CN1421442A - 从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法。首先用90～99％乙醇或甲醇多次室温浸提絮凝物，乙醇或甲醇的提取物或将其进一步用二氯甲烷萃取所得产物，先后进行常压硅胶柱层析和薄层硅胶低压柱层析，柱层析所得紫杉醇用乙酸乙酯和正已烷或丙酮和正己烷混合溶剂多次重结晶，紫杉醇纯度达98.1％。由于红豆杉植物细胞培养液絮凝物体积相对细胞培养液体积小得多，却富集了细胞培养液中95～100％的紫杉醇，所以，从絮凝物中提取紫杉醇要比从细胞培养液中直接提取紫杉醇节省了大量有机溶剂、简化了分离过程、降低了成本、节省了提取紫杉醇的时间。
Description
本发明涉及一种从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法。即滤除红豆杉植物细胞培养物中的细胞后所得到的溶液，经絮凝及过滤得到固形絮凝物，再从固形絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法。
紫杉醇是从天然红豆杉植物中分离鉴定的一种二萜生物碱，临床上用于治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌等癌症，疗效良好，毒副作用小，是一种新型的天然源抗癌药。由于医用的需求不断增加，而其天然植物资源量却极为有限，且为国家保护植物，其价格居高不下，每克高达2000元人民币，所以寻求紫杉醇的新来源已成为医学、药学、生物学、化学界关注的热点。目前，利用红豆杉植物细胞培养技术合成紫杉醇的研究倍受关注，并取得了较好的成效。在此研究中，我们在对红豆杉植物细胞培养物中紫杉醇进行初分离时，针对红豆杉植物细胞合成的紫杉醇分泌到培养液中的特点，曾发明了絮凝方法来初分离红豆杉植物细胞培养液中的紫杉醇，已申请中国专利(申请号00122083.7)。利用该方法能够简便、快速地将红豆杉植物培养液中95～100％的紫杉醇富集到絮凝物中，经过滤将富含紫杉醇的固形絮凝物从细胞培养液中分离出来，同时，大部分不被絮凝的杂质留在滤液中而与紫杉醇分离，实现了紫杉醇的初分离。但絮凝物中尚含某些杂质，如要获得高纯度的紫杉醇，必须对红豆杉植物细胞培养液絮凝物中的紫杉醇进一步分离纯化。经对大量有关专利和文献检索，至今未见到国内外有从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的报导。
本发明的目的就是提供一种从含紫杉醇的红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法。即通过使用有机溶剂提取、硅胶柱层析、重结晶等技术从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法。
本发明可由如下方式来实现：将红豆杉植物细胞培养液絮凝物用90～99％乙醇或甲醇在搅拌下室温浸提4～5次，每次浸提20～24小时，过滤，合并提取液，在减压下，用旋转蒸发器回收乙醇或甲醇，真空度-0.08Mpa或-0.06MPa，水浴温度60～65℃或50～55℃；所得流浸膏与柱层析硅胶(100～200目)混合，搅拌均匀，在50℃真空下干燥，磨碎，过100目筛，进行硅胶柱层析，用含5％～30％丙酮的正己烷进行梯度洗脱，紫杉醇在含20～30％丙酮的正乙烷洗脱下来，减压下回收洗脱溶剂，用硅胶HF254薄层层析追踪检测洗脱物中的紫杉醇，含紫杉醇相同成份的洗脱物合并，挥干溶剂，取样，HPLC检测，紫杉醇纯度达70％～80％，回收率达89％～93％；将该紫杉醇粗品进一步用薄层层析硅胶H(10～40μm)低压柱层析纯化，用含3％～5％丙酮的二氯甲烷梯度洗脱，减压回收洗脱溶剂，用薄层层析检查紫杉醇，含紫杉醇洗脱物合并，挥干溶剂，取样，HPLC检测，紫杉醇纯度达90％～92％，回收率达90％～95％；用乙酸乙酯和正己烷体积比为(1.6∶1)或丙酮和正己烷体积比为(1∶1.7)混合溶剂重结晶，HPLC检测得到纯度为98.1％的紫杉醇。红豆杉植物细胞培养液絮凝物是中国红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉或南方红豆杉细胞培养液的絮凝物。
由于红豆杉植物细胞培养液絮凝物体积相对细胞培养液体积小得多，却富集了细胞培养液中95～100％的紫杉醇，所以从絮凝物中提取紫杉醇要比从细胞培养液中直接提取紫杉醇节省大量有机溶剂，且简化分离程序、降低成本、缩短了提取紫杉醇的时间。
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述。
实施例使用的分析纯试剂有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、石油醚(广州化学试剂二厂生产)。色谱纯试剂有：甲醇、乙腈(进口分装)、丙酮(天津四友生物医学技术有限公司生产)。高压液相色谱仪由美国Waters公司生产。柱层析硅胶(100～200目)、薄层层析硅胶H(10～40μm)、薄层层析硅胶HF254(10～40μm)(青岛海洋化工集团公司生产)。
