CN1446581A - Cb与生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原的偶联物及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了霍乱原B亚基(CB)作为配基/载体与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性多肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶联物，以及含有所述偶联物和可药用辅剂或增强剂的复方组合物，和所述保持偶联物生物活性的制备改良方法。本发明的偶联物能够经外周神经受体介导入胞(receptor－mediated endocytosis RME)、由神经轴浆转运进入中枢神经，而绕过血脑屏障，创立了神经受体介导入胞(RME)的投药系统(delivery system DS)，即RME－DS神经转运投药。所述的CB偶联物用于治疗和/或预防脑脊髓疾病或损伤。(例如：CB－NGF，CB－Anti betaA，CB－IGF治疗老年痴呆；CB－CNTF，CB－BDNF，CB－MnA治疗运动神经元病)。

Description

CB与生物活性肽或免疫球蛋白或 免疫活性原的偶联物及其医药用途

技术领域

本发明涉及霍乱原B亚基作为配基/载体与生物活性多肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶联物，及其医药用途和制备方法，以及含有其的组合物。

背景技术

传统的药物学投药系统基本上都是‘经血途径’(Blood routed deliverysystem)：无论是从历史上最初口服的‘经胃肠血循’，还是到近代和当代的各种注射(i.m，i.v.等)‘经肌肉内微血管入血循或直接注入血管’。传统研究对不能透过血脑屏障(BBB)的药物制剂，也都是专注于‘经血途径’，着眼于BBB本身，设法改变制剂，使之易于透过脑血管内皮细胞的BBB。如：改变制剂使之更有脂溶性、改变制剂的若干分子结构或偶联上能进入脑血管内皮细胞的物质使之能蒙混过BBB(Science 2002，297：1116-1118)。

药物入脑的途径是中枢神经系统(CNS)药物设计的源头问题。近代医药学史记载：血脑屏障BBB是德国医学家Paul Ehrlich在十九世纪七十年代发现的(他在细菌免疫学上的贡献曾获1908年诺贝尔医学及生理学奖)；他的学生Edwin Goldmann随之发现脑实质与脑脊液CSF密切相通，从而建立了经CSF进入脑脊髓实质的脑室注射及腰穿等侵害性的投药途径。百余年来，中枢神经的医药学全是追随着Ehrlich和Goldmann开辟的源头，把药物经过血循，生方设法使之穿过BBB或作侵害性的脑室注射、腰椎穿刺等[近年还有脑内移植细胞的手术，其对病人的外科手术侵害性、只能作一次植入、且转基因细胞常只释放一种营养因子、并不能保证长期持续释放，这都使之难予推广]。本专利发明首次在医药学史上开辟了大分子制剂入脑的”神经受体介导入胞投药系统”RME-D神经转运投药的新途径，从源头上设计了一系列经过神经进入脑脊髓的新药，是一项源头创新的重大发明。

2002年八月美国Science(297：1116-1118，2002)的‘焦点新闻’综合报导了试图突破BBB的当代情况：走在前面的UCLA的Pardridge等人也仍还在此老路上徘徊、摸索。近年，Pardridge利用脑血管内皮细胞转铁蛋白(transferrin)受体或转运蛋白(transporter)的抗体偶联BDNF(脑源性神经营养因子)，从而把BDNF偷渡过BBB，在实验动物上治疗实验性脑缺血等，其临床目标是中风[Science的报导形象地把这方法比作是‘愚弄’了内皮细胞的特洛伊木马计，也说明其偷渡的性质]。此技术的缺点：一是，系统经血给药没有靶向性，它使全脑脊髓均介入，多功能的神经营养因子在这种情况下很可能发生副作用(如：有人报道BDNF可能诱发癫痫)；二是，针对转运蛋白的抗体会阻滞转运蛋白的正常功能，从而可能影响脑功能。这都是Pardridge要在临床试用的障碍。2002年Science的这次报导预示着大分子CNS药物即将走上临床应用的药物市场，与及偶联结合是这一发展的技术趋势。

现行的对神经营养因子(NT)的投药方式有三种使之越过血脑屏障(BBB)的方法，一是脑室内注射，二是椎管内蛛膜下腔注射，三是把分泌NT的细胞或组织行脑内移植(或蛛膜下腔移植)手术。三种都有较大的手术创伤，不能作长期的或多次反复的使用。而本发明使用普通的肌肉注射或滴鼻，安全、无创伤，可作常规多次反复使用。肌注部位视治疗目的所需的靶向，而选择相应的神经节段部位。滴鼻的制剂(如：CB-NGF，CB-Anti betaA，CB-IGF等)可经嗅神经进入端脑嗅球，进而影响基底前脑区(Basal forebrain area)，特别是Meynert基底核(nucleusbasalis of Meynert)胆碱能神经元、海马及大脑皮质等大脑结构(治疗Alzheimer’s disease AD阿滋海默氏老年性痴呆、帕金森氏病或中风、脑栓塞等大脑疾患或损伤)；经III，V，VII，XI，XII对脑神经分布区域的肌肉注射或肌内置放缓释胶囊的方式给药即靶向性地把治疗和/或预防脑干疾病的大分子药物导入脑干；经相应节段的脊神经分布区域的肌肉注射或肌内置放缓释胶囊把治疗和/或预防脊髓疾病或损伤的大分子药物导入脊髓(CB-CNTF，CB-BDNF，CB-MnA等治疗运动神经元病，CB-BDNF，CB-IGF，CB-Anti Nogo治疗脊髓损伤或截瘫)。

各种病毒性脑炎的治愈率低、后遗症严重。虽在病毒学上已能产生许多特异性的抗病毒抗体，但IgG大分子不能或很不易通过BBB，特异性的治疗抗体不能进入神经细胞，发挥不了治疗/预防作用。

霍乱原(Choleragen，即霍乱毒素，Cholera Toxin)B亚基或单位(CB，choleragen B subunit)是无毒性的受体结合单位，也称为类霍乱原(choleragenoid)。80年代初，万选才在美国宾大(Univ.of Pennsylvania，UPenn)用霍乱毒素(CT)及WGA等植物凝集素(lectins)与辣根过氧化物酶(HRP)共价结合，用作神经解剖学探针。实验证明CT-HRP受体介导入胞(RME)的轴浆转运(At)效率比UPenn实验室领导人，细胞生物学教授Dr.N.Ganatas推荐的WGA-HRP更为灵敏有效。万回国后又率先甩去CT的毒性A亚单位，只用CB结合HRP。CT或CB作为轴浆转运利化剂(a potent axonal transport facilitator)比非RME转运的效果高百余倍(Wan et al.，1982，Brain Res.243：215)。万选才并以之发现了神经解剖学历史上用经典Golgi方法(高尔基银染法)从所未见的神经元树突，万命名为Golgi-phobic Dendrites，GBD，“嫌高尔基树突”(Exp.Neurol 1982，78：167-175；Anat.Rec，1984，208(3)：190A；PROC.CAMS&PUMC 1986，1：1-10)。这一工作在1984年获国家卫生部甲级科研成果奖，1985年获国家科学技术进步二等奖。

