CN1314467A - 一种rna逆转录扩增标记探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在基因芯片的制备中能用少量的mRNA为模板,扩增出大量cDNA探针的标记方法。采用一步逆转录法,只需用一种逆转录酶反应,只用了一种引物,使操作更简单、成本大大降低、步骤少而节约时间。

Description

一种RNA逆转录扩增标记探针的制备方法

本发明属于基因技术领域，涉及基因芯片技术，尤其涉及一种基因芯片RNA逆转录扩增标记探针的制备方法。

基因芯片是九十年代发展起来的一项前沿生物技术。随着生物技术的迅猛发展，20世纪人类最宏伟的计划之一—人类基因组计划预计将提前至2003年完成，届时人类将完成25种染色体(22种常染色体，2种性染色体和1种线粒体染色体)共计30亿对碱基的序列测定，以及小鼠、果蝇、线虫等模式生物的全基因组序列的测定。人类基因组计划将由此进入后基因组时代，研究的重点将由发现基因转向发现基因的功能。人们将逐步阐明从基因到蛋白再到生命现象这一过程的奥秘。如何大规模研究人类约10万条基因的功能，特别是基因相互作用和调控关系，迫切需要一种新的方法能以大规模、高通量的方式进行成千上万个基因在各种生理状态下表达状况的研究。传统的Northern blot杂交或点杂交方法，以及以电泳为基础的基因表达、序列测定、突变和多态性分析等研究方法显然不能适应上述的要求。基因芯片技术由此应运而生。

将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500μm)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片，也叫基因微矩阵(Microarray)。基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。

基因芯片的概念可追溯到southern blot杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出northern blot杂交和点杂交技术。这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。

美国affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在1cm²左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics 13,1008-1017.)。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描(U.S Patent5981965)和计算机分析(U.S Patent 5974164)等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。

原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片(Baldwin,D等(1999)Curr OpinPlant Biol 2(2):96-103.)。

有鉴于基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点，目前世界上许多国家和地区都已着手进行基因芯片的研制和开发工作。美国政府于1998年正式启动基因芯片计划，NIH、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne,Oakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。

目前的基因微矩阵芯片技术包含以下几个关键步骤：PCR制备靶基因，点样及固定，探针制备，杂交，检测与分析。

在基因芯片技术中，探针标记是指通过PCR或逆转录的方法等，掺入经过荧光基团修饰的碱基(如dCTP、dUTP)，形成带有荧光标记的DNA探针。这是基因芯片检测系统的重要步骤。杂交的结果通过荧光信号来表示，所以探针标记的好坏直接影响到杂交信号的强弱。

目前，一步逆转录法标记探针是表达谱芯片(cDNA芯片)制备中最常用的的标记方法(DR.Joseph,,et al；(1996).Nature genetics,14,457-460)，但这个方法有一个很大的缺陷，即样本mRNA的需求量大，每次芯片杂交实验需2-5μgmRNA，需要0.2g-1g的组织材料，对于来源困难的材料其应用受到限制。

国外Eberwine等人发明了一种RNA的逆转录扩增及标记方法(GelderRNV,PNAS.USA,87:1663-1667,1990)，这种方法的基本原理及思路是：以mRNA为模板，以5’端含有T7启动子的Oligo dT为引物，通过反转录酶合成第一链cDNA，然后用RNase H降解mRNA，用DNA聚合酶合成第二链cDNA片段(这时以还未降解的mRNA为引物)，再用大肠杆菌连接酶将第二链cDNA片段连接成完整的链，再以此cDNA为模板，用T7 RNA多聚酶扩增大量反义RNA，从而达到扩增效果。再利用反义RNA为模板，用6碱基随机引物进行反转录标记cDNA.

