CN1423748A - Mmp－13活性部位的溶液和晶体结构及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人胶原酶3(MMP－13)的三维结构,以及(i)利用MMP－13结构合理设计或鉴定可抑制或激活MMP－13活性的化合物或分子的方法,和(ii)利用该方法鉴定的化合物。
Description
发明领域
本发明涉及人胶原酶3(MMP-13)的三维结构，以E及(i)利用MMP-13结构合理设计或鉴定可抑制或激活MMP-13活性的化合物或分子的方法，和(ii)利用该方法鉴定的化合物。
发明背景
人胶原酶-3(MMP-13)是包括胶原酶、溶基质素和明胶酶的基质金属蛋白酶(MMP)家族的一个成员。MMP参与胞外基质的降解，与正常组织的重建(remodeling)过程(如妊娠、创伤愈合和血管生成)有关。由于这些酶的降解性质，MMP的表达和活性高度受控，MMP调节的明显丧失导致结缔组织的病理性破坏和随后发生的病情。因此，MMP是一组具有高活性的靶标，用于设计关节炎和肿瘤学疾病领域的治疗剂(综述参见，Woessner，J.E.，FASEB 1991；Ries，C.和Petrides，E.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 1995；Browner，M.E.，Perspect.Drug Discovery Des.1995；Morphy等人，Curr.Med.Chem.1995；Zask等人，Curr.Pharm.Des.1996)。
MMP-13的鉴定是根据在正常乳腺组织和乳癌中的不同表达。另外，已经报道它在喉、头和颈的鳞状细胞癌中、在HCS-2/8人软骨肉瘤细胞中、在胎儿骨化期间、在关节炎患者的关节软骨中表达。
已经有大量X-射线和NMR结构，解析与不同抑制剂复合的MMP的催化域(参见，例如：Bode等人，EMBO J.1994；Gooley等人，Nat.Struct.Biol.1994；Lovejoy等人，Science 1994；Lovejoy等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1994；Lovejoy等人，Biochemistry 1994；Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994；Stams等人，Nat.Struct.Biol.1994；Becker等人，Protein Sci.1995；Gonnella等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995；van Doren等人，Protein Sci.1995；Botos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996；Broutin等人，Acta Crystallogr.，Sect.D：Biol.Crystallogr.1996；Gooley等人，J.Biomol.NMR 1996；Betz等人，Eur.J.Biochem.1997；Gonnella等人，Bioorg.Med.Chem.1997；Moy等人，Biochemistry 1998)。这些蛋白质的总体三维折叠有密切相似性，这与它们相对较高的序列同源性(＞40％)一致。尽管MMP结构有这种相似性，但这些酶之间具有不同的底物特异性，表明不同MMP的特殊生物学作用及与独特病程的相应关系。这种可能的特异性的一个例子是MMP-13在乳癌中过量表达，而MMP-1在乳头瘤中过量表达。因此，当前发展MMP抑制剂的一个范例是在小分子结构中设计特异性，而不是发展广谱MMP抑制剂(Birkedal-Hansen等人，Crit.Rev.Oral Biol.Med.1993；Rockwell等人，J.Am.Chem.Soc.1996)。该方法的基本原理是，只与一种病程有关的MMP特异性抑制剂可能使毒副作用最小。因此，不同MMP的大量结构信息对于以结构为基础设计抑制剂选择性的方法至关重要(Birkedal-Hansen等人，Crit.Rev.Oral Biol.Med.1993；Rockwell等人，J.Am.Chem.Soc.1996；Ghose等人，J.Am.Chem.Soc.1995；Hajduk等人，J.Am.Chem.Soc.1997；Olejniczak等人，J.Am.Chem.Soc.1997)。
获得的MMP的大量结构数据支持以上观点，其中观察到S1’袋(Pocket)的大小和形状显著不同(Moy等人，Biochemistry 1998；Bode等人，EMBO J.1994；Gooley等人，Nat.Struct.Biol.1994；Lovejoy等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1994；Lovejoy等人，Biochemistry 1994；Lovejoy等人，Science 1994；Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994；Stams等人，Nat.Struct.Biol.1994；Becker等人，Protein Sci.1995；Gonnella等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995；van Doren等人，Protein Sci.1995；Botos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996；Broutin等人，Acta Crystallogr.，Sect.D：Biol.Crystallogr.1996；Gooley等人，J.Biomol.NMR.1996；Betz等人，Eur.J.Biochem.1997；Gonnella等人，Bioorg.Med.Chem.1997)。MMP家族中的这种结构差异提供了一种明显的方法，它通过设计可适当填充S1’袋中可用空间的化合物，并利用序列差异，在强MMP抑制剂中设计特异性。以前已经报道了采用该方法的大量实例，其中通过向S1袋中加入联苯基已经获得了MMP之间的一定的选择性(参见，例如：Hajduk等人，J.Am.Chem.Soc.1997；Olejniczak等人，J.Am.Chem.Soc.1997)。
发明者已经确定了MMP-13的溶液和晶体结构，并且利用合理药物设计方法，设计了一种对MMP-13有高度选择性的新的强抑制剂。
发明概述
本发明涉及人胶原酶3(MMP-13)的三维结构，更具体而言，涉及与抑制剂N-羟基-2-[(4-甲氧基-苯磺酰基)-吡啶-3-基甲基-氨基]-3-甲基-苯甲酰胺(下文称为“化合物A”)复合的MMP-13的晶体和溶液结构，利用结晶学、波谱学和多种计算机模建技术确定。特别是，本发明涉及MMP-13的活性部位，它包括位于MMP-13催化性锌右侧(S1’，S2’，S3’)和左侧(S1，S2，S3)的不同结合袋的三维结构，最特别的是涉及包含催化性锌和S1’结合袋的MMP-13活性部位的三维结构，这对于设计和选择对MMP-13的效能和特异性提高的抑制剂，或者相反，对于设计和选择MMP-13特异的基质金属蛋白酶抑制剂至关重要。
因此，本发明公开了一种溶液，它含有与化合物A复合的人胶原酶3(MMP-13)的生物活性催化片段，以及与化合物A复合的结晶的MMP-13催化片段。图4的相对原子结构坐标显示了由波谱学数据获得的MMP-13催化片段的三维结构，图5显示了由结晶学数据获得的结构。也显示了MMP-13的活性部位，其特征在于一个催化性锌、一条β链、一个Ca2+结合环、一条α螺旋和一个随机卷曲区，其中该活性部位的β链优选地含有根据图1的残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19和V20，Ca2+结合环含有根据图1的残基F75、D76、G77、P78和S79，α螺旋含有根据图1的残基N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122和H123，随机卷曲区含有根据图1的残基P139、I140和Y141。该活性部位的特征还在于具有一种三维结构，该结构具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对结构坐标，在所有情况下，催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个±均方根差，其不超过1.5_。
在本发明的一个备选实施方案中，MMP-13的活性部位的特征在于具有一种三维结构，该结构具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140的相对结构坐标，在所有情况下，催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个±均方根差，其不超过1.5_。
本发明提供的MMP-13或其部分的溶液或晶体结构坐标能以机器可读的形式存储于机器可读的存储介质上，例如，计算机硬盘、软磁盘、DAT磁带等，用于显示三维形状或其它用途，包括计算机辅助操作其定义的结构坐标或三维结构，或据此计算。例如，定义MMP-13或本发明的MMP-13复合物，或MMP-13或此处公开的MMP-13复合物之一部分的三维结构的数据可存储于机器可读的存储介质中，通常可利用能从该存储介质中读取数据并用由这些数据生成图像的指令编程的计算机，显示为相关结构坐标的图形三维图像。
因此，本发明提供一种机器，如计算机，其存储器中用MMP-13分子或分子复合物或其部分的坐标(例如，MMP-13催化性锌与相邻S1’、S2’和/或S3’结合袋的坐标)编程，同时还有一种程序，能在与机器连接的显示器上将坐标转换为结构坐标的三维图像。存储器中含有这些数据的机器有助于合理设计或选择MMP-13活性的抑制剂或激活剂，包括评估特定化学个体偏好与MMP-13或此处公开的MMP-13复合物结合的能力，以及有助于根据与MMP-13的结构或序列同源性，模建相关化合物、蛋白质、复合物等。
本发明另外还涉及一种确定结构未知的分子或分子复合物的三维结构的方法，包括下列步骤：首先获得结构未知的分子或分子复合物的晶体或溶液，然后由结晶的分子或分子复合物获得X-射线衍射数据，和/或由该分子或分子复合物的溶液获得NMR数据。然后将该分子或分子复合物的衍射或波谱数据与此处公开的MMP-13的已知三维结构相比较，利用标准技术，如分子置换分析，2D、3D和4D同位素滤波，编辑和三重共振NMR技术和计算机同源性模建，使未知分子或分子复合物的三维结构符合已知的MMP-13结构。此外，未知分子的三维模型也可如下产生：根据任何或全部氨基酸序列同一性、二级结构元件或三级折叠，进行MMP-13与未知分子之间的序列比对，然后利用MMP-13的三维结构和与它的序列比对，通过计算机模建产生该分子的三维结构。
本发明还提供一种鉴定MMP-13的可能的抑制剂或激活剂的方法，包括下列步骤：应用由编码MMP-13的氨基酸的相对结构坐标定义的MMP-13三维结构，设计或选择可能的抑制剂或激活剂，并合成或获得这种可能的抑制剂或激活剂。该抑制剂或激活剂可以通过筛查适当的数据库选择，可以通过结合适当软件程序分析空MMP-13活性部位的立体构型和电荷电位从头设计，或者可以利用MMP-13或其它胶原酶的已知抑制剂或激活剂的特征设计，以产生“杂种”抑制剂或激活剂。本发明的方法优选地用于设计或选择MMP-13活性抑制剂。
此外，本发明也提供一种方法，用于鉴定对基质金属蛋白酶家族除MMP-13之外的一个或多个成员具有选择性的可能的抑制剂或激活剂，该方法包括下列步骤：(i)应用MMP-13和希望的靶基质金属蛋白酶的三维结构(由编码MMP-13和靶基质金属蛋白酶的氨基酸的相对结构坐标定义)，设计或选择这种可能的抑制剂或激活剂，(ii)合成或获得这种可能的抑制剂或激活剂。在这种情况中，可能的抑制剂或激活剂设计为具有易于与希望的基质金属蛋白酶活性部位结合，而不宜与MMP-13活性部位结合的化学或立体特征，优选地该活性部位含有MMP-13 S1’袋。该抑制剂或激活剂可以通过筛查适当的数据库选择，可以通过结合适当软件程序分析空MMP-13/基质金属蛋白酶的活性部位的立体构型和电荷电位从头设计，或者可以利用MMP-13或其它胶原酶的已知抑制剂或激活剂的特征设计，以产生“杂种”抑制剂或激活剂。
本发明也提供利用此处公开的方法设计或选择的抑制剂和激活剂。
附图简述
图1显示编码人MMP-13催化片段的氨基酸序列。
图2显示(A)MMP-13与MMP-8和(B)MMP-13与MMP-1之间基于序列的比对，用于MMP-13同源性模型。
图3说明氧肟酸抑制剂的磺酰胺衍生物N-羟基-2-[(4-甲氧基-苯磺酰基)-吡啶-3-基甲基-氨基]-3-甲基-苯甲酰胺(化合物A)，它含有相应的质子标记。
图4列出了通过NMR波谱法获得的，与化合物A复合的MMP-13的制约(restrained)最小化平均结构的原子结构坐标。“原子类型”是指测量其坐标的原子。“残基”是指测量的每个原子是它的一部分的残基类型，即氨基酸、辅因子、配体或溶剂。“x，y和z”坐标是指测量的每个原子位置(_)的笛卡尔坐标。所有非蛋白质原子(化合物A，锌和钙)列为HETATM，而不是按照PDB惯例的原子(ATOM)。
图5列出了由结晶MMP-13：化合物A复合物的X-射线衍射获得的MMP-13的原子结构坐标。图题如上所述，不同之处是：“Occ”是指占用率，“B”是指“B值”，它是原子在原子结构中如何运动的量值(_2)。“MOL”是指用于独特鉴定晶体中每个分子的片段鉴定。
图6说明化合物B抑制剂，它含有相应的质子标记。
图7是一种设计方案，它将2-[苄基-(4-苯乙氧基-苯磺酰基)-氨基]-N-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺(下文称为“化合物C”)分解为对应于其有效成分(2-[苄基-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-N-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺，下文称为“化合物D”)和其选择性成分的两种成分，从而为设计化合物B的杂种抑制剂提供基础。
图8A是一种设计方案，显示从化合物B和化合物C到杂种抑制剂苯并呋喃-2-羧酸(2-{4-[苄基-(2-羟基氨甲酰基-4，6-二甲基-苯基)-氨磺酰]-苯氧基}-乙基)-酰胺(下文称为“化合物E”)的流程。图8B显示与MMP-13：化合物D模型重叠的NMR MMP-13：化合物B复合物的透视图，确证形成杂种抑制剂化合物E的方法。MMP-13的活性部位显示为网格表面，化合物B和化合物D显示为甘草(liquorice)键。该视图从S1’袋处看去。
发明详述
在此使用时，下列术语和短语具有以下所述的含义：
“化合物A”是N-羟基-2-[(4-甲氧基-苯磺酰基)-吡啶-3-基甲基-氨基]-3-甲基-苯甲酰胺，如图3所示。“化合物B”是具有图6所示化学结构的化合物。“化合物C”是2-[苄基-(4-苯乙氧基-苯磺酰基)-氨基]-N-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺，如图7所示。“化合物D”是2-[苄基-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-N-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺，如图7所示。“化合物E”是苯并呋喃-2-羧酸(2-{4-[苄基-(2-羟基氨甲酰基-4，6-二甲基-苯基)-氨磺酰]-苯氧基}-乙基)-酰胺，如图8A所示。“化合物F”是2-(苄基-4-(3-苯基-丙氧基)-苯磺酰基)-氨基]-N-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺。
除非另外指出，“MMP-13”包括图1的氨基酸序列编码的人胶原酶3(包括其保守置换)，以及“MMP-13类似物”，在此定义为含有一个本发明定义的MMP-13样活性部位的蛋白质，包括但不限于这样的活性部位：其特征在于一种三维结构，具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140的相对结构坐标，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_，或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_。此外，本发明的MMP-13类似物是含有MMP-13样活性部位的蛋白质，该活性部位的特征在于一个催化性锌、一条β链、一个Ca2+结合环、一条α螺旋和一个随机卷曲区，或者，更优选地，含有一个活性部位，其特征在于一种三维结构，它具有根据图4和图5的催化性锌和氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对结构坐标，或者更优选地，该三维结构还具有根据图4或图5的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对结构坐标，或者最优选地，该三维结构还具有根据图4或图5的F149和P152的相对结构坐标，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子(N，Cα，C和O)的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。
除非另外指出，“蛋白质”或“分子”包括蛋白质、蛋白质域、多肽或肽。
“结构坐标”是对应于分子或分子复合物中一种原子与其它原子的空间关系的笛卡尔坐标。结构坐标可以利用x-射线结晶学技术或NMR技术获得，或者可以利用分子置换分析或同源性模建获得。有多种软件程序可以用图形表现一组结构坐标，获得分子或分子复合物的三维图像。本发明的结构坐标可以通过数学操作，如倒置或整数加减，根据图4或图5所示的原始坐标进行修改。因此，可以认为本发明的结构坐标是相对的，决不只限于图4和图5的实际x，y，z坐标。而且，也应当认为，图5的结构坐标可以来自于MMP-13：化合物A晶体中MMP-13催化片段的任一分子(即来自A-13或B-13)。
“试剂”包括蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物。
“均方根差”是平均值方差的算术平均值的平方根，是表示此处所述结构坐标的偏差或变异的术语.