瑞典免疫学者Holmgren在90年代初已用CB作为免疫佐剂，以CB-结合过敏原或抗原(antigen，Ag)的结合物作疫苗，实验证明可以发挥免疫调节作用，使抗原产生的致敏作用受到抑制或得到耐受(tolerance)。对致敏原或自身免疫抗原所致的过敏及自身免疫病，可以由接种CB-Ag获得治疗性的缓解(口服或滴鼻，经粘膜免疫系统发挥作用)。特别是CB的免疫佐剂作用(滴鼻或口服)已在北欧瑞典志愿人群中实验过，证明CB对人体安全无损(Holmgrenetal.，Am.J.Trop.Med.Hyg.1994，50：5Suppl.42-54)。但他从未涉及也未观察CB-GM1受体介导入胞或神经系统疾患。

发明内容

本发明者经过多年研究，发现霍乱原B亚基(CB)作为配基/载体与对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽(神经营养因子neurotrophic factors和neurotrophins，NT等)、或抗体免疫球蛋白immunoglobulins，IgG连接成偶联物，这些偶联物能经周围神经进入脑脊髓，即绕开了血脑屏障(BBB)，把大多数原本是不能透过BBB、但在实验中对脑脊髓疾病有治疗作用的活性多肽/蛋白或IgG等导入了脑脊髓实质，神经转运投药使这些活性物质的临床防治潜力得到充分有效的发挥，而有现实可能应用于临床，由此完成了本发明。

本发明提供了霍乱原B亚基作为配基/载体与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性多肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶联物及其复方组合物。

在本发明中，所述生物活性肽指包括多肽/蛋白及神经营养因子(neurotrophic factors NT，包括神经生长因子nerve growth factor NGF，neurotrophins家族及其他细胞因子家族)、神经激素(neurohormones)、神经肽(neuropeptides)、镇痛肽和细胞凋亡抑制因子(inhibitors forapoptosis)；免疫球蛋白主要是对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的特异性抗体IgG；免疫活性原主要是导致脑脊髓疾病的自身免疫原(immunogens)及过敏原(allergens)。

可以用本发明的神经营养因子包括，但不限于神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子(IGF)等；神经激素有退黑素(melantonin)等；细胞凋亡抑制因子有Bcl2等。

可以用本发明对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的抗体有抗β淀粉样蛋白1-42(betaA)的IgG(anti betaA)(治疗阿滋海默氏老年痴呆)；对疼痛递质的抗体，其中包括抗P物质IgG；对亲神经病毒的抗体IgG；抗白介素-1受体的抗体；和抗Nogo蛋白(抑制中枢神经纤维再生的Nogo蛋白)的IgG。

可以用本发明治疗免疫型运动神经元病(如侧索硬化肌无力ALS等)的导致脑脊髓疾病的自身免疫原有运动神经元抗原蛋白(MnA)；单涎酸节苷酯2(GM2)；乙酰胆碱N受体a亚基(针对重症肌无力)等。

本发明提供了两类以霍乱原B亚基(CB)作为配基/载体的偶联物：

1.CB与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性多肽/蛋白的偶联物—CB-NT。

在本发明中，对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性多肽/蛋白，它们是指以神经营养因子(neurotrophic factors，NT)为代表的神经生长因子(NGF)、神经营养因子neurotrophins家族(NGF及脑源性神经营养因子BDNF，NT3等)，还包括别的几种神经营养因子家族(睫状神经营养因子CNTF，胰岛素样生长因子IGF，胶质细胞源性神经营养因子GDNF等)、神经激素、神经肽和细胞凋亡抑制因子等。

即本发明中的NT包括神经生长因子NGF及以其为代表的别的几种神经营养因子家族、睫状神经营养因子CNTF、胰岛素样生长因子IGF、胶质细胞源性神经营养因子GDNF等以及神经激素、神经肽和细胞凋亡抑制因子等。对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性肽/蛋白的CB偶联制剂是指以CB-NGF为代表的CB-CNTF，CB-BDNF，CB-IGF，CB-GDNF，以及CB-Bcl2，CB-细胞凋亡抑制因子，CB-melatonin，CB-神经激素、CB-神经肽等。

2.CB与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的抗体(IgG)或免疫活性原(immunogenIg)的偶联物—CB-IgG或CB-Ig

在本发明中，对脑脊髓疾病有治疗作用的抗体是指一类免疫球蛋白IgG的单克隆或多克隆抗体，其包括但不限于IgG也包括IgE、IgM等。IgG一类包括有抗痛的抗P物质抗体，抗β淀粉样蛋白1-42单克隆抗体(抗beta Amyloid 1-42，AntibetaA)，抗白介素-1受体的抗体(Anti IL-1r)，抗亲神经病毒的抗体、抗脑炎病毒及抗脑脊髓炎病毒的抗体及抗抑制神经生长蛋白Nogo的抗体等。其中所述的免疫活性原Ig主要是指导致脑脊髓疾病的自身免疫原(immunogens Ig)及过敏原(allergens)，包括：运动神经元抗原蛋白(MnA)及单涎酸节苷酯2(GM2)，乙酰胆硷N受体a亚基等。

对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的抗体IgG或免疫活性原的CB偶联物——CB-IgG/Ig是指以CB-抗P物质抗体(CB-Anti P)为代表的CB-Anti betaA及CB-Anti Nogo，CB-Anti IL-1r，CB-MnA等。

本发明还提供了含有霍乱原B亚基作为配基/载体与对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶联物和可药用辅剂及增强剂的药物组合物。“增强剂”是指增强CB偶联物被神经受体摄取或延缓其被鼻黏液或肌肉血液稀释带走的一些制剂。″药用辅剂″是指制药领域通常认为是安全、无毒性的辅剂，并且它们既无生物学活性也无不良作用。这些辅剂例如可以包括乳糖、淀粉，水，醇等。本发明的复方组合物中可以含有本发明偶联物补充辅助剂。

本发明的药物组合物可以制成缓释胶囊、溶液剂、喷雾剂、注射液等剂型，可以采用胃肠外给药或鼻腔滴入、喷雾等形式给药。本发明的药物组合物优选采用滴鼻给药、肌肉注射或肌内置放缓释胶囊的方式给药(经肌肉神经终末的CB-GM1介导入胞，并不经血)。

本发明涉及上述的偶联制剂在RME-DS靶向给药、绕开血脑屏障对脑脊髓疾患或损伤进行治疗/预防的医药用途具有坚实的理论基础。附图1显示了CB-NT，CB-Ab(IgG)受体介导入胞投药(RME-DS)的细胞生物学原理。