通过这种方法，可以使RNA扩增几十到一百倍，减少对组织的需求。但此方法有以下的缺点：

1．操作步骤过于繁琐，步骤太多；

2．成功率不高；

3．成本太高；

4．由于步骤多，会导致不同的mRNA扩增效率不一样，从而导致结果不够准

确。

由于以上的原因，限制了此方法的广泛推广，目前基因芯片的探针标记还是用常规的逆转录方法进行。

本发明的目的在于公开一种在基因芯片的制备中能用少量的mRNA为模板，逆转录扩增出大量cDNA标记探针的方法。

本发明的构思是这样的：

本发明是将RNA循环逆转录技术应用于基因芯片扩增标记探针的制备。RNA循环逆转录反应方法(中国专利，申请号：98121932.2)是指由一份RNA模板循环逆转录得到多倍份的cDNA的技术。本发明将该技术应用于基因芯片领域，根据基因芯片探针标记的技术要求，提出一种在基因芯片技术中能用少量的mRNA为模板，逆转录扩增出大量cDNA标记探针的技术方案。本发明亦是这样实现的：本发明提出的CRT(循环逆转录)反应体系(50μl)如下：在反应体系中加入1x反应液，Tris-HCl pH7.5-8.5,10-50mmol/l；(NH₄)₂SO₄5.0-25mmol/l；MnCl₂ 1.0-5.0mmol/l；DTT 0.5-5.0mmol/l；dNTP 0.05-1mmol/L；Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)0.04-0.2mmol/L；polydT₁₈ 0.5-2.0umol/l；耐热逆转录酶0.8-8U；mRNA模板50ng-300ng.上述反应体系利用高温逆转录酶，如FD酶、Tth酶等，进行循环逆转录(CRT)，即变性-复性-延伸的循环过程。上述反应混匀后，置于PCR仪中，按以下程序进行CRT：1．变性：温度条件：85-94℃，保温时间：5-120秒；2．复性：温度条件：45-60℃，保温时间：5-100秒；3．延伸：温度条件：55-70℃，保温时间：5-300秒。

循环次数：10-40个然后进行纯化去掉未掺入的单核苷酸。

以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围，有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，举一反三地应用于基因芯片RNA逆转录扩增标记探针的制备，这也在本发明的保护范围之内。实施例：表达谱芯片探针制备(1)采用一步法制备组织mRNA(具体方法略)(2)在50μL反应体系中含有Tris-HCl pH8.0,25mmol/l；(NH₄)₂SO₄ 10mmol/l；

MnCl₂2.0 mmol/l；DTT 2.0mmol/l；dA,G,C，各0.5-mmol/L；dTTP 150mmol/L；

Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 150mmol/L；polydT₁₈ 4umol/L；FD酶(或Tth酶)

5U；mRNA模板80ng。混匀后，在PCR仪上设置反应程序：87℃,10秒；55

℃,10秒；65℃,60秒；循环次数：30个。然后乙醇沉淀进行纯化去掉未掺

入的单核苷酸。同时采用一步逆转录法和RNA扩增法作对照，一步法需用用3μg mRNA才能达到相同的效果，RNA的扩增法也只用了80ng mRNA，但成功率低，不到50％。

通过说明书所公开的技术方案和实施例表明，本发明可以利用少量的mRNA制备芯片杂交探针，只需常规方法的三十分之一左右的mRNA用量就能完成一次杂交，使基因芯片技术几乎不受标本取材少的限制。其与目前常用的RNA扩增标记技术相比，具有以下优点：

1．操作大大简单，只需一种酶反应，而RNA扩增标记技术需要6种酶4步反应及至少3次纯化过程，成功率低；

2．成本大大降低，由于只使用一种酶，只需一次纯化，因此成本只有RNA扩增标记方法的十分之一左右；

3．节约时间，只需2-3小时就完成标记过程，而RNA扩增标记法至少需要两个工作日；

4．RNA扩增标记方法由于步骤多，会导致不同的mRNA扩增效率不一样，另外，扩增的是反义RNA，再用随机引物进行反转录标记，使不同的mRNA标记效率不一样，而导致芯片杂交结果不够准确。而本发明只用了一种酶反应，只用了一种引物(oligo dT),cDNA探针量基本上代表了其mRNA的量，使得芯片的结果更准确。

Claims (2)

1、一种RNA逆转录扩增标记探针的制备方法，其特征在于，应用循环逆转录方法，

(1)CRT(循环逆转录)反应体系(50μl)为：在反应体系中加入1x反应液，Tris-HCl pH7.5-8.5,10-50mmol/l；(NH₄)₂SO₄5.0-25mmol/l；MnCl₂ 1.0-5.0mmol/l；DTT 0.5-5.0mmol/l；dNTP 0.05-1mmol/L；Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)0.04-0.2mmol/L；polydT₁₈ 0.5-2.0umol/l；耐热逆转录酶0.8-8U；mRNA模板50ng-300ng。

(2)循环逆转录(CRT)，即变性-复性-延伸的循环过程，其于PCR仪中的程序和条件为：

变性：温度条件：85-94℃，保温时间：5-120秒；

复性：温度条件：45-60℃，保温时间：5-100秒；

延伸：温度条件：55-70℃，保温时间：5-300秒。

循环次数：10-40个

然后进行纯化去掉未掺入的单核苷酸。

2、如权利要求1所述的RNA逆转录扩增标记探针的制备方法，其特征在于，最适条件为，在50μL反应体系中含有Tris-HCl pH8.0,25mmol/l；(NH₄)₂SO₄ 10mmol/l；MnCl₂ 2.0mmol/l；DTT 2.0mmol/l；dA,G,C，各0.5-mmol/L；dTTP150mmol/L；Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 150mmol/L；polydT₁₈ 4umol/L；FD酶(或Tth酶)5U；mRNA模板80ng。混匀后，在PCR仪上设置反应程序：87℃,10秒；55℃,10秒；65℃,60秒；循环次数：30个。然后乙醇沉淀进行纯化去掉未掺入的单核苷酸。