CN1645144A - 一种荧光标记试剂2－萘氧基乙酰氯的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
一种荧光标记试剂2－萘氧基乙酰氯的制备和应用，属于荧光标记试剂技术领域。2－萘氧基乙酰氯的制备是以2－萘氧基乙酸和草酰氯反应，反应物用乙酸乙酯/石油醚重结晶而制得。该产品被应用于金刚烷胺(AT)、1，3二甲基金刚烷胺(MT)和脑组织、脑脊液中氨基酸的荧光标记。本发明方法反应条件温和、产品纯度高，所得产品是一种简单、新型、经济、高灵敏的荧光标记试剂，还可广泛用于氨基类化合物、氨基酸类化合物的荧光标记。在生物、制药行业有广泛的应用前景，产品化可产生较大的经济效益。
Description
技术领域
一种荧光标记试剂2-萘氧基乙酰氯的制备和应用，属于荧光标记试剂技术领域。
背景技术
作为一种高灵敏的检测手段，荧光衍生化反应已广泛应用于化学、生物制药、环境监测和其他分析化学领域。对于大多数胺类、氨基酸类化合物，由于不含生色基团，不能用简单的分光光度法加以分析。采用化学衍生法是一个行之有效的途径。开发简单有效的荧光标记物，用于胺类、氨基酸类化合物荧光标记，对于多肽、蛋白、蛋白水解产物、生物制药质量控制、食品行业、环保行业等方面有很广泛的应用前景。
荧光标记试剂的基本构成：包括荧光团(试剂分子母体生色基团)和取代基。
衍生试剂要求具有与被衍生物反应生成稳定共价键的取代基，衍生试剂必须含有可检测的基团，对于荧光衍生试剂，荧光团就是衍生试剂分子母体，一个好的衍生试剂还要具备较好的溶解性。目前常用的衍生试剂有如下几类。
胺类化合物的衍生试剂：通常有邻二醛类(OPA)，异硫氰酸酯类(FITC)，酰氯类(FMOC)，活性卤类(NDB-Cl)，N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类(AQC)。
醇、酚的衍生试剂：羰基氯类(FMOC)，磺酰氯类(DNs-Cl)，卤代三嗪类(EDTN)。
羧酸类化合物的衍生试剂：溴甲基类(BrMMC)，哌嗪基类(DBD-Pz)，重氮甲烷基类(ADAM)。
羰基化合物的衍生试剂：肼类(DNs-H)，氨基类(氨基甲基芘)。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光标记试剂2-萘氧基乙酰氯的制备和应用，该试剂与胺类、氨基酸类化合物能发生简单的衍生化反应进行荧光标记，广泛用于蛋白水解产物、生物制药质量控制、食品行业、环保行业等。
本发明的技术方案：
2-萘氧基乙酰氯的结构式为：
一种荧光标记试剂2-萘氧基乙酰氯的制备方法，是用2-萘氧基乙酸和草酰氯进行合成反应，2-萘氧基乙酸与草酰氯的mol配比为1∶0.5～1，50～70℃搅拌回流1.5小时，反应结束后，再用乙酸乙酯/石油醚重结晶制得淡黄色固体产品。
1、2-萘氧基乙酰氯的制备
25ml三口瓶中加2-萘氧基乙酸(2.20g，10mmol)，加草酰氯(0.63～1.27g，5～10mmol)，50～70℃搅拌回流1.5小时，用10～20ml乙酸乙酯溶解，滴加5～10ml石油醚析出淡黄色晶体，熔点96～98℃。FT-IR：1795，1588，1217，945。MS：m/z 220(M)+，m/z 222(M+2)+，m/z 127(C10H7)+。收率87.3％。
2、2-萘氧基乙酰氯的特性