本发明还涉及上述的偶联物在制备经外周神经受体介导入胞、轴浆转运进入中枢神经的药物的用途。具体地，本发明的偶联物经神经膜上的神经节苷酯寡糖受体介导入胞、轴浆转运，从周围进入中枢神经系统，并进一步在脑脊髓内作跨细胞转运。

本发明涉及上述的偶联物的制备用于治疗和/或预防脑脊髓疾病或损伤中的医药用途。具体而言，所述脑脊髓疾病或损伤包括：退行性神经疾患，其选自阿滋海默氏老年性痴呆(Alzheimer’s dementia，AD)、运动神经元病(motor neuron disease，MND)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、顽固性偏头疼和神经系统自身免疫病；脑脊髓损伤，其选自中风、脑血栓、脑缺血、脑外伤和脊髓外伤；疼痛；病毒性脑炎及病毒性脑脊髓炎；HIV脑炎。

退行性中枢(或外周)神经疾患的病理—生理学机制或发病过程多少都有免疫失调或自身免疫参与，有的已明确基本上是自身免疫病(如：重症肌无力，多发性硬化及运动神经元病)。所以，免疫调节复合神经转运投药的靶向性神经营养治疗是缓解、治疗和预防现为不治之症的退行性神经疾患的最好战略。

另一方面，本发明还涉及的霍乱原B亚基作为配基/载体与对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽或抗体、免疫活性原的偶联物的制备改良方法，包括将霍乱原B亚基与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原连接起来，并保持偶联物的生物活性不变。具体地，将霍乱原B亚基的氨基或羧基与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原的羧基或氨基连接起来；或导入硫氢基或二硫酮以二硫键连接起来。也就是说，将霍乱原B亚基的氨基酸与对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽或抗体、免疫活性原的氨基酸经桥联剂以化学共价连接起来，而又保持生物活性的改良技术。

近年来连接不同蛋白/多肽的方法很多，常用的方法学可以参见[Chemistry of Protein and Cross-Linking.Wong 1991 CRC Press Inc.；BocaRaton，Fla；及E.Harlow and D.Lan，Eds，Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor.NY，1988]。蛋白/多肽之间可以用羧酸酯类、酐类、酰基卤类、酰基叠氮化合物等有机化合物作为桥联剂，与蛋白/多肽的反应基团形成共价连接(如与赖氨酸的氨基或与蛋白/多肽的硫基结合等)。具体的方法可参阅上两书。理想的共价连接是经过蛋白/多肽赖氨酸氨基的氨基侧链。五聚体的霍乱原B亚基在每个单体上有9个赖氨酸，可见CB是一个特别合适做偶联的对象。在偶联结合物中CB的结构及活性状况可用与单涎酸节苷GM1的结合做鉴定。在我们的实践中优选改良的是以下两种方法：

方法I(戊二醛GA两步改良法)是对Avrameas和Temyck及Gonatas等的改良法(Modification of Avrameas and Ternyck 1971，Immunochemistry8，1175；Gonatas等，1979，J.Histochem.Cytochem.27，728；Wan，XST 1986，Proc.CAMS & PUMC，1，1-10；1984，Anat.Rec.208，3，190A)。近年为适应不同的活性多肽又经改良。第一步：用1.25％戊二醛活化CB；经Sephadex G-25 column胶柱(60×0.9cm)分离活化的CB与未连接的戊二醛(或不过柱而在0.15M NaCl透析，去除未被连接的戊二醛)；浓缩。第二步：在浓缩的经戊二醛活化的CB中加入等容积的对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽/蛋白或抗体等进行偶联(注意不同的等电点及生物活性位点)；经Sephadex G-200胶柱分离结合态与非结合态的成分；浓缩并稳定。

CB-对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽的生物活性可用离体的细胞培养鉴定(如PC12)。

方法II(二硫键连接改良法)是对Friden等人原法的改良(Modification from Friden et al.，1993，Science 259，373；Kordower etal.，1994，PNAS USA 91，9077)。它是先以EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminoproyl)carbodiimide]作用于有治疗作用的生物活性肽/蛋白(如NGF或IgG)使其赖氨酸的羧基易与叠氮物连接，再用Carlson等七十年代提出的有机试剂SPDP(Carlson et al.1978，Biochem J173，723)的衍生物，吡啶二硫丙酸酰肼PDP[pyridyldithiopropionate-hydrazide]在生物活性肽(或IgG及其他蛋白)赖氨酸的羧基附上一个反应硫基(2-pyridyl-sulfide group)。注意不同的等电点及生物活性位点。用SATA[N-succinimidyl-S-acetylthioacetate]作用于CB上的赖氨酸胺基使其接上硫氢基。CB上的硫氢基与NGF(或IgG)赖氨酸的吡啶硫化基(2-pyridyl-sulfide group)置换形成二硫键，即把两个蛋白分子偶联结合，释放出2-硫吡啶(pyridine-2-thione)。用蛋白A-Sepharose柱纯化偶联结合物。此法获得的偶联结合物其营养因子的生物活性较好。不同的CB偶联物在制备细节上均有各自的改良特点和技术窍门。本发明医药学意义及经济开发价值

本发明者在药物治疗学上第一次设计提出了：神经转运投药法，即以神经受体介导入胞的配基/载体把药物从外周神经轴浆转运进入脑脊髓的“RME—投药系统(RME-Delivery System，RME-DS)。本发明者首次从基础理论及方法学上提出了：RME的神经轴浆转运不只是生理性物质的转运通道，也可是制剂药物等进入脑脊髓实质的大道。二十世纪后半叶细胞分子生物学的发展获得了一序列特异性的生物活性肽/蛋白，称之为生长因子、细胞因子等。Rita Levi-Montalcini及Stanley Cohen的NGF，EGF工作获1986年诺贝尔生理医学奖，标志着这一广阔领域的学术成就。但这一序列大分子多肽/蛋白对中枢神经(CNS)脑脊髓疾患和损伤的医学应用潜力，却受到血脑屏障BBB的限制，得不到发挥。能通过BBB的500Da以下的小分子药物仍是当前CNS药物的主流。

本发明为一序列特异性的生物活性肽/蛋白，神经营养因子、生长因子、细胞因子、细胞凋亡抑制因子等无侵害性入脑开辟了道路；为老年痴呆及运动神经元病等不治之症带来新希望。

本发明的CB-偶联物以其靶向性投药、无损伤性等特点和优点而具有很大的医学意义和经济开发价值。Science(Vol.297：1116-1118，2002)的资料估计：1998年全球市场上中枢神经(CNS)药物为380亿美元，几乎全是小分子药物；大分子药物尚未进入市场，本发明的CNS大分子药物如经临床试用投入市场后，经济效益是巨大的。

