CN1382802A - 含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法。属于酶的凝胶包埋固定化技术。该方法以酯为前驱体,在酸、碱和无机盐的分步催化作用下,与水发生反应,生成氧化硅溶胶。把该溶胶与溶于缓冲液中一定浓度的酶原溶液混合,在短时间内形成凝胶,静置老化后得到含酶生物凝胶,其特征在于:前驱体为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯,其用量是,与水的摩尔比为0.05-0.10;催化剂为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、氢氧化钠、氨水、磷酸盐、醋酸盐,其用量与正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯的摩尔比为1.0-2.0;水解和缩聚反应温度控制在20-25℃,反应最终pH值控制在7.0。凝胶化时间短,固定化过程简便易行,凝胶平均孔径较大,固定化后酶活性维持率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法,属于酶的凝胶包埋固定化技术。
背景技术
sol-gel法一般是前驱体在水、助溶剂(通常为醇)及催化剂(酸或碱)存在下,发生水解和缩聚反应,释放出水和相应的醇等,形成三维网络,得到湿凝胶,湿凝胶经过陈化、干燥得到干凝胶。其特点是:通过低温化学手段在相对小的尺寸范围内能够裁剪和调控材料的显微结构,使均匀性达到亚微米级、纳米级甚至分子水平。作为一种“软化学”方法,sol-gel法为生物分子掺杂于无机或无机-有机复合基质中提供了新颖途径。
与物理吸附法、化学交联法和化学键合法等固定化方法相比,酶的sol-gel固定化方法具有以下突出优点:
(1)固定化酶的可调控性酶作为三维有序的有机分子,可从微观和介观水平上控制sol-gel过程,从而形成具有特殊组装方式和多级结构特点的生物矿化凝胶。根据需要,可以控制基质(Matrix)中孔的比表面积、结构尺寸,并可以对基质的前驱体进行各种化学改性。另外,固定化酶可以制成薄膜状、块状、粒状或涂覆于其它载体的表面。
(2)固定化过程的高效性sol-gel法包埋酶通常在常温或低温下进行,通过温和、简便的物理过程,即可达到很高的酶空间结构维持率。另外,基质的笼效应(Cage effect)使固定在基质中的酶一般不会渗出;基质的刚性提高了酶的热稳定性;基质中足够量的水为酶分子提供了适宜的微环境,从而保证了酶的活性和稳定性,使固定化酶呈现出与游离酶相似的行为。化学键合法则要求酶分子具有一定的取向,这样可能会阻碍底物分子进入酶的活性位点而影响酶的催化活性。
(3)固定化方法的普适性sol-gel法包埋酶的过程是在溶胶转变为凝胶的过程中逐步把酶包埋在基质中的,因此,酶对基质无特殊要求,而吸附交联法则要考虑基质孔与酶的适配性。Sol-gel法基质对酶也无特殊要求,而化学键合法则要求酶分子要有一定的功能基团。
但现有的Sol-gel法也有一些明显缺点,总体表现是由于Sol-gel反应的复杂性和缺乏分子水平上调控凝胶结构的手段,酶的Sol-gel固定化基本上停留在试差水平。具体的问题主要体现在下述方面:溶胶凝胶过程多用一步法,缺乏对水解缩聚速率有效的调控手段;基质的刚性强而柔性差,易破碎;基质的孔径偏小(一般均小于1.5纳米),内扩散阻力大,底物与产物在基质中的传递速度慢;基质的生物相容性差,一定程度上破坏酶的活性和稳定性。此外,前驱体多为烷基硅酸盐、烷氧基烷基硅烷,水溶性差需助溶剂和催化剂,而助溶剂和催化剂都会对凝胶的性能带来不利影响。水解反应释放出的醇容易引起酶分子的折叠和团簇化而使二级和三级结构受到一定程度的破坏,醇蒸发在干凝胶形成时会引起较大幅度的收缩和孔塌陷。这样的复杂性再加上老化效应控制方面的困难意味着重复地制备结构适宜、活性和稳定性高、机械强度大的生物凝胶面临着相当大的困难和挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法。本发明提供的凝胶凝胶化时间短且可灵活调控,过程操作易行,凝胶的平均孔径较大。因此,酶的空间结构维持率和酶的活性维持率较高。
