CN1595152A - 一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法，以使生物芯片激光共聚焦扫描仪适合于高密度生物芯片检测。第一步：以f_m频率对激发光源所发出的光进行强度调制，使恒定激光激发时所产生的荧光信号频率f_s为被移到f_m－f_s，荧光信号具有与光电倍增管的噪声以及背景光噪声有所区别的f_m－f_s的频率特征，第二步：然后对荧光电信号进行带通放大，放大后的荧光电信号输入到相敏检波电路，同时将调制激光器用的交流信号做为参考信号输入到相敏检波电路，通过相敏检波解调电路滤除燥声并恢复频率为f_s的荧光信号。本发明能著降低生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度受光电倍增管的噪声以及背景光燥声对灵敏度的影响，满足高密度生物芯片检测的需要。

Description

一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法

技术领域

本发明涉及生物光学检测仪器领域，更具体地说，它涉及一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法。

背景技术

生物芯片可应用于疾病诊断、药物开发、药物个性化治疗等生物学领域，生物芯片扫描仪是用于生物芯片信息检测的信息读出装置，生物芯片上通过点样仪固定有代表各种生物信息的探针，在其表面标记荧光物质；使用时，将被测生物样品涂敷在生物芯片上进行杂交，如果生物样品中含有探针一致的信息，二者就结合在一起，就可以将荧光物质固定，然后用蒸馏水冲洗生物芯片，没有被固定的荧光物质将被清洗掉，被固定的荧光物质将被保留，因此，生物芯片的检测，实际上是对杂交后芯片上微弱荧光物质的检测。

现有生物芯片检测方法有CCD成像法和激光共聚焦扫描法两种。

CCD成像法是用激发光源同时照射生物芯片，在检测端用滤光片滤除激发光，只让荧光通过，并通过成像系统在CCD上成像，由CCD记录二维荧光信号。CCD成像法一次测量可以得到生物芯片上一块面积的信息，因此其检测速度快，但横向分辨率比较低；视场很小，即一次测量的芯片面积较小，当需要测量的芯片面积较大时，就只能多次分块测量，然后拼接起来。分块扫描实际上是通过机械运动方式使芯片与成像系统做相对运动，但是由于机械定位误差，将形成扫描图像的拼接误差，所以这种方法不适用于高密度生物芯片检测，另一方面，CCD灵敏度远低于光电倍增管，为此检测灵敏度也是比较低的。

在激光共聚焦扫描法中，使用激光作为激发光，通过光学系统将激光会聚，生物芯片放置在焦平面上；然后使生物芯片做二维扫描，激光照射到荧光物质时，将产生荧光，由光学系统收集荧光，最后通过光电倍增管将荧光信号转换为电信号。在激光共聚焦扫描法中，对生物芯片是逐点扫描的，由于生物芯片放置在焦平面上，因此激发光的光斑尺寸是非常小的，其横向分辨率比较高。而且通过在接收端设置一共轭针孔，可以消除焦平面以外的杂散光的干扰，检测灵敏度也比较高。但是，在高密度生物芯片检测中，荧光信号强度非常微弱，作为光电转换器件的光电倍增管的噪声以及背景光将限制灵敏度的提高。而这个问题是共聚焦法所不能解决的。

发明内容

本发明的目的是为了解决生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度受光电倍增管的噪声以及背景光限制这一问题，给出一种提高灵敏度的方法，以使生物芯片激光共聚焦扫描仪适合于高密度生物芯片的检测。

本发明方法包括以下步骤：

第一步：以f_m频率对激发光源所发出的光进行强度调制，使恒定激光激发时所产生的荧光信号频率f_s为被移到f_m-f_s，荧光信号具有与光电倍增管的噪声以及背景光噪声有所区别的f_m-f_s的频率特征，

第二步：然后对荧光电信号进行带通放大，放大后的荧光电信号输入到相敏检波电路，同时将调制激光器用的交流信号做为参考信号输入到相敏检波电路，通过相敏检波解调电路滤除燥声并恢复频率为f_s的荧光信号。

