CN1548541A - 一类重组基因产生的朊蛋白（PrPc）融合变构体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类由酵母朊病毒结构域与动物和人正常朊蛋白基因重组表达的融合变构体，其中正常朊蛋白基因可来自人、牛、羊、鹿、貂、鸡、猫等。酵母朊病毒结构域基因为Ure2p1－65或Sup351－114。域Ure2p1－65或Sup35p1－114基因的重组及其表达的融合变构体的制备方法。这种融合变构体可作为阳性对照替代品应用于疯牛病等朊病毒病的检测与诊断，其优越性在于避免了用有病脑组织提取物作为阳性对照造成传染的危险，以及未发生疯牛病等朊病毒病的国家获得阳性对照。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域。具体地讲提涉及一种由酵母朊病毒结构域与动物和人正常朊蛋白基因重组表达的融合变构体，其中正常朊蛋白基因可来自人、牛、羊、鹿、貂、鸡、猫等，酵母朊病毒结构域为编码Ure2p1-65或Sup35p1-114基因，及重组表达的融合变构体的制备方法。这种融合变构体可作为阳性对照替代品应用于疯牛病等朊病毒病的检测与诊断，其优越性在于避免了用有病脑组织提取物作为阳性对照造成传染的危险，以及未发生疯牛病等朊病毒病的国家地区获得阳性对照。
背景技术
朊病毒(Prion)是一类可引起人和动物的可转移性神经退化疾病的新型感染因子，病原为致病型朊蛋白(PrPSC)。它是由宿主体内正常表达的朊蛋白(PrPC)空间结构异常变化而形成的。PrPC和PrPSC来源于同一基因，具有相同的氨基酸序列和共价修饰，但在空间结构和理化性质上存在很大的差异。PrPC主要由α-螺旋组成，对蛋白酶消化高度敏感，而PrPSC中β-折叠含量显著增加，具有一定的抵抗蛋白酶水解的能力。目前，对PrPC的正常生理功能以及PrPC→PrPSC的转变机制尚不清楚。
朊病毒不仅是对传统生物学理论的全新挑战，而且已造成了严重的经济损失和社会恐惶。1985-1996年英国爆发严重的疯牛病疫情，已确诊的疯牛达18万头，数以百万计的牛被扑杀、焚烧处理。随后，疫情扩散到了整个欧洲。截止到2002年12月，日本已出现四例疯牛病，经济损失高达2000亿日元，约1.3万吨牛肉被销毁。目前我国尚未发现疯牛病，但前景不容乐观。最主要的隐患是尚未建立严格准确的朊病毒检测体系。其中阳性对照是检测中必须的。阳性对照通常是来源非常有限的病脑组织提取物。由于这种提取物是有很高的传染性，其贮存、运输和使用要受到严格的监控，不适合我国广大基层检疫部门和海岸关口的使用。因此研制一种安全、有效的阳性对照替代品应用于疯牛病等朊病毒病的检测迫在眉捷。
近年来，朊病毒概念已扩展到低等生物-酵母中。发现酵母表型[URE3]和[PSI]分别是由酵母正常朊蛋白Ure2p和Sup35p空间结构异常变化引起的。Ure2p是一种氮代谢调节蛋白，由两个独立的结构域组成：N端1-65区域涉及其异常构象的诱导和增殖，故称朊病毒结构域；C端66-354区域负责正常的氮代谢调节。Sup35p是一种转录终止因子，同样也由两大部分组成：N端1-114区域负责构象转变，其它区域负责转录终止作用。Ure2p和Sup35p的朊病毒结构域富含天冬酰胺和谷氨酰胺，已证明二者具有类似的构象转变机制。重组表达的Ure2p和Sup35p朊病毒结构域在体外达到一定浓度时，会自发聚集，形成电镜下可见的纤维状结构，并具有类似PrPSC的理化性质，包括对蛋白酶K消化抵抗能力增加；刚果红染色后呈黄绿双折光等。
我们在国内率先开展了中国肉牛、小尾寒羊和人等正常朊蛋白结构与功能的研究工作，同时也对酵母朊病毒结构域的构象转变功能进行了深入探讨。在此基础上，首次将酵母朊病毒结构域应用到正常朊蛋白的变构研究中。得到的正常朊蛋白与酵母朊病毒结构域的融合体在所设条件下结构发生变化，并具有类似PrPSC的理化性质，如抵抗蛋白酶K消化等，但不是有感染性。这类融合变构体可作为阳性对照替代品应用于疯牛病、羊搔痒病与人类朊病毒疾病等的检疫与诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有正常朊蛋白基因与酵母朊病毒Ure2p或Sup35p结构域基因的重组基因和由重组基因所表达的融合变构体。所述的正常朊蛋白基因可以来自人、牛、羊、鹿、貂、猫动物的全长或其截短形式并具有相同功能的朊蛋白基因，所述的酵母朊病毒结构域基因是指编码Ure2p的1-65位氨基酸区域或Sup35p的1-114位的氨基酸区域基因片段，在保持酵母朊病毒结构域功能的前提下，可以对上述区域作适当的删减或延长。其中，酵母朊病毒结构域基因片段融合在正常朊蛋白基因的N端或C端。酵母朊病毒结构域基因片段和正常朊蛋白基因可以直接融合或加适当的连接区，如八聚甘氨酸基因片段。
