CN1425681A - 治疗用蛋白和核酸 - Google Patents

治疗用蛋白和核酸 Download PDF

Info

Publication number
CN1425681A
CN1425681A CN01138385A CN01138385A CN1425681A CN 1425681 A CN1425681 A CN 1425681A CN 01138385 A CN01138385 A CN 01138385A CN 01138385 A CN01138385 A CN 01138385A CN 1425681 A CN1425681 A CN 1425681A
Authority
CN
China
Prior art keywords
albumen
cell
sequence
esophageal
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN01138385A
Other languages
English (en)
Inventor
S·H·卢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Cancer Research Fund
Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Original Assignee
National Cancer Research Fund
Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Cancer Research Fund, Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC filed Critical National Cancer Research Fund
Priority to CN01138385A priority Critical patent/CN1425681A/zh
Priority to AU2002357145A priority patent/AU2002357145A1/en
Priority to PCT/US2002/039543 priority patent/WO2003054215A2/en
Publication of CN1425681A publication Critical patent/CN1425681A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种以前未被鉴定的蛋白和片段，其具有抑制食管肿瘤生长的活性。

Description

治疗用蛋白和核酸
本发明涉及一种新的蛋白，肽片段及其结合体(conjugate)，以及编码此蛋白及其片段的核酸，它们都能用于肿瘤疾病的诊断和治疗，尤其是食管癌的诊断和治疗。
人食管癌(EC)是最常见的遍及世界的癌症之一，中国、南非、乌拉圭、法国和意大利(见图1和2)发病率很高。美国EC发病率较低，大多数发生在美国黑人。
中国食管癌的死亡率是全世界最高的，占全世界死亡人数的50％。河南边界的太行山南部地区、山西和湖北省食管癌死亡率高，尤其是河南省林县年龄相关死亡率最高，男性为151/100 000，女性为115/100 000(见图3)。以往对中国的研究表明许多肿瘤抑制基因和癌基因参与此病的发病和进展过程，然而没有确定与EC直接相关的基因。
本发明人分离了四个不同的基因片段，并用mRNA差异显示技术将其克隆，比较正常食管上皮和EC之间异常基因表达的不同之处。
在GenBank数据库中进行序列同源性分析发现这些片段与已知序列无显著相似性，因而这四个片段可能是新的基因。用5’-RACE(cDNA末端快速扩增)技术测定了一个序列的全长，称为食管癌相关基因-1(ECRG-1)。对这些基因研究表明，它们的失活或删除将促使食管形成肿瘤，这对EC基础和临床研究有很强的重要性，使得将其用于制备抗体、设计新的药物、基因诊断、基因治疗和抑制或清除基因产物方面的进展成为可能。
用逆转录酶PCR确定ECRG1在正常食管上皮和食管癌上皮表达有明显的不同。Northern杂交分析发现正常食管细胞出现长约1kb的ECRG1阳性信号，而食管癌细胞未出现此信号(见图4：N＝正常，C＝食管癌)。此外，还将ECRG1的融合蛋白在体外和体内应用于肿瘤细胞，能显著抑制肿瘤生长。
本发明的第一个方面提供了分离或纯化的编码含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，与之有至少50％同源性的氨基酸序列或其片段的蛋白的核酸序列，其中所说的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮细胞肿瘤生长速度的活性。
该蛋白优选分子量在43和47kD之间。更优选是丝氨酸蛋白酶型。更优选该蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突变体的氨基酸序列的跨膜位点。更优选该蛋白具有下列一个或优选全部的位点：N-糖基化位点、蛋白激酶糖基化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、酰胺化位点、异戊二烯基组结合位点(CAAX盒)、微体C-末端靶信号、细胞粘附序列和丝氨酸蛋白酶(胰岛素型)组氨酸位点。更优选的的位点显示于下面的表1中。
该蛋白可包括前面所述的与一个或更多编码标记序列的区域联结或相连的活性蛋白或片段序列，例如GST或GFP融合序列，或与能增强细胞膜，尤其是食管上皮细胞膜穿透力的序列联结或相连。
优选的核酸序列是能够在标准严格杂交条件下与SEQ ID NO 1的核酸序列杂交的核酸序列，标准严格杂交条件是2×SSC，65℃；更优选的高度严格条件是0.2×SSC，65℃。杂交步骤优选按照Church和美国国家科学院院报(USA)(1984)81，1991-1995(通过引用被在此合并)。
更优选的核酸是mRNAs和cDNAs，尽管用于诊断食管癌的探针和引物在下述本发明更进一步的方面也能想到。
本发明更优选的核酸是DNAs，尤其是cDNAs，它与启动序列及其他选择性调控序列可操纵地连接，这些序列允许DNA表达，从而在细胞内产生本发明所述的能抑制食管肿瘤生长的蛋白或片段，从中分离并纯化作为抗肿瘤试剂、疫苗或poart fo诊断试剂盒。这类细胞可以是原核细胞，但优选是真核细胞，更优选是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。这些细胞可以替换为靶肿瘤细胞，靶肿瘤细胞需要该蛋白或片段抑制其分裂，从而抑制肿瘤生长。