本发明的霍乱原B亚基作为配基/载体与对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽/蛋白的偶联物，能绕过血脑屏障(BBB)把大多数原本是不能透过BBB的对脑脊髓疾病有治疗作用的生物活性肽/蛋白如NT、免疫活性球蛋白IgG等导入了脑脊髓实质，使这些活性物质的临床防治潜力得到充分有效的发挥。

作为与CB偶联的对脑脊髓疾病有治疗/预防作用的生物活性肽/蛋白、抗体或免疫活性原都是在已知文献中有大量动物实验证明有疗效并安全可靠的，有的是已用于临床或正有意通过临床试用的治疗制剂。而经与CB偶联后，则成为了更高效、安全、无侵害地进入脑脊髓的目前临床和市场所未有的新药制剂。

霍乱原B亚基(CB)是无毒性的受体结合单位。其本身无毒安全，经我们的实验说明，尚有一定的神经营养作用，这是由于CB激活了神经细胞GM1的代谢再利用率(Liu Z-P and Wan X-C，1995，Chinese J.Neuroimmurol.Neurol 2：61)。

附图表说明

图1显示了CB-NT，CB-Ab(IgG)受体介导入胞投药(RME-DS)的细胞生物学原理

图2显示了NGF、CB-NGF体外生物活性的测定比较曲线。说明偶联未影响生物活性

图3a显示了实验实施例1，A-E组水迷宫实验的逃遁潜伏期(Escapelatency，El)的比较及老龄鼠G组CB-NGF滴鼻治疗前Gb与滴鼻治疗后Gp的比较。

图3b显示了实验实施例1，A-E组水迷宫实验的游泳距离(Distancetraveled，Dt)的比较及老龄鼠G组CB-NGF滴鼻前Gb滴鼻后Gp的比较。

图3c显示了实验实施例1，A-E组水迷宫实验游泳速度(Dt/El)的比较及老龄鼠G组CB-NGF滴鼻前Gb滴鼻后Gp的比较。

图4照片A-F显示了实验实施例1，A，B，C，D，E组及F青少组前脑基底ChAT(胆碱乙醯转移酶)阳性神经元的形态学比较(并见表1)。

图5显示了在实验实施例2中，CB-兔抗P物质IgG对甩尾痛阈的影响。说明了兔抗P物质IgG已从腰髓跨细胞转运到了控制甩尾痛反应的骶尾髓。

图6照片1显示了在实验实施例3中，以蔗糖梯度超速离心分离的猪脊髓运动神经元(胆碱脂酶组化染色，600倍放大)Swine spinalmotoneurons isolated by sucrose gradient ultra-centrifuge method(cholinesterase staining.Magnification，x 600)

图6照片2显示了在实验实施例3中，免疫损伤Lewis大鼠的腰骶膨大脊髓前角(焦油紫染色，300倍放大)照片右侧胶质细胞增生，运动神经元丢失。The anterior hom of the lumbosacral enlargement of animmuno-injured Lewis rat(Cresyl violet staining，x 300)

图6照片3显示了在实验实施例3中，正常对照Lewis大鼠的腰骶膨大脊髓前角(焦油紫染色，250倍放大)

图6照片4显示了免疫损伤Lewis大鼠的腰骶膨大脊髓前角(焦油紫染色，250倍放大)照片中间(前角外侧)胶质细胞增生，运动神经元丢失。

图6照片5显示了免疫损伤Lewis大鼠(症状中度者)的腰骶膨大脊髓前角已有萎变的深染神经细胞(焦油紫染色，600倍放大)

图6照片6显示了免疫损伤Lewis大鼠(症状较重，频临死亡者)的腰骶膨大脊髓前角。有胶质细胞增生，运动神经元溃变及丢失(焦油紫染色，600倍放大)

图6照片7显示了正常对照Lewis大鼠血清(稀释1：40)不能染出Wistar大鼠的前角运动细胞，免疫组化阴性。(ABC方法，600倍放大)

图6照片8显示了MND模型动物的血清(稀释1：800)可以作为第一抗体用于免疫组化反应，可染出Wistar大鼠的前角运动细胞，免疫组化阳性。(ABC方法，600倍放大)

图6照片9显示了正常对照大鼠两后肢有力的支撑状况。

图6照片10显示了MND模型大鼠后肢的无力拖懈状况。

图6照片11显示了正常大鼠胫前肌注射10ul HRP在脊髓前角标记细胞较少之处(400倍放大)。

图6照片12显示了中度免疫损伤大鼠胫前肌注射10ul HRP在脊髓前角标记细胞较多之处，以示免疫损伤大鼠神经的轴浆转运尚基本正常，可以转运药物制剂(400倍放大)。

图7显示了在实验实施例3中，CB-CNTF复合CB-MnA治疗免疫损伤MND大鼠(1-4组)的存活比较图

实施例制备实施例1：CB-IgG[兔抗P物质]的戊二醛GA偶联

CB[五聚体pentamer分子量45-50kDa，List Ltd.，US]3.0mg溶于1.25％GA[Sigma，用于电镜标本者]1ml，0.1M磷酸钠(pH6.5)于室温作用过夜[较低的pH可防止CB中赖氨酸的氨基自身偶联]；经SephadexG-25 column胶柱(40×0.9cm，用0.15M NaCl溶液过柱)分离活化的CB与未连接的戊二醛(或不过柱而在0.15M NaCl透析，去除未被连接的戊二醛)；用微孔滤膜浓缩过柱液的CB组份(分子量45-50kDa)到约1ml。

用1M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)调节浓缩的活化CB的pH到9.5，加入兔抗P物质IgG(分子量150kDa)9.0mg溶于1M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)1ml，与活化CB在4度低温中作用24小时；经Sephadex G-200胶柱(1.6×90cm)分离结合态(分子量200kDa)与非结合态的成分；浓缩并稳定(加入赖氨酸，使成0.1M)。制备实施例2：CB-NGF的GA偶联

CB[分子量45-50kDa，List Ltd.，US]4mg溶于1.25％GA[Sigma，用于电镜标本者]1ml，0.1M磷酸钠(pH6.5)于室温作用过夜[较低的pH可防止CB中赖氨酸的氨基自身偶联]；经Sephadex G-25 column胶柱(40×0.9cm，用0.15M NaCl溶液过柱)分离活化的CB与未连接的戊二醛(或不过柱而在0.15M NaCl透析，去除未被连接的戊二醛)；用微孔滤膜浓缩过柱液的CB组份(分子量45-50kDa)到约1ml。

用1M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)调节浓缩的活化CB的pH到9.5，加入NGF(betaNGF，4mg二链，分子量26.0kDa，Sigma，N8133)2.0mg溶于1M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)1ml，与活化CB在4度低温中作用24小时；经Sephadex G-200胶柱(1.6×90cm)分离结合态(分子量80kDa)与非结合态的成分；浓缩并稳定(加入赖氨酸，使成0.1M)。制备实施例3：CB-NGF的二硫键S-S偶联过程

