CN1521253A - 细胞培养装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改良的细胞培养装置,特别是涉及体外培养哺乳动物细胞的培养装置及方法。特征在于所说的装置主要由培养瓶壳体和一个置于其内部的由选择性通透膜构成的分隔的细胞培养袋构成,其中由选择性通透膜限制的培养袋完全浸没在培养瓶内的液体培养基中,并且培养瓶的上壁开有多个通气孔。

Description

细胞培养装置
发明领域
本发明涉及改良的细胞培养装置,特别是涉及,但不限于,体外培养各類細胞,包括哺乳动物细胞,昆虫細胞,植物細胞等以及組織培养的培养装置及方法。特征在于所说的装置主要由培养瓶壳体和一个置于其内部的由选择性通透膜构成的分隔的细胞培养袋构成,其中由选择性通透膜限制的培养袋完全浸没在培养瓶内的液体培养基中,并且培养瓶的上壁开有多个通气孔。本发明的培养瓶可单独使用,也可由多个培养瓶在摇床或转床上构成复和装置,以实现细胞和其有用产物的大批量生产。
发明背景
体外培养细胞和组织的装置是一类常用的生物学实验和生产装置。传统的体外细胞特别是哺乳动物细胞培养通常是在固定的组织培养瓶或转瓶中进行的。使用这种培养装置时,要定时更换培养基、除去废物并收集有用的产物。这些培养装置存在操作麻烦、细胞密度小、条件(如营养素浓度)不易控制、细胞或组织产物浓度较低和易于丢失等缺点。
美国专利4,748,124号描述一种由下部可透过气体但不透液体的片层和上部透析膜限定的细胞培养分隔室。虽然这种结构可使透析膜不被阻塞,但存在改变氧压力的能力有限、对透气材料的表面化学要求高以及难以实现高密度培养等缺点。美国专利5,693,537号公开了一种分隔的细胞培养瓶,特征在于瓶中有一个由半透膜构成的细胞隔离培养室,培养室下面的透气膜形成培养瓶底部,直接接触空气;而上面的选择性透过化合物的片层则与培养液接触。培养瓶上部有一个进气及加料口,空气通过瓶底部进入培养室,再与进气口形成流通,以允许通过底部透气膜与分隔培养室的内容物进行气体交换。该装置使得细胞表达产物与培养室外的培养液相对分离,并且培养基或气体可通过半透膜进入培养室,从而达到营养更换目的。然而,该美国专利仍存在分隔的细胞培养室只有一面接触营养培养基、底层通气孔易被堵塞、以及加样孔易于受到污染等缺点。
为了解决这些问题,有必要在现有技术的基础上进一步改进培养装置的结构,以期提高单位体积的营养素供应、加大气体交换能力、提高培养的细胞密度,并尽可能地减少污染机会,从而达到提高效率、改进产物质量和降低生产成本的目的。
发明目的
因此,本发明的一个目的提供一种分隔的细胞培养装置,所说的培养装置由一个其上壁带有通气孔的培养瓶和置于瓶体内部的一个由选择性通透膜构成的分隔的细胞培养袋以及用于支撑所说的培养袋的网状支架,其中由选择性通透膜限制的培养袋完全浸没在培养瓶内的液体培养基中。
根据本发明的一个优选实施方案,其中构成培养袋的所说的选择性通透膜是可透过气体并可透过小于选择的特定分子量范围之化合物的半透膜。
根据本发明的一个优选实施方案,其中培养袋支架被安排在培养袋的下面,以允许培养基和其中溶解的气体与所说的培养袋的底面接触,并自由出入培养袋。
根据本发明的一个优选实施方案,其中培养瓶内充入培养基后培养基液面的高度不小于15毫米。
根据本发明的一个特别优选的实施方案,其中所说的培养瓶的顶面左右两侧分别带有至少1个通气孔。
根据本发明的一个优选实施方案,其中培养瓶的一端有一个直接与培养瓶内部的培养袋相通并向其中输入细胞或组织块悬液的第一入口,并且另一端有一个通向瓶内部向并其中输入培养基的第二入口。
根据本发明的一个特别优选的实施方案,其中所说的第一入口的外侧端口是漏斗状的。
根据本发明的一个优选实施方案,其中培养袋的一端开口直接与第一入口延伸到培养瓶瓶体内部的朝下的内侧端口相连,另一端为封闭端或是可用透析袋夹紧闭的开口。