本发明的另外一个目的在于提供一种制备所述的融合物变构体的方法。该方法包括：1)正常朊蛋白基因与酵母朊病毒Ure2p或Sup35p结构域基因的融合；2)将1)的基因融合重组片段插入到原核表达载体pET30a(+)中，在大肠杆菌BL21中表达、表达产物(包含体形式)用6M盐酸胍溶解，进行Ni亲合层析和柱上复性，以16％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝鉴定纯度，得到大于95％纯度的蛋白。所得组分浓度高于1mg/ml；3)将浓度至少为1mg/ml的重组蛋白在pH4.0-9.0的缓冲液中，0℃-37℃反应至少7小时，获得融合物变构体。
本发明还提供了一种获得如上所述的融合变构体的制备方法，该方法和其获得的融合变构体在制备蛋白酶消化朊蛋白试剂中的应用；和在制备朊病毒的检测与诊断阳性对照试剂中的应用。
本发明中的融合变构体属基因工程产品，成本廉价，适于大量生产。融合变构体本身无危险性，依据如下：1.采用的宿主为大肠杆菌，缺乏PrPSC感染所必须的糖基化和糖基磷酸肌醇化等转录后修饰过程；2.融合变构体的构象转变属酵母朊病毒结构域依赖性，体内增殖环境为低等生物-酵母，与人和哺乳动物相差甚远；3.融合变构体的构象转变本质上属突变类型。至今通过点突变、缺失产生的PrPC可发生构象转变，但证实均无感染性；4.融合变构体的获得须经过蛋白变性和复性处理，证据表明即便是PrPSC经过上述处理也不能恢复其致病性。
为了更好地理解本发明的上述目的，如下对发明内容与效果做进一步描述：
一、本发明首先提供了一种通过基因重组途径产生正常朊蛋白(PrPC)变构体的新方法。
已报道在体外产生PrPC变构体的方法主要是利用一些化学试剂等对PrPC长时间处理，包括还原剂(如二硫苏糖醇DTT)；高浓度的铜离子；核酸大分子；酸性条件下的低浓度变性剂(如盐酸胍，尿素)等。
与上述方法不同，本发明首次将酵母朊病毒结构域应用到PrPC的变构研究中。结果证实，酵母朊病毒结构域具有促进与之融合蛋白构象异常变化，并导致聚集成纤维的功能。我们将此结构域基因与PrPC基因融合表达，其产物在所设条件下构象产生异常变化，使部分α-螺旋转变为β-折叠，对蛋白酶K消化的抵抗能力也随之增加。本变构方法的方便之处在于不需额外加入上述化学试剂，融合蛋白会自发产生变构反应。
二、本发明提供了一类酵母朊病毒结构域基因片段与PrPC基因融合所表达的变构体。
酵母朊病毒结构域基因片段包括Ure2p的1-65位氨基酸残基或Sup35p的1-114位氨基酸残基对应的区域。以上是酵母朊病毒发挥其构象改变功能的公认区域，但在保持该功能前提下，对所述区域的适当删减或延长也应包括在本发明范围之内。
正常朊蛋白基因可分别来自人、牛、羊、貂、鹿、猫、鸡全长朊蛋白片段或其截短形式。
由于酵母朊病毒结构域基因片段和正常朊蛋白基因存在结构上的相对独立性，所得融合变构体的异构作用不受两种结构域基因片段在重组次序上的限制：对应的两个基因片段可直接重组或加适当的柔性连接区。
融合变构体的表达系统可以是大肠杆菌或酵母菌。
三、本发明提供了一种将(二)所述融合变构体结构改变的方法
以牛正常朊蛋白(bPrPC 25-242)基因和酵母朊病毒结构域(Ure2p1-65)的重组体为例。将对应的基因重组片段插入到原核表达载体pET30a(+)中，在大肠杆菌BL21中得到高效表达，产物(包含体形式)用6M盐酸胍溶解，进行Ni亲合层析和柱上复性。以16％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝鉴定纯度，得到大于95％纯度的蛋白。所得组分在浓度高于1mg/ml时放置7小时后开始出现变构聚集体。该聚集体经乙酸铀负染色，在电镜下呈纤维状；经刚果红染色在偏振光显微镜下呈黄绿双折光性；对蛋白酶消化抵抗能力增加。
