CN1408211A - 一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法 - Google Patents
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Abstract
一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法。本发明的技术方案是，一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，对同一品种的植株分别进行以下处理：1)自短日植物出苗起，对其进行短日处理，直至开花；2)自短日植物出苗起，对其进行短日处理8－15天，然后进行长日处理，诱导植株发生顶端花序逆转；3)一直进行长日处理，使植株保持营养生长状态；在上述处理中植株发育的不同阶段，取植物组织，通过基因差异表达分析方法，比较不同发育状态植株中基因表达的差异，筛选、克隆与光周期反应直接相关的基因。本发明可广泛用于短日植物如大豆发育相关基因的克隆和育种材料的多次采种。
Description
技术领域
本发明涉及一种克隆基因的方法，特别是涉及克隆短日植物中与光周期反应相关基因的方法。
背景技术
光周期反应是植物对环境日长变化的主动适应方式。日照长度和自身的光周期反应特性共同影响作物的生长发育过程，决定生育期长短和适应范围。光周期反应一直是作物科学和植物生理学的重要研究领域。光周期现象的发现、研究和应用是20世纪植物科学领域最重大的成就之一。过去的80多年里，几代科学工作者致力于揭示光周期调控植物花芽分化和开花的机制，并取得重要成果。然而，由于光周期现象本身的复杂性和缺少良好的实验材料系统及技术手段，光周期反应的确切生理生化和分子机制一直未能完全阐明，改良作物光周期反应特性和有效调控生长发育进程的研究和实践也因此受到阻碍。
以往对植物光周期反应机制的研究，集中在光周期调控花芽分化和开花的机制方面，主要研究方法是比较短日处理和长日处理的差异。由于光周期导致的生理生化过程多样而复杂，仅通过二者的比较难以确认哪些反应起关键作用。自20世纪60年代起，光周期反应机制研究一直进展缓慢。近年来，由于同源异型基因的发现和分子生物学技术的发展，植物发育生物学的研究重点转向拟南芥菜等模式植物器官发生的分子机制方面。但由于所用模式植物拟南芥菜的光周期反应不甚敏感，且大部分基因型表现长日反应，并非光周期反应机制研究的良好材料，致使光周期反应的分子机制研究一直未能取得突破。
在前人工作的基础上，本发明的发明人对大豆开花后光周期反应进行了系统的研究，发现了大豆的花逆转和花序逆转现象(韩天富等，作物学报，1998，24：168-171)，为进一步系统地研究短日植物光周期现象的规律奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效地克隆短日植物光周期反应相关基因的方法。
本发明的技术方案如下，一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，对同一品种的植株分别进行以下处理；
1)自短日植物出苗起，对其进行短日处理，直至开花；
2)自短日植物出苗起，对其进行短日处理8-15天，然后进行长日处理，诱导植株发生顶端花序逆转；
3)一直进行长日处理，使植株保持营养生长状态；
在上述处理中植株发育的不同阶段，取植物组织，通过基因差异表达分析方法，比较不同发育状态植株中基因表达的差异，筛选、克隆与光周期反应直接相关的基因。
所述第一种处理的植株开花后，进行长日处理，诱导恢复营养生长后，再进行短日处理，可诱导生殖生长，该过程可以循环进行。
所述短日植物是大豆，其中优选的是自贡冬豆，最优选的是自贡冬豆纯系。
第二种处理中，自短日植物出苗起，对其进行短日处理13天效果较好。
所述短日处理是指每天日照10-12.5小时；所述长日处理是指每天日照14小时以上。
用于研究不同发育状态植株中基因表达的差异，筛选、克隆与光周期反应直接相关基因的植物组织是叶片或生长点。
本发明巧妙地将开花逆转现象应用于大豆光周期反应机制研究，建立了以自贡冬豆为试材，短日处理(正常开花)-长日处理(持续营养生长)一短日处理后进行长日处理(开花逆转)三位一体的实验系统，将以往只比较长日和短日两种处理差异的系统，改进为同时比较长日处理、短日处理和开花逆转三者差异的新系统，大大提高了生理生化和分子差异筛选的可靠性。利用这一可靠、高效、简单的方法，借助现代分子生物学技术(如差别显示技术、微阵列技术等)，可分析出大豆光周期诱导过程中发育相关基因的表达模式，克隆大豆光周期反应相关基因，为研究这些基因的表达和调控机制、揭示光周期现象的本质、能动地改良和调控大豆乃至其它作物的开花期、成熟期和生态适应性奠定基础。
用本发明所提供的开花逆转诱导方法，将已开花并开始结实的短日敏感品种置于长日条件下，诱导植株产生整株逆转，产生新的分枝，此类植株的基部有部分荚果可正常成熟。对发生整株逆转的材料再次进行短日处理，可使植株重新开花结实，从而在大豆等短日照敏感植物的繁种过程中实现一次播种、多次采种。可用于果菜类蔬菜的生产和大田作物的快速繁种。
本发明将开花逆转现象引入光周期反应相关基因的克隆，便于排除光周期诱导产生的次要反应，并可排除春化作用的干扰。本发明的方法不仅可研究短日照对生殖发育的促进作用，而且可用于研究长日抑制作用，同时还可用于研究光周期引起的开花时间及花器官结构的变化。
具体实施方式
在本发明所进行的实验中，所用的植物材料是光周期反应十分敏感的大豆〔Glycine max(L.)Merr.)品系自贡冬豆纯系(韩天富等，作物学报，1996，22：20-26)。自贡冬豆纯系，具有基因高度纯合、遗传稳定、光周期反应十分敏感等特点。
除了合理利用太阳光以外，用帆布棚或暗室遮光，白炽灯人工补光来控制照光时间。遮光期间植株顶端光量子通量在0.02-0.03uEs-1m-2以下，补光期间植株顶端光量子通量为28.5-50.1uEs-1m-2，光量子通量测定所用的仪器为美国Li-COR公司的Li-188B型数字式光量子/辐射/光照强度综合测定计。除了光照外，实验期间对植株进行正常的田间管理。
实施例1、苗期光周期信号的接收器官定位
在处理早期，取单叶作为取样器官；单叶衰老发黄后，用展开的功能复叶作为取样器官。研究证明，单叶是苗期光周期信号的接收器官。出苗后，对自贡冬豆幼苗进行13天每天12小时的短日诱导，处理期间去除三出复叶。经13天短日处理的植株，即使以后转移到非诱导条件下也可产生顶端花序，说明对单叶进行光周期诱导即可使植株开始生殖发育，从而将苗期光周期信号的接收器官定位于单叶上；
实施例2、短日处理的最佳时间