本发明的另一个目的是提供一种培养细胞的方法,该方法包括由可透过气体并选择性地透过小于特定分子量范围之化合物的通透膜构成培养袋,将其放置在位于其下面的网状支架上;用少量培养基将培养袋润湿,然后由培养瓶的漏斗状第一入口注入细胞或组织块悬液,排去袋内的残留空气后封闭第一入口,并由第二入口注入培养基至特定的水平面,以使培养基足可浸没整个培养袋;于预定的温度下,使接种的细胞在培养袋内保持特定的时间,同时允许培养袋内环境与其周围的培养基并通过培养基与大气环境进行营养素、细胞代谢产物和气体的交流。
附图简要说明
图1是本发明的分隔细胞培养装置的正视图。
图2是本发明细胞培养装置的延着长轴中心线纵断面的侧视图。
以上各附图中均具有统一的参考编号(详见下文)。
发明的详细描述
本发明涉及改良的细胞培养装置,特别是涉及,但不限于,体外培养各類細胞,包括哺乳动物细胞,昆虫細胞,植物細胞等以及組織培养的培养装置及方法。特征在于所说的培养瓶壳体内置有一个由选择性通透膜构成的分隔的细胞培养袋和用于支撑所说的培养袋的支架,并且由选择性通透膜限制的培养袋完全浸没在培养瓶内的液体培养基中。本发明对现有技术的改进和其优点包括:将装有细胞或组织的选择性培养袋平铺在特定的支架上,以保证袋内细胞或组织与袋外环境进行充分的营养和气体的交换。所说的细胞培养袋的远端可以是闭合的,也可以是开放的,并且使用时可借助透析袋夹或类似装置封闭所说的远端开口。培养瓶上方加有多个气体对流孔,以防止气孔被阻塞;向装置内灌输细胞的上口呈漏斗状,从而避免了因液体存留或反溢造成的污染机会。
本发明的一个目的是提供一种用于培养细胞特别是哺乳动物细胞或组织的分隔的培养装置。根据本发明的一个优选实施方案,所说的分隔的细胞或组织培养装置基本上包括由可透过气体和小于特定截留分子量之化合物的通透膜限制的并容纳细胞或组织悬液的培养袋,以及包围在所说的培养袋外面并充入了液体培养基的扁平型培养瓶构成。其中培养瓶的一端有一个直接与培养瓶内部的培养袋相通并向其中输入细胞或组织块悬液的第一入口,并且另一端有一个通向瓶内部并向其中输入培养基的第二入口。所说的第一入口的外侧端是漏斗状的。培养瓶瓶体上方入口的这种漏斗状结构,可以有效地防止并减少因液体存留或反溢而可能造成的污染。特别是,本发明培养装置之培养瓶部分的上方有2个以上可保证瓶内培养基与外界环境进行气体交流的通气孔。这样,当培养瓶内充入培养基后,由选择性通透膜限制的培养袋内的细胞或组织培养物即可透过通透膜从充满周围环境的培养基中获取所需的包括溶解于其中的氧在内的各种营养成分,并排出有用的代谢产物或废物。
用于构成细胞培养袋的选择性通透膜(透气膜)材料可以是为细胞生长与繁殖提供适当的细胞外周环境的任何生物相容性的亲水或疏水、多孔或非多孔材料。例如所说的材料可以是纤维素、聚碳酸、聚丙烯酰胺等。当用于培养小鼠杂交瘤细胞时,透析膜通常应截留分子量不小于15,000道尔顿的分子和化合物。另外,值得提到的是,本发明细胞培养装置的两端各设有一个入口并且在上方设有多个通气孔,所以不仅可允许吸管进入培养瓶或培养袋内部,而且可防止由于温度增加而导致的瓶内或袋内压力增加。特别是,本发明装置的结构防止了因蒸发所引起的透析液丢失,并可长时间维持细胞的高密度生长。
本发明对现有技术的最重要改进在于,将现有技术中细胞培养分隔室只有一个侧面通过半透膜与培养基进行营养交换,改为细胞培养分隔室的所有侧面均可通过半透膜与培养基进行营养交换,因而大大改善了细胞的营养供应和生长繁殖条件。
应特别指出的是,虽然本发明的细胞或组织培养装置并未设有一个独立的气体充入部分,但本发明人相信,由于本装置中培养瓶的上侧壁上均匀地开有2个以上的通气孔,通过这些通气孔完全可以实现外界大气环境或人为造成的高氧环境与培养袋周围培养基的气体交换,并依靠溶解于培养基中的氧气来保证袋内细胞或组织的氧供应。我们实验室使用本发明的装置完成的杂交瘤细胞和荷有質粒的CHO等培养实验,已有利地证明本发明装置的实践可应用性(抗體生產量可達1-5mg/ml)。
