CN1661104A

CN1661104A - 长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法

Info

Publication number: CN1661104A
Application number: CN 200410093154
Authority: CN
Inventors: 李德葆; 骆红梅; 戴承恩; 姜玉新; 董海涛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2004-12-17
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2024-12-17
Also published as: CN1314814C

Abstract

本发明公开了一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法。方法的步骤是：目的基因进行聚合酶链式反应扩增并检测；阳性产物约5μg100℃煮沸变性，冰上冷却；将检测用基因芯片用磷酸缓冲液润湿后，加入预杂交液进行预杂交；接着加入制备好的5μg变性DNA，60℃进行杂交；用洗膜液I洗涤2次，用洗膜液II洗涤；将芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液染色；用TE缓冲液漂洗，重复2次；紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。该方法省却了对探针进行标记的繁杂程序，特别是避免了同位素标记对人体所造成的伤害和对环境造成的放射污染；应用该方法可以克服单纯运用聚合酶链式反应扩增可能造成的假阳性结果，使所得结果更灵敏、稳定、可靠。

Description

长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法

技术领域

本发明为生物技术领域，尤其涉及一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法。

背景技术

自1992年Adams提出表达序列标签(expressed sequence tag)和随后的大规模表达序列标签技术的建立，以及生物技术的发展和生命科学发展的需要，基因芯片技术应运而生。基因芯片(Biochips)的实质就是在面积不大的基片上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置地可寻址的生物识别分子(R.J.Lipshutz et al.，Bio Techniques 19(1995)，442-447；S.P.Fodor et al.，Nature364(1993)，555-556；S.P.Fodor et al.，Science 251(1991)，767-773；A.C.Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的基因芯片主要是用于DNA序列测定，基因表达谱鉴定(D.J.Lockhart et al.，Nature Biotechnol.14(1996)，1675-1680)和基因突变体的检测和分析(Feriotto G，et al.，Hum Mutat1999；13：390-400；Hacia J.G.et al.，Nat Genet 1999；21(suppl 1)：42-7；Hacia JG，etal.，Nat Genet 1999；22：164-7；Nilsson P，et al.，Biotechniques 1999；26：308-16)，所以又称为DNA芯片或基因芯片。目前，这一技术以扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域。如今基因芯片主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、动电微阵列和蛋白质芯片等。运用基因芯片技术，将获得的芯片运用杂交技术和扫描技术对基因芯片进行芯片处理、有效数据提取、分析和报告，可获得相应的基因表达谱(Gene expression profiling)。基因芯片因具有强有力性、灵活性、敏感性和相对简单等特点而被应用在许多领域，如：DNA序列测定、基因多态性检测、新基因的发现、疫苗和药物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS2000；97：11655-11660)。

基因芯片技术的发展势必带动一大批相应技术的发展，如基因芯片的信号检测方法。目前基因芯片信号检测方法主要包括以Cy5/Cy3标记的荧光信号检测方法和以同位素标记的信号检测方法，而且这些方法目前大都应用于高通量的基因芯片的信号检测中，但无论应用那种信号检测方法，都需要对探针进行标记，而且应用Cy5/Cy3荧光标记需要对Cy5和Cy3分别进行两次，用同位素标记不仅能够对操作者的人身受到伤害，还会对环境造成核辐射污染。

鉴于此，本发明提供了一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法。方法的步骤是：运用特异引物对目的基因进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并用琼脂糖凝胶进行电泳检测；聚合酶链式反应扩增阳性产物约5μg 100℃煮沸5min变性后，直接放入冰上冷却3-5min，以备探针杂交用；将检测用基因芯片用0.25M的磷酸缓冲液(pH7.2)进行润湿后，加入预杂交液(0.25mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃进行预杂交1-2小时；接着加入制备好的5μg变性探针DNA(该探针无需进行任何标记，如同位素、生物素等)，60℃进行杂交10-12小时；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L柠檬酸钠，pH7.0)，0.1％SDS)洗涤2次，每次20min，用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗涤15min；将芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2次；在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。该方法省却了对探针进行标记的繁杂程序，特别是避免了同位素标记对人体所造成的伤害和对环境造成的放射污染；应用该方法可以克服单纯运用聚合酶链式反应扩增可能造成的假阳性结果，使所得结果更灵敏、稳定、可靠。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法。方法的步骤为：