熟练技术人员应当周知，在本发明包括的MMP-13多种同种型或MMP-13类似物中氨基酸残基的编号方式可能不同于此处所述，或者可能含有某些保守氨基酸置换，产生与图4或图5所示相同的三维结构。其它同种型或类似物中相应的氨基酸和保守置换，通过观察相关氨基酸序列或利用商品同源性软件程序能容易地确定。“保守置换”是在功能上与置换的氨基酸残基相当的氨基酸置换，方法是具有类似的极性、立体排列或属于与置换残基相同的类别(例如疏水、酸性或碱性)，包括在用于鉴定和设计MMP-13的激活剂或抑制剂、用于分子置换分析和/或同源性模建方面，对MMP-13的三维结构没有重要影响的置换。
“活性部位”是指分子或分子复合物中的一个区域，由于其形状和电荷电位，易于与另一种试剂(包括但不限于：蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物)相互作用或结合。因此，活性部位可能包括底物切割或胶原酶活性的实际部位，以及与底物切割部位相邻的某些或全部结合部位或袋，它在与一种试剂相互作用或结合后，通过直接干扰底物切割部位或间接影响MMP-13分子的立体构象或电荷电位，可影响MMP-13的活性。MMP-13分子的催化中心的特征在于一个被H119、H123和H129螯合的锌原子。MMP-13中位于催化性锌右侧的结合部位或袋包括S1’、S2’和S3’。位于催化性锌左侧的结合部位或袋包括S1、S2和S3。
本发明涉及人胶原酶3(MMP-13)或MMP-13类似物的三维结构，更具体而言，涉及与一种抑制剂(下文称为“化合物A”)复合的MMP-13的晶体和溶液结构，其利用结晶学、波谱学和多种计算机模建技术确定。MMP-13：化合物A复合物(如此处分别在图4或图5中公开的)和未复合的MMP-13催化片段(可以由图4或图5的结构坐标计算得出)的三维溶液和晶体结构，可用于许多用途，包括但不限于：显示、鉴定和表征MMP-13的活性部位，包括被H119、H123和H129螯合的MMP-13催化性锌，以及与MMP-13分子的催化性锌相邻的多个MMP-13结合袋。然后可用此活性部位结构预测设计或选择的MMP-13蛋白激活剂或抑制剂的方向和结合亲和力。因此，本发明特别涉及MMP-13活性部位的三维结构，包括但不限于与MMP-13分子的催化性锌分开或在一起的S1’、S2’、S3’、S1、S2和/或S3结合袋。
本发明提供一种溶液，其含有与化合物A复合的人胶原酶3(MMP-13)的生物活性催化片段。在一个具体实施方案中，MMP-13的催化片段含有图1的氨基酸残基，或其保守置换。优选地，此处提供的溶液含有在一种缓冲液中与化合物A以1∶1摩尔比复合的MMP-13，更优选地含有与化合物A等摩尔复合的1mM MMP-13，该缓冲液在90％H2O/10％D2O或100％D2O中含有10mM氘代Tris碱、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2mM NaN3和10mM氘代DTT，优选地pH6.5。溶液中MMP-13：化合物A的浓度应当高到足以在NMR谱中产生良好的信噪比，但不能高得使蛋白质沉淀或聚集。此外，溶液中的MMP-13可富含15N或富含15N、13C。如下所述，本发明的溶液的NMR谱优选地在35℃下获得。
本发明的溶液中使用的催化片段的二级结构包含3个α螺旋和1个含5条β链的混合平行及反平行β折叠，它们以βI、αA、βII、βIII、βIV、βV、αB和αC的顺序排列。这3个α螺旋对应于图1的残基28-44(αA)、112-123(αB)和153-163(αC)，这5条β链分别对应于图1的残基83-86(βI)、95-100(βII)、59-66(βIII)、14-20(βIV)和49-53(βV)。尽管本发明的溶液含有与化合物A以1∶1摩尔比复合的MMP-13，但应当理解，本领域技术人员可以利用适当摩尔浓度的备选抑制剂或配体设计其它溶液，从而防止MMP-13自身降解，形成其稳定性和浓度足以获得可用NMR谱的溶液。
在本发明的溶液中使用的蛋白质包括MMP-13，以及MMP-13类似物，其中该蛋白质含有一个活性部位，其特征在于一种三维结构，具有根据图4的溶液坐标的催化性锌与氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140(或其保守置换)的相对结构坐标，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_，或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_。这些残基包括在MMP-13：化合物A复合物中与化合物A最紧密结合的残基，根据观察到的MMP-13与化合物A之间的NOE确定(表1)。
此外，在本发明的溶液中使用的蛋白质含有一个活性部位，其特征在于含有一个催化性锌、一条β链(含有氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19和V20或其保守置换)、一个Ca2+结合环(含有氨基酸残基F75、D76、G77、P78和S79或其保守置换)、一条α螺旋(含有氨基酸残基N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122和H123或其保守置换)和一个随机卷曲区(含有氨基酸残基P139、I140和Y141或其保守置换)，或者更优选地，其特征在于一种三维结构，它具有根据图4的催化性锌和氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对结构坐标，或者更优选地，该三维结构还具有根据图4的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对结构坐标(在活性部位中加入一个S1’袋)，或者最优选地，该三维结构还具有根据图4的F149和P152的相对结构坐标(进一步确定了位于S1’袋底部的一个疏水区)，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子(N，Cα，C和O)的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。最后，在最优选的实施方案中，在本发明的溶液中使用的蛋白质包括根据图4的完整结构坐标，±该氨基酸(或其保守置换)的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。
本发明也提供与化合物A复合的结晶的MMP-13催化片段。本发明的晶体高效衍射X-射线，可用于确定MMP-13：化合物A复合物的结构坐标，其被表征为含有空间群P21212的斜方晶形式，晶胞参数为a＝108.3_，b＝79.8_，c＝36.1_。此外，本发明的晶体复合物由不对称晶体单元中的两个MMP-13：化合物复合物分子组成。
在一个优选实施方案中，本发明的晶体复合物中的MMP-13含有图1的氨基酸残基(或其保守置换)，其特征在于二级结构含有3个α螺旋和1个含5条β链的混合平行及反平行β折叠，它们以βI、αA、βII、βIII、βIV、βV、αB和αC的顺序排列。而且，这3个α螺旋优选地对应于图1的残基28-44(αA)、112-123(αB)和153-163(αC)，这5条β链分别对应于图1的残基83-86(βI)、95-100(βII)、59-66(βIII)、14-20(βIV)和49-53(βV)。
在本发明的晶体或晶体复合物中使用的蛋白质包括MMP-13，以及MMP-13类似物，其中该蛋白质含有一个活性部位，其特征在于一种三维结构，具有根据图5的晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140(或其保守置换)的相对结构坐标，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_，或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_。
此外，在本发明的晶体或晶体复合物中使用的蛋白质含有一个活性部位，其特征在于含有一个催化性锌、一条β链(含有氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19和V20或其保守置换)、一个Ca2+结合环(含有氨基酸残基F75、D76、G77、P78和S79或其保守置换)、一条α螺旋(含有氨基酸残基N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122和H123或其保守置换)和一个随机卷曲区(含有氨基酸残基P139、I140和Y141或其保守置换)，或者更优选地，其特征在于一种三维结构，它具有根据图5的催化性锌和氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对结构坐标，或者更优选地，该三维结构还具有根据图5的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对结构坐标(在活性部位中加入一个S1’袋)，或者最优选地，该三维结构还具有根据图5的F149和P152的相对结构坐标(进一步确定了位于S1’袋底部的一个疏水区)，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。
最后，在最优选的实施方案中，在本发明的晶体中使用的蛋白质包含根据图5的完整结构坐标，±该氨基酸(或其保守置换)的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。
本领域周知的分子模建方法可用于鉴定MMP-13分子、MMP-13分子复合物或MMP-13类似物的活性部位或结合袋。具体而言，本发明提供的结构坐标可用于表征MMP-13分子、MMP-13分子复合物或MMP-13类似物的三维模型。根据这种模型，能以分子表面结构、表面电荷、立体排列、反应性氨基酸的存在、疏水或亲水区等为基础，计算显示、鉴定和表征推断的活性部位。这些推断的活性部位可以进一步精化，方法包括使用多种和不同MMP-13复合物产生的波谱的化学位移微扰(perturbation)，竞争和非竞争性抑制实验，和/或产生和表征MMP-13突变体，以鉴定活性部位的关键残基或特征。
鉴定分子或分子复合物的推断活性部位是极其重要的，因为通常是由试剂与分子或分子复合物的一个或多个活性部位的相互作用得出分子或分子复合物的生物活性。因此，分子或分子复合物的活性部位是最好的靶标，用于设计或选择可影响分子或分子复合物活性的激活剂或抑制剂。
本发明涉及MMP-13或MMP-13类似物的活性部位，由于其形状、反应性和电荷电位等，易于与另一种试剂(包括但不限于：蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物)相互作用或结合。因此，本发明的活性部位包括底物切割或胶原酶活性的实际部位(被H119、H123和H129螯合的催化性锌)，以及与底物切割部位相邻的结合部位或袋(即S1’、S2’、S3’、S1、S2和/或S3)，它们在与试剂相互作用或结合后，可通过直接干扰底物切割部位或间接影响MMP-13分子的立体构象或电荷电位，影响MMP-13的活性。因此，本发明涉及MMP-13分子的活性部位，其特征在于一个被H119、H123和H129螯合的锌原子，和优选地位于催化性锌右侧的S1’结合袋。
在一个备选实施方案中，本发明的活性部位的特征在于一种三维结构，它具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140(或其保守置换)的相对结构坐标，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_，或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_。
此外，本发明的活性部位的特征在于含有一个催化性锌、一条β链(含有氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、119和V20或其保守置换)、一个Ca2+结合环(含有氨基酸残基F75、D76、G77、P78和S79或其保守置换)、一条α螺旋(含有氨基酸残基N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122和H123或其保守置换)和一个随机卷曲区(含有氨基酸残基P139、I140和Y141或其保守置换)，或者更优选地，其特征在于一种三维结构，它具有分别根据图4或图5的催化性锌和氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对溶液或晶体结构坐标，或者更优选地，该三维结构还具有根据图4或图5的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对溶液或晶体结构坐标，或者最优选地，该三维结构还具有根据图4或图5的F149和P152的相对溶液或晶体结构坐标，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。
为了使用分别如图4和图5所示的，本发明的晶体或溶液结构产生的结构坐标，通常必须将相关坐标显示为或转换为三维图形或图像，或者以其它方式操作它们。例如，结构坐标的三维表示通常用于合理药物设计、分子置换分析、同源性模建和突变分析。其实现一般是利用能由一组结构坐标产生分子或其部分的三维图像的多种商品软件程序。这些商品软件程序的例子包括但不限于：GRID(牛津大学，牛津，英国)；MCSS(Molecular Simulations，San Diego，CA)；AUTODOCK(ScrippsResearch Institute，La Jolla，CA)；DOCK(加利福尼亚州立大学，SanFrancisco，CA)；Flo99(Thistlesoft，Morris Township，NJ)；Ludi(Molecular Simulations，San Diego，CA)；QUANTA(MolecularSimulations，San Diego，CA)；Insight(Molecular Simulations，San Diego，CA)；SYBYL(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)；和LEAPFROG(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)。