本发明的第二个方面提供了一种分离纯化、无菌或无热原质形式的含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，或与之有至少50％同源性的氨基酸序列或片段的蛋白，其中蛋白或肽片段具有抑制食管上皮细胞肿瘤生长速度的活性。
该蛋白优选分子量在43和47kD之间，更优选约47kD。更优选是丝氨酸蛋白酶型。更优选该蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突变体的跨膜位点的氨基酸序列。更优选该蛋白具有下列一个或最好全部的位点：N-糖基化位点、蛋白激酶糖基化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、酰胺化位点、异戊二烯基组结合蛋白(CAAX盒)、微体C-末端靶信号、细胞粘附序列和丝氨酸蛋白酶(胰岛素型)组氨酸位点。更优选的的位点显示于下面的表1中。
该蛋白可能包括前面所述的活性蛋白或与一个或更多编码标记序列的区域结合或侧接的片段序列，例如GST或GFP融合序列，或与能增强细胞膜，尤其是食管上皮细胞膜穿透力的序列联结或相连。
同源性是指氨基酸或核酸序列同一性的百分比，或对于氨基酸来说，相同或保守取代氨基酸同一性的百分比。同一性是指氨基酸序列相同的百分比。这两个百分比术语允许在序列缺失时仍能进行下述的比对。
特别是，术语同一性是指当进行选择性序列排列比较时，要求保护的氨基酸或碱基序列在参考文献中序列的同一相应位点出现的百分比，尽管实际上序列可能在一定位点有缺失或增加，此时在该位点需要加入缺口来排列比较氨基酸或碱基相同的最高百分比。尤其是在序列排列比较是使用了20或20个以下缺口，即加入到两个序列之间的所有缺口总数之和为20或20以下，更优选是10或小于10。这些缺口的长度不是非常重要，只要两个有关E2F结合和E2FDNA结合调节的中一个或另一个的确定活性存在，但一般不超过50个氨基酸，优选不超过10个，或不超过150个碱基，优选不超过30个碱基。
前述突变形式序列优选保守取代。关于氨基酸“保守取代”涉及用同一族中有相同物理化学特性的氨基酸取代一给定的氨基酸。这样当某氨基酸有一个疏水性基团时，它被另一个也含有疏水性基团的氨基酸保守取代；其他这类族是特性基团包括亲水、阳离子、阴离子或含有一个硫醇或硫醚的族。这样的取代只是在预计取代后的蛋白具有DP肽或蛋白活性时，讨论有关E2F异二聚化和E2F-DNA结合或转录活化调节。
氨基酸或核苷酸序列排列比较以及计算序列同源性或同一性的适当运算法和软件都是本领域技术人员熟知的。这类工具的主要例子是Pearson和基于FAST的Lipman以及BLAST程序。具体可在Altschul et al(1990)，J.Mol.Biol.215：403-10；Lipman D J and Pearson W R(1985)Science 227，p143541中找到。公众可在互联网‘http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast-help.html’中得到BLAST详情。因而可经商业、公众可得软件包，例如FASTA和BLASTn软件或通过网络计算机服务商来确定同源性和同一性百分比。前者的例子是GCG程序包(Devereux et al Nucelic Acids Research(1984)12(1)：387)和Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，eg.Version 8 for Unix or IBM equivalent，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，他们使用Smith和Waterman当地同源性算法，Advances in Mathematics 2：482-489(1981)。许多国际机构，例如GenBank(见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和EMBL：(见http：//www.embl-heidelberg.de/Blast2)提供网络服务。
软件包使用的参数和网络服务商应该与适当的序列长度和前述缺口特性一起应用。排列比较策略在W098/40483第39-41页有叙述，此文献通过引用被在此合并。
BLAST检索中方便的参数时缺省值，即对EMBL Advanced Blast2：Blastp Matrix BLOSUMS 62，Filter缺省值，Echofilter X，Ecpect 10，Cutoff缺省值，双链，描述50，排列比较50。优选使用BLASTn的缺省值。GCG Wisconsin软件包的缺口缺省值为12，长度缺省权值4。更优选的同源性算法的FASTDB参数时错配罚值＝1.00，缺口罚值＝1.00，缺口大小罚值＝0.33及增加碱基罚值＝30.0。
关于氨基酸“保守取代”涉及用同一族中有相同物理化学特性的氨基酸取代一给定的氨基酸。这样当某氨基酸有一个疏水性基团时，它被另一个也含有疏水性基团的氨基酸保守取代；其他这类族是特性基团包括亲水、阳离子、阴离子或含有一个硫醇或硫醚的保守取代。此种取代被具体描述在参考文献US5380712中。
本发明的核酸可被序列列表中的例子变性取代。‘变性取代’涉及核苷酸被编码相同氨基酸的密码子核苷酸序列取代；这些在细胞或载体表达蛋白时具有优越性的变性取代的类型与源生物细胞DNA不同，它含有与源细胞cDNA不同的转录/翻译优选密码子。这类变性取代由此可能成为宿主特异性取代。
本发明的第三个方面是提供了寡核苷酸探针和引物，它用于第一个方面所述的核酸的鉴定、分离和复制，以及在研究食管肿瘤和食管肿瘤细胞时，用于鉴定组织中ECRG1基因的存在和/或缺失。
该探针的长度足够在标准或严格杂交条件下与ECGR1基因特异性结合。它们可能是SEQ ID NO 1序列相应的全长探针，但其长度为10-100个碱基可能更合适一些，更优选是15-30个碱基，每一探针含有与前述长度片段邻近的序列。
同样地，用于扩增DNA的引物本身可被鉴定来检测是否存在活性ECRG1基因或其他的关键序列。本领域技术人员熟知引物的合适长度，例如长度为8-30个碱基。特别优选的引物和探针是那些通过用标记核苷酸进行连接酶链式反应来检测单一核苷酸表现的多肽性，例如位点直接突变，使有关肿瘤生长抑制的蛋白发生失活或与此处公开的野生型蛋白相比活性降低。
本发明的第四个方面是提供了可表达本发明的蛋白或蛋白片段的表达载体，该蛋白或蛋白片段包括本发明第一个方面所述的与启动子和其他可引起蛋白或片段在靶肿瘤细胞表达或产生蛋白的选择性调节区域可操纵连接的核酸。