把NGF(beta NGF，二链，分子量26.0kDa，Sigma，N8133)2.0mg溶于1ml，1M的碳酸盐缓冲液(pH8.5)中，缓慢加上6.0mg/ml的citraconic anhydride(柠檬酐，Sigma，US)，置室温作用1小时以阻断游离氨基；以G10胶柱分离柠檬酐及NGF肽。在2.0mg/2ml的NGF加入EDC20mg作用于羧基，先调pH为5，随调至8，置室温10分钟；过G10胶柱去除EDC；浓缩NGF液为2ml；滴加20mM的PDP溶液(Sigma，US)0.5ml于NGF液中，在室温中搅拌30分钟；过SephadexG-25(0.1M，PBS elute)胶柱去除多余的PDP，微孔滤膜浓缩NGF液至2ml。

把4mgCB(List，US)溶于1ml，1M的碳酸盐缓冲液(pH8.5)中，滴加20mM的SATA溶液(Sigma，US)0.5ml，在室温中搅拌30分钟，使CB的赖氨酸胺基接上硫氢基；过Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)胶柱去除多余的SATA，微孔滤膜浓缩容积至1.5ml。

混合NGF(-2pyridyl sulfide)及CB(-sulfhydryl)两溶液，在室温中搅拌30分钟；用蛋白A-Sepharose柱及NGF单抗亲和柱纯化偶联结合物的CB-NGF。浓缩至2ml，分装，速冻于负20-40度备用。NGF，CB-NGF(S-S偶联)及CB-NGF(GA偶联)的生物活性测定比较(图2)

以NGF，CB-NGF(S-S偶联)及CB-NGF(GA偶联)分别作用于PC-12细胞，视其对细胞神经突起生长的影响而代表生物活性。

用96孔培养盘(牛胶元蛋白IV贴壁)培养PC-12细胞，每孔约1x10k个细胞，贴壁生长6小时后分别加入不同剂量的NGF，CB-NGF(S-S偶联)及CB-NGF(GA偶联)，测试对细胞神经突起生长的影响[200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6ng/ml，3ng/ml，1ng/ml，0ng/ml]；5天后，观察记录各孔(每孔2-3视野)细胞神经突起长度超过胞体2个直径以上的细胞数与观察细胞总数的百分比，NGF、CB-NGF体外生物活性的测定比较曲线如图2所示。结果说明：CB-NGF(S-S偶联)和CB-NGF(GA偶联)都具有与NGF相当的生物活性，S-S偶联的CB-NGF活性似较好。

生物活性测定实验说明偶联的过程均未影响所偶联的生物活性肽及蛋白的活性。

图2显示了NGF、CB-NGF体外生物活性的测定比较曲线。制备实施例4：CB-CNTF的二硫键S-S偶联过程

把CNTF(Sigma，C3835)400μg溶于1ml，1M的碳酸盐缓冲液(pH8.5)中，缓慢加上6.0mg/ml的citraconic anhydride(柠檬酐，Sigma，US)，置室温作用1小时以阻断游离氨基；以G10胶柱分离柠檬酐及CNTF肽。在400mug/2ml的CNTF加入EDC20mg作用于羧基，先调pH为5.5，随调至8.5，置室温10分钟；过G10胶柱去除EDC；浓缩CNTF液为2ml；滴加20mM的PDP溶液(Sigma，US)0.5ml于CNTF液中，在室温中搅拌30分钟；过Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)胶柱去除多余的PDP，微孔滤膜浓缩CNTF液至2ml。

把4mgCB(List，US)溶于1ml，1M的碳酸盐缓冲液(pH8.5)中，滴加20mM的SATA溶液(Sigma，US)0.5ml，在室温中搅拌30分钟，使CB的赖氨酸胺基接上硫氢基；过Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)胶柱去除多余的SATA，微孔滤膜浓缩容积至1.5ml。

混合CNTF(-2pyridyl sulfide)及CB(-sulfhydryl)两溶液，在室温中搅拌30分钟；用蛋白A-Sepharose柱及CNTF单抗亲和柱纯化偶联结合物的CB-CNTF。浓缩至2ml，分装，速冻于负20-40度备用。制备实施例5，CB-MnA/MnA的GA偶联制备

运动神经元抗原蛋白(MnA)：按Engelhardt et al.，的方法(J NeurosciMethods 1985，15：219)由鲜屠猪的颈段及上胸段脊髓分离前角运动神经元胞体[见图6照片1]作匀浆，电泳，提取高分子量(150-180kD)蛋白3.0mg作为MnA。以CB[五聚体pentamer分子量45-50kDa，List Ltd.，US]2.0mg溶于1.25％GA[Sigma，用于电镜标本者]1ml，0.1M磷酸钠(pH6.5)于室温作用过夜[较低的pH可防止CB中赖氨酸的氨基自身偶联]；经SephadexG-25 column胶柱(40×0.9cm，用0.15M NaCl溶液过柱)分离活化的CB与未连接的戊二醛GA(或不过柱而在0.15M NaCl透析，去除未被连接的戊二醛)；用微孔滤膜浓缩过柱液的CB组份(分子量45-50kDa)到约1ml。

用1M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)调节浓缩的活化CB的pH到9.5，加入MnA(分子量150-180kDa)3.0mg溶于1M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)1ml，与活化CB在4度低温中作用24小时。此CB-MnA及MnA是用于滴鼻诱发黏膜免疫，CB起佐剂作用，使机体产生对免疫原MnA的耐受，故不需分离结合态与非结合态的成分。只以0.15M NaCl透析，浓缩至2.0ml(此CB-MnA，MnA混合液，相当于MnA 3mg/2.0ml)。实验实施例1：CB-NGF滴鼻保护前脑基底胆硷能神经元及改善学习记忆的实验

CB(CTB，美国List公司产品)，betaNGF(美国Sigma公司产品)；偶联用的试剂均为美国Sigma的产品。

Wistar大鼠(4-5月龄)15只，分五组(A-E)：A.正常无损伤对照组(n＝3)；B.假损伤对照组(n＝3)；C.背侧海马损伤组(n＝3)；D.海马损伤+非结合的CB，NGF对照滴鼻组(n＝3)，治疗期五周；E.海马损伤+结合态CB-NGF滴鼻组(n＝3)，治疗期五周。F.青少年(1月龄)大鼠及G老龄大鼠(22月龄)各两只CB-NGF滴鼻四周。F作ChAT免疫组化分析(图4)；G作滴鼻治疗前(Gb)及治疗后(Gp)的水迷宫学习记忆行为比较(图3)。

NGF滴鼻的剂量在结合态及非结合态均为25mu g/100ul，日滴一次，保持大鼠仰卧位40分钟以使制剂较好进入嗅粘膜嗅细胞。

背侧海马损伤手术：水化氯醛(400mg/kg，i.p.)麻醉；微量注射器(Hamilton)进入海马的立体定位坐标为：AP前囟点之后4.5mm，L中线旁开3mm，DV自脑表面向下，即-3mm.海仁酸类神经毒制损(Quinolinate or ibotenate 10nmol溶于人工脑脊液，注射2.0ul.)微量注射速度为0.5/min，注射结束后留针5min。

