乳剂属于实际无皮肤刺激性。
3.急性眼刺激试验：选取3只双眼无异常纯种日本大耳白兔。吸取0.1ml复合乳剂滴入白兔左眼结膜囊内，右眼以生理盐水作对照。滴入后，被动闭眼4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后24h、48h和72h用裂隙灯观察白兔眼虹膜、角膜损害和结膜充血、水肿4个方面的平均评分，判定复合乳剂对眼睛的刺激程度。结果见表6。
表6急性眼刺激试验结果
| 组别 | 眼虹膜、角膜和结膜损害和充血情况 | 刺激评分 | 刺激分级 | ||
| 24h | 48h | 72h | |||
| 受试眼侧 | 无 | 无 | 无 | 0 | 无刺激 |
| 对照眼侧 | 无 | 无 | 无 | 0 | 无刺激 |
结果表明，复合乳剂对兔角膜、结膜和虹膜的刺激平均积分＝0，无眼刺激性。
4.阴道粘膜刺激试验：选取6只健康纯种雌性日本大耳白兔，实验组和对照组各3只。将复合乳剂或生理盐水2ml缓慢注入阴道。灌注后24h，处死动物，取出完整阴道，纵切观察充血水肿表现，10％福尔马林中固定3d，取阴道的上、下端和中央部位组织切片，HE染色后，病理学检测。根据上皮组织、白细胞浸润、血管充血和水肿的情况评分，计算平均分和刺激指数评定对阴道粘膜刺激反应强度。结果见表7。
表7阴道粘膜刺激试验结果
| 组别 | 阴道组织反应 | 反应得分 | 刺激指数 | 反应强度 | |||
| 上皮组织 | 白细胞浸润 | 血管充血 | 水肿 | ||||
| 受试组 | 完好 | 无 | 无 | 无 | 0 | ＜1 | 无刺激 |
| 对照组 | 完好 | 无 | 无 | 无 | 0 | ＜1 | 无刺激 |
结果表明，复合乳剂对阴道粘膜刺激指数＜1，无粘膜刺激性。
急性毒性试验综合评价结果：本发明复合纳米乳剂安全、无毒性和无刺激作用，可在人体的皮肤、粘膜多途径安全使用并有保护作用的特点。可有效预防和抑制生物恐怖原感染、发病，并可对污染的环境、民用设施和精密仪器等实施消毒的新型消毒剂。
Claims (9)
1、一种蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，其特征在于，其为含有浓度为0.125～2g/100ml平均粒径在30～100纳米之间的蜂胶和浓度为3.125～50ug/l的银离子的水包油型乳剂。
2、根据权利要求1所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，其特征在于，还包括有机溶剂，所述有机溶剂为乙醇、甲醇，正丁醇、或丙酮中的一种。
3、根据权利要求1或2所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，其特征在于，所述乳剂中所用乳化剂为吐温-20、吐温-60、或吐温-80中的一种。
4、根据权利要求1或2所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，其特征在于，所述银离子来自于硝酸银或磷酸银。
5、根据权利要求1或2所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂，其特征在于，每100体积份乳剂中，含有2重量份蜂胶，5体积份乙醇，10～15体积份吐温-80，5×10-6重量份硝酸银，并且当体积份为毫升时，重量份对应为克，依此类推。
6、一种权利要求1至5任一所述蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，包括以下操作：将蜂胶溶于有机溶剂中，室温条件下，将乳化剂滴加入该蜂胶有机溶液中，同时进行磁力搅拌，直至混合液澄清形成油相，然后边搅拌边滴加银离子水溶液直至最终形成复合乳剂即为所述消毒剂。
7、根据权利要求6所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，其特征在于，将乳化剂滴加入蜂胶有机溶液中滴加速度为1～2ml/min；滴加银离子水溶液时滴加速度为3～5ml/min。
8、根据权利要求6或7所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，其特征在于，所述乳化剂和蜂胶有机溶液的最佳体积比范围为1∶1～2∶1。
9、根据权利要求6或7所述的蜂胶和银离子复合纳米消毒剂的制备方法，其特征在于，所述银离子水溶液形成的水相与乳化剂和蜂胶有机溶液形成的油相的最佳体积比范围为7∶3～4∶1。
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