上述变构体形成的最佳条件为10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，pH7.0。反应最适温度为37℃，在反应体系中加入预先经超声处理的变构聚集体，可加速上述变构过程。
本变构方法也同样适用于(二)中所述人和其它动物PrPC融合变构体的变构反应。
四、本发明提供了一种利用(二)中所述融合变构体来确定朊病毒检测中具体样品的蛋白酶消化条件的方法。
目前区分正常朊蛋白(PrPC)和致病型朊蛋白(PrPSC)的公认依据是对前者对蛋白酶K消化高度敏感性而后者具有有限的抵抗能力。待检样品首先经蛋白酶K处理，完全除去正常型PrPC，再作进一步检测，如免疫印迹法。但是大量待检样品的不均一性决定了样品中PrPC或PrPSC含量会在较大范围内波动，这要求根据样品性质及时地调整蛋白消化条件，否则会造成假阳性或假阴性结果。
应用本发明提供的融合变构体，可解决上述困难。
方法如下：
(1)运用Western blot确定与待检样品中朊蛋白(PrPC或PrPSC)含量相对应的融合变构体的蛋白浓度。取若干不等量的融合变构体，例如1μg，3μg，5μg，10μg等。与待检样品作平行的Western blot实验。根据待检样品的显色浓度确定与之相当的融合变构体的蛋白量。
(2)根据(1)中确定的融合变构体的蛋白量确定合适的蛋白酶消化浓度和作用时间。
当固定蛋白酶消化时间(如37℃ 1小时)时，将蛋白酶K分成若干作用浓度如10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，50μg/ml等。在正常样品中加入量如(1)所确定的融合变构体，并分别经上述一系列浓度的蛋白酶K 37℃作用1小时，消化产物作Western blot鉴定。根据显色结果找出融合变构体刚好未被完全消化的对应的蛋白酶浓度。此浓度可应用(1)中待检样品的朊病毒检测。
当固定蛋白酶作用浓度时，与上述过程类似可确定合适的作用时间。
五、本发明提供了(二)中所述融合变构体在检测与诊断朊病毒中的阳性对照应用。
以bPrPC 25-242-Ure2p1-65变构体为例。它可作为阳性对照替代品应用于免疫印迹法检测与诊断疯牛病。
取等量的待检脑组织样品和正常样品分别加入bPrPC 25-242和bPrPC 25-242-Ure2p1-65变构体蛋白。其中加入bPrPC 25-242-Ure2p1-65变构体的正常样品为阳性对照组。在待检样品中额外加入bPrPC 25-242的目的在于使之与阳性对照组的蛋白总量相同，以保持实验的可比性。样品经蛋白酶K消化(具体见施实例)后，进行电泳和电转分析，结果表明在对照组由于融合变构体对蛋白酶K消化的抵抗能力远高于未变构的重组蛋白，所以Western blot鉴定为阳性。待检样品中bPrPC会被完全消化，Western blot结果取决于样品中是否含有PrPSC。
本应用条件同样适合于(二)中所述其它融合变构体在相关朊病毒检测中阳性对照的应用。
具体实施方案：
实施例1 牛朊蛋白(bPrPC 25-242)基因的克隆
从新鲜牛血中低速离心获得淋巴细胞，加入蛋白酶K(终浓度50-70μg/ml)和SDS(终浓度0.5％)，混匀后50℃保温3-5小时。加入等体积酚-氯仿抽提两次，取上清加2倍体积无水乙醇，沉淀得到牛总DNA。
通过聚合酶链式反应(PCR)克隆牛朊蛋白成熟基因片段，所用引物为：
引物1：5’CGGGATCCCATATGAAGAAGCGACCAAAACCTG 3’
引物2：5’GGGAATTCTATTAACTTGCCCCTCGTTGGTA 3’
PCR反应条件如下：94℃变性 3分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃1分钟，共30循环；72℃ 10分钟。
PCR产物为约700bp的片段，末端人为引入两个酶切位点BamHI和EcoRI，将扩增片段进行测序，结果与文献报导(Goldmann W. et al.，GeneBank编号：A54330)一致。
实施例2 bPrPC 25-242在大肠杆菌中的表达、纯化、复性和抗血清的制备
将扩增片段经BamHI与EcoRI酶切后连接到表达载体pET30a(+)转化大肠杆菌BL21。此菌株经1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4小时后产生表达，以12％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测表达产物分子量约23Kda，与理论值基本一致。