所述的调制频率f_m与恒定激光激发时所产生的荧光信号频率f_s之间应满足f_m＞＞f_s，至少为f_m＞10f_s。

用半导体激光器作为激发光源，激光的调制通过直接调制激光器驱动电流实现，激发光源采用包括He-Ne激光器的其它类型激光器，激光的调制通过斩波器来实现。

本发明的有益效果是：

本发明能著降低生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度受光电倍增管的噪声以及背景光燥声对灵敏度的影响，满足高密度生物芯片检测的需要。

附图说明

图1是本发明实施例1原理图，

图2是合成器原理图；

图3是本发明实施2原理图；

图4是斩波器中转盘的示意图

图5是斩波器结构图

具体实施方式

下面结合附图1、2、3、4、5对本发明作进一步的描述。

本发明方法包括以下步骤：

第一步：以f_m频率对激发光源所发出的光进行强度调制，使恒定激光激发时所产生的荧光信号频率f_s为被移到f_m-f_s，荧光信号具有与光电倍增管的噪声以及背景光噪声有所区别的f_m-f_s的频率特征；

第二步：然后对荧光电信号进行带通放大，放大后的荧光电信号输入到相敏检波电路，同时将调制激光器用的交流信号做为参考信号输入到相敏检波电路，通过相敏检波解调电路滤除燥声并恢复频率为f_s的荧光信号。

其工作原理是：

用正弦波信号对激光器进行强度调制，设调制频率为f_m，激发光表示为：

                         I(t)＝I_mcos(2πft)

式中：I_m为激发光强度；

设芯片匀速扫描、恒定度幅激光(强度为I_m)激发下，产生的荧光信号为：

                         I_s(t)＝I_smcos(2f_st)

在调制后激光激发下，得到的荧光信号则为：I′_s(t)＝I_smcos(2πf_st)cos(2πf_mt)

在光电倍增管中转换为电信号为：u_s(t)＝RI_smcos(2πf_st)cos(2πf_mt)式中：R为光电转换参数。

解调时，使用正弦信号调制信号作为同步信号，与荧光电信号相乘，再通过低通滤波器滤除高频信号，得到原始荧光信号。滤除载波信号在数学上可以用在载波信号的一个周期内取平均值来表示，输出信号可表示为：输出信号可表示为：

$u_0=\frac{1}{2\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}{u}_s\cos \left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)=\frac{1}{2\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}R{I}_{\mathrm{sm}}\cos \left(2\mathrm{\π}{f}_{s}t\right){\cos }^2\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)$

$=\frac{1}{2\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}R{I}_{\mathrm{sm}}\cos \left(2\mathrm{\π}{f}_{s}t\right)\left(\frac{1+\cos \left(4\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)}{2}\right)d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)=\frac{1}{2}R{I}_{\mathrm{sm}}\cos \left(2\mathrm{\π}{f}_{s}t\right)$

可见，经过相敏检波后可获得原始荧光信号。下面分析本方法滤除噪声的能力。

当光电倍增管的噪声以及背景光噪声迭加到荧光信号上时，这种噪声为加性噪声。首先考虑频率为载波高次谐波频率的噪声，设为u_n(2πnf_mt)，其中n为大于1的整数，由它产生的附加输出为：

$u_{n0}=\frac{1}{2\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}{u}_n\cos \left(2\mathrm{\πn}{f}_{m}t\right)d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)$

$=\frac{1}{4\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}{u}_n[\cos \left(2\mathrm{\π}(n-1)f_{m}t\right)+\cos \left(2\mathrm{\π}(n+1)f_{m}t\right)]d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)=0$

可见相敏检波电路具有抑制频率为载波高次谐波频率的噪声的能力。当噪声频率f_n与载波频率f_m无倍数关系时，有

$u_{n0}=\frac{1}{2\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}{u}_n\cos \left(2\mathrm{\πn}{f}_{m}t\right)d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)$

$=\frac{1}{4\mathrm{\π}}{\∫}_0^{2\mathrm{\π}}{u}_n[\cos \left(2\mathrm{\π}(f_n-f_m)t\right)+\cos \left(2\mathrm{\π}(f_n+f_m)t\right)d\left(2\mathrm{\π}{f}_{m}t\right)$