为达到上述目的,本发明是通过下述技术方案实现的。以酯为前驱体,在酸、碱和无机盐的分步催化作用下,与水发生反应,生成氧化硅溶胶。过程中通过调节pH值来控制水解和缩聚反应的速度。把该溶胶与溶于磷酸盐缓冲液中的浓度为10-100mg/ml的酶原溶液混合,在1分钟之内形成凝胶,静置老化5-7天后得到含酶生物凝胶,其特征在于:前驱体为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯,其用量是,与水的摩尔比为0.05-0.10,催化剂为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、氢氧化钠、氨水、磷酸盐、醋酸盐,其用量与正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯的摩尔比为1.0-2.0。水解和缩聚反应温度控制在20-25℃,反应最终pH值控制在7.0。
本发明制备的含酶凝胶经测定,其平均孔径为3.0-6.0纳米,比表面积为200-300m2/g。本发明提出的制备方法的优点在于:凝胶化时间短且可以灵活调控,固定化过程简便易行,凝胶的平均孔径较大,固定化后酶的空间结构维持率和酶活性维持率高。
具体实施方式
实施例一
称取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料试管中,加入3%的HCl溶液1.10g,在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液,然后边混合边滴加2%的NaOH溶液2.10g,用以调节pH至接近中性,凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取FateDH 7.0mg、FaldDH 2.0mg、ADH(均来自Sigma公司)2.0mg,溶于1ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中,形成总浓度11mg/ml的酶原溶液(B)。取1ml空白溶胶(A)与酶原溶液(B)在苯乙烯试管中混合,大约50-60s内形成凝胶。将试管密封,3℃下静置老化7天,记为1#凝胶。
实施例二
称取2.60g正硅酸乙酯(TEOS)放入塑料试管中,加入3%的HCl溶液1.10g,在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液,然后边混合边滴加2%的NaOH溶液2.10g,用以调节pH至接近中性,凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取FateDH 14.0mg、FaldDH 4.0mg、ADH 4.0mg,溶于1ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中,形成总浓度22mg/ml的酶原溶液(C)。取1ml空白溶胶(A)与酶原溶液(C)在苯乙烯试管中混合,大约5-10s内形成凝胶。将试管密封,3℃下静置老化7天,记为2#凝胶。
实施例三
称取1.94g正硅酸甲酯(TMOS)放入塑料试管中,加入3%的HCl溶液1.10g,在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液,然后边混合边滴加2%的NaOH溶液2.10g,用以调节pH至接近中性,凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取FateDH 7.0mg、FaldDH 2.0mg、ADH(均来自Sigma公司)2.0mg,溶于1ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中,形成总浓度11mg/ml的酶原溶液(B)。取1ml空白溶胶(A)与酶原溶液(B)在苯乙烯试管中混合,大约50-60s内形成凝胶。将试管密封,3℃下静置老化7天,记为3#凝胶。
实施例四
称取1.94g正硅酸甲酯(TMOS)放入塑料试管中,加入3%的HCl溶液1.10g,在旋涡混合仪上混合至形成均一溶液,然后边混合边滴加2%的NaOH溶液2.10g,用以调节pH至接近中性,凝胶化后形成透明空白溶胶(A)。
称取FateDH 14.0mg、FaldDH 4.0mg、ADH 4.0mg,溶于1ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中,形成总浓度22mg/ml的酶原溶液(C)。取1ml空白溶胶(A)与酶原溶液(C)在苯乙烯试管中混合,大约5-10s内形成凝胶。将试管密封,3℃下静置老化7天,记为4#凝胶。
实施例五
NADH溶解到0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中,配成NADH浓度为0.025mol/L、0.05mol/L和0.075mol/L的溶液。将老化后的凝胶取出,用大量pH=7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液浸泡,其间多次更换新鲜的缓冲液,并取样进行气相色谱分析,至无乙醇残留。取出凝胶,加入2ml NADH溶液,浸泡24h,以使NADH充分扩散到凝胶内部。