1)运用特异引物对待测目的基因进行聚合酶链式反应扩增并用琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性PCR产物备用；

2)聚合酶链式反应扩增产物5μg 90-100℃煮沸5-10min进行变性后，直接放入冰上冷却3-5min；

3)将检测用基因芯片用0.25M的磷酸缓冲液，pH7.2，进行润湿后，加入预杂交液，55-65℃进行预杂交1-2小时；预杂交液为0.25mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，重量体积比为7％十二烷基磺酸钠，重量体积比为1％牛血清白蛋白；

4)接着加入步骤2)的5μg变性DNA，55-65℃进行杂交10-12小时；

5)用洗膜液I洗涤1-3次，每次15-20min；洗膜液I为2×SSC，重量体积比为0.1％十二烷基磺酸钠；2×SSC为0.3mol/L氯化钠，0.03mol/L柠檬酸钠，pH7.0；

6)用洗膜液II洗涤15-20min；洗膜液II为0.1×SSC，重量体积比为0.1％十二烷基磺酸钠；

7)将基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液中染色5-10min；1×TE缓冲液为10mmo/LTris碱，pH8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；

8)用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2-3次；

9)在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。

本发明的优点是：1)该方法省却了对探针进行标记的繁杂程序，特别是避免了同位素标记对人体所造成的伤害和对环境造成的放射污染；2)应用该方法可以克服单纯运用聚合酶链式反应扩增可能造成的假阳性结果，使所得结果更可靠。3)该方法与常规的检测方法相比具有高灵敏度和较高的检出率。

附图说明

图1是Nos终止子基因为探针杂交后进行染色的结果，图中：1为Nos终止子，2为NPTII基因，3为CP4-EPSPS基因，4为Bar基因；

图2是用于长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法基因芯片的结构示意图；

图3是用于长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法基因芯片图2的方阵结构放大示意图。

具体实施方式

实施例

(一)长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的制备

如图2所示，基因芯片是在平面型支撑载体5的平面上被覆有带正电荷材料的膜6，在该膜层的表面设有点阵7，在点阵7上排布有如下供转基因植物判断用的外源基因探针：1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。

点阵7为排布的凹窝状结构8，点阵7之间保持有空间间隔，所说的各供转基因植物判断用的外源基因探针分别被覆于各凹窝状结构8内。带正电荷材料的膜层6为聚赖氨酸材料或氨基硅烷材料膜层。平面型支撑载体5为玻片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。

将预先合成好的上述的19个基因的单链寡核苷酸片段(长度大于50bp)稀释成浓度为0.2μg/μl，按照实验要求将各种浓度、各种不同基因的单链寡核苷酸片段排列于96孔PCR板中，用于基因芯片的点制；基因芯片由arrayer(GenomicSolution，USA)机器手，使用直径为0.4mm的96针点制，基因芯片载体为尼龙膜(Millipore Nylon N⁺)，所有的点点制为36×24的一级方阵，每种基因的三种不同浓度在3×3的二级阵中平行三次重复以验证试验的重复性。

(二)CTAB法抽提转基因大豆DNA

用液氮将0.1g转基因大豆磨成粉末，将粉末状的干物质加入400μl预冷的CTAB提取缓冲液I(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液II(2％CTAB，50mmol/LTris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巯基乙醇，混匀，65℃保温30-90min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷至室温后加入450μl氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状。12000rpm离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，加入5μl Rnase A储液，室温下保温30min。依次加入600μl异丙醇及60μl乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。12,000rpm离心10min，沉淀DNA。弃上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，沉淀DNA，除去残留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE缓冲液中，4℃保存备用。

(三)聚合酶链式反应(PCR)扩增

总反应体系为50μl，10μl上述模板DNA，5μl 10×PCR反应缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl₂，4μl 4种dNTP(每种2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混匀后离心5秒。将混合物在94℃下加热5min后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心。95℃变性5min，用95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次扩增反应循环，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10min，使反应产物扩增充分。PCR扩增的引物分别为：