为了存储、转移和使用这些程序，准备一台机器(如计算机)，用于产生MMP-13分子、其部分(如活性部位或结合部位)、MMP-13分子复合物或MMP-13类似物的三维图像。本发明的机器包括机器可读的数据存储介质，包括用机器可读数据编码的数据存储材料。包含数据存储材料的机器可读存储介质包括适于计算机使用的常规计算机硬盘、软磁盘、DAT磁带、CD-ROM和其它磁性、磁光、光学、可光读的和其它介质。本发明的机器也包括工作存储器，用于存储处理机器可读数据的指令，以及与工作存储器和机器可读数据存储介质连接的中央处理器(CPU)，用于将机器可读数据处理为希望的三维图像。最后，本发明的机器还包括一台与CPU连接的显示器，使用户能看到三维图像。因此，当使用为应用该数据指令编程的机器，如安装有一个或多个上述程序的计算机时，此处提供的机器能显示任何分子或分子复合物或分子或分子复合物的一部分的三维图像。
在本发明的一个实施方案中，机器可读数据包括根据图4或图5的催化性锌和氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140的相对结构坐标，在所有情况下都包括其保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)，其中该结构坐标表征了MMP-13或MMP-13类似物的一个活性部位。
在一个备选优选实施方案中，机器可读数据包括根据图4或图5的催化性锌和氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y14l的相对结构坐标，在所有情况下都包括其保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。在一个更加优选的实施方案中，机器可读数据还包括根据图4或图5的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对结构坐标，最优选地，还包括根据图4或图5的F149和P152的相对结构坐标，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。
最后，最优选地，机器可读数据包括根据图4或图5的组成MMP-13催化片段的所有残基的相对结构坐标，在所有情况下，±该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_。在所有情况下，所述实施方案包括所述残基的保守置换，产生在规定的均方根差之内的相同结构坐标。
本发明的结构坐标允许使用多种分子设计和分析技术，用以(i)解析相关分子、分子复合物或MMP-13类似物的三维结构，(ii)设计、选择和合成能与MMP-13分子或MMP-13类似物的活性部位结合或相互作用的化学试剂，其中该化学试剂可能用作MMP-13或MMP-13类似物的激活剂或抑制剂。
更具体而言，本发明提供一种确定结构未知的分子或分子复合物的分子结构的方法，包括下列步骤：获得结构未知的分子或分子复合物的晶体或溶液，然后由结晶的分子或分子复合物获得x-射线衍射数据，和/或由该分子或分子复合物的溶液获得NMR数据。然后将结构未知的分子或分子复合物的x-射线衍射数据与本发明的MMP-13：化合物A晶体获得的x-射线衍射数据相比较。此外，也将结构未知的分子或分子结构的NMR数据与本发明的MMP-13：化合物A溶液获得的NMR数据相比较。然后，利用分子置换分析，使由本发明的MMP-13：化合物A晶体测得的三维结构符合未知分子或分子复合物的x-射线衍射数据，或者，利用2D、3D和4D同位素滤波、编辑和三重共振NMR技术，使由本发明的MMP-13：化合物A溶液测得的三维结构符合该分子或分子复合物的溶液的NMR数据。
分子置换分析使用具有已知结构的一种分子作为起点，来模拟未知晶体样品的结构。该技术是基于两种具有类似结构、方向和位置的分子将类似地衍射x-射线这一原理。一种相应的分子置换方法适用于利用NMR技术模拟未知的溶液结构。对于结构保守的蛋白质区域，两种类似结构的NMR谱和对NMR数据的分析基本相同，其中NMR分析包括获得NMR共振归属(assignment)和结构制约归属，可能包括氢键、距离、二面角、偶合常数、化学位移和偶极偶合常数制约。观察到的两种结构的NMR谱之间的差异将突出两种结构之间的差异，并确定结构制约中的相应差异。未知结构的结构确定方法是基于改变已知结构的NMR制约，使之与观察到的NMR谱之间的波谱差异一致。
因此，在本发明的一个非限制性实施方案中，MMP-13：化合物A复合物的共振归属为新的MMP-13：“未知试剂”复合物中MMP-13的共振归属提供了起点。在二维15N/1H谱中能观察到化学位移微扰，并且比较MMP-13：化合物A复合物与新的MMP-13：试剂复合物。这样，受影响的残基可能与图4的相关残基提供的MMP-13的三维结构相关。这有效鉴定了与MMP-13：化合物A复合物相比发生结构改变的MMP-13：试剂复合物的区域。然后可获得对应于MMP-13连续主链和侧链氨基酸归属的1H、15N、13C和13CO NMR共振归属，利用2D、3D和4D三重共振NMR技术和NMR归属方法，以MMP-13：化合物A结构、共振归属和结构制约作为参照，产生新MMP-13：试剂复合物的的三维结构。可以进行新试剂与MMP-13三维模型的多种计算机拟合分析，产生与MMP-13复合的新试剂的初始三维模型，并且可以用标准实验制约和能量最小化技术精化得到的三维模型，以定位和定向与MMP-13三维结构结合的新试剂。
本发明进一步提供，本发明的结构坐标可应用标准同源性模建技术，以确定一种分子或分子复合物的未知三维结构。同源性模建包括利用一种或多种相关蛋白质分子、分子复合物或其部分(即活性部位)的结构坐标构建未知结构的模型。同源性模建可如下进行：具体利用图4和/或图5提供的相关(即同源)结构坐标，使将要解析其三维结构的蛋白质的共同或同源部分与已知分子中同源结构组件的三维结构拟合。可以根据氨基酸序列同一性、同源二级结构组件和/或同源三级折叠确定同源性。同源性模建可包括重建氨基酸(或其它成分)已被替换为将要解析的相关结构的部分或全部三维结构。
因此，未知分子或分子复合物的三维结构可以使用本发明的MMP-13：化合物A复合物的三维结构产生，利用本领域周知的多种技术精化，然后以与本发明的结构坐标相同的方式使用，例如，用于包括分子置换分析、同源性模建和合理药物设计在内的用途。
确定此处公开的MMP-13及其催化性活性部位的三维结构对于合理鉴定和/或设计可用作MMP-13酶活性抑制剂或激活剂的治疗剂至关重要。此外，应用常规药物测定技术，鉴定这种药剂的唯一方法是通过培养或通过对适当实验动物模型施用，筛查上千种测试化合物，直到鉴定出对靶化合物具有希望的抑制或激活作用的药剂。这些常规筛查方法必然是昂贵的、耗时的，并且不能阐明所鉴定的药剂对靶化合物的作用机理。
然而，先进的X-射线、波谱和计算机模建技术使研究人员能显示靶化合物的三维结构。研究人员利用这种三维结构确定推断的结合部位，然后鉴定或设计能与这些结合部位相互作用的试剂。然后根据对靶分子的激活或抑制作用筛选这些试剂。这样，不仅对于希望的活性要筛选的药剂数量大大减少，而且对靶化合物的作用机制得以更好的理解。
因此，本发明还提供一种鉴定可能的MMP-13抑制剂或激活剂的方法，包括下列步骤：应用由编码MMP-13的氨基酸的相对结构坐标定义的MMP-13的三维结构，设计或选择可能的抑制剂或激活剂，合成或获得这种可能的抑制剂或激活剂。这种抑制剂或激活剂可以通过筛查适当的数据库选择，可以通过结合适当软件程序分析空MMP-13活性部位的立体构型和电荷电位从头设计，或者可以利用MMP-13或其它胶原酶的已知抑制剂或激活剂的特征设计，以产生“杂种”抑制剂或激活剂。本发明的方法优选地用于设计或选择MMP-13活性抑制剂。
一种与MMP-13或MMP-13类似物的活性部位相互作用或结合的试剂可如下鉴定：由MMP-13或MMP-13类似物的三维模型确定MMP-13或MMP-13类似物的活性部位，进行计算机拟合分析，鉴定可与该活性部位相互作用或结合的试剂。计算机拟合分析应用多种计算机软件程序，评估推断的活性部位与鉴定的试剂之间的“拟合”，方法包括：(a)利用活性部位的同源性模建或原子结构坐标，产生推断的分子或分子复合物活性部位的三维模型，(b)确定推断的活性部位与鉴定的试剂之间的结合程度。此结合程度可利用多种商品软件程序计算确定，或者可用标准结合试验实验确定。
推断的活性部位的三维模型可用本领域周知的大量方法之一产生，包括但不限于：对用结晶或波谱技术产生的原始结构坐标数据的同源性模建及计算机分析。用于产生三维模型和/或进行必要的拟合分析的计算机程序包括但不限于：GRID(牛津大学，牛津，英国)；MCSS(MolecularSimulations，San Diego，CA)；AUTODOCK(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)；DOCK(加利福尼亚州大学，San Francisco，CA)；Flo99(Thistlesoft，Morris Township，NJ)；Ludi(Molecular Simulations，SanDiego，CA)；QUANTA(Molecular Simulations，San Diego，CA)；Insight(Molecular Simulations，San Diego，CA)；SYBYL(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)；和LEAPFROG(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)。
在本发明的一种优选方法中，确定的MMP-13或NMP-13类似物的活性部位含有一个催化性锌、一条β链、一个Ca2+结合环、一条α螺旋和一个随机卷曲区。更优选地，确定的活性部位含有一个催化性锌、一条含有根据图1的残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19和V20(或其保守置换)的β链、一个含有根据图1的残基F75、D76、G77、P78和S79(或其保守置换)的Ca2+结合环、一条含有根据图1的残基N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122和H123(或其保守置换)的α螺旋，和一个含有根据图1的残基P139、I140和Y141(或其保守置换)的随机卷曲区。
更具体而言，本方法确定的活性部位具有根据图4或图5的催化性锌与氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对结构坐标，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。在另一个优选实施方案中，确定的活性部位还包括根据图4或图5的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对结构坐标，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。在第三个优选实施方案中，本方法确定的活性部位还包括根据图4或图5的氨基酸残基F149和P152的相对结构坐标，在所有情况下都包括该氨基酸的保守置换，在所有情况下，±该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_(或更优选地不超过1.0_，或最优选地不超过0.5_)。含有所述氨基酸的保守置换的实施方案产生在规定均方根差之内与图4或图5中相应残基相同的结构坐标。
通过计算机拟合分析鉴定的这种试剂对MMP-13(或MMP-13类似物)的作用可通过计算进一步评估，或者通过使鉴定的试剂接触MMP-13(或MMP-13类似物)并测量该试剂对酶活性的影响来实验评估。根据该试剂对MMP-13活性部位的作用，该试剂可以作为MMP-13活性的抑制剂或激活剂。可进行标准酶学测定，分析结果确定该试剂是MMP-13活性的抑制剂(即可降低或防止MMP-13与相关底物之间的结合亲和力，从而与基线相比降低了MMP-13活性水平或速率的试剂)还是MMP-13活性的激活剂(即可提高MMP-13与相关底物之间的结合亲和力，从而与基线相比提高了MMP-13活性水平或速率的试剂)。可以进行进一步的检测，以评估所鉴定的试剂对MMP-13与其它金属蛋白酶相比的选择性。
设计或选择的能与MMP-13相互作用的试剂必须能够通过不同共价和/或非共价分子作用与MMP-13物理和结构上结合，并且能够假定可互补MMP-13分子的相关活性部位的三维构型和方向。
因此，利用这些标准，此处公开的MMP-13：化合物A复合物的结构坐标，和/或利用分子置换分析或同源性模建由其产生的结构坐标，可以设计试剂，提高已知抑制剂或激活剂的效能和/或选择性，方法包括修饰已知抑制剂或激活剂的结构，或经计算检查MMP-13活性部位的三维构型和静电势，从头设计新的试剂。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的图4或图5的结构坐标，或利用上述分子置换或同源性模建技术由其产生的结构坐标，用于筛查数据库，以筛选可作为可能的MMP-13活性(或MMP-13类似物活性)抑制剂或激活剂的试剂。具体而言，本发明获得的结构坐标读入软件包，并图形分析三维结构。许多计算软件包可用于结构坐标的分析，包括但不限于：Sybyl(Tripos Associates)、QUANTA和XPLOR(Brunger，A.T.，(1993)XPLOR 3.1版手册，耶鲁大学，New Haven，CT)。其它软件程序用于检查坐标在键和原子类型等特征方面的正确性。必要时，利用适当软件修改三维结构，然后能量最小化，直到所有结构参数为平衡/最佳值。将能量最小化的结构与最初的结构重叠，证实最初的和能量最小化的坐标之间没有显著差异。
然后分析与一种“解析”抑制剂或激活剂复合的MMP-13的能量最小化坐标，确定解析的配体与MMP-13间的相互作用。如下修改最终MMP-13结构：在图形上除去解析的抑制剂或激活剂，只留下MMP-13和解析的试剂的少量残基进行结合部位腔分析。可进行QSAR和SAR分析和/或构象分析，确定其它抑制剂或激活剂如何与解析的抑制剂或激活剂比较。解析的试剂可以停靠(dock)于未复合结构的结合部位内，用作数据库搜索的模板，利用软件产生排除体积和距离制约查询用于搜索。然后用标准试验和本领域周知的其它方法筛选命中(hit)的结构的活性。
