CN1563358A - 紫菜原生质体纯系的超低温保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种紫菜原生质体的超低温保存方法，其特征是将紫菜剪切，用解离液进行单棵酶解，紫菜与解离液的重量比为1∶1.2－1.5，将酶解后的原生质体洗涤离心沉淀，用筛绢过滤收集不同纯系的原生质体，放入冻存管中，经玻璃化冻存剂过渡及脱水处理后，立即放入液氮中冻存。其优点在于实现了单细胞水平的紫菜纯系的种质保存，从而保证了种质遗传性的稳定，有效地防止遗传基因的变异或丢失，有利于运用紫菜原生质进行遗传育种操作和生理生化等各种实验生物学的基础研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产养殖领域的紫菜原生质体纯系的超低温保存方法。
背景技术
紫菜是重要的经济海藻。我国主要栽培种类有南方的坛紫菜(Porphyrahaitanensis)和北方的条斑紫菜(P.yezoensis)。紫菜的生活史包括微型的丝状孢子体(二倍体)和大型的叶状配子体(单倍体)。不同种类的紫菜有不同的生殖特点。坛紫菜的配子体为雌雄同体和雌雄异体，不放散单孢子，一般为有性繁殖。条斑紫菜的配子体为雌雄同体，除有性繁殖外，也能放散单孢子行无性繁殖。利用有性繁殖培育配子体纯系需要雌雄异体的交配，再自交或雌雄同体的自交。经过连续自交选择才能得到纯系，培养的时间长，操作繁杂。条斑紫菜能放散单孢子进行无性繁殖培养纯系，但这些纯系都是多细胞个体。已有报道用-20℃的温度短时间保存幼苗，用于海里养殖。也有用条斑紫菜的丝状孢子体和由单孢子产生的纯系叶状配子体的超低温保存，这些保存都属于多细胞个体。但是单细胞水平的紫菜原生质体纯系超的低温保存方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫菜原生质体纯系的超低温保存方法，它能弥补现有技术的上述不足。
一种紫菜原生质体的超低温保存方法，其特征是将紫菜剪切，用解离液进行单棵酶解，紫菜与解离液的重量比为1∶1.2-1.5，将酶解后的原生质体洗涤离心沉淀，用筛绢过滤收集不同纯系的原生质体，放入冻存管中，经玻璃化冻存剂过渡及脱水处理后，放入液氮中冻存。
本发明中酶解得到的原生质体，由于它没有细胞壁，在冷冻期间能排除细胞产生的张力。用该原生质体代替叶状体进行冷冻，使细胞内物质及液体能在更短时间内凝固，能更均匀地形成玻璃化物质，其优点在于实现了单细胞水平的紫菜纯系的种质保存，从而保证了种质遗传性的稳定，有效地防止遗传基因的变异或丢失，有利于运用紫菜原生质进行遗传育种操作和生理生化等各种实验生物学的基础研究。
具体实施方案
(1)将人工养殖或自然生长的坛紫菜或条斑紫菜阴干，其含水量在30～40％，密封于塑料袋中，速冻保存在-20～-30℃的冰柜里。
(2)将冷冻保存的坛紫菜或条斑紫菜置无菌海水中复苏，培养1～2天。
(3)将复苏的紫菜或现采集的新鲜紫菜2g剪成2mm2大小，加入解离液2.5-3.0g，在20～25℃下单棵酶解3小时，将酶解后的原生质体洗涤离心沉淀，用40μm的筛绢过滤收集不同纯系的原生质体，并用灭菌海水洗涤三次。所述的解离液由1-3％(重量百分浓度，下同)的海藻工具酶(由中国海洋大学生产，已市售多年)、0.8-1.2％的纤维素酶(Onozuka R-10)和25～30％的葡萄糖和无离子水所组成，其中葡萄糖起渗透剂的作用。
(4)取0.3g原生质体，加入1ML用海水稀释成重量百分浓度为25％的玻璃化冻存剂VS6(该VS6由9-11％的二甲基亚砜(DMSO)、25～30％的甘油、9-11％的蔗糖，用海水配制而成)0℃过渡处理5分钟后，离心收集原生质体，加入1ML于0℃预冷的VS6，转移至2ML的冻存管中，脱水3分钟，立即放入液氮罐中冻存。
(5)复苏时，将冻存管置于38-42℃水浴中解冻，一旦冰块消失立即取出，在30分钟内加入7倍体积预冷的灭菌海水，离心收集原生质体，再用灭菌海水洗涤培养，用二乙酸酯荧光素(fluorescein diacetate，FDA)活性染色法，检测冻存后原生质体的存活率，最高可达66.5％。
本发明利用酶法分离紫菜原生质体，使不能无性繁殖的坛紫菜能够培养原生质体纯系；同时也能克服条斑紫菜在自然状态下放散单孢子只能培养纯系叶状体的缺点；以及使个体水平上的种质保存变为细胞水平上的种质保存。由此建立紫菜的细胞株库，使不同地方的紫菜良种细胞系、各种抗逆性细胞系、极端环境下生长的稀少种细胞系和其他紫菜物种等细胞株系的种质资源，都能长久保持遗传的稳定性，以便为基础研究和生产应用提供有价值的种质资源。
Claims (3)
1、一种紫菜原生质体的超低温保存方法，其特征是将紫菜剪切，用解离液进行单棵酶解，紫菜与解离液的重量比为1∶1.2-1.5，将酶解后的原生质体洗涤离心沉淀，用筛绢过滤收集不同纯系的原生质体，放入冻存管中，经玻璃化冻存剂过渡及脱水处理后，放入液氮中冻存。
2、如权利要求1所述的保存方法，其特征是所述的解离液由1-3％的海藻工具酶、0.8-1.2％的纤维素酶、25～30％的葡萄糖和无离子水所组成。
3、如权利要求1所述的保存方法，其特征是所述的玻璃化冻存剂由9-11％的二甲基亚砜、25～30％的甘油、9-11％蔗糖，用海水配制而成。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101418350B (zh) * | 2008-10-28 | 2011-06-15 | 南京农业大学 | 利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒的方法 |
| CN103013905A (zh) * | 2013-01-19 | 2013-04-03 | 安徽科技学院 | 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术 |
| CN106508519A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-03-22 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种条斑紫菜筏架设施的绿藻防治方法 |
| CN114731943A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-07-12 | 常熟理工学院 | 条斑紫菜果孢子的制备方法 |
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2004
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