常规播种，子叶展开后分组进行5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15天，每天12小时的短日处理，此后移至16小时长日条件下，直至实验结束。18天左右，植株发生顶端花序逆转。其中短日处理13天然后进行长日处理的材料逆转频率最高，达到56.5％。可见，出苗后进行13天短日处理然后进行长日处理，可保证顶端分生组织开始花芽分化，而长日处理又会使花序逆转。
实施例3、营养生长与生殖生长的互相转换
正常播种的自贡冬豆纯系，自子叶展开，每天自然光照12小时，然后用帆布棚遮光12小时，18天植株开花。此后移至16小时长日条件下，21天后，植株发生顶端花序逆转和整体逆转，恢复到营养生长状态。将发生顶端花序逆转和整株逆转的材料置于12小时短日条件下，20天后，植株在逆转过程中新产生的枝条上重新开花、结荚。
实施例4、克隆大豆光周期反应相关基因
一、对同一品种的植株分别进行以下处理
1、短日(SD)处理诱导植株正常开花
正常播种的自贡冬豆纯系，自子叶展开，每天自然光照12小时，然后用帆布棚遮光12小时，18天植株开花。
2、长日(LD)处理使植株保持营养生长状态
正常播种的自贡冬豆纯系，自子叶展开，每天自然光照12小时，然后用帆布棚遮光12小时，13天后，利用自然光照加白炽灯人工补光达到每天16小时光照，21天后，植株发生顶端花序逆转，原有花荚开始大量脱落，着生于植株主茎基部的极少数存留花荚发育迟缓，4周左右，主茎叶腋处产生分枝，逐步恢复到旺盛的营养生长状态。
3、一直进行长日处理，使植株保持营养生长状态
正常播种的自贡冬豆纯系，自子叶展开，每天利用自然光照加白炽灯人工补光达到每天16小时光照，使植株保持营养生长状态。
4、大豆光周期反应基因的克隆
a)取样。在处理的不同时期选取单叶(苗期)或当时的功能叶。置液氮中速冻，保存于-70℃冰箱中备用。
b)基因分离。提取不同处理的mRNA，反转录合成cDNA，分别用Oligo(dT)12XX和不同随机引物组合，作PCR；用测序胶分离，筛选短日下表达、长日下不表达、开花逆转过程中先表达后关闭的特异片段；用常规方法克隆特异片段。
c)克隆片段的特异性检测。用得到的特异片段为探针，对不同光周期处理的RNA作Northern blot分析，进一步确定片段对光周期反应的特异性。
d)按常规方法进行核苷酸序列测定。
Claims (8)
1、一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，对同一品种的植株分别进行以下处理：
1)自短日植物出苗起，对其进行短日处理，直至开花；
2)自短日植物出苗起，对其进行短日处理8-15天，然后进行长日处理，诱导植株发生顶端花序逆转；
3)一直进行长日处理，使植株保持营养生长状态；
在上述处理中植株发育的不同阶段，取植物组织，通过基因差异表达分析方法，比较不同发育状态植株中基因表达的差异，筛选、克隆与光周期反应直接相关的基因。
2、根据权利要求1所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：所述第一种处理的植株开花后，进行长日处理，诱导恢复营养生长后，再进行短日处理，诱导生殖生长，该过程可以循环进行。
3、根据权利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：所述短日植物是大豆。
4、根据权利要求3所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：所述短日植物是自贡冬豆，其中优选自贡冬豆纯系。
5、根据权利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：第二种处理中，自短日植物出苗起，对其进行短日处理13天。
6、根据权利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：所述短日处理是指每天日照10-12.5小时。
7、根据权利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：所述长日处理是指每天日照14小时以上。
8、根据权利要求1所述的克隆短日植物光周期反应相关基因的方法，其特征在于：在植株的不同阶段所取的植物组织是叶片或生长点。
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|---|---|---|---|
| CN 01141795 CN1408211A (zh) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | 一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法 |
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| CN 01141795 CN1408211A (zh) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | 一种克隆短日植物光周期反应相关基因的方法 |
Publications (1)
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| CN1408211A true CN1408211A (zh) | 2003-04-09 |
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Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN1408211A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102718852A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-10 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 大豆光受体蛋白GmZTL2及其应用 |
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2001
- 2001-09-19 CN CN 01141795 patent/CN1408211A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN102718852A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-10 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 大豆光受体蛋白GmZTL2及其应用 |
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