将包涵体bPrPC 25-242蛋白用8M尿素溶解，经POROS 20HS(BioCAD公司)进行阳离子层析纯化。用透析法复性所得组分。以12％SDS-PAGE电泳和银染鉴定纯度，得到大于95％纯度的bPrPC 25-242蛋白。表达产物用3F4单克隆抗体进行Western blot鉴定。
将bPrPC 25-242蛋白(1mg/ml)与完全弗氏佐剂等体积混合后免疫新西兰白兔。两周后，将bPrPC 25-242蛋白(1mg/ml)与不完全弗氏佐剂等体积乳化，肌肉注射进行加强免疫。两周后，再进行一次加强免疫，用ELISA检测抗血清效价达1∶10000以上。
实施例3 酵母朊病毒结构域Ure2p1-65基因的克隆
按实施1中方法从具有[URE3]表型的酵母3687中提取总DNA。
通过PCR方法克隆Ure2p1-65基因，所用引物为：
引物3：5’AT GAA TTC AAT AAC AAC GGC AAC C 3’
引物4：5’GG CTCGAG TTA GCG GCC GCT GTT ATT G 3’
PCR反应条件如下：94℃ 3分钟；94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 1分钟，25循环；72℃ 10分钟。
PCR产物长约180bp，通过两端引入的酶切位点EcoRI和XhoI克隆到表达载体pET30a(+)质粒中并并命名为pET30a-Ure2p1-65。其中Ure2p1-65与文献报导(Coschigano，P. W. et al，GeneBank编号：AF525199)一致。
实施例4 牛朊蛋白(bPrPC 25-242)基因与酵母朊病毒结构域(Ure2p1-65)基因片段的重组
按施实例1中PCR条件，改造bPrPC 25-242基因两端的酶切位点，所用引物为：
引物5：5’GGCATATGAAGAAGCGACCAAAACCTG 3’
引物6：5’GGGAATTCACTTGCCCCTCGTTGGTA 3’
bPrPC 25-242基因经改造后，两端酶切位点为BamHI和EcoRI，不含终止子，将此片段连接到实施例3中的重组表达载体pET30a-Ure2p1-65中，得到重组基因bPrPC 25-242-Ure2p1-65的融合表达载体。序列测定证明两基因片段阅读框正确。
实施例5 PrPC 25-242-Ure2p1-65重组体在大肠杆菌中表达，纯化与复性处理
将实施例4中构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，重组菌株经1mM IPTG诱导4小时后产物表达，以12％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝检测表达产物约为32Kda，与预期值一致。
将包涵体bPrPC 25-242-Ure2p1-65蛋白用6M盐酸胍溶解，经Ni柱(Parmacia Biotech公司)进行亲合层析，并用6M-0M盐酸胍进行梯度洗涤使之在柱上复性。以缓冲液(10mM tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，0.5M imdole)洗脱组分，以12％SDS-PAC电泳和银染鉴定，得到大于95％纯度的bPrPC 25-242-Ure2p1-65重组体，表达产物用3F4单克隆抗体进行Western blot鉴定。
实施例6 bPrPC 25-242-Ure2p1-65重组体的变构处理与表征
将bPrPC 25-242-Ure2p1-65重组蛋白加入缓冲液(10mM Tris-HCl，150mMNaCl，1mM EDTA，pH8.0)至1mg/ml，37℃摇床中缓慢振荡，7小时后开始出现重组体的变构聚集物，100小时后变构反应基本完成。
取5μl bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体，滴于喷过碳的铜网上，用去离子水洗2次，2％乙酸铀染色30秒，再用去离子洗2次，空气干燥，在日立H600A电子显微镜下观察。结果表明变构体呈纤维状，长度为100-500nm，直径为6-15nm。