优选载体被用于所谓的基因治疗，包括突变病毒形式的载体，所述病毒能感染食管上皮并在食管表达该蛋白或片段。此病毒可方便地是腺病毒、腺病毒相关病毒或细小病毒，但也包括其他治疗病毒是本领域技术人员熟知的适合用于基因治疗的病毒。特别优选的病毒是在非靶细胞中复制的能力比它们在靶细胞中弱。因此，优选定向到达上皮细胞的病毒突变体。
本发明的第五个方面是提供了被本发明的核酸转染的细胞。
本发明的第六个方面提供了本发明的蛋白或片段的抗体，例如在实施例中提供的。这些抗体可能与纯化分离SEQ ID NO 1蛋白或与其抗原结合片段结合，如实施例中所列，或与联接着标记蛋白(例如谷光苷肽-S-转移酶(GST)或绿荧光蛋白(GFP))的蛋白或片段结合。这些抗体可能由各种动物产生，例如猪、兔、小鼠或大鼠，也可能是多克隆抗体，但更优选的为单克隆抗体，例如由熟知的杂交瘤技术产生的单克隆抗体。
本发明的第七个方面是提供了一种诊断编码异常食管肿瘤生长抑制蛋白的基因ECRG1存在的方法，包括确定患者食管组织样本中是否存在所述基因序列，并与已知SEQ ID NO 2及其突变体序列比较，该序列能诱导或增强抑制食管上皮细胞肿瘤生长的效果，确定所述基因序列丢失或具诱导活性的ECRG1丢失的患者存在发生食管肿瘤的高危因素。用本发明的探针或引物能方便地作出诊断。
本发明的第八个方面提供了一种治疗可疑癌症患者的方法，包括给药于患者有效量的本发明第二个方面的蛋白或片段，抑制肿瘤的生长。该可疑癌症优选食管肿瘤。
本发明的第九个方面提供了一种治疗可疑癌症患者的方法，包括给患者施与有效量的本发明第四个方面的病毒载体，感染任何肿瘤细胞，并在细胞内产生有效量的蛋白或蛋白片段来抑制肿瘤的生长。该可疑癌症优选食管癌。
本发明的第十个方面提供了一种延长癌细胞的细胞周期的方法，包括用本发明第二或第四个方面的蛋白或片段或载体处理该细胞。
本发明的第十一个方面提供了一种药物组合物，包括第二个方面的蛋白或片段与药物可接受的载体、稀释液或赋形剂。优选无菌和无热原质形式的组合物。
本发明的第十二个方面提供了第二个方面所述蛋白或片段在制备治疗癌症，尤其是食管肿瘤的药物中的应用。
本发明的第十三个方面提供了一种药物组合物，其包含第四方面的载体，尤其是病毒载体，与药物可接受的载体、稀释液或赋形剂。优选无菌和无热原质形式的组合物。更优选该组合物与类固醇或其它抗细胞因子，例如TNF受体，联合进行治疗，以减轻炎症反应。
下面用下列非限制的附图、序列表和实施例对本发明作进一步的描述。进一步体现对于本领域技术人员按照这些描述所作的改动都落入本发明的保护范围。
附图：
附图1：食管癌在全世界的发病率地图。
附图2：遍及世界的各种癌症的死亡率。
附图3：食管癌在中国的分布。
附图4：正常和异常食管癌组织的Northern杂交结果。
附图5：本发明全长ECRG1蛋白在各个pH值的净电荷。
附图6：全长ECRG1蛋白的抗原决定部位分析，SEQ ID NO 2中所列氨基酸序列位于水平轴。
附图7：本发明蛋白的稳定构型。
附图8：ECRG1基因染色体4q22-25上的位置。
附图9：在 E coli中表达融合蛋白所用质粒pGEX-4T-1-ECRG1的构建步骤。
附图10和11：蛋白表达的Western杂交杂交凝胶图谱。
附图12：抗BALB/C小鼠来源的纯化蛋白的抗体与GST融合蛋白的抗血清免疫反应活性。
附图13：与GST的抗血清免疫反应活性，其显示与蛋白的不同。
附图14：一个能在人细胞中表达GST-ECRG1的真核表达质粒pcDNA3-ECRG1的构建步骤。
附图15：GST-ECRG1通过pcDNA-ECRG1质粒在NEC细胞中表达。
附图16：用GST融合蛋白处理过的NEC细胞的生长曲线。
附图17：NEC细胞接触GST融合蛋白后的抑制率。
附图18：体外培养的NEC细胞的幻灯片，证明加入编码质粒的GST-ECRG1融合蛋白后对生长的作用。
附图19：GST-ECRG1融合蛋白剂量从0.05mg/ml增加到0.4mg/ml的作用。
附图20：ECRG1基因转染的NEC细胞生长抑制图。
附图21：ECRG1基因转染的NEC细胞生长抑制速度。
附图22：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
附图23：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经GST融合蛋白处理的NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
附图24：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3-ECRG1转染的NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
附图25：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3-ECRG1转染的NEC细胞诱导肿瘤后，肿瘤细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
附图26：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明用无ECRG1基因的pcDNA3转染的NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
附图27：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3转染的NEC细胞诱导肿瘤后，肿瘤细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
附图28：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3-ECRG1转染的NEC细胞诱导肿瘤后，肿瘤细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。
序列表
SEQ ID NO 1表示ECRG1的cDNA序列，其5’端有80个碱基，3’端有122个碱基，包括多聚腺苷酸尾。
SEQ ID NO 2表示ECRG1蛋白的氨基酸序列。
实施例1
使用设计而成的长引物利用cDNA末端(RACE)5’快速扩增法获得全长ECRG 1，并测定全部核苷酸序列。Northern杂交分析ECRG-1 mRNA得到约1.2kb的单一信号。GENBANK中序列同源性分析表明现登录号AF071882的新序列没有与其高度同源的序列，由此鉴定出该序列是新的序列。