假手术损伤组动物以同样麻醉及手术定位坐标注射入海马人工脑脊液2.0ul，注射结束后留针5min。

I.学习记忆实验(Morris水迷宫实验图3a，3b，3c)：手术损伤及治疗组(B，C，D，E)均在术后2周及治疗开始后2周才做水迷宫实验，共作十次(日)，每次(日)做6回水迷宫测试。

A，(正常对照)，B(假手术对照)，两组在逃遁潜伏期(Escape latency，寻找平台的时间E1)，经3-4次测试后均为10sec(SEM＝2)，几无差别；找到逃遁平台的游泳距离(Distance traveled，Dt)分别为210cm(SEM＝12)，220cm(SEM＝11)，无明显差别[p＞0.05]；游泳速度(Dt/El)分别为21cm/sec及22cm/sec，无明显差别[p＞0.05]。

C.背侧海马损伤组的上三参数大有变化El及Dt均成倍增加，游泳速度(Dt/El)大为减慢[p＜0.001，ANOVA]。说明学习记忆受到损害。

D.海马损伤加非结合态CB，NGF滴鼻，水迷宫的三个参数与C损伤组无明显差别[p＞0.05，ANOVA]。说明了非结合态CB，NGF基本无效。

E.海马损伤加CB-NGF滴鼻治疗组在水迷宫的三个参数上与A，B，对照组无明显差别[p＞0.05，ANOVA]。说明海马损伤对学习记忆的损害已得到恢复。

D.E水迷宫测试相比较也说明：只CB-NGF具有明显疗效。

F.少年鼠CB-NGF滴鼻实验组未做水迷宫行为实验，只做了前脑基底区ChAT神经元的神经解剖学分析(见图4)。

G.组老龄鼠在CB-NGF治疗前Gb与治疗后Gp相比，学习记忆能力也有改善[p＜0.05，t-test]。提示CB-NGF可有预防保健作用。(见图3)

II.前脑基底胆硷乙酰转移酶(ChAT)神经元的神经解剖学分析(，见图4及表1)

上述A，B，C，D，E，F组的动物均在实验第五周末牺牲取脑做冰冻切片(20um)[前脑基底区连续切片]，用抗ChAT抗体(CambridgeBiochemicals)作免疫细胞化学染色反应(Vector ABC试剂盒)。

结果如图4和数字表1所示：

图4照片A显示了正常无损伤成鼠对照组前脑基底区(BFA)ChAT(choline acetyl transferase)免疫细胞化学染色；

图4照片B显示了假损伤(注射人工脑脊液)成鼠对照组BFA，ChAT免疫细胞化学染色与A比较基本无改变；

图4照片C显示了成鼠背侧海马损伤组BFA，ChAT免疫细胞化学染色大为减弱，细胞萎缩并有丢失；

图4照片D显示了成鼠海马损伤+非结合的CB混合NGF对照滴鼻组BFA ChAT免疫细胞化学染色减弱，细胞萎缩并有丢失[较轻于C](治疗期五周后)；

图4照片E显示了成鼠海马损伤+结合态CB-NGF滴鼻治疗组，BFAChAT免疫细胞化学染色基本恢复正常(治疗期五周后)；

图4照片F显示了青少年大鼠(1月龄)两只CB-NGF滴鼻五周后BFA ChAT免疫细胞化学染色，较A有所增强。

表1显示了实验实施例1，A，B，C，D，E实验组前脑基底Meynert基核中ChAT(胆碱乙醯转移酶)阳性神经元的数目、大小及一级树突的量化情况表1：前脑基底Meynert基核中ChAT(胆碱乙醯转移酶)阳性神经元的数目、大小及一级树突的定量情况

组别	ChAT阳性神经元的数目[以A为基数的％]	ChAT阳性神经元的大小(μm2)[以A为基数的％]	一级树突数大于3的ChAT阳性神经元％
				A.正常对照	910±20[100±2]％	190±14[100±2]％	90±2％
B.假手术	914±20[100±2]％	188±15[99±2]％	89±3％
				C.海马损伤	730±35[82±4]％	142±10[74±2]％	27±5％
D.非结合混合滴鼻	780±30[86.7±4]％	160±10[84±1]％	34±5％
				E.CB-NGF滴鼻治疗	918±30[100±2]％	185±8[100±2]％	85±4％
F.CB-NGF对少年大鼠ChAT的增强作用	948±30[105±3]％	195±12[102.6±2]％	97±3％

CB-NGF滴鼻实验明确地说明了RME-DS经嗅细胞-嗅神经入脑后，NGF在端脑嗅球跨细胞转运，发生了‘细胞生物机理图解’中指出的NGF二级作用(secondary effect)：通过前脑基底胆硷能神经元向嗅球投射的侧支，NGF保护了因背侧海马损伤而萎缩溃变的前脑基底胆硷能神经元。背侧海马破坏损伤是国际公认AD老年痴呆的解剖学模型，本实验是CB-NGF能治疗或改善AD老年痴呆的重要实验基础。老年大鼠Gb，Gp及F青少年大鼠的实验提示：CB-NGF对前脑基底胆硷能神经元的保护有增强记忆的保健作用及对痴呆的预防作用。实验实施例2：(见图5)CB-兔抗P物质IgG肌注提高痛阈及抗P物质IgG在脊髓的跨细胞转运实验

材料：CB(CTB，美国List公司产品)，兔抗P物质IgG(美国Sigma公司产品)；偶联用的兔抗P物质抗体IgG及其他试剂均为美国Sigma的产品；羊抗兔ABC试剂盒(美国Vector公司产品)。

Wistar大鼠(4-5月龄)及瑞士小鼠(2月龄)各12只，各分三组：A组为未作处理的对照(n＝3)；B组作假处理对照(n＝4)：每隔1日于股四头肌(腰神经L 2-3支配)处注射非结合态兔抗P物质IgG 20μg(n＝2)；鼠(或小鼠)的非特异性IgG 20μg(n＝2)；C组为实验组(n＝6)，每隔1日于股四头肌处(腰神经L 2-3支配)注射CB-兔抗P物质IgG偶联结合物(含20μg兔IgG)。

I.CB-兔抗P物质IgG肌注股四头肌[腰段脊髓支配]对甩尾痛阈的影响(见图5)[甩尾痛反应为脊髓骶尾段支配]

实验处理(C)及假处理(B)的注射均历时三周；自第一周至第四周(停止注射处理后一周)测A，B，C组动物的甩尾痛阈，每周三日(次)，每次测试8回；测痛的刺激仪为AusBio G16型(AusBio Pty Ltd)，刺激参数固定为N-6.6(大鼠)，N-4.4(小鼠)，定距电热灼痛，记录甩尾痛阈值(sec)。