取100μl bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体，涂于载玻片上，用去离子水洗2次，加入0.1体积的2％刚果红，室温染色1小时，去离子水洗2次。干燥后用90％乙醇洗涤。在Olympus BH2偏振光显微镜下观察，结果表明融合变构体经刚果红染色后呈黄绿双折光性。
实施例7 bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体对蛋白酶K消化抵抗能力实验
用缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA pH8.0)将bPrPC 25-242，bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体蛋白浓度调整为1mg/ml，加入终浓度分别为1，3，5，10，20，50μg/ml的蛋白酶K，在37℃进行反应，1小时后立即加入含5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的上样缓冲液，置于沸水浴中3-5分钟，用16％SDS-PAGE检测消化情况。结果表明bPrPC 25-242在蛋白酶K为浓度1μg/ml时已经被完全消化，而bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体在蛋白酶K为50μg/ml时仍存在对应的蛋白带，说明融合变构体对蛋白酶K水解抵抗能力较重组牛正常朊蛋白至少提高了50倍。
实施例8 应用bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体确定检测牛脑组织时相适应的蛋白酶K消化条件
取1g牛脑组织用预冷裂解液A(10mM Tris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，10mM EDTA)制成10％的匀浆，3000rpm离心除去细胞碎片。取20μl匀浆液与蛋白量依次为50ng，100ng，200ng，300ng，400ng的融合变构体bPrPC 25-242-Ure2p1-65分别经16％SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕后，在4℃ 100V条件下将蛋白转移到硝酸纤维膜上。用5％脱脂奶粉室温封闭1h。将自制bPrPC抗血清3T1按1∶1000稀释，与膜在室温下共浴2h。随后与按1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG反应1h。最后用ECL Kit显色，结果表明匀浆液中牛朊蛋白含量相当于200ng的bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体。
将200ng bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体加入到正常牛脑组织中，经蛋白酶K浓度为1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml37℃作用1h，立即加入5mM PMSF(苯甲基磺酰氟)终止反应。将消化产物按上述方法进行电转和电转条件处理，结果表明在蛋白酶K浓度大于50μg/ml时，融合变构体被完全消化。
由以上实验得出检测牛脑组织的合适蛋白酶消化条件是蛋白酶K为50μg/ml，37℃作用1h。
实施例9 bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体作为阳性对照替代品应用于疯牛病的检测与诊断。