此外，在解析的抑制剂或激活剂之间的特异相互作用确定后，应用不同抑制剂或激活剂的停靠研究可产生与MMP-13复合的新抑制剂或激活剂的初始模型。这些新模型的完整性可用多种方法评估，包括使用分子动态方法的制约构象分析(即，MMP-13和复合抑制剂或激活剂都可采样不同的三维构象状态，直到获得或发现在蛋白质与复合试剂之间存在最佳状态)。目视分析由分子动态分析得出的最终结构，证实该模型符合基于测得的结合亲和力的已知实验SAR。待获得与MMP-13结合的初始解析试剂的模型和与MMP-13结合的其它分子的计算机模型后，确定在激活剂或抑制剂中设计修饰以提高其活性和/或选择性的策略。
在如上所述优选或设计MMP-13结合剂后，可以在一些原子或侧基中进行置换，以提高或改变其选择性和结合性质。最初的置换一般是保守性的，即，替换基团具有与原始基团大致相同的大小、形状、疏水性和电荷。然后通过以上详述的计算机方法，分析这些置换化学化合物与MMP-13拟合的效率。
此外，本发明也提供一种方法，用于鉴定对基质金属蛋白酶家族除MMP-13之外的一个或多个成员具有选择性的可能的抑制剂或激活剂，该方法包括下列步骤：(i)应用MMP-13和希望的靶基质金属蛋白酶的三维结构(由编码MMP-13和靶基质金属蛋白酶的氨基酸的相对结构坐标定义)，设计或选择这种可能的抑制剂或激活剂，(ii)合成或获得这种可能的抑制剂或激活剂。在这种情况中，可能的抑制剂或激活剂设计为具有易于与希望的基质金属蛋白酶活性部位结合，而不宜与MMP-13活性部位结合的化学或立体特征，优选地该活性部位含有MMP-13 S1’袋。该抑制剂或激活剂可以通过筛查适当的数据库选择，可以通过结合适当软件程序分析空MMP-13/基质金属蛋白酶的活性部位的立体构型和电荷电位从头设计，或者可以利用MMP-13或其它胶原酶的已知抑制剂或激活剂的特征设计，以产生“杂种”激活剂或抑制剂。
在美国专利号5,834,228、5,939,528和5,865,116以及公布为WO99/09148的PCT申请号PCT/US98/16879中进一步公开了多种分子分析和合理药物设计技术，其内容在此引用作为参考。
参照下列非限制性实施例，本发明更易于理解。下列实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案，决不应视为限制本发明的范围。
实施例1
与化合物A复合的MMP-13的1H、15N和13CO归属和二级结构确定
方法与结果：按照公开的方法(Freije等人，J.Biol.Chem.1994)，均匀15N-和13C-标记的人胶原酶-3(MMP-13)的165氨基酸催化片段在含有质粒pProMMP-13的大肠杆菌BL21(DE3)株中表达。MMP-13如前所述纯化(Moy等人，J.Biomol.1997)，只有较少的修改。进行N端氨基酸测序证实蛋白质的同一性，并通过MALDI-TOF质谱法(PerSeptive Biosystems)进行MMP-13的均匀15N-和13C-标记。氧肟酸化合物的磺胺衍生物N-羟基-2-[(4-甲氧基-苯磺酰基)-吡啶-3-基甲基-氨基]-3-甲基-苯甲酰胺，由2-氨基-3-甲基-苯甲酸甲酯和对甲氧基苯磺酰氯制备，随后用3-吡啶甲基氯烷化，水解(LiOH/THF)产生羧酸，转化为氧肟酸(草酰氯/DMF/NH2OH)。HCl盐的形成产生如图3所示的化合物A。
NMR样品在与化合物A的等摩尔复合物中含有1mM MMP-13，它在一种缓冲液中用分光光度法测定，该缓冲液在90％H2O/10％D2O或100％D2O中含有10mM氚代Tris碱、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mMZnCl2、2mM NaN3和10mM氘代DTT，pH6.5。所有NMR谱用配有三重共振梯度探头的Bruker AMX-2600分光计在35℃下记录。
波谱用NMRPipe软件包(Delaglio等人，J.Biomol.NMR 1995)处理，用PIPP(Garrett等人，J.Magn.Reson.1991)、NMRPipe和PEAK-SORT(一种内部软件包)分析。1H、15N、13CO和13C NMR共振归属基于下列实验：CBCA(CO)NH、CBCANH、C(CO)NH、HC(CO)NH、HBHA(CO)NH、HNCO、HCACO、HNHA、HNCA、HCCH-COSY和HCCH-TOCSY(综述见，Bax等人，Mehtods Enzymol.1994；Clore和Gronenborn，Mehtods Enzymol.1994)。MMP-13 NMR归属的精确性进一步用15N-编辑的NOESY-HSQC谱中的连续NOE证实。
在分析MMP-13 NMR结构之前，已经报道了不含抑制剂的MMP-1催化片段的结构确定(Moy等人，Biochemistry 1998；Moy等人，J.Biomol.NMR 1997)(蛋白质数据库保藏的30个模拟退火结构，保藏号1AYK；蛋白质数据库保藏的制约最小平均结构，保藏号2AYK)。因为MMP有高度自身催化能力，通过建立酶仍具活性但酶的自身切割速率降低的缓冲液条件，进行对不含抑制剂的MMP-1的NMR分析。实现方法包括，加入可明显减少酶自身聚集的DTT，将样品pH降为6.5，恰好在由于催化性锌丢失使酶失活的pH之上。在此条件下，MMP-1 NMR样品一般稳定1-2个月。遗憾的是，MMP-13并非这样，该蛋白质在几个小时内快速降解，需要使用抑制剂归属MMP-13 NMR共振。
MMP-13：化合物A复合物的二级结构是基于特有的NOE数据，包括来自15N-编辑的NOESY-HSQC和13C-编辑的NOESY-HSQC谱的NH、Hα和Hβ质子、来自HNHA的3JHNα的偶合常数、慢交换NH质子和13Cα和13Cβ二级化学位移(综述见Wishart和Sykes，MethodsEnzymol.1994；Wuthrich，《蛋白质和核酸的NMR》，John Wiley&Sons，纽约，1986)。经测定，复合物中的MMP-13 NMR结构包括对应于残基28-44(αA)、112-123(αB)和153-163(αC)的3个α螺旋，和由对应于残基83-86(β1)、95-100(β2)、59-66(β3)、14-20(β4)和49-53(β5)的5条链组成的混合平行及反平行β折叠。这与其它MMP结构所见的二级结构基本相同。
在共振归属不完全的MMP-13：化合物A波谱中有3个不同的区域。它们对应于残基G70-Y73、P87-N91和T144-H148。残基T144-H148对应于以前在MMP-1结构中所见的动态环区的一部分(Moy等人，J.BiomoL.NMR 1997)。这提示甚至在高亲和力抑制剂存在下，MMP-13结构中的该区仍有类似的动态分布图(IC50＝33nM)。残基P87-N91含有一个脯氨酸簇，由于缺少NH它可破坏连续归属过程。残基G70-Y73对应于结构锌附近的环区，在MMP-1结构中易于归属。对于蛋白质的其余部分，主链和侧链1H、15N、13C和13CO归属基本上完成。
实施例2
与化合物A复合的MMP-13催化片段的高分辨率溶液结构
材料与方法：
化合物A的制备：氧肟酸化合物的磺胺衍生物(化合物A)按照实施例l所述的方法制备，产生图3的化合物。
重组15N-和13C/15N-标记的MMP-13的表达：169残基C端截短的人胶原酶-3(MMP-13)在大肠杆菌中表达。由含有MMP-13完整编码序列的质粒pNot3a(Frieje等人，J.Biol.Chem.1994)PCR扩增C端截短的胶原酶原的编码序列。PCR引物含有易于克隆的适当限制位点。该构建体编码截短的proMMP-13，它在原始proMMP-13序列中添加了一个N端甲硫氨酸和位于残基169处的C端脯氨酸。将PCR扩增的DNA片段克隆到pET-21a(+)的NdeI/SalI位点，产生被命名为pProMMP-13的重组质粒。含有质粒pProMMP-13的大肠杆菌BL21(DE3)在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养。过夜培养物1∶20稀释，在37℃下剧烈振荡培养至A600＝0.6-0.8。加入异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，在37℃下振荡培养3小时。离心收集细胞(7000×g15分钟)，用PBS洗涤，-70℃冻存直到使用。
在含有2.0g/l[13C6，98％+]D-葡萄糖和1.0g/l[15N，98％+]氯化铵分别作为唯一碳源和氮源的合成培养基中培养BL21(DE3)大肠杆菌，获得均匀15N-和13C-标记的ProMMP-13。合成培养基中另外还含有M9盐(Sambrook等人，《(分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约，NY 1989)、痕量元素、维生素和100μg/ml氨苄青霉素。温育和生长条件同上。
重组15N和13C MMP-13的纯化：MMP-13按照Moy等人，J.Biomol.NMR 1997所述纯化，具有如下修改。冷冻细胞沉淀在冰上融化。通过在裂解缓冲液(0.1M Tricine，pH8.0，10mM EDTA，2mM DTT，0.5mMPMSF)中匀浆重悬浮细胞。通过French Press(2次)随后用溶菌酶(1mg/ml；终浓度)在室温下处理30分钟裂解细胞。以45000×g离心裂解液30分钟。沉淀用50mM Tricine，pH7.5、0.2M NaCl2、0.5％TritonX-100洗涤两次，重悬浮于新鲜尿素缓冲液(20mM Tricine，pH7.5，8M尿素，0.2％NaN3，2mM DTT)中，室温温育1小时。尿素溶解的蛋白质以45000×g离心30分钟，过滤得到的上清液，加样到用6M尿素缓冲液平衡的Hitrap-Q Sepharose(Pharmacia Biotech)阴离子交换柱上。该柱用尿素缓冲液洗涤，以0-0.25M NaCl线性梯度洗脱。含有proMMP-13的级分经SDS-PAGE检测，合并，快速稀释到5倍过量的复性缓冲液(50mM Tricine，pH7.5，0.4M NaCl，10mM CaCl2，0.1mM ZnOAc2，0.02％NaN3)中。在对25倍体积的复性缓冲液(更换3次)透析2天后，用Millipore Biomax 5浓缩器将重折叠的proMMP-13浓缩为约4-10mg/ml。在1mM对氨基乙酸苯汞(APMA)存在下37℃温育过夜，使proMMP-13活化为MMP-13CAT(催化域)。
然后将活化的蛋白质加到用2.5mM Iris-HCl，pH7.5、5mM CaCl2、0.4M NaCl、2mM DTT、0.02％NaN3和0.05mM ZnOAc2平衡的Superdex-75 16/60凝胶过滤柱上。洗脱蛋白质，经SDS-PAGE鉴定含MMP-13CAT的级分。合并峰级分，用Millipore Biomax浓缩器将该蛋白质浓缩为约5mg/ml，贮存于-70℃。进行N端氨基酸测序，证实该蛋白质的身份。MMP-13-CAT的均匀15N-和13C-标记通过MALDI-TOF质谱法(PerSeptive Biosystems)证实。
NMR样品制备：MMP-13：化合物A NMR样品含有与化合物A以1∶1复合的1mM15N-或15N/13C-标记的MMP-13。使用20-30ml在90％H2O/10％D2O或100％D2O中含有10mM氘代Tris碱、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2mM NaN3、10mM氘代DTT和0.2mM化合物A的溶液，通过重复更换缓冲液，制备样品。缓冲液更换在MilliporeUltrafree-15离心过滤单元上进行。通过从缓冲液中除去化合物A的另外几次缓冲液更换，除去过量的化合物A。
NMR数据采集：利用梯度提高的三重共振1H/13C/15N探头，用Bruker AMX-2 600分光计在35℃下记录所有波谱。对于在H2O中记录的波谱，用WATERGATE序列和水翻转(flip back)脉冲实现水的抑制(Piotto等人，J.Biomol.NMR 1992；Grzesiek和Bax，J.Am.Chem.Soc.1993)。间接检测的维度的正交检波以States-TPPI超复数相位增长记录(Marion等人，J.Magn.Reson.1989)。以适当的重聚延迟采集波谱，以进行0，0或-90，180相位校正。
MMP-1：化合物A复合物中化合物A的共振归属和结合构象是基于2D12C/12C-滤波的NOESY(Petros等人，FEBS Lett.1992；Gemmecker等人，J.Magn.Reson.1992)、2D12C/12C-滤波的TOCSY(Petros等人，FEBS Lett.1992；Gemmecker等人，J.Magn.Reson.1992)和12C/12C-滤波的COSY实验(Ikura和Bax，J.Magn.Reson.1992)。
MMP-13：化合物A的结构是基于以下一系列波谱：HNHA(Vuister和Bax，J.Am.Chem.Soc.1993)、HNHB(Archer等人，J.Magn.Reson.1992)、3D长程13C-13C相关(Bax和Popchapsky，J.Magn.Reson.1992)、偶合CT-HCACO(Powers等人，J.Magn.Reson.1991；Vuister等人，J.Am.Chem.Soc.1992)、HACAHB-COSY(Grzesiek等人，J.Amer.Chem.Soc.1995)、3D 15N-(Marion等人，Biochemistry 1989；Zuiderweg和Fesik，Biochemistry 1989)和13C-编辑的NOESY(Zuiderweg等人，J.Magn.Reson.1990；Ikura等人，J.Magn.Reson.1990)和3D 13C-编辑/12C-滤波的NOESY(Lee等人，FEBS Lett.1994)实验。分别以100msec、120msec和110msec混合时间采集15N-编辑的NOESY、13C-编辑的NOESY和3D 13C-编辑/12C-滤波的NOESY实验。在测定与化合物A复合的MMP-13的溶液结构中使用的每次实验的采样参数如前所报道(Moy等人，Biochemistry l998)。