实施例一
取中国红豆杉细胞培养液的絮凝物267g(未干燥)，其中含紫杉醇210mg(HPLC测定)，(细胞培养液絮凝物的获得方法参考中国专利“从红豆杉植物细胞培养液中初分离紫杉醇的方法”，申请号00122083.7)，用95％食用乙醇室温浸提4次，每次20小时，浸提过程中定时搅拌，乙醇添加量以浸没絮凝物并高出絮凝物3～4厘米为宜。每次浸提物用布氏漏斗减压抽滤，各次滤液合并，在63℃水浴，-0.08Mpa的真空度用旋转蒸发器回收乙醇至流浸膏，趁热拌50g柱层析硅胶(100～200目)，50℃下真空干燥、磨碎、过100目筛，在100cm×3cm的玻璃层析柱中用正己烷湿法装入柱层析硅胶，高度60cm，用正己烷平衡后，在硅胶顶部均匀装填拌入样品的硅胶，用含丙酮5％、15％、20％、25％、30％的正己烷梯度洗脱，在20％～30％丙酮的正己烷梯度洗脱部分，紫杉醇被洗脱下来，回收溶剂后，用HF254硅胶薄板层析检查，标样对照，展开剂为正己烷∶乙酸乙酯体积比为2∶3。含紫杉醇的洗脱部分合并，回收溶剂至干，共得固体物268.7mg，定容后，用HPLC测紫杉醇含量为195.2mg，紫杉醇纯度72.6％，回收率为93％。含紫杉醇固体物用丙酮溶解后，拌入5g薄层层析硅胶H(10～40μm)，45℃下真空干燥、磨碎。在60cm×3cm的低压玻璃层析柱中用正己烷湿法均匀装填薄层层析硅胶H(10～40μm)30cm，待正己烷平衡后，将拌有样品的薄层硅胶均匀装入硅胶顶部，用3.5W小型气泵加压，用正己烷洗脱后，再先后用含3％丙酮、4％丙酮、5％丙酮的二氯甲烷梯度洗脱，回收溶剂，用硅胶HF254薄板层析检查，标样对照，展开剂同上。合并含紫杉醇的部分，回收溶剂至干，重206mg，HPLC测紫杉醇含量为185.5mg，紫杉醇纯度90％，回收率95％，将回收溶剂后的固体紫杉醇在乙酸乙酯和正己烷混合溶剂重结晶6次，乙酸乙酯与正己烷体积比为(1.6∶1)，HPLC检测紫杉醇，重结晶紫杉醇纯度为97.5％。
实施例二
取含278mg紫杉醇的中国红豆杉细胞培养液絮凝物370g，絮凝物在通风厨中用甲醇室温浸提5次，每次浸提24小时，定时搅拌，浸提时，甲醇的加入量以浸没絮凝物且高出絮凝物3～4厘米为宜。浸提完成后，用布氏漏斗减压抽滤，各次滤液合并，在-0.06Mpa的真空度下，用旋转蒸发器回收甲醇，水浴温度53℃，浓缩物用甲醇溶解，在搅拌下加入等量水，搅拌均匀后，先用30℃～60℃石油醚萃取4次，去脂溶性杂质，接着用二氯甲烷萃取4次，回收二氯甲烷至少量，加入柱层析硅胶15g(100～200目)，搅拌均匀，在50℃真空下烘干、磨碎，过100目筛，进行硅胶柱层析，梯度洗脱过程与实施例一相同。含紫杉醇的柱层析产物317.2mg，用HPLC检测，含紫杉醇247.4mg，回收率89％，紫杉醇纯度78％。将经柱层析后的紫杉醇粗品进一步用薄层硅胶H(10-40μm)低压柱层析分离，含紫杉醇的低压柱层析产物回收溶剂至干重245mg，用HPLC检测，含紫杉醇225mg，回收率90％，紫杉醇纯度92％，用丙酮和正己烷混合溶剂重结晶8次，丙酮与正己烷体积比为1∶1.7，重结晶的紫杉醇用HPLC检测，紫杉醇纯度98.1％。
Claims (4)
1、一种从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法，其特征在于：
(1)紫杉醇的红豆杉植物细胞培养液絮凝物用90～99％乙醇或甲醇室温浸提4～5次，每次浸提20～24小时，定时搅拌，减压抽滤，滤液合并减压回收乙醇或甲醇得流浸膏；
(2)乙醇或甲醇提取得到的流浸膏直接进行硅胶柱层析，用正己烷洗脱除脂溶性杂质，用含5％～30％丙酮的正己烷梯度洗脱；
(3)常压硅胶柱层析所得紫杉醇粗品，用薄层层析硅胶H(10～40μm)装填的低压柱层析，含3％-5％丙酮的二氯甲烷梯度洗脱紫杉醇；
(4)低压柱层析所得紫杉醇用乙酸乙酯和正己烷混合溶剂(体积比为1.6∶1)进行重结晶。
2、依权利要求1所述的从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法，其特征在于乙醇或甲醇提取得到的流浸膏用等量甲醇和水溶解，用石油醚和二氯甲烷先后萃取，二氯甲烷萃取物浓缩后，进行硅胶柱层析。
3、依权利要求1所述的从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法，其特征在于低压柱层析所得紫杉醇用丙酮和正乙烷混合溶剂(体积比为1∶1.7)进行重结晶。
4、依权利要求1所述的从红豆杉植物细胞培养液絮凝物中分离纯化紫杉醇的方法，其特征在于红豆杉植物细胞培养液絮凝物是中国红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉或南方红豆杉细胞培养液的絮凝物。
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