2-萘氧基乙酰氯结构中的萘基具有荧光发色基团，并且具有可取代的烷氧基，没有发色团的氨基和羟基可直接联接到发色团萘基上，使其具有很好的分光光度性质。2-萘氧基乙酰氯对潮湿的空气较敏感，但在干燥的棕色瓶中可保持数月而外观无变化。其对氨基化合物具有较高的活性，衍生反应很快。是一种新型的较好的荧光标记化合物。
3、荧光标记的应用
金刚烷胺(AT)和1，3二甲基金刚烷胺(MT)是典型的伯胺类化合物，是抗病毒类药物，结构式见下，因为结构式中缺少发色基团，对其药物的质控、体内药物分布、药代动力学研究造成很大的困难，用2-萘氧基乙酰氯标记后，可很方便地检测生物样品中药物的浓度。
本发明的有益效果：2-萘氧基乙酰氯，一种简单、经济、高灵敏的荧光标记试剂，可广泛用于氨基类化合物、氨基酸类化合物的荧光标记。在生物、制药行业有广泛的应用前景，产品化可产生较大的经济效益。
关于2-萘氧基乙酰氯的制备，Tsai-Hui Duh等报导了其制备方法，以2-萘氧基乙酸和氯化亚砜反应，反应过程产生的氯化氢气体用氢氧化钠干燥装置吸收，反应液蒸去溶剂进行浓缩，用正己烷重结晶得2-萘氧基乙酰氯。该方法中使用的原料氯化亚砜不稳定，需先进行处理，反应液的颜色较深。反应过程产生较多的氯化氢气体，需要用氢氧化钠干燥装置吸收，而且易造成环境污染。重结晶采用正己烷的用量很大，得到的产品纯度不高，需多次处理。
本发明对文献方法进行了改进。2-萘氧基乙酰氯的制备是以2-萘氧基乙酸和草酰氯反应，反应过程产生二氧化碳，无需多余的装置，反应条件较温和。反应物用乙酸乙酯/石油醚重结晶而制得，产物纯度很高。
具体实施方式
实施例1
2-萘氧基乙酰氯用于AT的荧光标记
衍生化反应：取300μl含有AT溶液，(5mmol/L的三乙胺甲苯溶液中含有10μmol/L的AT)，加入有100μl内标溶液(9，10-二苯基蒽作为内标)和100μl的2-萘氧基乙酰氯的25ml的试管中，30℃反应5～6分钟。衍生反应结束后加入250μl甲醇，在25～30℃下进一步反应8分钟以除去多余的2-萘氧基乙酰氯。标记后甲醇处理过的溶液可以直接用于HPLC分析。
(1)、2-萘氧基乙酰氯用量试验
反应温度保持25～30℃，配制不同浓度的2-萘氧基乙酰氯，与AT(≥50nmol)衍生反应，通过试验可知达到反应平衡所需的2-萘氧基乙酰氯用量为10-1000nmol。
(2)、衍生反应时间试验
用AT与2-萘氧基乙酰氯反应，反应控制在0.5～10分钟之间，显示30秒就能达到反应完全。考虑一些样品来源于血浆、或其他生物制剂，所以为了让其反应充分，我们将衍生反应时间选择为5～6分钟。
(3)、衍生物的稳定性研究
衍生反应结束后，将反应产物在室温放置，结果发现反应物在48小时内稳定。
(4)、标准曲线与精确度试验
AT线性范围：配制不同浓度的AT试验。用积分面积对浓度作回归，发现浓度在0.5-10μmol/L范围内，线性良好。线性方程：AT：y＝(0.26±0.004)x+(0.031±0.003)，r＝0.9996(n＝5)。检测限：(S/N＝3)3ng。日内标准偏差：RSD≤2.0％(n＝5)。
实施例2
2-萘氧基乙酰氯用于MT的荧光标记
被标记物改用MT，其他操作同实施例1。配制不同浓度的MT试验。用积分面积对浓度作回归，发现浓度在0.5-10μmol/L范围内，线性良好。线性方程：MT：y＝(0.275±0.006)x-(0.005±0.008)，r＝0.9991(n＝5)。检测限：(S/N＝3)3ng。日内标准偏差：RSD≤2.5％(n＝5)。