波谱用NMRPipe软件包(Delaglio等人，J.Biomol.NMR 1995)处理，在Sun Sparc工作站上用PIPP(Garrett等人，J.Magn.Reson.1991)分析。适当时，数据处理包括溶剂滤波，将数据补零至翻倍(a power oftwo)，线性预测间接采集的数据的一个数据点以获得零相位校正，线性预测间接采集的维数的其它点以提高分辨率。利用镜像技术的线性预测只用于恒时实验(Zhu和Bax等人，J.Magn.Reson.，1992)。在所有情况下，数据用偏正弦钟形切趾函数处理，在所有维度中使用一次充零。
质子间距制约：由3D13C-编辑/12C-滤波的NOESY和3D15N-编辑的NOESY实验归属的NOE分为强、中、弱，分别对应于1.8-2.7_(对于涉及NH质子的NOE，为1.8-2.9_)、1.8-3.3_(对于涉及NH质子的NOE，为1.8-3.5_)和1.8-5.0_的质子间距制约(Williamson等人，J.Mol.Biol.1985；Clore等人，EMBO J.，1986)。适当校正涉及甲基质子和非立体特异性归属的亚甲基质子的距离上限，进行中心平均(Wuthrich等人，J.Mol.Biol.，1983)。
扭角制约和立体特异性归属。β-亚甲基立体特异性归属和χl扭角制约主要通过由HACAHB-COSY实验定量估计3Jαβ偶合常数(Grzesiek等人，J.Am.Chem.Soc.1992)以及由HNHB实验估计3JNβ偶合常数(Archer等人，J.Magn.Reson.，1991)的大小获得。由涉及NH、CαH和CβH质子的残基内NOE的近似距离制约进一步证实了此归属(Powers等人，Biochemistry，1993)。
φ和Ψ扭角制约如下获得：在HNHA实验中，根据与NH对角线的Hα交叉峰的相对强度测得的3JNHα偶合常数(Vuister和Bax等人，J.Am.Chem.Soc.1993)，在HACAHB-COSY实验中，定量估计3Jαβ偶合常数的大小(Grzesiek等人，J.Am.Chem.Soc.1992)，和利用构象网格搜索程序STEREOSEARCH(Nilges等人，Bio.Polymers 1990)获得涉及NH、CαH和CβH质子的残基内和连续NOE的近似距离制约，如前所述(Kraulis等人，Bjochemisty，1989)。由偶合3D CT-HCACO谱获得的1JCαHβ偶合常数用于确定具有正f主链扭角的非甘氨酸残基的存在(Vuister等人，J.Am.Chem.Soc.1992)。1JCαHα偶合常数大于130Hz可使最小φ制约由-2°变为-178°。
根据由长程13C-13C NMR相关谱中Cα和Cδ交叉峰相对强度获得的3JCαCδ偶合常数(Bax等人，J.Am.Chem.Soc.1992)，结合残基内NOE的相对强度(Powers等人，Biochemistry 1993)，确定Ile和Leuχ2扭角制约和亮氨酸甲基的立体特异归属。缬氨酸甲基的立体特异性归属根据残基内NH-CγH和CαH-CγH NOE的相对强度确定，如Zuiderweg等人(1985)所述(Zuiderweg等人，Biopolymers 1985).用于φ、Ψ和χ扭角制约的最小范围分别是±30°、±50°和±20°(Kraulis等人，Biochemistry1989)。
结构计算：这些结构利用Nilges等人(1988)(Protein Eng.)的杂种距离几何-动态模拟退火法计算，对该方法做微小改动(Clore等人，Biochemistry 1990)，使用程序XPLOR(Brunger，A.T.，XPLOR 3.1版手册，耶鲁大学，New Haven CT)，适于为3JNHα偶合常数(Garrett等人，J.Magn.Reson.Ser.B 1994)、二级13Cα/13Cβ化学位移制约(Kuszewski等人，J.Magn.Reson.Ser.B 1995)和构象数据库电势(Kuszewski等人，Protein Sci.1996；Kuszewski等人，J.Magn.Reson.1997)加入赝势(pseudopotential)。在制约最小化和模拟退火期间最小化的靶功能只包含共价几何、3JNHα偶合常数和二级13Cα/13Cβ化学位移制约的二次谐波项、实验距离和扭角制约的矩形势阱平方电势，和非键合接触的四次范德华项。所有肽键制约于平面和反式。在靶功能中没有氢键键合、静电或6-12 Lennard-Jones经验势能项。
为了防止Zn和Ca离子在精化方案的高温模拟退火阶段中被排除，根据观察到的X-射线结构中的坐标，在XPLOR距离制约文件中包含His侧链与Zn之间和主链原子与Cα之间的最少量的距离制约(Lovejoy等人，Science 1994；Lovejoy等人，Biochemistry 1994；Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994；Borkakoti等人，Nat.Struct.Biol.1994)。
模拟退火方案的起始MMP-13：化合物A复合物结构通过向MMP-13的同源性模型内手工停靠化合物A获得。化合物A在MMP-13活性部位中的最初定向是根据以前报道的MMP-1：CGS-27023A结构(Moy等人，Biochemistry 1999)。
利用同源性模建法产生MMP-13的三维模型。根据X-射线结晶学结构的可用性(Bode等人，EMBO J.1994；Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994；Betz等人，Eur.J.Biochem.1997；Lovejoy等人，Nat.Struct.Biol.1999；Borkakoti等人，Nat.Struct.Biol.1994；Browner等人，Biochemistry 1995)，将对应于MMP-13催化域的线性氨基酸序列与MMP-1、MMP-7和MMP-8的催化域比对(SYBYL)。MMP-13与MMP-1和MMP-8的比对证实有最高同源性，计算的同一性分别为58.9％和61.4％(图2)。
选择MMP-8的X-射线结构，用作同源性模建MMP-13结构的模板。这一决定主要基于如图2B所示的序列比对，其中在关键特异性环(以下划线和黑体字标记)中未发现插入(标记为“###”)。在图2A中，特异性环中标记为“##”的区显示，与MMP-1的序列长度相比，有另外2个氨基酸残基的“插入”。根据我们的比对分析，MMP-8将可更精确地模建抑制剂结合袋，因为在该环区内不必进行预测。
利用COMPOSER(SYBYL)构建MMP-13的初始同源性模型。唯一的插入是MMP-13位点32处的一个丝氨酸(在图2B中标为“**”)。S32的插入发生在卷曲区内，它是长α螺旋的入口，距离S’特异性环约17埃。然后利用一组套式精化方法(Chen等人，J.Biomol.Struct.Dyn.1995)，使MMP-13模型能量最小化，但蛋白质主链重原子被制约得近可能地接近原位置。
然后对MMP-13：化合物A模型进行1000个CHARMM最小化步骤，在MMP-13和化合物A间发现5个分子内NOE制约和47个距离制约，其中MMP-13的坐标保持固定。该方法估计化合物A在MMP-13活性部位中的定位，而不扭曲MMP-13的结构。最终结构表示为PDB文件，并用作XPLOR模拟退火方案的起点，其中该结构中的所有残基均可自由移动。由于模拟退火方案的最初阶段对应于具有相对较弱XPLORNOE力常数的高温动力学(1500K)(Ries和petrides，Biol.Chem.Hopp-Seyler 1995)，初始MMP-13：化合物A结构不会偏离结构确定方法，因为该结构能够有效地自由研究可及的构象空间。另外，模拟退火方法的每次重复开始于分子动力学的随机轨迹。这些轨迹相差可达10_的事实确保可清楚地研究由此模拟退火方案确定的总体MMP-13：化合物A结构的构象空间。
结果与讨论
化合物A共振归属和结合构象：化合物A的一级结构按质子命名惯例显示于图3中。MMP-13复合物中化合物A的NMR归属按照已建立的方法，应用2D 12C-滤波实验(Petros等人，FEBS Lett.1992；Gemmecker等人，J.Magn.Reson.1992；Ikura和Bax，J.Magn.Reson.1992)，因为NMR样品由13C/15N-标记的MMP-13和未标记的化合物A组成。因此，在MMP-13存在下，化合物A的传统2D-NOESY、COSY和TOCSY波谱产生化合物A的直接归属，以及游离化合物A的归属(数据未显示)。游离和结合化合物A归属中的唯一显著差异是在复合物中发现两个明显的2HB1/2共振(4.91ppm；4.67ppm)。游离化合物A中缺乏共振可被水遮掩。观察到对甲氧基苯环上的质子退化也提示，当与MMP-13复合时该环快速翻转。对于与MMP-1和溶基质素复合的CGS-27023A也观察到这一现象(Gonnella等人，Bioorg.Med.Chem.1997；Moy等人，Biochemistry 1998；Moy等人，Biochemistry 1999)。
结构NOE的缺乏证实，在缺乏MMP-13时，化合物A不采用一种优选构象。对MMP-13复合物中的化合物A，只观察到最少量的分子内NOE，这与化合物A的结合构象有关(数据未显示)。最少量的结构NOE是化合物A构象、结构和化学位移衰退的结果。观察到的大量NOE对应于连续相互作用，它对抑制剂的总体构象没有影响，在化合物A或复合物的精化中不使用。观察到的结构分子内NOE主要在1HH*与吡啶环之间和2HB1/2与对甲氧基苯环和芳环之间。这些NOE与以前观察到的与MMP-1和溶基质素结合的CGS-27023A的“倾斜”构象一致，但化合物A的结合构象主要取决于化合物A与MMP-13之间的分子间NOE(表1)。
结构确定：NMR结构确定方法是一种迭代方法，用现有的结构状态分析不清楚的NOE数据。本质上是用这种结构作为距离滤波器，分类不明确的NOE列表，其中第一种结构由明确的数据确定。为了精化MMP-13，最初的结构是一种基于MMP-8X-射线结构的同源性模型。以前报道的MMP结构中的总体相似性和利用NMR对MMP-13的二级结构归属证实该方法是有效的。MMP-13的规则的二级结构单元通过定性分析连续和链间NOE、NH交换速率、3JHNα偶合常数(Clore等人，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.1989)和13Cα和13Cβ二级化学位移(Spera和Bax，J.Am.Chem.Soc.1991)确定。推断的二级结构与以前报道的不含抑制剂的MMP-1 NMR结构基本相同。
为残基7-164计算的最后30个模拟退火结构基于3279个实验NMR制约，包括2561个近似质子间距离制约、51个MMP-13与化合物A之间的距离制约、88个44个主链氢键的距离制约、391个扭角制约、103个3JNHα制约、123个Cα制约和108个Cβ制约。对100个含β-亚甲基质子的残基中的81个、6个Val残基中的5个的甲基、13个Leu残基中的12个的甲基，获得立体特异性归属。另外也说明了12个Phe残基中的12个和8个Tyr残基中的7个，使得能只对CδH和CεH质子对之一归属NOE制约，并归属χ2扭角制约。类似地，为三个Trp残基归属χ2扭角制约。30个模拟退火结构中有关残基7-164的平均坐标位点的原子均方根分布，对于主链原子为0.43±0.06_，所有原子为0.81±0.09_，除杂乱表面侧链之外的所有原子为0.47±0.04_。残基7-164的φ和Ψ主链扭角的平均标准差分别为6.2±11.3°和7.1±11.8°。MMP-13 NMR结构的高质量也被PROCHECK分析的结果和计算的Lennard-Jones-范德华能量的较大负值(-695±11kcal mol-1)所证实。对于PROCHECK统计，总G因子为0.16±0.16，氢键能量为0.82±0.05，每100个残基只有7.8±1.0个不良接触，这符合与1_X-射线结构相当的高质结构。
与理想共价几何形状的极小偏差，没有分别高于0.1_和1°的质子间距和扭角偏离，非甘氨酸残基的大多数主链扭角位于拉曼图的预期区域内(未显示)，也都证实了MMP-13 NMR结构的高质量。91.5％的残基位于拉曼φ，Ψ图的最优区内，7.8％位于其它容许区内。偶合CT-HCACO实验得出的1JCαHα偶合常数表明，所有非甘氨酸残基具有负φ扭角。
化合物A和活性部位残基的确定的坐标也证实了适当定义该复合物的NMR数据的质量，其中化合物A的重原子和MMP-13主链原子的原子均方根分布分别为0.47±0.08_和O.18±0.03_。
MMP-13：化合物A结构的描述：MMP-13的整体折叠与以前报道的MMP结构基本相同(Bode等人，EMBO J.1994；Gooley等人，Nat.Struct.Bio1.1994；Lovejoy等人，Science 1994；Lovejoy等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1994；Lovejoy等人，Biochemistry 1994；Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994；Stams等人，Nat.Struct.Biol.1994；Becker等人，Protein Sci.1995；Gonnella等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995；vanDoren等人，Protein Sci.1995；Botos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996；Broutin等人，Acta Crystallogr.，Sect.D：Biol.Crystallogr.1996；Gooley等人，J.Biomol.NMR.1996；Betz等人，Eur.J.Biochem.1997；Gonnella等人，Bioorg.Med.Chem.1997；Moy等人，Biochemistry 1998和Moy等人，Biochemistry 1999)。MMP-13的NMR结构包含对应于残基28-44(αA)、112-123(αB)和153-163(αC)的3条α螺旋，和由对应于残基83-86(β1)、95-100(β2)、59-66(β3)、14-20(β4)和49-53(β5)的5条链组成的混合平行及反平行β折叠。MMP-13的活性部位以β链IV、Ca2+结合环、螺旋B和残基来自残基P139-Y141的随机卷曲区为界。催化性锌被H119、H123和H129螯合，而结构锌被H69、H84和H97螯合。钙离子在由残基D75-G79组成的环区中螯合。MMP活性部位结构的一个有趣的特征是主链中有一个明显的扭结(kink)，它存在于Ca2+结合环与β链IV之间。对于MMP-13，这使L82和A83的NH朝向酶活性部位。底物和抑制剂与MMP结合的一个重要特征是与β链IV的氢键相互作用，这种异常的扭结构象利于这种作用(Lovejoy等人，Science1994；Lovejoy等人，Biochemistry 1994；Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994；Borkakoti等人，Nat.Struct.Biol.1994)。