本发明的另一个目的提供一种培养细胞的方法,该方法包括由可透过气体并选择性地透过小于特定分子量范围之化合物的通透膜构成一个培养袋,将其一端开口与第一入口的内端口严密接合并放置在位于其下面的网状支架上;用少量培养基将培养袋润湿,然后由培养瓶的漏斗状第一入口注入细胞或组织块悬液,排去袋内的残留空气后关闭第一入口,并由第二入口注入培养基至特定的水平面,以使培养基足可浸没整个培养袋;于预定的温度下,使接种的细胞在培养袋内保持特定的时间,同时允许培养袋内环境与其周围的培养基并通过培养基与大气环境进行营养素、细胞代谢产物和气体的交流。
还应说明的是,在某些特定情况下,为了进行细胞的大批量培养,可以将多个本发明的培养瓶同时固定在可按照选择的速度正向或反向自转(例如1-5秒/转)或纵向摇动(例如1-5次/秒)的单层或多层固定架或床体上,以实现细胞的大批量连续培养和细胞表达产物的生产。
实施例
为了进一步描述本发明,作为实施例,以下将结合附图更为具体地说明本发明装置的结构和工作状态。
图1是本发明的分隔细胞培养装置的正视图。其中1是培养瓶瓶体,其形状、大小和制作材料均与传统的普通培养瓶相似。2是培养瓶瓶体一端突出的直接与培养瓶内部的培养袋4相通并向其中输入细胞或组织块悬液(即含有细胞或组织的培养基)6的第一入口。培养袋为细胞培养场所,其中存放含细胞或组织的培养基6,并且向其中引入细胞或组织的第一入口2被盖201覆盖。其中3是培养瓶另一端呈J形伸出的通向瓶内部向并其中输入培养基7的第二入口。第二入口3被盖301覆盖。5是平置状态下培养瓶壳体上壁开设的通气孔,一般每个装置开有孔径一般为5-20mm的2-8个通气孔。为了避免可能发生的污染,可在通气孔5的上缘附加一个密闭的,大多数微生物不能通过的空气滤膜或滤片。
图2是本发明细胞培养装置的延着长轴中心线纵断面的侧视图。从图2可以更为清楚地了解装置的内部结构:第一入口2的上缘约占该入口上方1/4的部分为大口向上的漏斗形状,这样的结构可有利于避免或减少加样或培养过程中因液体滞留或反溢所导致的污染。第一入口2伸向培养瓶内的下部约1/2的部分为开口向下的倒置漏斗状或直形的,其下缘口径约相当于第一入口2的口径。培养袋4的一端开口与第一入口2伸向培养瓶内部的倒置漏斗状部分202的下缘密接。另一端是闭合的或是可用透析袋夹401夹紧的可口。培养袋4的下方为置于培养瓶下壁上的孔径约2-4mm的网状支架8,用于支撑由选择性通透膜构成的培养袋,并保证培养瓶内培养基7能够与培养袋底面接触。
操作中,含有细胞或组织的培养基6通过第一入口2被引入培养袋4中。同时,将液体培养基7通过第二入口3引入培养瓶1的瓶体内,直到培养瓶1内的培养基7浸没整个培养袋4为止。一般说来,当培养瓶和培养袋内分别充入液体培养基或含有细胞或组织的培养基之后,培养瓶内培养基上方的培养基顶部空间不小于培养瓶内精总高度的1/3,从而保证这个空间里存有足够量通过通气孔5与培养基6和7并进而通过这些培养基与细胞进行交换的气体。
实质上开放的通气孔5作为培养瓶内环境与外界大气环境的交流通道,其不仅有利于向培养瓶内输入气体,保证细胞的氧气供应和气体交换,而且可有效地防止细胞培养过程中因温度升高所导致的内环境压力增加。另外,通气孔和液体培养基上方空间的存在还可避免液体培养基携氧能力的降低,并可避免因压力增加对培养袋造成的挤压,以确保培养袋和培养瓶间的静水压平衡。
用于构成细胞培养袋的选择性通透膜(透析膜)材料可以是为细胞生长与繁殖提供适当的细胞外周环境的任何生物相容性的亲水或疏水、多孔或非多孔材料。例如可以是纤维素、聚碳酸、聚丙烯酰胺等。当用于培养小鼠杂交瘤细胞时,透析膜内一般保留分子量大于15,000道尔顿的分子或化合物。具有这种特征的膜,可使细胞、外加的生长因子和细胞分泌的抗体均保留在培养袋内,而具有较小分子量的细胞代谢产物则排除到培养袋外。在某些特定的情况下,本领域技术人员完全可以根据实际需要选择具有不同截留分子量范围的膜。