实施例3
脑组织和脑脊液中神经递质氨基酸的荧光标记
谷氨酸和天门冬氨酸是脑部重要的兴奋性神经递质、r-氨基丁酸及甘氨酸是脑部重要的抑制性神经递质，这些氨基酸类神经递质存在于脑组织和脑脊液中，其含量变化可诱发如癫痫、舞蹈病、帕金森病、老年痴呆等多种神经系统疾病。测定这些氨基酸类神经递质的含量变化对于神经系统疾病的病因和预后分析有极其重要的意义。但是其含量很低(pmol/L)，一般的分析方法灵敏度不够。用2-萘氧基乙酰氯标记后，可定量地检测到脑内和脑脊液中神经递质的变化，可用于临床检测，有较重要的推广应用价值。
样品预处理
脑脊液中氨基酸类神经递质的检测：取脑脊液20μl加0.4mol/L过氯酸180μl，混匀，离心。取上清液10μl，用5mmol/L的三乙胺甲苯溶液稀释至300μl，接着同实施例1同样操作，用2-萘氧基乙酰氯进行标记，即可用于HPLC分析。
脑组织中氨基酸类神经递质的检测：用0.1mol/L磷酸盐缓冲液制备脑组织匀浆，用过氯酸除去蛋白，离心沉淀，上清液10μl同上操作，经2-萘氧基乙酰氯标记后用于HPLC分析。
2-萘氧基乙酰氯可用于几十种氨基酸的荧光标记。用乙腈-乙酸钠混合液作为流动相，荧光检测激发波长为265nm，发射波长为310nm。
实施例4
2-萘氧基乙酰氯可以用于伯胺(AT，MT)，仲胺(哌啶，二乙胺)，芳香族胺(苯胺)，伯醇(n-丙醇)，仲醇(2-丙醇)，叔醇(氟哌啶醇)，苯酚、苯硫酚和牛磺酸的标记。
Claims (6)
1.一种荧光标记试剂2-萘氧基乙酰氯的制备方法，其特征是用2-萘氧基乙酸和草酰氯进行合成反应，2-萘氧基乙酸与草酰氯的mol配比为1∶0.5～1，50～70℃搅拌回流1.5小时，反应结束后，再用乙酸乙酯/石油醚重结晶制得淡黄色固体产品。
2.一种权利要求1方法制得的产品2-萘氧基乙酰氯的应用，其特征是用于对金刚烷胺进行荧光标记。
3.一种权利要求1方法制得的产品2-萘氧基乙酰氯的应用，其特征是用于对1，3二甲基金刚烷胺进行荧光标记。
4.一种权利要求1方法制得的产品2-萘氧基乙酰氯的应用，其特征是用于对脑组织和脑脊液中神经递质类氨基酸进行荧光标记。
5.根据权利要求2、3或4的应用，其特征是：
(1)测试溶液的配制：5mmol/L的三乙胺甲苯溶液中含有10μmol/L金刚烷胺，或含有10μmol/L1，3二甲基金刚烷胺，或含有10μl/L的脑组织或脑脊液中神经递质类氨基酸的处理液；
(2)荧光标记：在25ml试管中加300μl含有金刚烷胺，或含有1，3二甲基金刚烷胺，或含有脑组织或脑脊液中神经递质类氨基酸的溶液，100μl 9，10-二苯基蒽内标溶液，和100μl的10-1000nmol/L的2-萘氧基乙酰氯，30□反应5-6分钟；
(3)后处理：标记反应结束后，加250μl甲醇，在30□下进一步反应8分钟以除去多余的2-萘氧基乙酰氯，甲醇处理过的溶液可以直接用于HPLC分析。
6、一种权利要求1方法制得的产品2-萘氧基乙酰氯的应用，其特征是用于哌啶、二乙胺、苯胺、n-丙醇、2-丙醇、氟哌啶醇、苯酚、苯硫酚、谷氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、r-氨基丁酸、牛磺酸的荧光标记。
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