逆转录酶PCR(RT-PCR)法检测ECRG-1在EC中的表达。在正常胎儿大脑、成人大脑、肝脏、肾脏、睾丸、骨髓和骨骼肌7个cDNA文库以及8个人胎儿组织，例如脑、肺、肌肉、皮肤、肾脏、肠道和腺体中，发现ECRG-1的表达。ECRG-1在7个正常食管上皮的表达100％阳性，但在44个EC患者中仅4.55％，p＜0.01。在26个肿瘤附近组织，其表达为46.15％，p＜0.05。这些结果表明ECRG-1基因产物是肿瘤抑制基因，其在EC发病和进展过程中起着重要的作用。
实施例2
用放射杂交法测定ECRG-1基因在染色体上的位置。发现此基因位于染色体4q22-25。
实施例3
通过生物信息来预测ECRG-1蛋白产物的结构和功能，表明它是一种与丝氨酸蛋白酶类似的跨膜蛋白。蛋白分子量约为45kD，三维晶体结构同丝氨酸蛋白酶。
表1 ECRG-1蛋白的功能位点
主题 氨基酸位点
N-糖基化位点 153-156；304-307
蛋白激酶C磷酸化位点 54-56；280-282；374-376；378-380
酪氨酸激酶II磷酸化位点 107-110；165-168；284-287；321-324
 N-豆蔻酰化位点 67-72；351-356；360-365
酰胺化位点 175-178
异戊二烯基组结合位点(CAAX盒) 388-391
微体C-末端靶信号 185-187；281-283；388-390
细胞粘附序列 366-368
丝氨酸蛋白酶(胰岛素型)组氨酸位点 223-228
信息肽和跨膜位点被鉴定为NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ。
实施例3
将ECRG-1 cDNA插入到可被ITPG诱导的表达质粒中，用Western杂交法鉴定表达蛋白。用纯化蛋白免疫BLAB/C小鼠，产生多克隆抗体。直接ELISA测定抗体的效价是1∶3200。
用质粒PGEX型PGEX-4T-ECRG-1在 E.coli中表达GST-ECRG-1蛋白。
实施例4
构建含ECRG-1基因的真核表达质粒，转染先前缺乏ECRG-1表达活性的NEC细胞。通过RT-PCR和Western杂交鉴定ECRG-1基因转染克隆。
与未被ECRG-1基因转染的细胞相比，ECRG-1基因转染的细胞的增殖率降低，肿瘤重量和体积也降低。当ECRG-1基因转染到NEC细胞中，NEC细胞的增殖率降低(表2)。还发现ECRG-1基因转染的NEC细胞较未被转染的细胞相比，肿瘤重量和体积显著降低。我们的发现表明ECRG-1基因在体外和体内都能显著抑制NEC细胞的生长。
表2 ECRG-1基因转染和无ECRG-1基因转染的细胞肿瘤抑制速度
  细胞     24小时     48小时     72小时    96小时    120小时
 Necneo1  1.06±4.17  1.28±2.59  0.80±0.02  5.06±0.89  7.34±0.28
 Necneo2  0.95±0.29  0.95±0.59  11.67±0.97  10.90±0.84  19.37±0.19
 NecECRG1a  0.63±7.78  3.11±0.71  45.68±0.92  48.37±0.81  37.12±0.42
 NecECRG1b  17.93±1.29  31.82±0.26  57.69±0.63  55.03±0.38  43.17±0.59
实施例5
ECRG-1基因编码的蛋白能抑制食管癌细胞增殖。经NMBA2A(NEC)诱导的人胎儿的食管癌细胞与融合蛋白培养，将NEC细胞肿瘤移植到裸鼠，然后注射ECRG-1融合蛋白。重组融合蛋白在体外和体内都能显著抑制肿瘤生长。
与未被ECRG-1基因转染的细胞相比，ECRG-1基因转染的NEC细胞的增殖率降低，肿瘤重量和体积也显著降低。这些结果表明ECRG-1及其蛋白在体外和体内均可调节细胞周期G2期延长。此外，被ECRG-1基因转染的NEC细胞肿瘤血管形成减少。
表2经GST-ECRG-1蛋白处理的NEC肿瘤重量和体积
组 处理天数   肿瘤质量(g)  肿瘤体积(cm3)
对照 28   0.956±0.494  1.103±0.432
透膜 28   0.850±0.409  0.877±0.479
细菌 28   0.972±0.410  1.016±0.442
质粒 28   0.866±0.339  0.979±0.365
融合蛋白 28   0.659±0.317  0.680±0.358
融合蛋白组与对照组P＜0.05
表3融合蛋白对NEC细胞周期的影响
组    G0±G1(％)体外  体内      S(％)体外   体内    G2±M(％)体外  体内
对照   54.6   88.0   35.6   12.0   9.8    0
透膜   52.5   61.4   36.3   23.4   11.3   15.2
细菌蛋白   46.2   57.9   37.2   16.4   16.2   25.7
质粒   46.8   67.0   38.2   0   15.0   33.0
融合蛋白   39.8   39.8   30.2   13.4   30.0   46.8
表4 ECRG-1转染NEC细胞对细胞周期的影响
 组   G0+G1(％)体外  体内     S(％)体外  体内     G2+M(％)体外   体内
 NEC   39.5   86.2   50.9  0   9.5    13.8
 NEC-neo1   35.5   35.8   58.9  4.7   5.6    59.4
 NEC-neo2   32.0   9.5   62.5  0   5.4    90.5
 NEC-ECRG-1   45.1   18.2   53.6  0   1.3    81.8
 NEC-ECRG-2   51.6   17.9   36.0  4.2   12.4   77.9
                           序列表<110>BTG国际有限公司<120>药用蛋白和核酸<130>ECRG1<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1375<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(81)..(1253)<400>1atcacgagat gtcatatagt tgattagtta gttgagttca gtgggtgcag acctgcaaga 60tcatattctt cctcctgtac atg atg tat cgg aca gta gga ttt ggc acc cga 113
                  Met Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg
                  1                 5                  10agc aga aat ctg aag cca tgg atg att gcc gtt ctc att gtg ttg tcc   161ser Arg Asn Leu Lys Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser
         15                  20                  25ctg aca gtg gtg gca gtg acc ata ggt ctc ctg gtt cac ttc cta gta   209Leu Thr Val Val Ala Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val
     30                  35                  40ttt gac caa aaa aag gag ttc tat cct ggc tcc ttt aaa att tta gat   257Phe Asp Gln Lys Lys Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp
 45                  50                  55ccg caa atc aat aac aat ttc gga caa agc aac aca tat caa ctt aag   305Pro Gln Ile Asn Asn Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys60                  65                  70                  75gac tta cga gag acg acc gaa aat ttg gtg gat gag ata ttt ata gat   353Asp Leu Arg Glu Thr Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp
             80                  85                  90tca gcc tgg aag aaa aat tat atc aag aac caa gta gtc aga ctg act   401ser Ala Trp Lys Lys Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Val Val Arg Leu Thr
         95                 100                 105cca gag gaa gat ggt gtg aaa gta gat gtc att atg gtg ttc cag ttc   449Pro Glu Glu Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile Met Val Phe Gln Phe
    110                 115                 120ccc tct act gaa caa agg gca gta aga gag aag aaa atc caa agc atc   497Pro Ser Thr Glu Gln Arg Ala Val Arg Glu Lys Lys Ile Gln Ser Ile
125                 130                 135tta aat cag aag ata agg aat tta aga gcc ttg cca ata aat gcc tca   545Leu Asn Gln Lys Ile Arg Asn Leu Arg Ala Leu Pro Ile Asn Ala Ser140                 145                 150                 155tca gtt caa gtt aat gca atg agc tca tca aca ggg gag tta att gtc   593Ser Val Gln Val Asn Ala Met Ser Ser Ser Thr Gly Glu Leu Ile Val
            160                 165                 170caa gca agt tgt ggt aaa cga gtt gtt cca cta aac gtc aac aga ata   641Gln Ala Ser Cys Gly Lys Arg Val Val Pro Leu Asn Val Asn Arg Ile
        175                 180                 185gca tct gga gtc att gca ccc aag gcg gcc tgg cct tgg caa gct tcc   689Ala Sar Gly Val Ile Ala Pro Lys Ala Ala Trp Pro Trp Gln Ala Ser
    190                 195                 200ctt cag tat gat aac atc cat cag tgt ggg gcc acc ttg att agt aac   737Leu Gln Tyr Asp Asn Ile His Gln Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asn
205                 210                 215aca tgg ctt gtc act gca gca cac tgc ttc cag aag tat aaa aat cca   785Thr Trp Leu Val Thr Ala Ala His Cys Phe Gln Lys Tyr Lys Asn Pro220                 225                 230                 235Cat caa tgg act gtt agt ttt gga aca aaa atc aac cct ccc tta atg   833His Gln Trp Thr Val Ser Phe Gly Thr Lys Ile Asn Pro Pro Leu Met