培养袋支架8用于支撑并稳定培养袋4。当通过第一入口2向培养袋4内引入含有细胞或组织的培养基6后,培养袋支架8可使培养袋4免于下沉并与培养瓶1的底面直接接触。由于培养袋支架8呈网状结构并离开的培养瓶1的底面约5-15mm,所以通过第二入口3充入培养瓶1内的培养基7也可接触到培养袋4底面,以保证培养袋4的内容物与膜外培养基7有足够的交流空间。必要时,可使用固定工具例如小夹子将培养袋4固定在支架上,以防止注入较多生长培养基7时导致培养袋漂浮或受压皱缩。培养袋支架8可以用生物相容的聚丙烯、聚碳酸或聚苯乙烯等高分子材料制成。
在培养瓶1内充有液体培养基的情况下,将含有细胞或组织的培养基6引入细胞培养袋4需要有足够的压力来克服袋外培养基形成的静水压。为此,通向培养袋的第一入口应足以能够向培养袋内伸入一个吸管、注射器或其他培养基容器。另外,由于培养袋内的细胞或组织悬液总是透过半透膜与培养基7接触,所以本装置也没有培养基蒸发或透析受到限制的问题。
构成培养袋4的通透膜材料是能够透过气体和特定范围分子量化合物的生物相容性材料,例如可以是能够或不能透过液体的、亲水或疏水的、多孔或非多孔的,厚度约0.1-0.5mm的高聚物材料。选择通透膜材料时,一般应考虑的主要因素是膜的气体可透过性以及膜与细胞或特定结构的蛋白质分子间的相互作用。
制造培养瓶1的材料可以是任何生物相容性材料,并最好具有一定的透明度,这样即有可能肉眼观测培养基的pH变化和可能发生的微生物污染。优选的培养瓶材料是聚苯乙烯。

Claims (10)

1,一种分隔的细胞培养装置,所说的培养装置由一个其上壁带有通气孔的培养瓶和置于瓶体内部的一个由选择性通透膜构成的分隔的细胞培养袋以及用于支撑所说的培养袋的网状支架,其中由选择性通透膜限制的培养袋完全浸没在培养瓶内的液体培养基中。
2,根据权利要求1的细胞培养装置,其中构成培养袋的所说的选择性通透膜是可透过气体并可透过小于选择的特定分子量范围之化合物的半透膜。
3,根据权利要求1的细胞培养装置,其中培养袋支架被安排在培养袋的下面,以允许培养基和其中溶解的气体与所说的培养袋的底面接触,并自由出入培养袋。
4,根据权利要求1的细胞培养装置,其中培养瓶内充入培养基后培养基液面的高度不小于15毫米。
5,根据权利要求1的细胞培养装置,其中所说的培养瓶的顶面左右两侧分别带有至少1个通气孔。
6,根据权利要求1的细胞培养装置,其中培养瓶的一端有一个直接与培养瓶内部的培养袋相通并向其中输入细胞或组织块悬液的第一入口,并且另一端有一个通向瓶内部向并其中输入培养基的第二入口。
7,根据权利要求1的细胞培养装置,其中所说的第一入口的外侧端口是漏斗状的。
8,根据权利要求1的细胞培养装置,其中培养袋的一端开口直接与第一入口延伸到培养瓶瓶体内部的朝下的内侧端口相连,另一端为封闭端或者是可用透析袋夹紧闭的开放端。
9,一种培养细胞的方法,该方法包括由可透过气体并选择性地透过小于特定分子量范围之化合物的通透膜构成培养袋,将其放置在位于其下面的网状支架上;用少量培养基将培养袋润湿,然后由培养瓶的漏斗状第一入口注入细胞或组织块悬液,排去袋内的残留空气后封闭第一入口,并由第二入口注入培养基至特定的水平面,以使培养基足可浸没整个培养袋;于预定的温度下,使接种的细胞在培养袋内保持特定的时间,同时允许培养袋内环境与其周围的培养基并通过培养基与大气环境进行营养素、细胞代谢产物和气体的交流。
10,根据权利要求9的方法,所说的培养瓶可以单独使用,也可以将多个培养瓶同时固定在可按照选择的速度正向或反向转动或纵向摇动的单层或多层固定架或床体上,以进行大批量连续培养。
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