MMP-13活性部位中化合物A的相互作用取决于化合物A的5个分子内NOE和MMP-13与化合物A之间的总共47个分子间距离制约。参加与抑制剂相互作用的关键MMP-13残基对应于3个不同MMP-13区：β链IV的残基L81、L82和A83；α螺旋II的残基L115、V116和H119；来自含MMP-13 S1’和S2’袋的活性部位环的L136、I140和Y141。MMP-13结构的独特特征是大S1’袋，它几乎到达蛋白质表面。
化合物A结合于催化性锌的右侧，化合物A的对甲氧苯基位于此处MMP-13活性部位的S1’袋中。由3HH*、3HE1/2和3HD1/2与L115、V116、H119、L136、I140和Y141之间观察到的NOE证实了这一定位。1HH*、1HE2和1HZ与L81自旋系统之间的强NOE证实芳基主要与L81的侧链相互作用。最后，吡啶环基本上暴露于溶剂，但与I140的侧链相互作用。这些相互作用定位化合物A，使得化合物A的氧肟酸部分与催化性锌的“右侧”螯合，而磺酰氧距L82的主链NH有一个氢键距离。
令人感兴趣的是注意到，根据S2次参数，活性部位环在无抑制剂和CGS-27023A结构中是高度动态的(Moy等人，J.Biomol.NMR 1997)。MMP-13：化合物A结构中的该区似乎明显迁移率较低，因为发现该环区中的大多数残基容易在1H-15N HSQC波谱中观察到，并易于归属。这种差异的一个可能的解释是化合物A的吡啶环与Ile-140的侧链之间的疏水相互作用。在MMP-1中，1140被替换为丝氨酸，这基本上消除了这种有利的相互作用。
MMP-13 NMR结构的另一个独特特征是残基H69到Y73的表观动力学性质。这些残基由于缺乏任何归属信息完全无序，导致的任何制约信息的缺乏可能是这些残基柔性的结果。残基H69到Y73存在于Ca2+结合环与结构锌之间，以前解析的MMP-1 NMR结构中的相应区已明确描述。两种NMR结构之间迁移率的改变没有明确的解释，但可能引起MMP-1和MMP-13物理性质的不同。在相同条件下，不含抑制剂的MMP-1可稳定高达2个月，而不含抑制剂的MMP-13立即降解。
MMP-13：化合物A与MMP-1：CGS-27023A结构的比较：通过用基于MMP-1 NMR结构的同源性模型作为分析不清楚的NOESY数据的初始模型，高效地确定了MMP-13：化合物A复合物的高分辨率NMR结构。该结果证实了MMP家族成员之间的高度结构及序列相似性，与以前观察到的MMP-1、溶基质素、matrilysin和嗜中性胶原酶的主链原子的最佳拟合(best-fit)重叠一致(Moy等人，Biochemistry 1998和Moy等人，Biochemistry 1999)。
不同MMP结构之间的强烈相似性在设计特异性MMP抑制剂中造成了困难。MMP之间活性部位的高度序列相似性即是一个例子。MMP-13与MMP-1之间序列相似性的比较说明了这种困难。在这两种酶之间只有少量的显著残基差异，但这些修饰使活性部位的局部环境显著改变。MMP-1与MMP-13之间R114-V115的修饰分别使S1’袋底部的亲水环境转变为疏水环境。类似地，N80-L81置换将一个较大的疏水性残基置于MMP-13的S2’袋中，而MMP-1为亲水性更强的环境。类似地，在活性环区内，MMP-13中的I140大疏水性残基替换MMP-1中较小的亲水性S139残基。显然，向小分子中掺入取代基以利用MMP-1与MMP-13之间空间上不同的环境改变是可行的。但是，当这些序列和环境差异在MMP家族中平均时，变得辨别力较低，并且难以严格按照小序列差异设计特定MMP亚型的抑制剂。
相反，易于在药物设计中加入特异性的MMP之间最明显的结构差异是S1’袋的相对大小和形状。通过比较MMP-13与MMP-1的确定的S1’袋清楚地得到证明。MMP-13与MMP-1 NMR结构之间S1’袋大小的较大差异是显著的。MMP-13的S1’袋几乎达到蛋白质的外表面，比MMP-1大两倍。两种抑制剂的填充能力最好地说明了MMP-13 S1’袋相对于MMP-1的大小。在MMP-1：CGS-27023A NMR结构中，对甲氧基苯基有效地填充MMP-1的可及的S1’袋。相反，在MMP-13：化合物A复合物中，对甲氧基苯基只部分填充MMP-13 S1’袋内的可用空间。MMP-13袋的大小实际上类似于溶基质素的大小，溶基质素抑制剂的设计就利用这种较深的S1’袋，使用另一系列的联苯取代基代替化合物A中的对甲氧基苯基，结合于S1’袋内(Hajduk等人，J.Am.Chem.Soc.1997；Olejniczak等人，J.Am.Chem.Soc.1997)。因此，MMP-13和MMP-1的NMR结构提示，用于设计这些MMP之间特异性的一种方法是利用大小显著不同的S1’袋。MMP-1活性部位的高迁移率显示MMP-1和MMP-13结构静态图像分析的势能警告(Caveat)。MMP-1活性部位由于在游离和抑制结构中的迁移率提高，也许能适应比当前结构所推断的更大的S1’取代基。
对MMP-13：化合物A复合物中化合物A结合模式的检查提示了一种基本类似于以前报道的MMP-1：CGS-27023A NMR结构中的CGS-27023A的构象(蛋白质数据库保藏的30个模拟退火结构，保藏号4AYK；蛋白质数据库保藏的制约最小平均结构，保藏号3AYK)。化合物A和CGS-27023A在结构上极其相似，唯一的不同是S2’袋中结合的取代基的性质，其中化合物A中的芳基代替CGS-27023A中的异丙基。观察到的抑制剂与蛋白质之间几乎相同的分子间NOE模式表明了化合物A与CGS-27023A结合模式的强烈相似性。参加与化合物A相互作用的关键MMP-13残基对应于β链IV的残基L81、L82和A83；α螺旋II的残基L115、V116和H119；活性部位环的L136、I140和Y141。类似地，参加与CGS-27023A相互作用的MMP-1残基对应于β链IV的残基N80、L81、A82和H83；α螺旋II的残基R114、V115、H118和E119；动态柔性环的L135、P138、Y137、S139和Y140。
如前所述，MMP-13和MMP-1之间在活性部位中有三个不同的残基改变。分别在MMP-1与MMP-13之间的R114-L115改变对S1’袋底部的环境有显著影响，但由于化合物A只部分填充MMP-13的S1’袋，这种改变不会影响化合物A相对于CGS-27023A的结合构象。相反，N80-L81置换直接在S2’袋中与抑制剂相互作用，并可导致抑制剂结合模式明显改变。使分析复杂化的抑制剂中的唯一改变是结合S2’袋的取代基。对于MMP-1：CGS-27023A复合物，异丙基与N80和H83的侧链相互作用，而化合物A的芳基只与MMP-13的L81相互作用。另外，CGS-27023A距L81和A82有一个氢键距离，而化合物A似乎与L82形成分支氢键。这一分析提示，CGS-27023A与β链IV更紧密结合，因为，由于在化合物A中缺乏大L81侧链和存在芳基，MMP-1中S2’袋更易接近。结合构象的直接比较提示在抑制剂的相对方向中只有微小差异。MMP-1与MMP-13间S139-I140的差异似乎与迁移率改变有关，不同于结构改变。在MMP-1：CGS-27023A结构中，吡啶环的位置基本上不知，并且可暴露于溶剂，这与MMP-13：化合物A结构相比较，其中吡啶环与I140的侧链结合。显然，相对于Ser，Ile是更大、更具疏水性的基团，它可引起与吡啶环的有利的疏水作用。更有趣的是，观察到MMP-13结构中活性环的迁移率明显降低，这可能与吡啶环I140相互作用有关。这似乎与以前的抑制MMP X-射线结构一致(Spurlino等人，Proteins：Struct.Funct.Genet.1994)，其中抑制剂可延长β链IV与活性环区之间β折叠的形成，产生X-射线结构中的低B因子。这可能提示，与抑制剂的任何阳性作用能消除活性环区的迁移率。
两种抑制剂在MMP-13：化合物A和MMP-1：CGS-27023A NMR结构中的结合模式明显不同。更显著的发现是两种结构之间的总体相似性。尽管S1’袋有一定显著序列差异和大小及形状的较大差异，任一种抑制剂结构将精确预测其它结构。这一发现似乎表明，抑制剂结合MMP的主要贡献因素是拟合S1’袋和氧肟酸与催化性锌的结合。S2’袋中的相互作用似乎对抑制剂结合和选择性有更微妙的影响，因为化合物A和CGS-27023A分别是MMP-13和MMP-1的低纳摩尔抑制剂。因此，MMP-13：化合物A的高分辨率溶液结构连同以前报道的MMP-1 NMR结构提示，利用S1’袋大小和形状的显著差异是研制特异性MMP抑制剂的一种合理方法。
此处所述的研究提供了与氧肟酸化合物磺胺衍生物(化合物A)复合的MMP-13的高分辨率溶液结构。MMP-13的整体折叠类似于以前报道的MMP结构。主要不同是几乎达到蛋白质表面的大S1’袋。该结构基于由X-滤波NOESY实验获得的总共3279个制约，包括47个MMP-13与化合物A之间的距离制约。发现该抑制剂与催化性锌的“右”侧结合，使得对甲氧基苯环位于S1’袋中，芳族部分与βIV的L81相互作用，吡啶环与活性部位环的I140相互作用，在磺胺氧与残基182之间存在氢键作用，氧肟酸螯合催化性锌。该抑制剂结合MMP-13类似于MMP-1：CGS-27023A复合物，提示适当填充S1’袋在研制选择性MMP抑制剂中可能起关键作用。表1.化合物A与MMP-13之间观察到的NOE化合物A MMP-13 NOE类别 化合物A MMP-1 NOE类别
1HH* L81HY W 3HH* Y141Hα M
1HH* L81Hδ1# W 3HH* Y141Hβ1 W
1HH* L8iHδ2# M 3HH* Y141Hβ2 W
1HH* L81Hα S 3HH* Y141Hδ2 W
1HE2 L81Hδ1# W 3HE2 L82Hδ1# W
1HE2 L81Hδ2# M 3HE1 A83Hβ# W
1HZ L81Hδ1# W 3HE1 H116Hα W
1HZ L81Hδ2# M 3HE1 H116Hγ1# M
2HZ I140Hγ2# W 3HE2 H116Hγ2# W
2HE1 I140Hδ1# W 3HE2 I140Hγ2# W
3HH* L82Hδ1# W 3HE2 Y141Hα W
3HH* L115Hβ# W 3HE2 Y141Hβ1 W
3HH* L115Hγ W 3HE2 Y141Hβ2 W
3HH* L115Hδ1# W 3HD2 L82Hδ1# W
3HH* L115Hδ2# W 3HD1 A83Hβ# W
3HH* V116Hα W 3HD1 V116Hγ1# W
3HH* V116Hγ1# W 3HD2 V116Hγ2# W
3HH* V116Hγ2# M 3HD2 I140Hα W
3HH* H119Hα W 3HD2 I140Hγ2# W
3HH* H119Hδ2 W 3HD2 Y141Hα W
3HH* H119Hβ1 W 3HD2 Y141Hβ1 W
3HH* H119Hβ2 W 3HD2 Y141Hβ2 W
3HH* L136Hδ1# W 3HD2 Y141HN W
3HH* L136Hδ2# W
实施例3
新型、有效、选择性MMP-13抑制剂的基于结构的设计
基质金属蛋白酶(MMP)包括含锌酶家族，它们能切割大量底物，包括胶原、纤连蛋白和明胶，对于各种MMP，底物偏好不同。MMP抑制剂的设计最初是基于模拟天然蛋白质底物与MMP的结合作用，与肽底物复合的MMP的结构信息已经通过X-射线结晶法和NMR波谱法确定。该结构信息产生了MMP活性部位的概述。
MMP的活性部位包含一个被3个组氨酸螯合的催化性锌，其中3个底物结合袋位于该催化性锌的右侧(S1’，S2’，S3’)和左侧(S1’S2，S3)。通过肽底物侧链与MMP的相互作用确定这些底物结合袋。MMP抑制剂设计的主要工作集中于螯合催化性锌而主要结合于S1’和S2’袋中的化合物。这由下列发现得出：S1’袋的结构特征(大小、形状、氨基酸组成)导致各种MMP之间的最大变异性，这提供了一种设计选择性和特异性MMP抑制剂的方法。但是，在抑制剂设计中除催化性锌右侧的结合袋之外(或与它一起)使用其左侧的结合袋也已取得成功。
设计MMP抑制剂的根本挑战是MMP家族各成员之间的相当高的序列和结构同源性，这使得在没有结构信息的情况下难以设计针对一种MMP的抑制剂。非特异性MMP抑制剂作为药物的问题是十分可能有严重的副作用，因为MMP家族有大量酶并且它们在靶标和功能上有相应的多样性。
因此，此处提供的详细结构信息是针对特定MMP酶的抑制剂设计计划的关键组成部分。
材料与方法：
化合物D和化合物E的合成：由2-氨基-3，5-二甲基-苯甲酸甲酯和对甲氧基苯磺酰氯产生的磺胺用苄基溴N-烷基化，水解(LiOH/THF)中间产物的酯基产生羧酸。通过制备酰基氯(草酰氯/DMF)随后与羟胺反应，形成相应的氧肟酸。化合物E如下合成：2-氨基-3，5-二甲基-苯甲酸甲酯与对氟苯磺酰氯反应，随后用苄基溴N-烷基化。水解甲酯(LiOH/THF)，随后将氟置换为苯并呋喃-2-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺的醇盐，在如上所述转化为氧肟酸和形成HCl盐后，产生化合物E。
NMR样品的制备：均匀(＞95％)15N-或15N/13C-标记的人重组MMP-13在大肠杆菌中表达，并如上所述纯化。使用MilliporeUltrafree-10离心过滤器，在90％H2O/10％D2O或100％D2O中含有10mM氘代Tris碱、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2mMNaN3、10mM氘代DTT的缓冲液中浓缩，并更换缓冲液，制备1mM13C/15N-和15N-MMP-13 NMR样品。通过向1mM 13C/15N或15N-MMP-13样品中加入化合物B，随后重新调节pH，制备10∶1的化合物B：MMP-13样品。通过首先向1mM 15N-MMP-13样品中加入1mM化合物A，随后加入10mM化合物B，制备用于研究化合物B和化合物A之间竞争性抑制的潜能的样品。通过向含有0.1mM化合物A的缓冲液中缓冲液交换15N-MMP-13，随后再次缓冲液交换除去过量的化合物A，制备初始MMP-13：化合物A样品。最后，向1mM 15N-MMP-13：化合物A样品中加入10mM化合物B，随后重新调节pH。