每头牛分别取1g待检牛脑组织和正常牛脑组织，用预冷的裂解液A(10mM Tris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，10mM EDTA)制成10％匀浆，离心除去细胞碎片，待检脑组织和正常脑组织上清液中分别加入正常重组牛朊蛋白bPrPC 25-242和bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体各200ng。按实施例8中确定的蛋白酶消化条件进行。消化产物经16％SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用5％脱脂奶粉室温1h，膜与牛朊蛋白抗血清(稀释度1∶1000)共浴2h。最后膜与辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(稀释度1∶2000)室温共浴1h。用ECL Kit显色。加入bPrPC 25-242-Ure2p1-65融合变构体的正常组织视为阳性对照反应。当阳性对照为阳性结果而待检组中不存在抗蛋白酶K消化的致病型朊蛋白时，方可视为阴性。
实施例10 羊朊蛋白基因(ovPrPC 25-231)的克隆
按实施例1中方法从中国小尾寒羊血液中提取总DNA，通过PCR方法克隆ovPrPC 25-231基因片段，所用引物为：
引物7：5’GGCATATGAAGAAGCGACCAAAACCTG 3’
引物8：5’GGGAATTCTAACTTGCCCCTCGTTGGTA 3’
PCR反应条件如下：94℃ 3分钟；94℃ 50秒，58℃ 50秒，72℃ 1分钟，25循环；72℃ 10分钟。
PCR产物长约600bp，通过两端引入的酶切位点NdeI和EcoRI克隆到ruc19质粒中并进行测序。结果与文献报导(Goldmann，W.et al.，1994)，分析比较表明中国小羊属寒羊为一新的基因型为PrPARH(GeneBank编号No.AY029774)。
实施例11 羊朊蛋白(ovPrPC 25-231)基因与酵母朊蛋白结构域(Ure2p1-65)基因片段的融合变构体的获得与应用
将实施例10得到ovPrPC 25-231基因片段通过NdeI和EcoRI连接到实施例3中构建的重组表达载体pET30a-Ure2p1-65中，将重组载体转化到大肠杆菌BL21中，经1m IPTG诱导4小时后得到表达产物，ovPrPC 25-231-Ure2p1-65纯化复性方法见实施例5。该重组体的变构反应按实施例6进行。ovPrPC 25-231-Ure2p1-65融合变构体的蛋白酶K抵抗能力实验同bPrPC 25-242-Ure2p1-65变体体(见实施例7)。结果显示，ovPrPC 25-231-Ure2p1-65变构后对蛋白酶K消化抵抗能力较ovPrPC 25-231重组蛋白提高了近50倍。实验表明ovPrPC 25-231-Ure2p1-65融合异构体可作为阳性对照替代品应用于羊搔痒的检测，也可应用于调整蛋白酶K消化的实验条件。
实施例12 人朊蛋白(huPrPC 91-231)基因片段的克隆
按实施例1中方法从人血液中提取总DNA。
通过PCR方法克隆huPrPC 91-231基因，所用引物为：
引物9：5’GG CAT ATG GGG TCA AGG AGG 3’
引物10：5’GG GAATTC TAA CTC TCC ACC TG 3’
PCR反应条件如下：94℃ 3分钟；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 1分钟，25循环；72℃ 10分钟。
PCR产物长约420bp，通过两端引入的酶切位点NdeI和EcoRI克隆到pUC19质粒中并进行测序，结果与文献报导一致。
实施例13 人朊蛋白(huPrPC 91-231)基因与酵母朊病毒结构域(Ure2p1-65)基因片段的融合变构体的获得与应用
将实施例12得到的huPrPC 91-231基因通过NdeI和EcoRI连接到实施例3中构建的重组表达载体pET30a-Ure2p1-65中，将重组载体转化到大肠杆菌BL21中，经1mM IPTG诱导4小时得到表达产物。huPrPC 91-231-Ure2p1-65纯化、复性方法同实施例5，变构反应同实施例6。蛋白酶K抵抗能力实验同实施例7。
结果表明，huPrPC 91-231-Ure2p1-65变构后对蛋白酶K消化抵抗能力较huPrPC 91-231重组蛋白提高近60倍。进一步实验表明，huPrPC 91-231-Ure2p1-65融合变构体可作为阳性对照替代品应用于人克雅氏病的检测，也可作为参照品应用于蛋白消化实验条件的建立。