A组痛阈值平均5(SEM＝2)，B组痛阈值平均5(SEM＝2.5)，没有明显差异(p＞0.05)。把A组的痛阈值(sec)作为基础(转换为100％)，C组的痛阈值在处理后的第二周及第三周分别提高为180％(SEM＝10)及200％(SEM＝12)，与A，B组比较具有明显的差异(p＜0.05)。停止注射处理后一周动物(n＝3)的痛阈有恢复趋势，最后一天C组动物的测痛痛阈值平均5(SEM＝2.5)，表明痛阈已恢复正常，与A，B组无明显差异(p＞0.05)。

实验说明CB-兔抗P物质IgG具有抗痛作用，明显提高了痛阈。结果见图5。

II.兔抗P物质IgG在脊髓内的免疫细胞化学分析

在实验的第三周末牺牲A(n=2)，B(n＝2)，C(n＝3)组的大、小鼠各7只，取腰骶尾髓做冰冻切片(30um)，用Vector羊抗兔ABC试剂盒做脊髓切片的免疫细胞化学反应。以显微分光光度仪(Nikon-CA)扫描检测各组动物脊髓切片灰质(Rexed II-VII层)免疫反应产物的光密度值OD。把A，B组的OD作为100％(SEM＝10)与C组分析比较。结果：C组腰髓的OD值是200％(SEM＝10)，骶尾髓的OD值分别是185％(SEM＝12)，180％(SEM＝12)；与A，B组相比均具有明显差异(p＜0.05)。OD半定量实验说明兔抗P物质IgG已进入腰髓并有跨细胞转运进一步到达了骶尾髓的Rexed II-VII层灰质。

P物质是疼痛递质，抗P物质IgG可以中和P物质的功能而发挥抗痛作用。周围注射抗P物质IgG，其抗痛作用最多只能一时性地表现在注射的局部，且由于血循的稀释，作用并不明显。本实验中，CB-兔抗P物质IgG内免疫细胞化学分析的实验证明了兔抗P物质IgG确已进入了腰骶尾髓的Rexed II-VII层灰质。注射部位(股四头肌)是腰髓支配，不跨细胞的轴浆转运只到腰髓；本实验证明了抗P物质IgG在脊髓的跨细胞转运(已从腰髓转运达骶尾髓)。进入骶尾髓的抗体中和了疼痛递质P物质，这是CB-兔抗P物质IgG能提高动物甩尾痛阈的机理所在(甩尾运动为骶尾髓支配)。持续了一个时期的抗痛作用，只能以抗P物质IgG进入骶尾脊髓中枢的作用来解释。

功能性IgG抗体在中枢神经跨细胞转运的再次证明，说明CB-治疗性抗体IgG偶联结合物靶向性地输入脑脊髓能有良好的治疗效果，也是设计CB-Anti betaA经鼻腔嗅神经进入大脑治疗老年痴呆可行性的实验基础[beta淀粉样蛋白1-42对大脑的毒性有大量基础实验文献]。用CB-Anti betaA IgG滴鼻进入大脑中和导致老年痴呆的毒性物质betaamyloid 1-42，并复合CB-NGF滴鼻进入大脑保护前脑胆硷能神经元应是对AD老年痴呆较好的治根方法。当前，尚无兼顾AD老年痴呆两大发病机理(胆碱能学说及beta Amyloid毒性学说)的药物，本发明的CB-NGF加CB-Anti betaA的复方第一次提供了这种药物。实验实施例3：(见图6照片1-12及图7)CB-CNTF及CB-MnA(运动神经元抗原蛋白)治疗运动神经元病的动物实验

I.CB-CNTF及CB-MnA(运动神经元抗原蛋白)的偶联制备(已见制备实施例4-5)：分别用S-S法及戊二醛GA法。CNTF购自Sigma；运动神经元抗原蛋白(MnA)：按Engelhardt et al.，的方法(J NeurosciMethods 1985，15：219)由鲜屠猪的颈段及上胸段脊髓分离前角运动神经元胞体[见图6照片1]作匀浆，电泳提取高分子量(150-180kD)蛋白作为MnA。

II.运动神经元病(MND)的免疫动物模型：以刚屠宰后的猪脊髓(颈及上胸段)前角组织匀浆(SAH)1ml(含蛋白6mg)加1ml完全福氏佐剂接种于Lewis大鼠背部皮下(10点)，一周后以相同剂量(用不完全福氏佐剂)作第二次接种。从第二周以后即出现程度不同的后肢无力、瘫痪、体重下降(图6照片9-10)，最后呼吸衰竭死亡。病理组织切片检查可见脊髓前角运动神经元变性及丧失；MND模型动物的血清(稀释1∶800)可以作为第一抗体用于免疫组化反应、可染出另一大鼠或小鼠的前角运动细胞，免疫组化阳性(图6照片8)，证明血清中存在抗运动神经元的特异性抗体。正常对照Lewis大鼠(同样的佐剂皮下注射)无任何症状及脊髓组织病理改变，其血清(稀释1∶40)不能染出大鼠或小鼠的前角运动细胞，免疫组化阴性(图6照片7)，说明其中不存在抗运动神经元的特异性抗体。III.CB-CNTF及CB-MnA治疗运动神经元病的明显疗效[图7]：

1组)：5只免疫损伤运动神经元病(MND)的Lewis大鼠，在SAH免疫接种后的26天内全部死亡。免疫接种一周后的‘爬坡运动功能测验’评分：2-0分[免疫接种一周后，让动物爬30度50cm长的斜坡，每周测试2次；正常动物爬坡流利顺当，后肢的支撑有力，为5分；后肢支撑力不大，但尚能爬30-40cm，为4分；20-30cm为3分；10-20cm为2分；后肢支撑无力，但稍能迈动，为1分；不能迈动，后肢向后拖洩、瘫痪(如图6照片10)，为0分]

2组)：经CB-MnA/MnA滴鼻治疗2周的5只免疫损伤MND的Lewis大鼠，在免疫接种后的4至6周间死亡2只，其余3只存活。[治疗期为免疫接种后的1-3周；滴鼻剂量为每次相当于MnA 30mug的CB-MnA/MnA液20ul，隔日一次]。免疫接种一周后的‘爬坡运动功能测验’评分：3-0分；3只存活的大鼠在6周以后的评分为3-4分。实验表明CB-MnA/MnA滴鼻有治疗效果。[这实验的CB-MnA/MnA混合液中的CB是起黏膜免疫的佐剂作用，CB-MnA含量低。经用1)组大鼠的血清为免疫组化的第一抗体做本组动物嗅球切片的免疫组化反应，染色微弱，也表明CB-MnA向中枢的逆行轴浆转运很少]。