NMR数据采集：利用梯度提高的三重共振1H/13C/15N探头，用Bruker AMX-2 600分光计在35℃下记录所有波谱。对于在H2O中记录的波谱，用WATERGATE序列和水翻转脉冲实现水的抑制(Piotto等人，J.Biomol.NMR 1992；Grzesiek和Bax，J.Am.Chem.Soc.1993)。间接检测的维度的正交检波以States-TPPI超复数相位增长记录(Marion等人，J.Magn.Reson.1989)。以适当的重聚延迟采集波谱，以进行0，0或-90，180相位校正。
MMP-1：化合物A复合物中化合物A的共振归属和结合构象是基于2D12C/12C-滤波的NOESY(Petros等人，FEBS Lett.1992；Gemmecker等人，J.Magn.Reson.1992)、2D 12C/12C-滤波的TOCSY(Petros等人，FEBS Lett.1992；Gemmecker等人，J.Magn.Reson.1992)和12C/12C-滤波的COSY实验(Ikura和Bax，J.Magn.Reson.1992)。
MMP-13：化合物B复合物中MMP-13的1H、15N和13C共振归属是基于以前MMP-13：化合物A复合物的归属，结合最少一组实验：2D1H-15N HSQC、3D 15N-编码的NOESY(Marjon等人，Biochemistry 1989；Zuiderweg和Fesik，Biochemistry 1989)、CBCA(CO)NH(Grzesiek和Bax，J.Am.Chem.Soc.1992)、C(CO)NH(Grzesiek等人，J.Magn.Reson.，Ser. B 1993)、HNHA(Vuister和Bax，J.Am.Chem.Soc.1993)和HNCA(Kay等人，J.Magn.Reson.1993)。在确定MMP-13：化合物B复合物溶液结构中使用的每次实验的采样参数，如以前所报道(Moy等人，Biochemistry 1998)。
MMP-13：化合物B的结构是基于由下列实验观察到的NOE：3D15N-NOESY(Marion等人，Biochemistry 1989；Zuiderweg和Fesik，Biochemistry 1989)和3D13C-编辑/12C-滤波的NOESY(Vuister和Bax，J.Am.Chem.Soc.1993；Lee等人，FEBS Lett.1994)实验。分别以100msec和110msec混合时间采集3D 15N-编辑的NOESY和3D 13C-编辑/12C-滤波的NOESY实验。
分子分析和设计：与MMP-13复合的化合物B和化合物D的最小化模型如前所述制备(Chen等人，J.Biomol.Struct.Dyn.1995；Chen等人，Biochemistry(印刷中)1998)。利用分子动态法(Sybyl v6.4，来自Tripos Inc)，距化合物B5_之内的蛋白质区与抑制剂一起采样，而在模拟中其余部分保持刚性。在能量会聚集(convergence)后，平均最后100皮秒运动的最后50个坐标系(Frames)，对平均结构进行最终的最小化。最终的蛋白质-化合物B模型似乎具有可能的最佳极性和范德华相互作用。对MMP-13与化合物D的复合物施行相同的方法。由于两种复合物使用相同的MMP-13结构，重叠蛋白质，来描述两种抑制剂在活性部位内的位置。对抑制剂的图形分析显示，含有2HB1/2质子的化合物B的亚甲基碳(图6)与化合物D的甲氧基碳相同地重叠。此分析表明了连接苯并呋喃部分与化合物D的甲氧基区的最佳或最小连接长度。杂种抑制剂的最终设计方案显示于图8A中。MMP-9的同源性模型利用COMPOSER程序(Tripos Inc，Sybyl v6.4)构建。
高通量筛选分析：化合物B确定为MMP-13高通量筛选(HTS)分析的先导。根据抑制MMP-13酶活性的能力，总共筛选了58079种化合物，其中385种化合物在10μg/ml剂量时显示40％抑制。化合物B对MMP-13显示弱抑制(10μg/ml时89％)，但更令人感兴趣的是观察到对其它MMP(MMP-1、MMP-9和TACE)的活性完全缺乏。图6显示了按照质子命名惯例的化合物B的一级结构。
得到的HTS拟合进一步通过聚簇分析检查。根据结构类似性将这些拟合聚簇，将这些化合物的性质与一组口服药物的性质相比较。用于分布HTS拟合的性质包括：非氢原子的总数、杂原子数、氢键供体和受体数、计算的logP和分子量。这种分布(profile)分析提供了一种初始方法，用于预测HTS拟合具有类似药物的特性(如生物利用性和体内稳定性)的可能性。化合物B的分布表明，该化合物具有类似于口服药物的性质，提示它将是优化酶效能和选择性的理想候选剂。
已知MMP抑制剂结构的一个共同特征是存在Zn螯合剂，它在活性中起基本作用。在大多数情况下，由于在小分子结构中存在氧肟酸而发生Zn螯合。从化合物B的结构看出，该化合物不含明显的可螯合Zn的取代基。因此，化合物B的独特结构提示MMP-13的一种可能的新型抑制机制，这进一步加强了选择化合物B作为先导候选剂。因此，确定化合物B作为优化活性和选择性的候选剂是基于以下三个特别发现：其固有的MMP-13选择性，其类似于已知生物可用药物的结构分布图，最后是明显的新型结构。
MMP-13：化合物B复合物的NMR结构：NMR结合研究提供了属于化合物B抑制MMP-13的机制的关键信息和设计提高效能的方法。当由HTS确定化合物B时，存在的主要问题是未知的MMP-13结合部位，和诱导MMP-13抑制的方法。以前对与化合物A复合的MMP-13和与CGS-27023A复合的MMP-1的NMR结构的研究提供了用于分析与MMP-13结合的化合物B的框架和方法(Moy等人，Biochemistry已提交1999；Moy等人，Biochemistry 1999)。
最初根据1H-15N HSQC谱的化学位移微扰确定化合物B MMP-13结合部位。将观察到的微扰在GRASP表面(未显示)上作图。显然，化合物B对MMP-13的化学位移的主要作用在S1’袋附近发生，提示化合物B加入该袋中。根据MMP-13的NMR和X-射线结构，确定MMP-13的S1’袋极深，为线状，几乎到达蛋白质表面。实际上，MMP-13表面靠近S1’袋底部的许多残基在化合物B存在下显示明显的化学位移微扰。由于化合物B是一种线性分子，停靠研究将延伸的抑制剂置于MMP-13的整个线性S1’袋中。剩下的唯一问题是，是将化合物B的吗啉或苯并呋喃部分置于该袋的一端，邻近催化性锌，还是置于相对端，远离锌原子。对酶S1’袋的性质分析说明，与锌相邻的一端是相对极性的，而相反的一端是疏水性的。该分析使我们将含有吗啉环的化合物B停靠于催化性锌原子附近，苯并呋喃部分位于S1’袋底部由L1l5、L136、F149和P152形成的疏水袋中。为了进一步证实所提出的化合物B在MMP-13 S1’袋中的结合，用化合物A进行简单的竞争实验。在化合物A存在下采集MMP-13：化合物B的1H-15N HSQC实验。化合物A的存在替换了所有的化合物B，1H-15N HSQC谱的明显不同证实了这一点，这进一步提示两种化合物都结合于S1’袋中。
由3D 13C-编辑/12C-滤波的NOESY实验，观察化合物B与MMP-13之间的分子间NOE，进一步证实化合物B与MMP-13的相对方向和结合。在10倍过量化合物B存在下采集NOESY谱，因为化合物B与MMP-13有弱亲和力。但是，在化合物B与L81、L115、V116、Y141、T142和Y143之间总共发现16个NOE，这支持了化合物B开始定位于MMP-13 S1’袋中。来自3D 13C-编辑/12C-滤波的NOESY实验的扩展2D平面(未显示)证实了在化合物B苯并呋喃基团共振与邻近吗啉环和L82δ的L115δ和化合物B共振之间的一些关键分子间NOE的例子。用NMR结果作为制约，对化合物B与MMP-13的复合物进行能量精化(Moy等人，Biochemistry 1999；Chen等人，J.Biomol.Struct.Dyn.1995)。模建结果描述了吗啉氧与Leu-82的主链酰胺基形成氢键，苯并呋喃基团深深堆积(packs)于S1’袋中，肽键接头部分与蛋白质主链基团形成氢键。该复合物显示在抑制剂和催化性锌之间没有明显的相互作用，证实了配体的微摩尔效能。
MMP-1、MMP-9和MMP-13的结构：用MMP-1和MMP-13的最新NMR溶液结构作为分子模建和分析的起点(Moy等人，Biochemistry已提交1999；Moy等人，Biochemistry 1998；Moy等人，Biochemistry1999)。MMP-9的同源性模型根据它与MMP-1的强烈同源性建立(在催化域周围有54％同一性)。根据此同源性模型，MMP-9的催化性部位与MMP-1和MMP-13中的相应部位相似。所有这三种结构均用作分析和合成设计的起点。
MMP结构的对比分析显示，除了特异性环的长度以外，残基位点115和144也决定S1’袋的大小和形状。MMP-1与MMP-13 NMR结构的比对显示，MMP-13在特异性环中含有另外两个插入。MMP-9的同源性模型没有另外的插入，所以，它的长度与MMP-1相同。
残基位点115和144在确定MMP的S1’袋相对长度时至关重要，这些位点处的侧链越长，S1’袋越小。因为残基115在空间上比残基144更接近催化性锌，与残基144相比，残基115的侧链越长，对限定较小S1’袋的影响越大。MMP-1在115位点有最长的侧链，因此它的S1’袋最小。MMP-9在144位点有一个Arg，因此它的S1’袋比MMP-1要长。相反，MMP-13在115和144位点有短侧链。短侧链加之延长的特异性环长度，使MMP-13具有最大的S1’袋。总之，MMP S1’袋的大小如下：MMP-13＞MMP-9＞MMP-1，其中这一结构特征在发展特异性强MMP-13抑制剂的设计策略中起关键作用。
设计策略：一种使用NMR和分子模建的策略用于设计和合成MMP-13选择性抑制剂先导。该设计策略的基本方法是优化化学先导化合物B的亲和力，而保持其固有的MMP-13选择性。这能利用MMP-13的明显结构特征——较深的线性S1’袋，而将化合物B的结构特征与其它强抑制剂重叠实现。化合物C是MMP-9和MMP13的选择性强抑制剂的一个例子(见表2)。根据与化合物A复合的MMP-13的NMR溶液结构(图4)，结构相似的抑制剂定位于MMP-13的活性部位中。
图7显示化合物C的关键区，它们能分解为两个成分：代表该化合物的锌螯合部分、有助于结合效能的化合物D，和有助于提高配体对MMP-1选择性的甲苯基(1A)。该策略将设计一种新的抑制剂，这基于将甲苯基(1A)替换为对于结合于MMP-13的延伸S1’袋内必不可少的化合物B的一种成分。化合物B的NMR溶液结构与化合物D的模型的重叠显示于图8B中。两种结构的定位的密切相似性使得可能产生两种结构的杂合体，它将有效的化合物D与化合物B的选择性成分结合(图8A)。这些结果然后用于设计提出的杂种抑制剂化合物E。表2中的试验数据清楚地显示，新抑制剂化合物E除了对MMP-13的选择性提高外，还具有比化合物C更好的效能。因此，NMR波谱学与分子模建技术的组合导致设计出一种新型、有效和选择性的MMP-13抑制剂(化合物E)，它对MMP-13的IC50为17nM，对MMP-1、MMP-9和TACE分别显示＞5800、56和＞500倍的选择性。就我们所知，这是显示MMP-9选择性的强MMP-13抑制剂的第一个例子。
表2-IC50和选择性数据
| 化合物 | MMP-1 | MMP-9 | MMP-13 | TACE | S-1a | S-9a | S-TACEa |
| C | 750nM | 46nM | 75nM | 470nM | 10.0× | 0.6× | 6.3× |
| D | 82nM | 21nM | 15nM | 240nM | 5.5× | 1.4× | 16× |
| E | NA | 945nM | 17nM | 19％ | ＞5800× | 56× | ＞500× |
| F | 1025nM | 71nM | 301nM | 664nM | 3.4× | O.2× | 2.2× |
| a选择性数据表示为MMP或TACE IC50与MMP-13之比 | |||||||
实施例4
MMP-13：化合物A复合物的X-射线晶体结构用下列方法测定：
基因/表达系统/生产：编码人MMP-13酶原的cDNA含有PRO域的85个残基，随后是催化域(CAT)的165个残基。该基因携带于pET-21a表达质粒上，在噬菌体T7启动子控制之下。表达宿主是大肠杆菌BL21(DE3)，它含有在lac控制下的T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。细胞在营养培养液中生长，PRO-CAT的合成由异丙基-β-硫代半乳糖苷诱导。蛋白质积累到总细胞蛋白质的5-10％，基本上全部聚集为包涵体。
对于可能的MAD实验，将该质粒转移到甲硫氨酸营养缺陷型宿主中。在用硒基甲硫氨酸代替甲硫氨酸的合成培养基中诱导生产含有硒基甲硫氨酸置换的PRO-CAT。
PRO-CAT的纯化和重折叠：机械破坏冷冻的细胞，离心分离包涵体。PRO-CAT用含二硫苏糖醇(用于破坏所有二硫键)的尿素溶解。在QSepharose上使用尿素经阴离子交换层析部分纯化PRO-CAT。蛋白质用tricine-HCl缓冲的氯化钠、氯化钙和乙酸锌溶液稀释为约400μg/ml。在透析过程中，多次更换缓冲液，重折叠继续3-4天。然后浓缩PRO-CAT，活化并释放CAT。
PRO-CAT的活化：当前公认的对MMP的观点认为，PRO域的一个半胱氨酸配位到活性部位的锌中，酶原形式保持灭活状态。如果该半胱氨酸被取代，该酶成为活性的。在我们的方案中，向蛋白质溶液中加入氨苯基乙酸汞，形成半胱氨酸与汞的加合物。利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳监测活化的进度。结果表明，CAT域积累，PRO域降解为小肽。
MMP-13(CAT)的纯化——大小排阻：在活化和PRO切割后，通过SuperDex75，用tris-HCl缓冲的氯化钠、氯化钙和乙酸锌溶液经大小排阻层析分离MMP-13。