总的来说，当f_n与f_mf_m无倍数关系时，上述积分式的值不为零。但是1)f_s+f_m与f_s-f_m值越大，积分式中正负相消的成分越多，积分值越小；2)f_n接近为f_m不等于1的整数倍时，在2πf_m的2π周期，cos(2π(f_s+f_m))与cos(2π(f_s-f_m))接近变化整数个周期，积分式中正负成分大部相消，积分值接近为零。这就是说，除了f_s≈f_m的一个窄频带内，其他频率的输入信号均得到较大的衰减，这说明相敏检波电路具有抑制干扰的能力。从而，证明了本方法提高灵敏度的可行性。

本发明可以显著降低生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度受光电倍增管的噪声以及背景光燥声对灵敏度的影响，满足高密度生物芯片检测的需要。

实施例1：

以半导体激光器(LD)为激发光源的提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法：CY5荧光物质的吸收峰值波长约为630nm，因此可以使用波长为635nm的半导体激光器作为激发光源。所述的激发光源用半导体激光器作为激发光源，激光的调制通过直接调制激光器驱动电流实现，由与半导体激光器相连接的信号发生器输出方波电压信号作为调制信号，直流电源输出恒定电压作为偏置电压，二者在合成器中合成，形成半导体激光器的驱动电流，半导体激光器被调制后输出方波形状的激发光。

由图1所示，仪器：信号发生器1、直流电源2、合成器3、激光器4、反射镜5、反射全息带阻滤光片6、显微物镜7、载波片8、二维扫描平台9、反射全息带阻滤光片10、聚焦透镜11、针孔12、光电倍增管13、带通放大器14、相敏检波器15。信号发生器1输出方波电压信号作为调制信号，直流电源2输出恒定电压作为偏置电压，二者在合成器3中合成，形成半导体激光器4的驱动电流。半导体激光器4被调制后输出方波形状的激发光，经反射镜5反射，入射到反射全息带阻滤光片6上，经反射全息带阻滤光片6反射，进入到显微物镜7，激发光被会聚，焦点位于生物芯片8的前表面，激发出荧光。在测量过程中，生物芯片8由二维扫描平台9带动，进行二维扫描。

荧光及散射激发光由显微物镜7收集并转换为平行光，荧光及部分散射激发光透过反射全息带阻滤光片6后，散射激发光被反射全息滤光片10进一步滤光，而荧光通过反射全息带阻滤光片10。荧光由聚焦透镜11会聚，通过放置于焦点处的针孔12，而杂散光则不能通过针孔12。通过针孔12的荧光照射在光电倍增管13上，转换为电信号，经带通放大器14放大后输入到相敏检波器15，同时信号发生器1输出的方波电压信号也输入到相敏检波器15，作为同步参考信号。相敏检波器15的输出信号为解调的荧光信号，并有效减小了光电倍增管13的噪声影响。

图2为合成器3的原理图。合成器同时具有将调制电压和偏置电压合成并转换为电流的功能。使用集成运算放大器作为核心元件，采用差动放大结构。方波调制电压V_m经电阻R₁输入到集成运算放大器的反相端，直流偏置V_b经电阻R₂输入到集成运算放大器的同相端。输出端电压V₀为：

$V_0=(1+\frac{R_f}{R_1})\frac{R_3}{R_2+R_3}{V}_b-\frac{R_f}{R_1}{V}_m$

设半导体激光器正向导通电压为为V_D，则半导体激光器工作电流为：

$I=\frac{V_0-V_D}{R_L}$

半导体激光器的输出功率P为：

                       P＝P_th+R(I-I_th)