由于实验条件所限，本发明不可能对每一种朊蛋白基因与Ure2p1-65基因片段进行融合表达与体外变构并确定抵抗蛋白酶K消化的能力，但我们以牛、羊和人朊蛋白为代表，得到的bPrPC 25-242-Ure2p1-65，ovPrPC 25-231-Ure2p1-65和huPrPC 91-231-Ure2p1-65融合变构体对蛋白酶K消化抵抗能力均提高了50倍以上。大量实验表明Ure2p1-65与常见朊蛋白融合后，可发生异构反应，具备了抗蛋白酶K消化的能力，可作为阳性对照替代品应用于朊病毒的检测，也可作为参照品来调整不同样品对应的合适的蛋白酶K消化条件。因此，除牛、羊和人朊蛋白之外，其它朊蛋白如鹿、貂、鸡等与Ure2p1-65的融合变构体的应用也应当在本发明的保护范围之内。
实施例14 酵母朊病毒结构域Sup35p1-114基因片段的克隆
按实施例1中方法，从具有表型[PSI]的酵母中提取总DNA，通过PCR方法克隆Sup35p1-114所用引物为：
引物9：5’ATGAA TTC GAT TCA AAC CAA GGC AAC 3’
引物10：5’GG CTC GAG TTA AGG TTG GAA TCC AGC 3’
PCR反应条件如下：94℃变性3分钟；94℃ 50秒，52℃ 50秒，72℃1分钟，25循环；72℃ 10分钟。
PCR产物长约340bp，通过两端引入的酶切位点EcoRI和XhoI克隆到表达载体pET30a(+)中命名为pET30a-Sup35p1-114，测序结果与文献报导一致。
实施例15 牛、羊、人朊蛋白(PrPC)基因与酵母朊病毒结构域Sup35P1-114基因片段的融合变构体的获得与应用
将bPrpC 25-242，ovPrPC 25-231和huPrPC 91-231基因片段(见实施例1，10和13)分别插入到实施例14构建的重组表达载体pET30a-Sup35p1-114并转化到大肠杆菌BL21中，经1mM IPTG诱导4小时后分别得到表达产物。纯化复性方法同实施例5。变构反应按实施例6进行。蛋白酶K消化实验按实施例7进行。结果显示bPrPC 25-242-Sup35p1-114，ovPrPC 25-231-Sup35P1-114和huPrPC 91-231-Sup35p1-114融合变构体均具有较强的抗蛋白酶K水解的能力。可作为阳性对照替代品应用于疯牛病、羊搔痒病和人克雅氏病的检测，也可作为参照品来调整不同样品对应的合适的蛋白酶K消化条件。
如实施例13所述，除牛、羊和人朊蛋白之外，其它朊蛋白如鹿、貂、鸡等与Sup35p1-114的融合变构体的应用也在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种含有正常朊蛋白基因与酵母朊病毒Ure2p或Sup35p结构域基因的重组基因。
2.一种由权利要求1所述的重组基因所表达的融合变构体。
3.按照权利要求1所述的重组基因，其中，所述的正常朊蛋白基因为来自人、牛、羊、鹿、貂、猫动物的全长或其截短形式并具有相同功能的朊蛋白基因。
4.按照权利要求1所述的重组基因，其中，所述的酵母朊病毒结构域基因对应于编码Ure2p的1-65位氨基酸区域或Sup35p的1-114位的氨基酸区域基因片段，在保持酵母朊病毒结构域功能的前提下，可对上述区域作适当的删减或延长。
5.按照权利要求1所述的重组基因，其中，酵母朊病毒结构域基因片段融合在正常朊蛋白基因的N端或C端。酵母朊病毒结构域基因片段和正常朊蛋白基因直接融合或加适当的连接区，如八聚甘氨酸基因片段。
6.一种制备权利要求2所述的融合物变构体的方法，包括：
1)正常朊蛋白基因与酵母朊病毒Ure2p或Sup35p结构域基因的融合；
2)将1)的基因融合重组片段插入到原核表达载体pET30a(+)中，在大肠杆菌BL21中表达、表达产物(包含体形式)用6M盐酸胍溶解，进行Ni亲合层析和柱上复性，以16％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝鉴定纯度，得到大于95％纯度的蛋白。所得组分浓度高于1mg/ml；
3)将浓度至少为1mg/ml的重组蛋白在pH4.0-9.0的缓冲液中，0℃-37℃反应至少7小时，获得融合物变构体
7.根据权利要求2所述的或6的方法获得的融合变构体，在制备蛋白酶消化朊蛋白试剂中的应用。
8.权利要求2所述的或6的方法获得的融合变构体，在制备朊病毒的检测与诊断阳性对照试剂中的应用。
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