MMP-13的纯化——亲和层析：MMP-13通过亲和层析用固定氧肟酸抑制剂进一步纯化。氧肟酸抑制剂通过哌嗪环的氨基与Sepharose偶联，制备亲和基质。MMP-13能吸附到该基质上，并通过更换为所选的另一种抑制剂解吸。
MMP-13的表征：结晶试验的蛋白质制品用几种技术验证。常规的是，SDS-PAGE显示迁移符合约19000的分子量的优势种。MALDITOF质谱法证实符合18588amu预期大小的单一种。(用硒基甲硫氨酸制备的MMP-13显示基本上完全的置换)。N端测序证实，蛋白质开始于YNVF，如PRO与CAT之间正确切割所预期的。分析型大小排阻层析中的保留体积符合单体蛋白质：未观察到可检测到的聚集。终蛋白质对荧光肽底物具有酶促活性，并降解变性的胶原。
MMP-13与化合物A的复合物的结晶：MMP-13蛋白溶液用10mMtris-HCl缓冲液，pH7.5和0.25M NaCl缓冲。用于结晶的蛋白质浓度为20.0mg/ml。以1∶2的摩尔比(蛋白质：抑制剂)向蛋白质溶液中加入抑制剂溶液，混合1小时以上。
用悬滴蒸汽扩散法筛选结晶条件(Mcpherson，A.，Methods Biochem.Anal.1976)。确定了一种在室温下形成该复合物的晶体的成功方法，并获得晶体。具体而言，由3μl蛋白质溶液和3μl沉淀剂溶液(由26％PEG4000、0.1M硫酸铵和0.1M氯化钠组成)制备一种溶液。该溶液的液滴悬浮于显微镜盖玻片上，用硅酮覆盖防止液滴扩散。储存溶液包含0.6ml沉淀剂溶液。在室温下通过蒸汽扩散进行平衡。3天后开始出现晶体。2周后，这些晶体停止生长。处理后的X-射线数据显示，MMP-13复合物以两种形式结晶。一种晶体形式是以C为中心的斜方晶；它属于空间群C2221，晶胞大小为a＝36.3_，b＝134.4_，c＝134.8_。该晶体为高度镶嵌性；因此，在研究该复合物结构时几乎没有用途。第二种晶体形式是粗(primitive)斜方晶，来自空间群P21212，晶胞常数为a＝108.3_，b＝79.8_，c＝36.1_。该晶体镶嵌性较低，但在大多数情况下极小。
为了获得大的单晶以进行X-射线数据采集，应用引晶技术(Thaller，C.等人，J.Mol.Biol.1981)。这通过微引晶和大引晶法实现。将小种晶转移到抑制玻片上的20％PEG4000沉淀剂溶液中。将洗涤的单晶注射到由3μl MMP-13复合物溶液和3μl沉淀剂溶液组成的悬滴溶液中。储存溶液包含pH8.0的0.6ml沉淀剂溶液。该方法成功生产了最大边长可达0.35×0.1×0.1mm3的较大晶体。这些晶体以2.0_的分辨率衍射X-射线。
X-射线数据采集：分辨率为30.0-2.0_的MMP-13：化合物A复合物晶体(P21212形式)的X-射线衍射数据用RAXIS IIc图像板区域检波器采集，该仪器使用在100K低温下由Rigaku RU200旋转阳极发生器(在50kV，100mA下运行)发出的石墨单频CuKα射线。每个板的振角为1度，暴露时间为每个“图像”20分钟。X-射线数据的处理用HKL程序实现(Otwinowski，Z.和Minor，W.，Methods in Enzymology276：307-26)。全部或部分反射的R-吸收分别为4.0％和6.04％。采集18782个单反射(以2.0的分辨率，全部的81％)。
结构确定和精化：使用由MMP-1和MMP-8结构产生的MMP-13模型，组合使用结晶模建和分子置换法，确定MMP-13复合物的晶体结构。MMP-13与MMP-8之间的同源性在序列上为56％，在结构上至少70％。MMP-13复合物的晶体在不对称单元中有两个分子，即该单元是二聚体。常规分子置换不能利用单体模型有效地确定二聚体结构。这有两个原因：(1)晶体结构的高度对称性；(2)MMP-13和MMP-8的柔性环中侧链和主链的构象和构型。
首先，MMP-13复合物的晶体结构高度对称。P21212晶体具有4个对称操作，在一个晶胞中有8个分子。确定了第二种晶体形式，它属于C222空间群，在一个晶胞中有8个对称操作。对于这种晶体，二聚体结构中每个晶胞有16个单体，四聚体结构中每个晶胞有32个单体。因此，旋转搜索和特殊平移搜索将更加困难。其次，尽管MMP家族的催化域结构高度保守，MMP-13和MMP-8的柔性环中侧链和主链的构象和构型可能不同。特别是，两种结构之间的相似性可能足以用单体作为搜索模型确定二聚体结构。
使用X-射线数据和MMP-8单体或MMP-1二聚体模型进行了旋转和平移搜索的许多工作。获得了一些旋转溶液，但使用单体模型未发现最终平移溶液。因此，为了确定该结构，建议首先构建二聚体模型，然后用分子置换法解析该结构。
这一建议的关键点在于晶体包装。为了构建二聚体，根据旋转搜索确定每个单体的方向。根据晶胞中的分子包装，定位每个单体的位置。已经构建了许多二聚体模型，并且作为“模型”，用于利用程序AMORE(合作计算计划，第4号(CCP4)(1994)，Acta Cryst.D50：760-763)搜索旋转和平移。发现一个二聚体模型是正确的，最终用分子置换法获得MMP-13 3D晶体结构。由于观察到最重要和最有意义的事实一一能从具有5个sigma切口的差异(Fo-Fc)图谱确定两个锌离子和两钙离子的位置，其中Fo是不含锌和钙原子的二聚体模型的观察到的结构因子，Fc是计算的结构因子，证实了MMP-13复合物的结构。
这些离子位于在其它MMP家族成员中观察到的确切位置。该分子极好地拟合主链和侧链中的(2Fo-Fc)电子密度。该分子极好地拟合2Fo-Fc电子密度。所有这些MMP分子在核心结构区保守，特别是中心螺旋和催化性锌位置。使用分子置换程序XPLOR(Brunger，A.T.，XPLOR 3.1版手册，耶鲁大学，New Haven CT)和MERLOT(Fitzgerald，P..MERLOT 2.4版(1991年11月10日))进一步证实MMP-13二聚体结构。它们都运行极好，产生与MMP-13结构一致的结果。
结构精化：用程序XPLOR进行结构的精化。初始二聚体模型包括不含锌和钙离子的320个氨基酸残基。用在100K温度下用RAXIS IIc区域检波器采集的2.0_ X-射线数据精化该二聚体模型。由蛋白质分子构象和电子密度图的质量和结晶R因子的值评价精化的进度。初始R因子为52％。在刚体最小化、共轭梯度最小化、加热阶段、4000K-300K的慢冷却阶段、能量最小化、B因子精化和位置精化后，R因子降为0.32。计算系数为(2Fo-Fc)和(Fo-Fc)的电子密度图以及相位。差异图显示在具有5个sigma切口的二聚体结构中含有4个锌离子和4个钙离子。在交互图形系统上重建某些侧链环和少数主环。精化重建的含锌和钙离子的二聚体，作为新模型。R因子降至26.6％。在此阶段，根据差异电子密度，抑制剂化合物A的模型位于活性部位区中。
将R因子降至20％，重复以上步骤，精化复合物的结构。水分子模建为氧原子。通过搜索(Fo-Fc)差异图中的峰，定位它们的最初位置。然后计算“水”与蛋白质的氧和氮的距离，核实这些位置。连同蛋白质(复合物)原子，这些“水”分子用X-射线数据精化。在水的温度因子高于50后，水被忽略。发现有120个水分子靠近蛋白质，在每个单体的活性部位中有5个水分子。(2Fo-Fc)图用于调节溶剂模型并帮助定位新的溶剂分子，以及核实和校正整个模型。对于理想几何形状的键角和键距，Cα原子的根均方差为1.6°和0.012_。在2.0_的分辨率下，终结晶R因子为22％。
上述所有公开文本，无论是公开的专利、未决的申请、发表的文章、蛋白质结构保藏还是其它的，都在此完整引用作为参考。尽管为了便于理解前面已经详述了本发明，但本领域技术人员应当理解，能在不背离附加权利要求书的真正范围的情况下，进行形式和细节上的多种改变。
Claims (32)
1.一种溶液，其含有与N-羟基-2-[(4-甲氧基-苯磺酰基)-吡啶-3-基甲基-氨基]-3-甲基-苯甲酰胺(“化合物A”)复合的人胶原酶3(MMP-13)的生物活性催化片段。
2.权利要求1的溶液，其中MMP-13的催化片段含有图1的氨基酸残基。
3.权利要求2的溶液，其含有在一种缓冲液中与化合物A以1∶1摩尔比复合的1mM MMP-13，该缓冲液在90％H2O/10％D2O或100％D2O中含有10mM氘代Tris碱、100nM NaCl、5mM CaCl2、0.1mMZnCl2、2mM NaN3和10mM氘代DTT。
4.权利要求3的溶液，其中MMP-13富含15N或富含15N、13C。
5.权利要求1的溶液，其中MMP-13的催化片段的二级结构含有3个α螺旋和1个含5条β链的混合平行及反平行β折叠。
6.权利要求5的溶液，其中α螺旋和β链以βI、αA、βII、βIII、βIV、βV、αB和αC的顺序排列。
7.权利要求6的溶液，其中3个α螺旋对应于图1的残基28-44(αA)、112-123(αB)和153-163(αC)，5条β链对应于图1的残基83-86(βI)、95-100(βII)、59-66(βIII)、14-20(βIV)和49-53(βV)。
8.与N-羟基-2-[(4-甲氧基-苯磺酰基)-吡啶-3-基甲基-氨基]-3-甲基-苯甲酰胺(“化合物A”)复合的结晶的MMP-13催化片段。
9.权利要求8的结晶复合物，其中MMP-13的催化片段含有图1的氨基酸残基。
10-权利要求9的结晶复合物，其被表征为含有空间群P21212的斜方晶形式，晶胞参数为a＝108.3_，b＝79.8_，c＝36.1_。
11.权利要求10的结晶复合物，其还被表征为在不对称单元中含有两个MMP-13：化合物A复合物分子。
12.权利要求11的结晶复合物，其中MMP-13的催化片段的二级结构含有3个α螺旋和1个含5条β链的混合平行及反平行β折叠。
13.权利要求12的结晶复合物，其中α螺旋和β链以βI、αA、βII、βIII、βIV、βV、αB和αC的顺序排列。
14.权利要求13的结晶复合物，其中3个α螺旋对应于图1的残基28-44(αA)、112-123(αB)和153-163(αC)，5条β链对应于图1的残基83-86(βI)、95-100(βII)、59-66(βIII)、14-20(βIV)和49-53(βV)。
15.MMP-13的一个活性部位，其特征在于一个催化性锌、一条β链、一个Ca2+结合环、一条α螺旋和一个随机卷曲区。
16.权利要求15的活性部位，其中β链含有根据图1的残基N14、L15、T16、Y17、R18、119和V20，Ca2+结合环含有根据图1的残基F75、D76、G77、P78和S79，α螺旋含有根据图1的残基N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122和H123，随机卷曲区含有根据图1的残基P139、I140和Y141。
17.权利要求16的活性部位，所述活性部位具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基N14、L15、T16、Y17、R18、I19、V20、F75、D76、G77、P78、S79、N112、L113、F114、L115、V116、A117、A118、H119、E120、F121、G122、H123、P139、I140和Y141的相对结构坐标，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_。
18.权利要求17的活性部位，所述活性部位具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的氨基酸残基G80、L81、L82、A83、H84、A85、K109、G110、Y111、S124、L125、G126、L127、D128、H129、S130、K131、D132、P133、G134、A135、L136、M137、F138、T142、Y143、T144和G145的相对结构坐标，在所有情况下，±该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_。
19.权利要求18的活性部位，其进一步具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的氨基酸残基F149和P152的相对结构坐标，在所有情况下，±该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_。
20.MMP-13的一个活性部位，其具有分别根据图4或图5的溶液或晶体坐标的催化性锌与氨基酸残基L81、L82、L115、V116、H119、L136和I140的相对结构坐标，在所有情况下，±催化性锌与该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_。
21.一种鉴定可能的MMP-13抑制剂或激活剂的方法，包括：
(a)应用MMP-13的三维结构，它由根据图4或图5的编码MMP-13的氨基酸的相对结构坐标定义，±该氨基酸的保守主链原子的一个均方根差，其不超过1.5_。
(b)使用这种三维结构设计或选择可能的抑制剂或激活剂；和
(c)合成或获得这种可能的抑制剂或激活剂。
22.根据权利要求21的方法，其中从头设计这种可能的抑制剂。
23.根据权利要求21的方法，其中根据一种已知的抑制剂设计这种可能的抑制剂。
24.权利要求22的方法，其进一步包括以下步骤：在底物存在下使可能的抑制剂接触MMP-13，确定这种可能的抑制剂抑制MMP-13的能力。
25.权利要求23的方法，其进一步包括以下步骤：在底物存在下使可能的抑制剂接触MMP-13，确定这种可能的抑制剂抑制MMP-13的能力。
26.根据权利要求21的方法，其中使用三维结构设计或选择可能的抑制剂的步骤包括下列步骤：
(a)鉴定能与MMP-13结合的化学个体或片段；和
(b)将鉴定的化学个体或片段装配为一个分子，产生可能的抑制剂的结构。
27.根据权利要求26的方法，其中从头设计这种可能的抑制剂。
28.根据权利要求26的方法，其中根据一种已知的抑制剂设计这种可能的抑制剂。
29.权利要求27的方法，它还包括以下步骤：在底物存在下使这种可能的抑制剂接触MMP-13，确定这种可能的抑制剂抑制MMP-13的能力。
30.权利要求28的方法，它还包括以下步骤：在底物存在下使这种可能的抑制剂接触MMP-13，确定这种可能的抑制剂抑制MMP-13的能力。
31.利用权利要求21的方法鉴定或设计的一种抑制剂。
32.利用权利要求26的方法鉴定或设计的一种抑制剂。
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