其中，I_th为半导体激光器的阈值电流，P_th为当半导体激光器的工作电流为阈值电流时的辐射功率，R为电光转换效率。

方波电压信号将使半导体激光器输出功率为方波形式的光信号。半导体激光器具有高达GHz的调制频率，完全可以满足需要。

实施例2

以He-Ne激光器为激发光源的提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法：CY5荧光物质的吸收峰值波长约为630nm，因此可以使用波长为632.8nm的He-Ne激光器作为激发光源。激发光源采用-Ne激光器，激光的调制通过斩波器来实现，He-Ne激光器所发出的激发光由斩波器调制，调制后输出方波形状的激发光。如图3所示，He-Ne激光器4发射功率恒定的激发光，激发光经过斩波器16，激发光被斩波器16调制，调制后输出方波形状的激发光，经反射镜5射，入射到分光镜17一部分光被反射，被光电管18为电信号，作为同步参考信号；分光镜17射光作为激发光，入射到反射全息带阻滤光片6上，经反射全息带阻滤光片6反射，进入到显微物镜7，激发光被会聚，焦点位于生物芯片8的前表面，激发出荧光。在测量过程中，生物芯片8由二维扫描平台9带动，进行二维扫描。

荧光及散射激发光由显微物镜7收集并转换为平行光，荧光及部分散射激发光透过反射全息带阻滤光片6后，散射激发光被反射全息带阻滤光片10进一步滤光，而荧光通过反射全息带阻滤光片10。荧光由聚焦透镜11会聚，通过放置于焦点处的针孔12，而杂散光则不能通过针孔12。通过针孔12的荧光照射在光电倍增管13上，转换为电信号，经带通放大器14放大后输入到相敏检波器15，同时光电管5输出的信号作为同步参考信号也输入到相敏检波器15，作为同步参考信号。相敏检波器15的输出信号为解调的荧光信号，并有效减小了光电倍增管13的噪声影响。

He-Ne激光器输出激发光调制所用的斩波器是由边缘上开有大小相同均布小孔的转盘与电机转轴连接而成。图4为斩波器16的示意图，在转盘的边缘开有分布均匀、半径相同的小孔，激光可以通过小孔。激光垂直照射转盘表面，转盘绕圆心转动时，从转盘另一侧可得到强度调制的激光。图5为斩波器的结构图，转盘19通过转轴20连接电机21，绕圆心匀速转动，电机21机固定架22在底座上。调制频率可通过电机21转速和转盘19孔的数量来确定。设电机21转速为m转/秒，转盘19孔数为n，则调制频率f_m为：

                     f_m＝m×nHz

Claims (5)

1、种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法，其特征在于方法包括以下步骤：

第一步：以f_m频率对激发光源所发出的光进行强度调制，使恒定激光激发时所产生的荧光信号频率f_s为被移到f_m-f_s，荧光信号具有与光电倍增管的噪声以及背景光噪声有所区别的f_m-f_s的频率特征，

第二步：然后对荧光电信号进行带通放大，放大后的荧光电信号输入到相敏检波电路，同时将调制激光器用的交流信号做为参考信号输入到相敏检波电路，通过相敏检波解调电路滤除燥声并恢复频率为f_s的荧光信号。

2、根据权利要求1所述的一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法，其特征在于，所述的调制频率f_m与恒定激光激发时所产生的荧光信号频率f_s之间应满足f_m＞＞f_s，至少为f_m＞10f_s。

3、根据权利要求1所述的一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法，其特征在于，所述的激发光源用半导体激光器作为激发光源，激光的调制通过直接调制激光器驱动电流实现，由与半导体激光器相连接的信号发生器输出方波电压信号作为调制信号，直流电源输出恒定电压作为偏置电压，二者在合成器中合成，形成半导体激光器的驱动电流，半导体激光器被调制后输出方波形状的激发光。

4、根据权利要求1所述的一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法，其特征在于，所述的激发光源为He-Ne激光器，激光的调制通过斩波器来实现，He-Ne激光器所发出的激发光由斩波器调制，调制后输出方波形状的激发光。

5、如权利要求1或4所述的一种提高生物芯片激光共聚焦扫描仪灵敏度的方法，其特征在于，所述的对He-Ne激光器输出激发光调制所用的斩波器是由边缘上开有大小相同均布小孔的转盘与电机转轴连接而成。

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