            240                 245                 250aaa aga aat gtc aga aga ttt att atc cat gag aag tgc cgc tct gca   881Lys Arg Asn Val Arg Arg Phe Ile Ile His Glu Lys Cys Arg Ser Ala
        255                 260                 265cca aga aag tac gac att gct gtt gtg cag gtc tct tcc aga gtc acc   929Pro Arg Lys Tyr Asp Ile Ala Val Val Gln Val Ser Ser Arg Val Thr
    270                 275                 280ttt ccg gat gac ata cgc cgg att tgt ttg cca gaa gcc tct gca tcc   977Phe Pro Asp Asp Ile Arg Arg Ile Cys Leu Pro Glu Ala Ser Ala Ser
285                 290                 295ttc caa cca aat ttg act gtc cac atc aca gga ttt gga gca ctt tac   1025Phe Gln Pro Asn Leu Thr Val His Ile Thr Gly Phe Gly Ala Leu Tyr300                 305                 310                 315tat ggt ggg gaa tcc caa aat gat ctc cga gaa gtc aga gtg aaa atc   1073Tyr Gly Gly Glu Ser Gln Asn Asp Leu Arg Glu Val Arg Val Lys Ile
            320                 325                 330ata agt gat gat gtc tgc aag caa cca cag gtg tat ggc aat gat ata   1121Ile Ser Asp Asp Val Cys Lys Gln Pro Gln Val Tyr Gly Asn Asp Ile
        335                 340                 345aaa cct gga atg ttc tgt gcc gga tat atg gaa gga att tat gat gcc   1169Lys Pro Gly Met Phe Cys Ala Gly Tyr Met Glu Gly Ile Tyr Asp Ala
    350                 355                 360tgc agg ggt gat tcc tgg ggg acc ttt agt cac aag gga tct gaa aga   1217Cys Arg Gly Asp Ser Trp Gly Thr Phe Ser His Lys Gly Ser Glu Arg
365                 370                 375tac gtg gta tct cat tgg aat tgt aag ctg ggg aga taactgtggt        1263Tyr Val Val Ser His Trp Asn Cys Lys Leu Gly Arg380                 385                 390caaaaggaca agcctggagt ctacacacaa gtgacttatt accgaaactg gattgcttca 1323aaaacaggca tctaattcac aataaaagtt aaacaaagaa aaaaaaaaaa aa         1375<210>2<211>391<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Mat Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg Ser Arg Asn Leu Lys1               5                  10                  15Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser Leu Thr Val Val Ala
         20                  25                  30Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val Phe Asp Gln Lys Lys
     35                  40                  45Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp Pro Gln Ile Asn Asn
 50                  55                  60Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Glu Thr65                  70                  75                  80Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp Ser Ala Trp Lys Lys
             85                  90                  95Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Val Val Arg Leu Thr Pro Glu Glu Asp Gly
        100                 105                 110Val Lys Val Asp Val Ile Met Val Phe Gln Phe Pro Ser Thr Glu Gln