3组)：经CB-CNTF肌肉注射治疗2周的5只免疫损伤MND的Lewis大鼠在免疫接种后的4至6周间死亡2只，其余3只存活。[治疗期为接种后的1-3周；肌肉注射的剂量为每次相当于CNTF 4μg的CB-CNTF 100ul隔日一次，分十点注射于双侧的股四头肌、肱二头肌及颈项部肌]。免疫接种一周后的‘爬坡运动功能测验’评分：3-0分；3只存活的大鼠在6周以后的评分为3-4分。实验表明CB-CNTF肌肉注射有治疗效果。

4组)：经CB-CNTF肌肉注射治疗又复合CB-MnA/MnA滴鼻治疗，共作3周疗程的5只免疫损伤MND的Lewis大鼠全部存活12周，无一死亡。肌肉注射的剂量为每次相当于CNTF 4μg的CB-CNTF 100ul每日一次，分十点注射于双侧的股四头肌、肱二头肌及颈项部肌]。免疫接种一周后的‘爬坡运动功能测验’评分一直持续为4-5分。实验表明CB-CNTF肌肉注射复合CB-MnA/MnA滴鼻有很明显的治疗效果。

病理组织切片检查1组)，2组)及3组)的死亡动物均可见脊髓前角运动神经元变性及丧失。(图6照片2，4，5，6与正常对的照片3比较)

2组)，3组)存活的大鼠以及4组)存活大鼠，在12周牺牲做组织切片检查，未发现明显的脊髓前角运动神经元变性及膈神经的髓鞘纤维丧失。以其血清作为第一抗体(稀释1∶40)均不能与Wistar大鼠的脊髓运动神经细胞发生免疫组化反应(一如图6照片7)。

以非结合态的辣根过氧化物酶(HRP)在中度免疫损伤大鼠胫前肌及正常大鼠胫前肌做同等计量的肌肉注射，做显示HRP逆行轴浆转运的组化反应，两者的染色无大差别(图6照片11，12)。中度免疫损伤大鼠逆行标记的细胞柱在细胞数较多的切片处(图6照片12)与正常大鼠细胞数较少处(图6照片11)深染的细胞无大差别，甚至较深重。说明即使在中度免疫损伤大鼠，逆行轴浆转运的功能仍存在，可以转运CB偶联制剂。

在图7中，显示了CB-CNTF复合CB-MnA/MnA治疗免疫损伤MND大鼠的存活比较图。

方块框：死亡

三角箭头：治疗

箭头0：免疫接种猪脊髓前角组织(SAH)

纵坐标：动物数(免疫损伤的Lewis大鼠)

横坐标：存活周数

1组(红线)MND(运动神经元病)免疫损伤模型(3-4周全部死亡)

2组(绿线)CB-MnA(猪运动神经元抗原蛋白)治疗MND免疫损伤(2只死亡，3只存活)

3组(中等绿线)CB-CNTF(睫状神经营养因子)治疗MND免疫损伤(2只死亡，3只存活)

4组(粗绿线)CB-CNTF及CB-MnA复合治疗MND免疫损伤(全部存活)

以上实验说明CB-CNTF，CB-MnA的复合治疗已使免疫型MND动物模型得到存活治愈，并无明显副作用。

人类的MND(侧索硬化肌无力ALS，amyotrophic lateral sclerosis等)是危害极大的不治之症，40至70岁发病，3-5年内几全部死亡，病因不明，目前尚无特效药物。[有的科研工作认为：编码Cu/Zn SOD超氧歧化酶的基因变异可能与之有关]。二十世纪90年代的实验工作发现CNTF，BDNF能保护运动神经元，曾以CNTF作临床试用(皮下给药)因副作用很大，未能在临床推广[Clin Neuropharmacol 1995，18(6)515-32；ArchNeurol 1996，53(2)141-7]。本发明的CB-CNTF，CB-MnA/MnA复方具有很大的医药应用价值。

实验实施例3说明了CB佐剂自身免疫原CB-MnA/MnA的黏膜免疫调节(对自身免疫原产生了耐受性)复合以CB-神经营养因子结合治剂(CB-CNTF，CB-BDNF等)神经转运投药的靶向性神经营养治疗，会是缓解、治疗和预防现为不治之症的退行性神经疾患运动神经元病ALS等的最好战略。

Claims (12)

1.霍乱原B亚基作为配基/载体与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性多肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶联物。

2.根据权利要求1的偶联物，其中所述生物活性肽选自神经营养因子，神经激素、神经肽、镇痛肽和细胞凋亡抑制因子；免疫球蛋白主要是对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的抗体IgG；免疫活性原主要是导致脑脊髓疾病的自身免疫原及过敏原。

3.根据权利要求1或2的偶联物，其中所述神经营养因子选自神经生长因子、睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子；神经激素有退黑素；细胞凋亡抑制因子有Bcl2。

4.根据权利要求1或2的偶联物，其中所述对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的抗体选自抗β淀粉样蛋白1-42的IgG；对疼痛递质的抗体，其中包括抗P物质IgG；对亲神经病毒的抗体IgG；抗白介素-1受体的抗体；和抗Nogo蛋白的IgG。

5.根据权利要求1或2的偶联物，其中所述导致脑脊髓疾病的自身免疫原及过敏原选自运动神经元抗原蛋白；单涎酸节苷酯2；乙酰胆碱N受体a亚基。

6.一种药物组合物复方，其含有根据权利要求1-5中任何一项的一种或多种偶联物和可药用辅剂、增强剂。

7.根据权利要求1-6中任何一项的的偶联物的制备方法，其特征在于将霍乱原B亚基与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原连接起来，并保持偶联物的生物活性不变。

8.根据权利要求7的的制备方法，其特征在于将霍乱原B亚基氨基或羧基与对脑脊髓疾病或损伤有治疗作用的生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原的羧基或氨基连接起来；或导入硫氢基或二硫酮以二硫键连接起来，并保持偶联物的生物活性不变。

9.根据权利要求1-6中任何一项的偶联物在制备经外周神经受体介导入胞、轴浆转运进入中枢神经的药物的神经转运投药用途。

10.根据权利要求8的用途，其中所述偶联物经神经膜上的神经节苷酯寡糖受体介导入胞、轴浆转运，从周围进入中枢神经系统，并进一步在脑脊髓内作跨细胞转运。

11.根据权利要求1-6中任何一项的偶联物的制备用于治疗和/或预防脑脊髓疾病或损伤中的用途。

12.根据权利要求11的用途，其中所述脑脊髓疾病或损伤包括：退行性神经疾患，其选自阿滋海默氏老年性痴呆、运动神经元病、帕金森氏病、顽固性偏头疼和神经系统自身免疫病；脑脊髓损伤，其选自中风、脑血栓、脑缺血、脑外伤和脊髓外伤；疼痛；病毒性脑炎及病毒性脑脊髓炎；HIV脑炎。

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