Nos终止子基因

Pnos-F1：5’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’

Pnos-R1：5’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’

(四)琼脂糖凝胶电泳

用0.5×TBE电泳缓冲液(45mmol/L Tris碱，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的琼脂糖凝胶液；加入10mg/ml溴化乙锭(EB)溶液母液，使其终浓度为0.5μg/ml；用制胶板制备相应的凝胶板；取10μl PCR产物与2μl 6×载样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液)混匀，用微量移液枪小心加入凝胶板的样品槽中；控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，立即接通电源进行电泳；当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳；在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色并拍照。

(五)分子杂交及信号检测

聚合酶链式反应(PCR)扩增产物约5μg 100℃煮沸5min进行变性后，直接放入冰上冷却3-5min，以备探针杂交用；将检测用基因芯片用0.25M的磷酸缓冲液(pH7.2)进行润湿后，加入预杂交液(0.25mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃进行预杂交1-2小时；接着加入制备好的5μg变性探针DNA(该探针未进行任何标记，如同位素、生物素等)，60℃进行杂交10-12小时；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L柠檬酸钠，pH7.0)，0.1％SDS)洗涤2次，每次20min；用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗涤15min；将芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2次；在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。

Claims

1.一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于，方法的步骤为：

4)接着加入步骤2)的5μg变性DNA，55-65℃进行杂交10-12小时；

7)将基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液中染色5-10min；1×TE缓冲液为10mmo/L Tris碱，pH8.0；1mmol/L 乙二胺四乙酸，pH8.0；

8)用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2-3次；

9)在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。

2.根据权利要求1所述的一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于，所说的聚合酶链式反应为：总反应体系为50μl，10μl模板DNA，5μl 10×聚合酶链式反应缓冲液，4μl 25mmol/L MgCl₂，4μl 4种dNTP，0.5μl 100ng/μl上游引物，0.5μl 100ng/μl下游引物，1μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，重蒸水25μl，混匀后离心5秒；10×聚合酶链式反应缓冲液为500mmol/L氯化钾，100mmol/L Tris碱，pH9.0，重量体积比为1.0％ Triton X-100；4种dNTP为包含各为2.5mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP；将混合物在94℃下加热5min后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入2.5U Taq DNA聚合酶，混匀后稍离心；95℃变性5min，用95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次扩增反应循环，进行PCR，最后一轮循环结束后，于72℃下保温10min。

3.根据权利要求1所述的一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法。其特征在于，所说的琼脂糖凝胶电泳方法为：用0.5×TBE电泳缓冲液配制重量体积比为1％的琼脂糖凝胶液；0.5×TBE电泳缓冲液为45mmol/L Tris碱，45mmol/L硼酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；加入10mg/ml溴化乙锭溶液母液，使其终浓度为0.5μg/ml；用制胶板制备相应的凝胶板；取10μl PCR产物与2μl 6×载样缓冲液混匀；6×载样缓冲液为重量体积比为0.25％溴酚蓝，重量体积比为40％蔗糖水溶液；用微量移液枪加入凝胶板的样品槽中；控制电压保持在60-80V，电流在40-100mA，接通电源进行电泳；溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2-3cm时，停止电泳；在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色并拍照。

4.根据权利要求1所述的一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于，所述的基因芯片是在平面型支撑载体(5)的平面上被覆有带正电荷材料的膜(6)，在该膜层的表面设有点阵(7)，在点阵(7)上排布有如下供转基因植物判断用的外源基因探针：1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。

5.根据权利要求4所述的一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于所述的点阵(7)为排布的凹窝状结构(8)，点阵(7)之间保持有空间间隔，所说的各供转基因植物判断用的外源基因探针分别被覆于各凹窝状结构(8)内。

6.根据权利要求4所述的一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于，所述的带正电荷材料的膜层(6)为聚赖氨酸材料或氨基硅烷材料膜层。

7.根据权利要求4所述的一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于所述的平面型支撑载体(5)为玻片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。