    115                 120                 125Arg Ala Val Arg Glu Lys Lys Ile Gln Ser Ile Leu Asn Gln Lys Ile
130                 135                 140Arg Asn Leu Arg Ala Leu Pro Ile Asn Ala Ser Ser Val Gln Val Asn145                 150                 155                 160Ala Met Ser Ser Ser Thr Gly Glu Leu Ile Val Gln Ala Ser Cys Gly
            165                 170                 175Lys Arg Val Val Pro Leu Asn Val Asn Arg Ile Ala Ser Gly Val Ile
        190                 185                 190Ala Pro Lys Ala Ala Trp Pro Trp Gln Ala Ser Leu Gln Tyr Asp Asn
    195                 200                 205Ile His Gln Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asn Thr Trp Leu Val Thr
210                 215                 220Ala Ala His Cys Phe Gln Lys Tyr Lys Asn Pro His Gln Trp Thr Val225                 230                 235                 240Ser Phe Gly Thr Lys Ile Asn Pro Pro Leu Met Lys Arg Asn Val Arg
            245                 250                 255Arg Phe Ile Ile His Glu Lys Cys Arg Ser Ala Pro Arg Lys Tyr Asp
        260                 265                 270Ile Ala Val Val Gln Val Ser Ser Arg Val Thr Phe Pro Asp Asp Ile
    275                 280                 285Arg Arg Ile Cys Leu Pro Glu Ala Ser Ala Ser Phe Gln Pro Asn Leu
290                 295                 300Thr Val His Ile Thr Gly Phe Gly Ala Leu Tyr Tyr Gly Gly Glu Ser305                 310                 315                 320Gln Asn Asp Leu Arg Glu Val Arg Val Lys Ile Ile Ser Asp Asp Val
            325                 330                 335Cys Lys Gln Pro Gln Val Tyr Gly Asn Asp Ile Lys Pro Gly Met Phe
        340                 345                 350Cys Ala Gly Tyr Met Glu Gly Ile Tyr Asp Ala Cys Arg Gly Asp Ser
    355                 360                 365Trp Gly Thr Phe Ser His Lys Gly Ser Glu Arg Tyr Val Val Ser His
370                 375                 380Trp Asn Cys Lys Leu Gly Arg385                 390

Claims (21)

1.分离或纯化的编码蛋白或其片段的核酸序列，所述蛋白含有SEQ IDNO 2的氨基酸序列，或与之有至少50％同源性的氨基酸序列，其中所说的蛋白或其肽片段具有抑制食管上皮细胞肿瘤生长速度的活性。
2.权利要求1的核酸，其特征在于其分子量在43和47kD之间。
3.权利要求1或2的核酸，其特征在于它编码的活性蛋白或片段序列结合或侧接于一个或更多编码标记序列，例如GST或GFP融合序列的区域，或能增强对细胞膜，尤其是食管上皮细胞膜穿透力的序列的区域。
4.权利要求1至3任一项的核酸序列，其特征在于能够在标准严格杂交条件下与SEQ ID NO 1的核酸杂交，标准严格杂交条件是2×SSC，65℃；更优选的高度严格条件是0.2×SSC，65℃。
5.权利要求1-4任一项的核酸，其特征在于该核酸是mRNA，cDNA，探针或引物。
6.权利要求1-5任一项所述的DNA，它与启动子序列及任选的其他调控序列可操纵地连接，这些序列允许DNA表达，从而在细胞内产生本发明所述的食管肿瘤生长抑制蛋白或片段。
7.权利要求6的DNA，其中细胞用于产生蛋白，然后由细胞中分离并纯化蛋白作为抗肿瘤药剂、疫苗或诊断试剂盒的一部分。
8.分离、纯化、无菌或无热原质形式的蛋白或其片段，其包含SEQ IDNO 2的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列有至少50％同源性，其中所说的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮细胞肿瘤生长速度的活性。
9.权利要求8的蛋白，其分子量在43和47kD之间。
10.权利要求8或9的蛋白或片段，其结合或侧接于一个或更多标记物氨基酸序列，例如GST或GFP融合序列，或能增强对细胞膜，尤其是食管上皮细胞膜穿透力的序列。
11.包含权利要求1-7任一项的核酸的能表达权利要求8，9或10的蛋白或蛋白片段的表达载体，所述核酸与启动子或任选的其他能引起蛋白或片段在靶肿瘤细胞或蛋白生成细胞中表达的调控区域可操纵地连接。