将处理好的凝胶和溶液一并移入反应器,通入CO2,反应器内压力维持在3atm,反应8hr。反应产物取样,气相色谱分析甲醇含量。
本发明采用Sol-gel法将甲酸脱氢酶(FateDH)、甲醛脱氢酶(FaldDH)和甲醇脱氢酶(ADH)三种酶包埋于SiO2多孔基质中作为催化剂,以还原型烟酰胺腺嘌呤二核甙酸(NADH)作为电子供体,通过酶促反应将CO2转化为甲醇。
本发明采用的酶法将CO2转化为甲醇反应中的甲醇收率最高达到了92.1%,相同实验条件下,游离酶酶促反应中甲醇收率达98.1%。可见,酶经凝胶包埋后,反应活性有所下降,估计是由于酶空间构型的微小变化和空阻效应所致。
用本发明制备的含酶凝胶作为催化剂,考察了酶包埋量、温度、pH值、NADH用量等因素对二氧化碳酶催化反应的影响。
3.1酶包埋量对酶催化CO2转化甲醇反应的影响
表1 酶包埋量对酶转化CO2反应的影响
编号 PH 温度/℃ NADH 压力 收率/%
用量 /Mpa
mmol
1# 7.0 37 100 0.3 92.1
2# 7.0 37 100 0.3 52.3
1# 7.0 37 150 0.3 42.2
2# 7.0 37 150 0.3 35.13.2温度对酶催化CO2转化甲醇的影响
表2 反应温度对酶CO2转化甲醇的影响(1#凝胶)
温度/℃ PH NADH 压力 收率/%
用量 /Mpa
mmol
25 7.0 100 0.3 30
37 7.0 100 0.3 92.1
25 7.0 150 0.5 27
37 7.0 150 0.3 42.23.3 pH值对酶催化CO2转化甲醇的影响
表3 pH值对酶催化CO2转化甲醇的影响(1#凝胶)
PH 温度/℃ NADH 压力 收率/%
用量 /Mpa
mmol
7.0 37 100 0.3 92.1
7.5 37 100 0.3 66.9
8.0 37 100 0.3 49.53.4 NADH用量对酶催化CO2转化甲醇的影响
表.4 NADH用量对酶催化CO2转化甲醇的影响(1#凝胶)
NADH用量 温度/℃ pH 压力/Mpa 收率/%
mmol
50 25 8.0 0.3 68.8
100 37 8.0 0.5 49.5
150 37 8.0 0.5 32.0
Claims (1)
1一种含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法,该方法以酯为前驱体,在酸、碱和无机盐的分步催化作用下,与水发生反应,生成氧化硅溶胶。过程中通过调节pH值来控制水解和缩聚反应的速度,把该溶胶与溶于磷酸盐缓冲液中的浓度为10-100mg/ml的酶原溶液混合,在1分钟之内形成凝胶,静置老化5-7天后得到含酶生物凝胶,其特征在于:前驱体为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯,其用量是,与水的摩尔比为0.05-0.10;催化剂为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、氢氧化钠、氨水、磷酸盐、醋酸盐,其用量与正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸异丙酯的摩尔比为1.0-2.0;水解和缩聚反应温度控制在20-25℃,反应最终pH值控制在7.0。
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CN 02121430 CN1382802A (zh) | 2002-06-21 | 2002-06-21 | 含脱氢酶生物硅凝胶的制备方法 |
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN100427594C (zh) * | 2006-06-13 | 2008-10-22 | 山西大学 | 包埋酶或微生物细胞的二氧化硅凝胶颗粒及其制备方法 |
WO2013159713A1 (zh) * | 2012-04-26 | 2013-10-31 | 深圳市科聚新材料有限公司 | I-iii-iv族化合物太阳能电池用二氧化硅阻隔层的制备方法 |
-
2002
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PB01 | Publication | ||
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