12.权利要求11的载体，其特征在于它是具有感染食管上皮细胞并表达蛋白或片段的突变病毒。
13.权利要求1-7任一项的核酸转染的细胞。
14.权利要求8-10任一项的蛋白或片段的抗体。
15.一种诊断编码异常食管肿瘤生长抑制蛋白的基因ECRG1存在的方法，包括确定患者食管组织样本中是否存在所述基因和/或测序，并将其蛋白产物与已知的SEQ ID NO 2及其具有减低或增强的抑制食管上皮细胞肿瘤生长效果的变体序列的蛋白产物进行比较，确定所述基因序列丢失或ECRG1活性降低的患者存在发生食管肿瘤的高危因素。
16.一种治疗可疑癌症患者的方法，包括给患者施用有效量的权利要求8-10中任一项的蛋白或片段，抑制肿瘤的生长。该可疑癌症优选食管肿瘤。
17.一种治疗可疑癌症患者的方法，包括给患者施用有效量的权利要求12的病毒载体，感染任何肿瘤细胞，并在细胞内产生有效量的蛋白或蛋白片段来抑制肿瘤的生长。该可疑癌症优选食管癌。
18.一种延长癌细胞的细胞周期的方法，包括用权利要求8-12任一项的蛋白或片段或载体处理该细胞。
19.一种药物组合物，包括权利要求8-10任一项的蛋白或其片段与药物可接受的载体、稀释液或赋形剂。优选无菌和无热原质形式的组合物。
20.权利要求8-10任一项的蛋白或片段在制备治疗癌症，尤其是食管肿瘤的药物中的应用。
21.一种药物组合物，包含权利要求11的载体，尤其是病毒载体，与药物可接受的载体、稀释液或赋形剂。
CN01138385A 2001-12-12 2001-12-12 治疗用蛋白和核酸 Pending CN1425681A (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN01138385A CN1425681A (zh) 2001-12-12 2001-12-12 治疗用蛋白和核酸
AU2002357145A AU2002357145A1 (en) 2001-12-12 2002-12-11 Therapeutic protein and nucleic acid
PCT/US2002/039543 WO2003054215A2 (en) 2001-12-12 2002-12-11 Therapeutic protein and nucleic acid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN01138385A CN1425681A (zh) 2001-12-12 2001-12-12 治疗用蛋白和核酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1425681A true CN1425681A (zh) 2003-06-25

Family

ID=4674581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN01138385A Pending CN1425681A (zh) 2001-12-12 2001-12-12 治疗用蛋白和核酸

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN1425681A (zh)
AU (1) AU2002357145A1 (zh)
WO (1) WO2003054215A2 (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6365391B1 (en) * 2000-09-27 2002-04-02 Pe Corporation (Ny) Isolated human serine protease, nucleic acid molecules encoding human serine protease, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002357145A8 (en) 2003-07-09
AU2002357145A1 (en) 2003-07-09
WO2003054215A3 (en) 2005-03-17
WO2003054215A2 (en) 2003-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1425681A (zh) 治疗用蛋白和核酸
CN1343725A (zh) 人血管生成素样蛋白和编码序列及其用途
CN1477117A (zh) 新型人磷脂酰乙醇胺结合蛋白，其编码序列及用途
CN1477118A (zh) 新型DnaJ/Hsp40分子DC-DJIII，其编码序列及用途
CN1303931A (zh) 一种新的多肽——xrn－100和编码这种多肽的多核苷酸
CN1279716A (zh) 人HsgⅢ基因
CN1299827A (zh) 新的人cd20同源分子、其编码序列及用途
CN1448402A (zh) 一种多肽——人贫血症相关蛋白35.4和编码这种多肽的多核苷酸
CN1477193A (zh) 新型人Rab GTP酶，其编码序列及用途
CN1167490A (zh) 人司登尼亚钙蛋白-α
CN1396259A (zh) 一种鸡cLATS1基因、核苷酸和蛋白的编码序列，及其制备与用途
CN1283693A (zh) 具有造血刺激和免疫调节作用的细胞因子cklf－h1a及其变异体cklf－h1b
CN1303944A (zh) 一种新的多肽——苏氨酸合成酶71和编码这种多肽的多核苷酸
CN1307059A (zh) 新的人包膜蛋白及其编码序列
CN1281463A (zh) 人ptd010基因(tpaaag12)
CN1396260A (zh) 一种牛bLATS1基因、核苷酸和蛋白的编码序列，及其制备与用途
CN1304449A (zh) 新血管紧张肽受体,其制备和用途
CN1281509A (zh) 人mdg1基因(cbfawb10)
CN1299828A (zh) 新的细胞因子受体、其编码序列及用途
CN1325874A (zh) 新的人c型外源凝集素样受体、其编码序列及用途
CN1303930A (zh) 一种新的多肽——锌指蛋白57和编码这种多肽的多核苷酸
CN1477119A (zh) 新型人半胱氨酸蛋白酶抑制物样分子，其编码序列及用途
CN1477120A (zh) 一种多肽—人组织阴离子转运多肽41和编码这种多肽的多核苷酸
CN1303866A (zh) 一种新的多肽——锌指蛋白36和编码这种多肽的多核苷酸
CN1281897A (zh) 一种人硫氧化还原蛋白相关蛋白及其编码序列

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication